ISO/TS 26844:2006

Milk and milk products — Determination of antimicrobial residues — Tube diffusion test

ISO/TS 26884|IDF/RM 215:2006 specifies a microbiological inhibitor test for the detection of a broad variety of antimicrobials in milk and milk products. The method is applicable to raw milk, heat-treated milk and reconstituted dried milk.

Lait et produits laitiers — Détermination de résidus antimicrobiens — Test de dissémination en tube

L'ISO/TS 26884|FIL/RM 215:2006 spécifie un test d'inhibition microbiologique pour la détection d'une grande variété d'antimicrobiens dans le lait et les produits laitiers. Cette méthode s'applique au lait cru, au lait traité thermiquement et au lait en poudre reconstitué.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 09-Nov-2006
• ICS: 67.100.01 - Milk and milk products in general
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 16-Feb-2022

Standards Content (Sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 26844
IDF/RM
215
First edition
2006-11-15

Milk and milk products — Determination
of antimicrobial residues — Tube
diffusion test
Lait et produits laitiers — Détermination de résidus antimicrobiens —
Test de dissémination en tube




Reference numbers
ISO/TS 26844:2006(E)
IDF/RM 215:2006(E)
©
ISO and IDF 2006

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IDF/RM 215:2006(E)
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Published in Switzerland

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ISO/TS 26844:2006(E)
IDF/RM 215:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Foreword. v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 1
5 Test organism, culture media, standard solutions and control samples . 2
6 Apparatus and glassware . 6
7 Sampling. 7
8 Preparation of test sample. 7
9 Procedure . 7
9.1 Control samples. 7
9.2 Test tube preparation . 7
9.3 Incubation. 8
9.4 Interpretation. 8
10 Confirmation (optional). 8
10.1 General. 8
10.2 Presumptive confirmation of beta-lactams.8
10.3 Presumptive confirmation of sulfonamides. 9
10.4 Confirmation of other inhibitors. 9
11 Expression of results . 9
12 Precision. 9
13 Test report . 9
Annex A (informative) Data from collaborative studies . 10
Annex B (informative) Preparation of test-organism suspension. 11
Bibliography . 13

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ISO/TS 26844:2006(E)
IDF/RM 215:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of normative document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee casting
a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a
further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is
confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an
International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 26844⎪IDFRM 215 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee
SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO
and IDF.

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IDF/RM 215:2006(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National
Committee in every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF
Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in the development of
standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the National Committees for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of the IDF National Committees
casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
Standing Committee may decide to publish an other type of normative document which is called by IDF:
Reviewed method. Such a method represents an agreement between the members of a Standing Committee
and is accepted for publication if it is approved by at least 50 % of the committee members casting a vote.
A Reviewed method is equal to an ISO/PAS or ISO/TS and will, therefore, also be published jointly under ISO
conditions.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 26844⎪IDF/RM 215 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published
jointly by IDF and ISO.
All work was carried out by the Joint ISO-IDF Action Team on Veterinary residues, of the Standing Committee
on Analytical methods for additives and contaminants, under the aegis of its project leaders, Mr H. Stegeman
(NL) and Mr J. Kerkhof (NL).

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ISO/TS 26844:2006(E)
TECHNICAL SPECIFICATION
IDF/RM 215:2006(E)

Milk and milk products — Determination of antimicrobial
residues — Tube diffusion test
1 Scope
This Technical Specification (Reviewed Method) specifies a microbiological inhibitor test for the detection of a
broad variety of antimicrobials in milk and milk products.
The method is applicable to raw milk, heat-treated milk and reconstituted dried milk.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 4833, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of micro-
organisms — Colony-count technique at 30 °C
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 13969⎪IDF 183, Milk and milk products — Guidelines for a standardized description of microbial inhibitor
tests
ISO 18330⎪IDF 188, Milk and milk products — Guidelines for a standardized description of immunoassays or
receptor assays for the detection of antimicrobial residues
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
antimicrobial substances
substances that show an inhibition in the procedure specified in this document
3.2
limits of detection
concentration level at which a defined percentage of positive samples is detected
EXAMPLE 95 %.
4 Principle
A milk sample is added to two test tubes with agar media containing Geobacillus stearothermophilus
ATCC 10149 (identical to NIZO strain C953). The test tubes differ from each other in pH, in added
supplements and synergistic antibiotics. Incubation resulting in normal growth of the organism causes the pH
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ISO/TS 26844:2006(E)
IDF/RM 215:2006(E)
indicator in the agar to change colour from purple to yellow. When substances that are inhibitory to the growth
of microorganisms are present in the milk, the colour of the pH indicator will remain purple.
Test tube A (pH 7,0; chloramphenicol) shows an improved sensitivity for tetracycline residues, and test tube B
(pH 8,0; trimethoprim) for beta-lactams, macrolides, aminoglycosides, sulfonamides and trimethoprim
residues.
5 Test organism, culture media, standard solutions and control samples
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or deionized water
or water of equivalent purity.
5.1 Test organism
1)
Use a suspension of Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 (identical to NIZO strain C953) adjusted
to a viable count of approximately 5 000 000 colony-forming units/ml (see Annex B for preparation). Check the
quality of each new batch of the test-organism suspension by determining the sensitivity for the standard
solutions mentioned in Table 1.
Table 1 — Standard solutions for testing the sensitivity of the test-organism suspension
Standard solution Content
µg/kg milk
Benzylpenicillin (Penicillin-G) 2
Sulfadiazine 150
Neomycin 30
Erythromycin 10
Oxytetracycline 100

Perform the check with standard solutions and control milk in 5-fold, according to the procedure described in
Clause 9. Determine the sensitivity of the test-organism suspension for benzylpenicillin and oxytetracycline
with tube A (5.2.5) and the sensitivity for sulfadiazine, neomycin and erythromycin with tube B (5.2.6). A
positive result should be obtained in all test tubes.
5.2 Culture media
In order to improve the reproducibility of the method, it is recommended to use dehydrated basic components
or dehydrated complete media for the preparation of culture media. Follow the manufacturers' instructions.
5.2.1 Basic medium
5.2.1.1 Components
Casein trypton 5,0 g
Yeast extract 2,5 g
Glucose, anhydrous 1,0 g
Agar 10 g to 15 g
Water 1 000 ml

NOTE The basic dehydrated medium is commercially available as Plate Count Agar.

1) Suspension of Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 or NIZO strain C953 is an example of a product available
commercially. This information is given for the convenience of users of this Technical Specification and does not constitute
an endorsement by ISO or IDF of this product.
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IDF/RM 215:2006(E)
5.2.1.2 Preparation
Dissolve the components in the water by heating. Adjust the pH so that after sterilization it is 7,0 ± 0,2.
Autoclave the medium at 121 °C ± 1 °C for 15 min.
The thus-prepared basic medium may be kept for a maximum of 3 months if stored in the dark at 0 °C to
+5 °C.
5.2.2 Bromocresolpurple solution
5.2.2.1 Components
Bromocresolpurple 250 mg
Ethanol, 96% 5 ml
Water 100 ml

5.2.2.2 Preparation
Dissolve the bromocresolpurple in the ethanol. Dilute with water to 100 ml.
The bromocresolpurple solution may be kept for a maximum of 6 months if stored in the dark at 0 °C to +5 °C.
5.2.3 Chloramphenicol (CAP) solution
5.2.3.1 Components
Chloramphenicol 20,0 mg
Methanol 5 ml
Water 100 ml

5.2.3.2 Preparation
Dissolve the chloramphenicol in the methanol. Dilute with water to 100 ml.
The chloramphenicol solution may be kept for a maximum of 1 month if stored in the dark at 0 °C to +5 °C.
5.2.4 Trimethoprim (TMP) solution
5.2.4.1 Components
Trimethoprim 25,0 mg
Ethanol, 96 % 5 ml
Water 1 000 ml

5.2.4.2 Preparation
Dissolve the trimethoprim in the ethanol. Dilute with water to 1 000 ml.
The TMP solution may be kept for a maximum of 1 month if stored in the dark at 0 °C to +5 °C.
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IDF/RM 215:2006(E)
5.2.5 Test tubes A (pH 7)
Melt the basic medium (5.2.1). Cool the medium in a water bath (6.3) to 63 °C ± 1 °C. Add 1,5 ml of CAP
solution (5.2.3) and 2 ml of bromocresolpurple solution (5.2.2) to 100 ml of the preheated basic medium, while
keeping the medium in the water bath set at 63 °C. Mix the medium well.
Keeping the medium in the water bath set at 63 °C, adjust the pH (see 6.5) to 7,0 ± 0,1 at that temperature by
using 1 mol/l NaOH or 1 mol/l HCl.
Subsequently, add per 100 ml of medium such an amount (approx. 2 ml) of test-organism suspension (5.1)
that in the absence of antimicrobial substances the colour change does appear after incubation in the water
bath at 63 °C for 4 h 15 min ± 30 min.
Mix and dispense the test medium in portions of 1 ml in tubes (6.4) and leave the medium to solidify.
The test tubes A may be stored at 0 °C to +5 °C for a maximum of 3 days, provided that the tubes are covered
to avoid evaporation (e.g. with parafilm).
5.2.6 Test tubes B (pH 8)
Melt the basic medium (5.2.1). Cool the medium in a water bath (6.3) to 63 °C ± 1 °C. Add 0,6 ml of TMP
solution (5.2.4) and 2 ml of bromocresolpurple solution (5.2.2) to 100 ml of the preheated basic medium, while
keeping the medium in the water bath set at 63 °C. Mix the medium well.
Keeping the medium in the water bath set at 63 °C, adjust the pH (see 6.5) to 8,00 ± 0,02 at that temperature
by using 1 mol/l NaOH or 1 mol/l HCl. Take care that while adjusting, the pH of the medium does not exceed a
value of 8,05.
Subsequently, add an amount (approx. 2 ml) of test-organism suspension (5.1) per 100 ml of medium so that
in the absence of antimicrobial substances the colour change appears after the incubation in the water bath at
63 °C for 4 h 15 min ± 30 min.
Mix and dispense the test medium in portions of 1 ml in tubes (6.4) and leave the medium to solidify.
The test tubes B may be stored at 0 °C to +5 °C for a maximum of 3 days, provided that the tubes are covered
to avoid evaporation (e.g. with parafilm).
5.3 Standard solutions and control samples
Correct all weighing for purity and salt contents in accordance with ISO 13969⎪IDF 183.
For the preparation of standard solutions and control samples, it may be assumed that 1 ml of solution is
equal to 1 g of solution.
5.3.1 Benzylpenicillin standard solutions and control samples
Taking into account the limited stability of benzylpenicillin, it is advisable to prepare all the benzylpenicillin
standard solutions freshly and to freeze the control milk samples on the same day at below −18 °C.
5.3.1.1 Benzylpenicillin standard stock solution
Dissolve 20,0 mg ± 0,1 mg of benzylpenicil
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 26844
FIL/MR
215
Première édition
2006-11-15


Lait et produits laitiers — Détermination
de résidus antimicrobiens — Test de
dissémination en tube
Milk and milk products — Determination of antimicrobial residues —
Tube diffusion test




Numéros de référence
ISO/TS 26844:2006(F)
FIL/MR 215:2006(F)
©
ISO et FIL 2006

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ISO/TS 26844:2006(F)
FIL/MR 215:2006(F)
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Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail [e-mail] E-mail [e-mail]
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Publié en Suisse

ii © ISO et FIL 2006 – Tous droits réservés

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ISO/TS 26844:2006(F)
FIL/MR 215:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 2
5 Organisme d'essai, milieux de culture, solutions étalons et échantillons témoins . 2
5.1 Organisme d'essai . 2
5.2 Milieu de culture. 3
5.3 Préparation des solutions étalons et des échantillons témoins . 5
5.4 Lait négatif (lait exempt d'antimicrobiens). 7
6 Appareillage et verrerie. 7
7 Échantillonnage . 7
8 Préparation de l'échantillon pour essai. 8
9 Mode opératoire . 8
9.1 Échantillons témoins. 8
9.2 Préparation des tubes à essais . 8
9.3 Incubation. 8
9.4 Interprétation. 9
10 Confirmation (facultative). 9
10.1 Généralités . 9
10.2 Confirmation indicative de la présence de bêta-lactamines . 9
10.3 Confirmation indicative des sulfamides. 10
10.4 Confirmation des autres inhibiteurs. 10
11 Expression des résultats . 10
12 Fidélité . 10
13 Rapport d'essai . 10
Annexe A (informative) Données obtenues lors d'études interlaboratoires. 11
Annexe B (informative) Préparation de la suspension de l'organisme d'essai . 12
Bibliographie . 14

© ISO et FIL 2006 – Tous droits réservés iii

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ISO/TS 26844:2006(F)
FIL/MR 215:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
Dans d'autres circonstances, en particulier lorsqu'il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d'autres types de documents normatifs:
⎯ une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans
un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des
membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
⎯ une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d'un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l'objet d'un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu'une ISO/PAS ou
ISO/TS a été confirmée, elle fait l'objet d'un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale, soit de son annulation.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 26844|FIL/RM 215 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 5, Lait et produits laitiers, et par la Fédération internationale de laiterie (FIL). Elle est publiée
conjointement par l'ISO et la FIL.
iv © ISO et FIL 2006 – Tous droits réservés

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ISO/TS 26844:2006(F)
FIL/MR 215:2006(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité
National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités
permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour
l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d'Action et les Comités permanents sont
soumis aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux votants.
Dans d'autres circonstances, notamment lorsqu'il y a un besoin urgent de ces documents sur le marché, un
Comité permanent peut décider de publier un autre type de document normatif que la FIL appelle une
Méthode révisée. Cette méthode représente un accord entre les membres d'un Comité permanent et elle est
acceptée pour publication si elle est approuvée par au moins 50 % des membres votants du comité. Une
Méthode révisée est l'équivalent d'une ISO/PAS ou d'une ISO/TS et sera donc également publiée
conjointement selon les conditions de l'ISO.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 26844|FIL/RM 215 a été élaborée la Fédération internationale de laiterie (FIL) et par le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée
conjointement par la FIL et l'ISO.
L'ensemble des travaux a été confié à l'Équipe d'Action Mixte ISO-FIL, Résidus vétérinaires, du Comité
Permanent chargé des Méthodes analytiques pour additifs et contaminants, sous la conduite de ses chefs de
projet, Messieurs H. Stegeman (NL) et J. Kerkhof (NL).

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ISO/TS 26844:2006(F)
SPÉCIFICATION TECHNIQUE
FIL/MR 215:2006(F)

Lait et produits laitiers — Détermination de résidus
antimicrobiens — Test de dissémination en tube
1 Domaine d'application
La présente Spécification technique internationale (Méthode révisée) spécifie un test d'inhibition
microbiologique pour la détection d'une grande variété d'antimicrobiens dans le lait et les produits laitiers.
Cette méthode s'applique au lait cru, au lait traité thermiquement et au lait en poudre reconstitué.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventuels amendements) s'applique.
ISO 4833, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des micro-
organismes — Technique de comptage des colonies à 30 °C
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Recommandations et règles générales pour les examens
microbiologiques
ISO 13969|FIL 183, Lait et produits laitiers — Lignes directrices pour une description normalisée des
méthodes microbiologiques de dépistage d'inhibiteurs microbiens
ISO 18330|FIL 188, Laits et produits laitiers — Lignes directrices pour la description normalisée des essais
immunologiques et des essais récepteur pour la détection des résidus antimicrobiens
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
substances antimicrobiennes
substances présentant une inhibition lors de la mise en œuvre du mode opératoire spécifié dans le présent
document
3.2
limites de détection
niveau de concentration où l'on détecte un pourcentage donné d'échantillons positifs
EXEMPLE 95 %.
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4 Principe
Un échantillon de lait est ajouté dans deux tubes à essais renfermant un milieu gélosé contenant du
Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 [identique à la souche C953 du NIZO (Institut néerlandais de
recherche sur les produits laitiers)]. Les tubes à essais diffèrent l'un de l'autre par leur pH, les suppléments
ajoutés et les antibiotiques synergiques. L'incubation entraînant une croissance normale de l'organisme
provoque un passage du pourpre au jaune de l'indicateur de pH de la gélose. Si des substances ayant un
effet inhibiteur de la croissance des micro-organismes sont présentes dans le lait, la couleur de l'indicateur de
pH restera pourpre.
Le tube à essais A (pH 7,0; chloramphénicol) présente une sensibilité améliorée aux résidus de tétracyclines
et le tube à essais B (pH 8,0; triméthoprime) aux résidus de bêta-lactamines, macrolides, aminoglycosides,
sulfamides et triméthoprime.
5 Organisme d'essai, milieux de culture, solutions étalons et échantillons témoins
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue. L'eau utilisée doit
être de l'eau distillée ou de l'eau déionisée ou encore de l'eau de pureté équivalente.
5.1 Organisme d'essai
Utiliser une suspension de Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 (identique à la souche C953 du
1)
NIZO) , ajusté à un nombre viable d'environ 5 000 000 unités formant colonie/ml (voir Annexe B pour la
préparation). Contrôler la qualité de chaque nouveau lot de suspension d'organisme d'essai en déterminant la
sensibilité des solutions étalons mentionnées dans le Tableau 1.
Tableau 1 — Solutions étalons pour les essais de sensibilité de la suspension d'organisme d'essai
Teneur
Solution étalon
(µg/kg de lait)
Benzylpénicilline (Pénicilline-G) 2
Sulfadiazine 150
Néomycine 30
Érythromycine 10
Oxytétracycline 100
Procéder à 5 contrôles avec les solutions étalons et le lait témoin, conformément au mode opératoire décrit à
l'Article 9. Déterminer la sensibilité de la suspension d'organisme d'essai à la benzylpénicilline et à
l'oxytétracycline à l'aide du tube A (5.2.5) et la sensibilité à la sulfadiazine, à la néomycine et à l'érythromycine
à l'aide du tube B (5.2.6). Il convient d'obtenir un résultat positif sur la totalité des tubes à essais.

1) La suspension de Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 ou de la souche C953 du NIZO est un exemple de
produit disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs de la

présente Spécification technique et ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit.
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5.2 Milieu de culture
Afin d'améliorer la reproductibilité de la méthode, il est recommandé d'utiliser des composants de base ou des
milieux complets déshydratés pour la préparation des milieux de culture. Suivre les instructions du fabricant.
5.2.1 Milieu de base
5.2.1.1 Composants
Peptone trypsique de caséine 5,0 g
Extrait de levure 2,5 g
Glucose anhydre 1,0 g
Gélose 10 g à 15 g
Eau 1 000 ml
NOTE Le milieu de base déshydraté est disponible dans le commerce sous forme de gélose de numération
(«Plate Count Agar», milieu PCA).
5.2.1.2 Préparation
Dissoudre les composants dans de l'eau en les chauffant pour mettre la totalité en solution. Ajuster le pH de
manière qu'il soit de 7,0 ± 0,2 après stérilisation.
Passer le milieu à l'autoclave à 121 °C ± 1 °C, pendant 15 min.
Le milieu de base ainsi préparé peut être conservé pendant 3 mois maximum, s'il est stocké à l'abri de la
lumière à une température comprise entre 0 °C et +5 °C.
5.2.2 Solution de pourpre de bromocrésol
5.2.2.1 Composants
Pourpre de 250 mg
bromocrésol
Éthanol à 96 % 5 ml
Eau 100 ml
5.2.2.2 Préparation
Dissoudre le pourpre de bromocrésol dans l'éthanol. Compléter à 100 ml avec de l'eau.
La solution de pourpre de bromocrésol peut être conservée pendant 6 mois maximum, si elle est stockée à
l'abri de la lumière à une température comprise entre 0 °C et +5 °C.
5.2.3 Solution de chloramphénicol (CAP)
5.2.3.1 Composants
Chloramphénicol 20,0 mg
Méthanol 5 ml
Eau 100 ml
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5.2.3.2 Préparation
Dissoudre le chloramphénicol dans le méthanol. Compléter à 100 ml avec de l'eau.
La solution de chloramphénicol peut être conservée pendant 1 mois maximum, si elle est stockée à l'abri de la
lumière à une température comprise entre 0 °C et +5 °C.
5.2.4 Solution de triméthoprime (TMP)
5.2.4.1 Composants
Triméthoprime 25,0 mg
Éthanol à 96 % 5 ml
Eau 1 000 ml
5.2.4.2 Préparation
Dissoudre le triméthoprime dans l'éthanol. Compléter avec de l'eau à 1 000 ml.
La solution de TMP peut être conservée pendant 1 mois maximum, si elle est stockée à l'abri de la lumière à
une température comprise entre 0 °C et +5 °C.
5.2.5 Tubes à essais A (pH 7)
Faire fondre le milieu de base (5.2.1). Refroidir le milieu dans un bain-marie (6.3) à 63 °C ± 1 °C.
Ajouter 1,5 ml de solution de CAP (5.2.3) et 2 ml de solution de pourpre de bromocrésol (5.2.2) à 100 ml de
milieu de base préchauffé, tout en conservant ce dernier dans le bain-marie réglé à 63 °C. Bien homogénéiser
le milieu.
En maintenant le milieu dans le bain-marie réglé à 63 °C, ajuster le pH à 7,0 ± 0,1 à cette température
(voir 6.5) en utilisant du NaOH à 1 mol/l ou du HCl à 1 mol/l.
Par 100 ml de milieu, ajouter ensuite une quantité (environ 2 ml) de suspension d'organisme d'essai (5.1) telle
que, en l'absence de substances antimicrobiennes, le changement de couleur mentionné plus haut se
produise après incubation dans le bain-marie à 63 °C pendant 4 h et 15 min ± 30 min.
Homogénéiser le milieu d'essai, le répartir par prises de 1 ml dans des tubes (6.4) et le laisser se solidifier.
Les tubes à essais A peuvent être conservés à une température comprise entre 0 °C et +5 °C pendant 3 jours
maximum, à condition d'être couverts (avec un parafilm, par exemple) afin d'éviter l'évaporation.
5.2.6 Tubes à essais B (pH 8)
Faire fondre le milieu de base (5.2.1). Refroidir le milieu au bain-marie (6.3) à 63 °C ± 1 °C. Ajouter 0,6 ml de
solution de TMP (5.2.4) et 2 ml de solution de pourpre de bromocrésol (5.2.2) à 100 ml de milieu de base
préchauffé, tout en conservant ce dernier dans le bain-marie réglé à 63 °C. Bien homogénéiser le milieu.
En maintenant le milieu dans le bain-marie réglé à 63 °C, ajuster le pH à 8,00 ± 0,02 à cette température
(voir 6.5) en utilisant du NaOH à 1 mol/l ou du HCl à 1 mol/l. En ajustant le pH du milieu, veiller à ce qu'il ne
dépasse pas 8,05.
Par 100 ml de milieu, ajouter ensuite une quantité (environ 2 ml) de suspension d'organisme d'essai (5.1) telle
que, en l'absence de substances antimicrobiennes, le changement de couleur mentionné plus haut se
produise après incubation dans le bain-marie à 63 °C pendant 4 h et 15 min ± 30 min.
Homogénéiser le milieu d'essai, le répartir par prises de 1 ml dans des tubes (6.4) et le laisser se solidifier.
Les tubes à essais B peuvent être conservés à une température comprise entre 0 °C et +5 °C pendant 3 jours
maximum, à condition d'être couverts (avec un parafilm, par exemple) afin d'éviter l'évaporation.
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5.3 Préparation des solutions étalons et des échantillons témoins
Corriger toutes les pesées en fonction de la pureté et de la teneur en sel conformément à l'ISO 13969|FIL 183.
Pour la préparation des solutions étalons et des échantillons témoins, on peut supposer que 1 ml de solution
est égal à 1 g de solution.
5.3.1 Solutions étalons et échantillons témoins de benzylpénicilline
Compte tenu de la stabilité limitée de la benzylpénicilline, il est conseillé de préparer toutes les solutions
étalons de benzylpénicilline extemporanément et de congeler directement les échantillons témoins de lait le
même jour, à une température inférieure à −18 °C.
5.3.1.1 Solution mère de benzylpénicilline
Dissoudre 20,0 mg ± 0,1 mg de benzylpénicilline dans 1 000 ml d'eau, puis homogénéiser. La solution mère
de benzylpénicilline ainsi préparée contient 20 mg/l de benzylpénicilline.
La solution mère de benzylpénicilline peut être conservée pendant 2 jours maximum, si elle est stockée à une
température comprise entre 0 °C et +5 °C.
5.3.1.2 Solution fille de benzylpénicilline
Diluer 10 ml de solution mère de benzylpénicilline (5.3.1.1) avec de l'eau à 1 000 ml, puis homogénéiser. La
solution fille de benzylpénicilline ainsi obtenue contient 200 µg/l de benzylpénicilline.
5.3.1.3 Échantillon témoin de lait à la benzylpénicilline
Diluer 1 ml de solution fille de benzylpénicilline (5.3.1.2) à 100 ml avec du lait négatif (5.4), puis homogénéiser.
L'échantillon témoin de lait ainsi préparé contient 2 µg/l de benzylpénicilline.
L'échantillon témoin de lait à la benzylpénicilline peut être conservé pendant 2 mois maximum, s'il est stocké
dans des tubes à essais (6.4), à une température inférieure à −18 °C.
NOTE 1 mg de pénicilline G potassique pure équivaut à 1 595 unités internationales de pénicilline G. 1 mg de
pénicilline G sodique pure équivaut à 1 670 unités internationales de pénicilline G.
5.3.2 Solutions étalons et échantillons témoins d'oxytétracycline
5.3.2.1 Solutions mère d'oxytétracycline
Dissoudre 5,0 mg ± 0,1 mg d'oxytétracycline dans 10 ml de solution de HCl à 0,1 mol/l. Compléter à 100 ml
avec de l'eau, puis homogénéiser. La solution mère d'oxytétracycline ainsi préparée contient 50 mg/l
d'oxytétracycline.
La solution mère d'oxytétracycline peut être conservée pendant 1 semaine maximum, si elle est stockée à
l'abri de la lumière à une température comprise entre 0 °C et +5 °C.
5.3.2.2 Solution fille d'oxytétracycline
Diluer 10 ml de solution mère d'oxytétracycline (5.3.2.1) à 100 ml avec de l'eau, puis homogénéiser. La
solution fille d'oxytétracycline ainsi obtenue contient 5 000 µg/l d'oxytétracycline.
5.3.2.3 Échantillon témoin de lait à l'oxytétracycline
Diluer 2 ml de solution fille d'oxytétracycline (5.3.2.2) à 100 ml avec du lait négatif (5.4), puis homogénéiser.
L'échantillon témoin de lait ainsi préparé contient 100 µg/l d'oxytétracycline.
L'échantillon témoin de lait à l'oxytétracycline peut être conservé pendant 3 mois maximum, s'il est stocké
dans des tubes à essais (6.4), à une température inférieure à −18 °C.
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5.3.3 Solutions étalons et échantillons témoins de sulfadiazine
5.3.3.1 Solution mère de sulfadiazine
Dissoudre 15,0 mg ± 0,1 mg de sulfadiazine dans 100 ml d'eau, puis homogénéiser. La solution mère de
sulfadiazine ainsi préparée contient 150 mg/l de sulfadiazine.
La solution mère de sulfadiazine peut être conservée pendant 2 semaines maximum, si elle est stockée à une
température comprise entre 0 °C et +5 °C.
5.3.3.2 Solution fille de sulfadiazine
Diluer 10 ml de solution mère de sulfadiazine (5.3.3.1) à 100 ml avec de l'eau, puis homogénéiser. La solution
fille de sulfadiazine ainsi obtenue contient 15 000 µg/l de sulfadiazine.
5.3.3.3 Échantillon témoin de lait à la sulfadiazine
Diluer 1 ml de solution fille de sulfadiazine (5.3.3.2) à 100 ml avec du lait négatif (5.4), puis homogénéiser.
L'échantillon témoin de lait ainsi préparé contient 150 µg/l de sulfadiazine.
L'échantillon témoin de lait à la sulfadiazine peut être conservé pendant 2 mois maximum, s'il est stocké dans
des tubes à essais (6.4), à une température inférieure à –18 °C.
5.3.4 Solutions étalons et échantillons témoins de néomycine
5.3.4.1 Solution mère de néomycine
Dissoudre 30,0 mg ± 0,1 mg de néomycine dans 5 ml de tampon phosphate à 0,1 mol/l (pH 8,0 ± 0,1), puis
homogénéiser. Compléter à 1 000 ml avec de l'eau, puis homogénéiser de nouveau. La solution mère de
néomycine ainsi préparée contient 30 mg/l de néomycine.
La solution mère de néomycine peut être conservée pendant 2 semaines maximum, si elle est stockée à une
température comprise entre 0 °C et +5 °C.
5.3.4.2 Solution fille de néomycine
Diluer 10 ml de solution mère de néomycine (5.3.4.1) à 100 ml avec de l'eau, puis homogénéiser. La solution
fille de néomycine ainsi obtenue contient 3 000 µg/l de néomycine.
5.3.4.3 Échantillon témoin de lait à la néomycine
Diluer 1 ml de solution fille de néomycine (5.3.4.2) à 100 ml avec du lait négatif (5.4), puis homogénéiser.
L'échantillon témoin de lait ainsi préparé contient 30 µg/l de néomycine.
L'échantillon témoin de lait à la néomycine peut être conservé pendant 2 mois maximum, s'il est stocké dans
des tubes à essais (6.4), à une température inférieure à −18 °C.
5.3.5 Solutions étalons et échantillons témoins d'érythromycine
5.3.5.1 Solution mère d'érythromycine
Dissoudre 20,0 mg ± 0,1 mg d'érythromycine dans 5 ml de méthanol. Compléter à 1 000 ml avec de l'eau,
puis homogénéiser. La solution mère d'érythromycine ainsi préparée contient 20 mg/l d'érythromycine.
La solution mère d'érythromycine peut être conservée pendant 2 semaines maximum, si elle est stockée à
une température comprise entre 0 °C et +5 °C.
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5.3.5.2 Solution fille d'érythromycine
Diluer 5 ml de solution mère d'érythromycine (5.3.5.1) à 100 ml avec de l'eau, puis homogénéiser. La solution
fille d'érythromycine ainsi obtenue contient 1 000 µg/l d'érythromycine.
5.3.5.3 Échantillon témoin de lait à l'érythromycine
Diluer 1 ml de solution fille d'érythromycine (5.3.5.2) à 100 ml avec du lait négatif (5.4), puis homogénéiser.
L'échantillon témoin de lait à l'érythromycine ainsi préparé contient 10 µg/l d'érythromycine.
L'échantillon témoin de lait à l'érythromycine peut être conservé pendant 2 mois maximum, s'il est stocké dans
des tubes à essais (6.4), à une température inférieure à –18 °C.
5.4 Lait négatif (lait exempt d'antimicrobiens)
Voir l'ISO 13969|FIL 183 pour l'obtention de lait négatif ou l'utilisation de lait entier stérilisé UHT exempt de
substances inhibitrices de micro-organismes.
6 Appareillage et verrerie
Les ustensiles à usage unique constituent une solution acceptable pour remplacer la verrerie réutilisable si
leurs spécifications sont appropriées.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Autoclave, pour stérilisation en chaleur humide.
Voir l'ISO 7218.
6.2 Micropipettes, d'une capacité de 1 000 µl.
6.3 Bain-marie, munis d'un couvercle ou couverts, thermorégulés, permettant une circulation de l'eau et
maintenant une température constante respectivement de 63 °C ± 1 °C, de 70 °C ± 1°C et de 80 °C ± 1 °C.
6.4 Tubes à essais, d'environ 16 mm de diamètre et de 80 mm de long.
6.5 pH-mètre, d'une précision de ± 0,01 pH, équipé d'une correction automatique de température et d'une
ou de plusieurs électrodes adaptées aux mesurages dans des liquides à 63 °C (c'est-à-dire électrode
en Ag/AgCl).
6.6 Balance analytique, d'une précision de 0,1 mg et d'une lisibilité de 0,01 mg.
6.7 Portoir, permettant de maintenir les tubes à essais (6.4).
7 Échantillonnage
Il convient qu'un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire. Il convient qu'il n'ait été ni endommagé
ni modifié au cours du transport ou du stockage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode indiquée dans la présente Spécification technique. Une
méthode d'échantillonnage recommandée est indiquée dans l'ISO 707|FIL 50.
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