ISO 11866-2:1997
(Main)Milk and milk products — Enumeration of presumptive Escherichia coli — Part 2: Most probable number technique using 4-methylumbelliferyl-beta-D-glucuronide (MUG)
Milk and milk products — Enumeration of presumptive Escherichia coli — Part 2: Most probable number technique using 4-methylumbelliferyl-beta-D-glucuronide (MUG)
Describes a combined method for the enumeration of presumptive Escherichia coli and of presumptive coliforms by means of a culture technique involving a liquid medium with 4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide (MUG), calculation of the number of Escherichia coli per gram or per millilitre by the most probable number (MPN) technique after incubation at 30 °C.
Lait et produits laitiers — Dénombrement d'Escherichia coli présumés — Partie 2: Technique du nombre le plus probable avec utilisation de 4-méthylumbelliféryl-bêta-D-glucuronide (MUG)
La présente partie de l'ISO 11866 prescrit une méthode pour le dénombrement d'Escherichia coli présumés et des coliformes présumés, au moyen de la technique de culture en milieu liquide contenant du MUG et calcul du nombre d'Escherichia coli présumés et/ou des coliformes par gramme ou par millilitre, par la technique du nombre le plus probable (NPP) après incubation à 30 °C. Cette méthode est plus rapide que celle décrite dans l'ISO 11866-1 étant donné que le temps d'incubation est réduit (il n'y a pas d'incubation à 44 °C). Cette méthode est applicable aux -- lait et produits laitiers liquides; -- lait sec, lactosérum sucré sec, babeurre sec et lactose; -- caséine acide, caséine lactique et caséine présure; -- caséinates et lactosérum acide sec; -- fromage et fromages fondus; -- beurre ; -- produits laitiers congelés (y compris les glaces de consommation); -- crème anglaise, desserts et crème. La méthode prescrite dans la présente partie de l'ISO 11866 est la méthode recommandée pour les échantillons supposés contenir un nombre relativement faible d'Escherichia coli présumés et/ou autres coliformes (moins de 100 par gramme ou 10 par millilitre). ATTENTION -- Certaines espèces pathogènes d'Escherichia coli ne se développent pas à 44 °C. Les possibilités d'application de la présente 368partie de l'ISO 11866 sont limitées du fait que cette méthode est sujette à de grandes variations. Il est recommandé d'appliquer cette méthode et d'interpréter les résultats à la lumière des renseignements donnés à l'article 12. NOTE -- Pour référence, les méthodes décrites dans l'ISO 5541-1 s'appliquent pour le dénombrement des coliformes.
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INTERNATIONAL
IS0
STANDARD 11866-2
First edition
1997-02-I 5
Milk and milk products - Enumeration of
presumptive Escherichia coli -
Part 2:
Most probable number technique using
4-methylumbe liferyk~-D-glucuronide (MUG)
Lait et produits laitiers - - Dknombrement d’Escherichia coli p&urn& -
Partie 2: Technique du nombre le plus probable avec utilisation de
4-m&hylumbellif&yl-P -D-glucuronide (MUG)
Reference number
IS0 11866-2: 1997(E)
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IS0 11866-2: 1997(E)
Foreword
IS0 (the international Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (IS0
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through IS0 technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. IS0 collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
This part of IS0 11866 was prepared by Technical Committee ISOnC 34, Agricultural food products, Subcommittee
SC 5, Milk and milk products, in collaboration with the International Dairy Federation (IDF) and AOAC
INTERNATIONAL, and will also be published by these organizations.
IS0 11866 consists of the following parts, under the general title Milk and milk products - Enumeration of
presumptive Escherichia coli:
- Part 1: Most probable number technique
- Par? 2: Most probable number technique using 4-methylumbelliferyl-/W-glucuronide (MUG)
- Pari 3: Colony-count technique at 44 “C using membranes
The method specified in IS0 11866-2 is preferred for samples in which comparatively low numbers of presumptive
fscherichia co/i and/or other coliforms are suspected.
Annex A forms an integral part of this part of IS0 11866. Annex B is for information only.
0 IS0 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
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Internet central @ isoch
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Printed in Switzerland
ii
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INTERNATIONAL STANDARD o IS0 IS0 11866-2: 1997(E)
Milk and milk products - Enumeration of presumptive Escherichia
co/i -
Part 2:
Most probable number technique using
4-methylumbelliferyl-b-D-glucuronide (MUG)
1 Scope
This part of IS0 11866 specifies a combined method for the enumeration of presumptive Escherichia co/i and of
presumptive coliforms by means of a culture technique involving a liquid medium with MUG, and calculation of the
number of presumptive Escherichia co/i and/or coliforms per gram or per millilitre by the most probable number
(MPN) technique after incubation at 30 “C.
It is a more rapid method than that described in IS0 11866-I as the incubation time is reduced (no incubation at
44 “C).
The method is applicable to
- milk, liquid milk products;
- dried milk, dried sweet whey, dried buttermilk, lactose;
- acid casein, lactic casein and rennet casein;
- caseinate and dried acid whey;
- cheese and processed cheese;
- butter;
- frozen milk products (including edible ices);
- custard, desserts and cream.
The method specified in this part of IS0 11866 is preferred for samples in which comparatively low numbers of
presumptive Escherichia co/i and/or other coliforms (less than 100 per gram or IO per millilitre) are suspected.
CAUTION - The applicability of this part of IS0 11866 is limited by the susceptibility of the method to a large
degree of variability. The method should, therefore, be applied and the results interpreted in the light of the
information given in clause 12.
NOTE - The methods described in IS0 5541-I apply for the enumeration of coliforms for reference purposes.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this part of
IS0 11866. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to revision, and
parties to agreements based on this part of IS0 11866 are encouraged to investigate the possibility of applying the
most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and IS0 maintain registers of currently valid
International Standards.
IS0 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for microbiological examinations.
- Preparation of test samples and dilutions for microbiological examination.
I SO 826 1: 1989, Milk and milk products
1
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IS0 11866-2: 1997(E) 0 IS0
3 Definitions
For the purposes of this part of IS0 11866, the following definitions apply.
31 presumptive Escherichia co/i; Bacteria which at 30 “C cleave 4-methyiumbetliferyt-b-D-glucuronide
(l&G), with the production of fluorescence, and which produce indole from tryptophan, under the conditions
specified in this part of IS0 11866.
32 coliforms: Bacteria which at 30 “C cause fermentation of lactose with the production of gas under the
conditions specified in this part of IS0 11866.
4 Principle
4.1 Inoculation of three tubes of double-strength liquid selective enrichment medium [5.3.1 .I a)] with a specified
quantity of test sample if the initial product is liquid, or with a specified quantity of the initial suspension in the case
of other products.
4.2 Inoculation of three tubes of single-strength liquid selective enrichment medium [5.3.1 .I b)] with a specified
quantity of test sample if the initial product is liquid, or with a specified quantity of the initial suspension in the case
of other products.
Then, under the same conditions, inoculation of single-strength medium with specified quantities of decimal dilutions
of the test sample or of the initial suspension.
4.3 Incubation of the tubes of double- and single-strength medium at 30 “C for 24 h to 48 h.
4.4 Identification of those tubes showing fluorescence and formation of indole as positive for presumptive
Escherichia co/i.
4.5 Identification of those tubes showing gas formation as positive for coliforms.
4.6 Determination of the MPN index from the numbers of positive tubes (4.4) of selected dilutions by means of an
MPN table (annex A) and calculation of the most probable number (MPN) of presumptive Escherichia co/i per gram
or per millilitre of the original sample.
4.7 Determination of the MPN index from the numbers of positive tubes (4.5) of selected dilutions by means of an
MPN table (annex A) and calculation of the most probable number (MPN) of coliforms per gram or per millilitre of
the original sample.
5 Dilution fluid, culture media and reagents
5.1 General
For current laboratory practice, see IS0 7218 and IS0 8261.
If the prepared culture media and reagents are not used immediately, they shall, unless otherwise stated, be stored
in the dark at a temperature between 0 “C and +5 “C for no longer than 1 month, under conditions which do not
produce any change in their composition.
5.2 Dilution fluid
See IS0 8261.
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0 IS0 IS0 11866-2: 1997(E)
5.3 Culture media
53.1 Modified lauryl sulfate tryptose broth (selective enrichment medium)
5.3.1.1 Composition
a) b)
Double-strength medium Single-strength medium
Tryptone 4090 g 2&O g
590 g
1090 g
Lactose
Dipotassium hydrogen phosphate (K,HPO,) 53 g 2975 g
Potassium dihydrogen phosphate (KH,PO,) 5s g 2975 g
590 g
1090 g
Sodium chloride
Sodium lauryl sulfate [CH,(CH,),,OSO,Na] 092 g 091 g
091 g
(MUG) 092 g
4-Methylumbelliferyl-P-D-glucuronide
190 g
290 g
Tryptophan
1 000 ml
1 000 ml
Water
5.3.1.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water, by heating if necessary.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is 6,8 at 25 “C.
Transfer the media in quantities of IO ml to tubes of dimensions 16 mm x 160 mm (6.2) containing inverted Durham
tubes (6.3) in the case of single-strength medium, and to test tubes of dimensions 20 mm x 200 mm (6.2) containing
inverted Durham tubes (6.3) in the case of the double-strength medium.
Sterilize for 15 min in the autoclave (6.1) set at 121 “C.
The inverted Durham tubes shall not contain air bubbles after sterilization.
5.4 lndole reagent (Kovacs reagent)
5.4.1 Composition
4-Dimethylaminobenzaldehyde 530 g
75,0 ml
2-Methylbutan-I -01 or pentan-l-01
25,0 ml
Hydrochloric acid (p,, = 1 ,I8 g/ml to 1 ,I 9 g/ml
P
5.4.2 Preparation
Dissolve the 4-dimethylaminobenzaldehyde in the alcohol by heating gently to between 50 “C and 55 “C by means
of the water bath (6.5).
Cool and add the hydrochloric acid.
Protect from light and store at approximately 4 “C. The colour of the reagent shall be light yellow to light brown.
3
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IS0 11866-2: 1997(E)
5.5 Sodium hydroxide solution, c (NaOH) >> 0,5 mol/l.
5.5.1 Composition
Sodium hydroxide
2g
Water 100 ml
5.5.2 Preparation
Dissolve the sodium hydroxide in the water.
6 Apparatus and glassware
For general requirements, see IS0 7218 and IS0 8261. Glassware shall be resistant to repeated sterilization.
Usual microbiological laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 Autoclave, capable of operating at 121 “C - 1 “C.
For details, see IS0 7218.
6.2 Test tubes, of dimensions approximately 16 mm x 160 mm and 20 mm x 200 mm, or flasks or bottles of
suitable capacity.
Test tubes should be checked for absence of autofluorescence before being used.
6.3 Durham tubes, of a size suitable for use in the test tubes (6.2).
6.4 Incubator, capable of maintaining a temperature of 30 “C - 1 “C at all points within it.
6.5 Water bath, capable of operating at between 50 “C and 55 “C.
6.6 Long-wave ultraviolet (UV) lamp, of wavelength between 360 nm and 366 nm, preferably in a UV cabinet or
in a dark room, or covered by a box or a carton which provides dark conditions.
NOTE - Short-wave UV (germicidal) lamps are unsatisfactory.
6.7 pH-meter, accurate to within - 0,l pH units at 25 “C.
6.8 Total-delivery pipettes, with nominal capacities of 1 ml and IO ml.
7 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this part of IS0 11866. A recommended sampling method is given in
IS0 707.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample according to the method given in IS0 8261 g
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0 IS0
IS0 11866-2: 1997(E)
9 Procedure
9.1 Test portion, initial suspension and further dilutions
Prepare the test portion, initial suspension (primary
...
NORME
11866-2
INTERNATIONALE
Première édition
. 1997-02-l 5
,’
Lait et produits laitiers - Dénombrement
d’Escherichia coli présumés -
Partie 2:
Technique du nombre le plus probable avec
utilisation de 4=méthylumbelliféryl-/?-
D-glucuronide (MUG)
Milk and milk products - fnumeration ofpresumptive Escherichia coli -
Pari 2: Most probable number technique using 4-methylumbelliferyl-/3-
D -g/ucuronide (M UG)
Numéro de référence
ISO 17 866-2: 7 997(F)
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ISO 11866-2: 1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
L’ISO collabore étroitement avec la Commission
liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 11866-2 a été élaborée par le comité technique ISOTTC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec la Fédération internationale de laiterie
(FIL) et I’AOAC INTERNATIONAL et sera également publiée par ces organisations.
le titre général Lait et produits laitiers -
L’ISO 11866 comprend les parties suivantes, présentées sous
Dénombrement d’Escherichia coli présumés:
Partie 1: Technique du nombre le plus probable
Partie 2: Technique du nombre le plus probable avec utilisation de 4-méthylumbelliféryl-P-o-glucuronide (MUG)
- Partie 3: Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes à 44 *C
La méthode prescrite dans I’ISO 11866-2 est particulièrement applicable aux échantillons supposés contenir un
nombre relativement faible d’Escherichia coli présumés.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente partie de I’ISO 11866. L’annexe B est donnée uniquement à titre
d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique. ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
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Imprimé en Suisse
ii
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NORME INTERNATIONALE @ ISO ISO 1,1866=2:1997(F)
Lait et produits laitiers - Dénombrement d’Escherichia coli
présumés
Partie 2:
Technique du nombre le plus probable avec utilisation de
4-méthylumbelliféryl-P-D-glucuronide (MUG)
1 Domaine d’application
La présente partie de I’ISO 11866 prescrit une méthode pour le dénombrement d’kcherichia coli présumés et des
coliformes présumés, au moyen de la technique de culture en milieu liquide contenant du MUG et calcul du nombre
d’Escherichia Co/i présumés et/ou des coliformes par gramme ou par millilitre, par la technique du nombre le plus
probable (NPP) après incubation à 30 “C.
Cette méthode est plus rapide que celle décrite dans I’ISO 11866-I étant donné que le temps d’incubation est
réduit (il n’y a pas d’incubation à 44 OC).
Cette méthode est applicable aux
- lait et produits laitiers liquides;
- lait sec, lactosérum sucré sec, babeurre sec et lactose;
- caséine acide, caséine lactique et caséine présure;
- caséinates et lactosérum acide sec;
- fromage et fromages fondus;
- beurre;
- produits laitiers congelés (y compris les glaces de consommation);
- crème anglaise, desserts et crème.
La méthode prescrite dans la présente partie de I’ISO Il 866 est la méthode recommandée pour les échantillons
supposés contenir un nombre relativement faible d’bcherichia Co/i présumés et/ou autres coliformes (moins de 100
par gramme ou 10 par millilitre).
ATTENTION - Certaines espèces pathogènes d’kcherichia Co/i ne se développent pas à 44 “C. Les possibilités
d’application de la présente partie de I’ISO II 866 sont limitées du fait que cette méthode est sujette à de grandes
variations. II est recommandé d’appliquer cette méthode et d’interpréter les résultats à la lumière des
renseignements donnés à l’article 12.
NOTE - Pour référence, les méthodes décrites dans I’ISO 5547-7 s’appliquent pour le dénombrement des coliformes.
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0 ISO
ISO 11866-2: 1997(F)
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de I’ISO II 866. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de I’ISO 11866 sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 7218:1996, Microbiologie des aliments - Règles générales pour les examens microbiologiques.
Préparation des échantillons pour essai et des dilutions en vue de
ISO 8261 :1989, Lait et produits laitiers -
/‘examen microbiologique.
3 Définitions
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 11866, les définitions suivantes s’appliquent.
3.1 Escherichia coli présumés:
Bactéries qui, à 30 OC, séparent le 4-méthylumbelliféryl-@glucuronide (MUG) en émettant une fluorescence et qui
produisent de I’indole à partir du ttyptophane, dans les conditions prescrites dans la présente partie de I’ISO 11866.
3.2 coliformes:
Bactéries qui, à 30 “C fermentent le lactose avec production de gaz, lorsque l’essai est effectué selon la méthode
prescrite dans la présente partie de I’ISO 11866.
4 Principe
4.1 Ensemencement de trois tubes de milieu sélectif liquide d’enrichissement double concentration [voir 53.1 .la)]
avec une quantité déterminée de l’échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou avec une quantité
déterminée de suspension mère dans le cas d’autres produits.
4.2 Ensemencement de trois tubes de milieu sélectif liquide d’enrichissement simple concentration [voir 53.1 .l b)]
avec une quantité déterminée de l’échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou avec une quantité
déterminée de suspension mère dans le cas d’autres produits.
Puis, dans les mêmes conditions, ensemencement du milieu simple concentration [5.3.1 b)] avec des dilutions
mère.
décimales de l’échantillon pour essai ou de la suspension
4.3 Incubation des tubes de milieu double ou simple concentration à 30 “C pendant 24 h à 48 h.
4.4 Identification comme étant positifs pour fscherichia Co/i présumés, des tubes présentant une fluorescence et
une formation d’indole.
4.5 Identification comme étant positifs pour les coliformes, des tubes présentant une formation de gaz.
4.6 Détermination du coefficient NPP d’après le nombre de tubes positifs (4.4) de dilutions choisies, au moyen
d’une table NPP (voir l’annexe A) et calcul du nombre le plus probable (NPP) d’kcherichia Co/i présumés par
gramme ou par millilitre d’échantillon original.
4.7 Détermination du coefficient NPP d’après le nombre de tubes positifs (4.5) de dilutions choisies, au moyen
d’une table NPP (voir l’annexe A) et calcul du nombre le plus probable (NPP) de coliformes par gramme ou par
millilitre d’échantillon original.
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0 ISO
ISO 11866-2: 1997(F)
5 Diluant, milieu de culture et réactifs
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoires, voir I’ISO 7218 et I’ISO 8261.
Si les milieux de culture et les réactifs préparés ne sont pas utilisés extemporanément, ils doivent, sauf indications
contraires, être conservés à l’obscurité à une température située entre 0 “C et + 5 “C pendant 1 mois au maximum,
dans des conditions évitant toute modification de leur composition.
5.2 Diluant
Voir I’ISO 8261.
5.3 Milieux de culture
5.3.1 Bouillon à la tryptose et au lauryl sulfate (milieu sélectif d’enrichissement)
5.3.1 .l Composition
a) W
Milieu double Milieu simple
concentration concentration
Tryptose
4090 g 20,o g
Lactose 1070 g 590 g
Hydrogénophosphate dipotassique (K,HPO,)
5’5 g 275 g
Dihydrogénophosphate de potassium (KH,PO,)
53 g 275 g
Chlorure de sodium
10,o g 590 g
Lauryl sulfate de sodium [CH,(CH,), , OSOsNa] 092 g 091 g
4-Méthylumbelliféryl-P-D-glucuronide (MUG) 02 g 091 g
Tryptophane
290 g 1’0 g
Eau 1 000 ml 1 000 ml
5.3.1.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en chauffant si nécessaire.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 6,8 à 25 “C.
Répartir les milieux, par quantités de 10 ml, dans des tubes de 16 mm x 160 mm (6.2) contenant des cloche de
Durham (6.3) dans le cas du milieu simple concentration, et dans des tubes de 20 mm x 200 mm (6.2) contenant
des cloches de Durham (6.3) dans le cas du milieu double concentration.
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant 15 min.
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de bulles d’air après stérilisation.
3.
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ISO 11866-2: 1997(F)
5.4 Réactif pour la recherche de I’indole (réactif de Kovacs)
5.4.1 Composition
Diméthylamino-4 benzaldéhyde
590 g
75,0 ml
Méthyl-2 butanol-l ou pentanol-1
(pZO = 1,18 g/ml à 1 ,19 g/ml) 250 ml
Acide chlorhydrique
5.4.2 Préparation
Dissoudre le diméthylamino-4 benzaldéhyde dans l’alcool en chauffant doucement entre 50 OC et 55 OC au moyen
du bain d’eau (6.5).
Refroidir et ajouter l’acide chlorhydrique.
Mettre à l’abri de la lumière et conserver à environ 4 “C.
Le réactif doit être de couleur jaune clair à brun clair.
.
5.5 Hydroxyde de sodium, solution, c(NaOH) = 0,5 mol/l.
5.5.1 Composition
Hydroxyde de sodium
2g
100 ml
Eau
5.5.2 Préparation
Dissoudre l’hydroxyde de sodium dans l’eau.
6 Appareillage et verrerie
Voir I’ISO 7218 et NS0 8261 pour les spécifications générales. La verrerie doit résister à des stérilisations répétées.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Autoclave, réglable à 121 OC + 1 OC.
Pour plus de détails, voir I’ISO 7218.
6.1 Tubes à essais, d’environ 16 mm x 160 mm et 20 mm x 200 mm, ou fioles ou flacons de capacités
appropriées.
II convient de vérifier, avant utilisation, que les tubes ne présentent aucune flluorescence propre.
6.2 Cloches de Durham, de dimensions appropriées en vue de leur utilisation dans les tubes (6.2).
6.3 Étuve, permettant de maintenir une température de 30 “C + 1 “C en tous points.
6.4 Bain d’eau, réglable entre 50 “C et 55 OC.
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0 ISO
ISO 11866-2: 1997(F)
6.5 Lampe à ultraviolets (UV) à ondes longues, de longueurs d’ondes comprises entre 360 nm à 366 nm, de
préférence dans une enceinte UV ou une chambre noire, ou couverte d’un dispositif (boîte ou carton) afin de faire le
noir.
Les lampes à ondes courtes (germicides) ne sont pas appropriées.
NOTE -
6.6 pH-mètre, précis à k 0,l unité de pH à 25 “C.
6.7 Pipettes à écoulement total, de 1 ml et 10 ml de capacités nominales.
7 Échantillonnage
II est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode prescrite dans la présente partie de I’ISO II 866. Une méthode
d’échantillonnage recommandée est donnée dans I’ISO 707.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à I’ISO 8261.
9 Mode opératoire
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions
Préparer la prise d’essai, la suspension mère (dilution primaire) et les dilutions décimales su
...
NORME
11866-2
INTERNATIONALE
Première édition
. 1997-02-l 5
,’
Lait et produits laitiers - Dénombrement
d’Escherichia coli présumés -
Partie 2:
Technique du nombre le plus probable avec
utilisation de 4=méthylumbelliféryl-/?-
D-glucuronide (MUG)
Milk and milk products - fnumeration ofpresumptive Escherichia coli -
Pari 2: Most probable number technique using 4-methylumbelliferyl-/3-
D -g/ucuronide (M UG)
Numéro de référence
ISO 17 866-2: 7 997(F)
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ISO 11866-2: 1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
L’ISO collabore étroitement avec la Commission
liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 11866-2 a été élaborée par le comité technique ISOTTC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec la Fédération internationale de laiterie
(FIL) et I’AOAC INTERNATIONAL et sera également publiée par ces organisations.
le titre général Lait et produits laitiers -
L’ISO 11866 comprend les parties suivantes, présentées sous
Dénombrement d’Escherichia coli présumés:
Partie 1: Technique du nombre le plus probable
Partie 2: Technique du nombre le plus probable avec utilisation de 4-méthylumbelliféryl-P-o-glucuronide (MUG)
- Partie 3: Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes à 44 *C
La méthode prescrite dans I’ISO 11866-2 est particulièrement applicable aux échantillons supposés contenir un
nombre relativement faible d’Escherichia coli présumés.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente partie de I’ISO 11866. L’annexe B est donnée uniquement à titre
d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique. ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Internet central @ iso.ch
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
ii
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NORME INTERNATIONALE @ ISO ISO 1,1866=2:1997(F)
Lait et produits laitiers - Dénombrement d’Escherichia coli
présumés
Partie 2:
Technique du nombre le plus probable avec utilisation de
4-méthylumbelliféryl-P-D-glucuronide (MUG)
1 Domaine d’application
La présente partie de I’ISO 11866 prescrit une méthode pour le dénombrement d’kcherichia coli présumés et des
coliformes présumés, au moyen de la technique de culture en milieu liquide contenant du MUG et calcul du nombre
d’Escherichia Co/i présumés et/ou des coliformes par gramme ou par millilitre, par la technique du nombre le plus
probable (NPP) après incubation à 30 “C.
Cette méthode est plus rapide que celle décrite dans I’ISO 11866-I étant donné que le temps d’incubation est
réduit (il n’y a pas d’incubation à 44 OC).
Cette méthode est applicable aux
- lait et produits laitiers liquides;
- lait sec, lactosérum sucré sec, babeurre sec et lactose;
- caséine acide, caséine lactique et caséine présure;
- caséinates et lactosérum acide sec;
- fromage et fromages fondus;
- beurre;
- produits laitiers congelés (y compris les glaces de consommation);
- crème anglaise, desserts et crème.
La méthode prescrite dans la présente partie de I’ISO Il 866 est la méthode recommandée pour les échantillons
supposés contenir un nombre relativement faible d’bcherichia Co/i présumés et/ou autres coliformes (moins de 100
par gramme ou 10 par millilitre).
ATTENTION - Certaines espèces pathogènes d’kcherichia Co/i ne se développent pas à 44 “C. Les possibilités
d’application de la présente partie de I’ISO II 866 sont limitées du fait que cette méthode est sujette à de grandes
variations. II est recommandé d’appliquer cette méthode et d’interpréter les résultats à la lumière des
renseignements donnés à l’article 12.
NOTE - Pour référence, les méthodes décrites dans I’ISO 5547-7 s’appliquent pour le dénombrement des coliformes.
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0 ISO
ISO 11866-2: 1997(F)
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de I’ISO II 866. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de I’ISO 11866 sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 7218:1996, Microbiologie des aliments - Règles générales pour les examens microbiologiques.
Préparation des échantillons pour essai et des dilutions en vue de
ISO 8261 :1989, Lait et produits laitiers -
/‘examen microbiologique.
3 Définitions
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 11866, les définitions suivantes s’appliquent.
3.1 Escherichia coli présumés:
Bactéries qui, à 30 OC, séparent le 4-méthylumbelliféryl-@glucuronide (MUG) en émettant une fluorescence et qui
produisent de I’indole à partir du ttyptophane, dans les conditions prescrites dans la présente partie de I’ISO 11866.
3.2 coliformes:
Bactéries qui, à 30 “C fermentent le lactose avec production de gaz, lorsque l’essai est effectué selon la méthode
prescrite dans la présente partie de I’ISO 11866.
4 Principe
4.1 Ensemencement de trois tubes de milieu sélectif liquide d’enrichissement double concentration [voir 53.1 .la)]
avec une quantité déterminée de l’échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou avec une quantité
déterminée de suspension mère dans le cas d’autres produits.
4.2 Ensemencement de trois tubes de milieu sélectif liquide d’enrichissement simple concentration [voir 53.1 .l b)]
avec une quantité déterminée de l’échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou avec une quantité
déterminée de suspension mère dans le cas d’autres produits.
Puis, dans les mêmes conditions, ensemencement du milieu simple concentration [5.3.1 b)] avec des dilutions
mère.
décimales de l’échantillon pour essai ou de la suspension
4.3 Incubation des tubes de milieu double ou simple concentration à 30 “C pendant 24 h à 48 h.
4.4 Identification comme étant positifs pour fscherichia Co/i présumés, des tubes présentant une fluorescence et
une formation d’indole.
4.5 Identification comme étant positifs pour les coliformes, des tubes présentant une formation de gaz.
4.6 Détermination du coefficient NPP d’après le nombre de tubes positifs (4.4) de dilutions choisies, au moyen
d’une table NPP (voir l’annexe A) et calcul du nombre le plus probable (NPP) d’kcherichia Co/i présumés par
gramme ou par millilitre d’échantillon original.
4.7 Détermination du coefficient NPP d’après le nombre de tubes positifs (4.5) de dilutions choisies, au moyen
d’une table NPP (voir l’annexe A) et calcul du nombre le plus probable (NPP) de coliformes par gramme ou par
millilitre d’échantillon original.
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0 ISO
ISO 11866-2: 1997(F)
5 Diluant, milieu de culture et réactifs
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoires, voir I’ISO 7218 et I’ISO 8261.
Si les milieux de culture et les réactifs préparés ne sont pas utilisés extemporanément, ils doivent, sauf indications
contraires, être conservés à l’obscurité à une température située entre 0 “C et + 5 “C pendant 1 mois au maximum,
dans des conditions évitant toute modification de leur composition.
5.2 Diluant
Voir I’ISO 8261.
5.3 Milieux de culture
5.3.1 Bouillon à la tryptose et au lauryl sulfate (milieu sélectif d’enrichissement)
5.3.1 .l Composition
a) W
Milieu double Milieu simple
concentration concentration
Tryptose
4090 g 20,o g
Lactose 1070 g 590 g
Hydrogénophosphate dipotassique (K,HPO,)
5’5 g 275 g
Dihydrogénophosphate de potassium (KH,PO,)
53 g 275 g
Chlorure de sodium
10,o g 590 g
Lauryl sulfate de sodium [CH,(CH,), , OSOsNa] 092 g 091 g
4-Méthylumbelliféryl-P-D-glucuronide (MUG) 02 g 091 g
Tryptophane
290 g 1’0 g
Eau 1 000 ml 1 000 ml
5.3.1.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en chauffant si nécessaire.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 6,8 à 25 “C.
Répartir les milieux, par quantités de 10 ml, dans des tubes de 16 mm x 160 mm (6.2) contenant des cloche de
Durham (6.3) dans le cas du milieu simple concentration, et dans des tubes de 20 mm x 200 mm (6.2) contenant
des cloches de Durham (6.3) dans le cas du milieu double concentration.
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant 15 min.
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de bulles d’air après stérilisation.
3.
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ISO 11866-2: 1997(F)
5.4 Réactif pour la recherche de I’indole (réactif de Kovacs)
5.4.1 Composition
Diméthylamino-4 benzaldéhyde
590 g
75,0 ml
Méthyl-2 butanol-l ou pentanol-1
(pZO = 1,18 g/ml à 1 ,19 g/ml) 250 ml
Acide chlorhydrique
5.4.2 Préparation
Dissoudre le diméthylamino-4 benzaldéhyde dans l’alcool en chauffant doucement entre 50 OC et 55 OC au moyen
du bain d’eau (6.5).
Refroidir et ajouter l’acide chlorhydrique.
Mettre à l’abri de la lumière et conserver à environ 4 “C.
Le réactif doit être de couleur jaune clair à brun clair.
.
5.5 Hydroxyde de sodium, solution, c(NaOH) = 0,5 mol/l.
5.5.1 Composition
Hydroxyde de sodium
2g
100 ml
Eau
5.5.2 Préparation
Dissoudre l’hydroxyde de sodium dans l’eau.
6 Appareillage et verrerie
Voir I’ISO 7218 et NS0 8261 pour les spécifications générales. La verrerie doit résister à des stérilisations répétées.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Autoclave, réglable à 121 OC + 1 OC.
Pour plus de détails, voir I’ISO 7218.
6.1 Tubes à essais, d’environ 16 mm x 160 mm et 20 mm x 200 mm, ou fioles ou flacons de capacités
appropriées.
II convient de vérifier, avant utilisation, que les tubes ne présentent aucune flluorescence propre.
6.2 Cloches de Durham, de dimensions appropriées en vue de leur utilisation dans les tubes (6.2).
6.3 Étuve, permettant de maintenir une température de 30 “C + 1 “C en tous points.
6.4 Bain d’eau, réglable entre 50 “C et 55 OC.
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0 ISO
ISO 11866-2: 1997(F)
6.5 Lampe à ultraviolets (UV) à ondes longues, de longueurs d’ondes comprises entre 360 nm à 366 nm, de
préférence dans une enceinte UV ou une chambre noire, ou couverte d’un dispositif (boîte ou carton) afin de faire le
noir.
Les lampes à ondes courtes (germicides) ne sont pas appropriées.
NOTE -
6.6 pH-mètre, précis à k 0,l unité de pH à 25 “C.
6.7 Pipettes à écoulement total, de 1 ml et 10 ml de capacités nominales.
7 Échantillonnage
II est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode prescrite dans la présente partie de I’ISO II 866. Une méthode
d’échantillonnage recommandée est donnée dans I’ISO 707.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à I’ISO 8261.
9 Mode opératoire
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions
Préparer la prise d’essai, la suspension mère (dilution primaire) et les dilutions décimales su
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.