Animal and vegetable fats and oils — Cocoa butter equivalents in cocoa butter and plain chocolate — Part 1: Determination of the presence of cocoa butter equivalents

ISO 23275-1:2006 specifies a procedure for the detection of cocoa butter equivalents (CBEs) in cocoa butter and plain chocolate by high-resolution capillary gas liquid chromatography of triacylglycerols and subsequent data evaluation by regression analysis. The method is applicable for the detection of 2 % CBE admixture to cocoa butter, corresponding to about 0,6 % CBE in chocolate (i.e. the assumed fat content of chocolate is 30 %).

Corps gras d'origines animale et végétale — Équivalents au beurre de cacao dans le beurre de cacao et dans le chocolat de ménage — Partie 1: Détermination de la présence d'équivalents au beurre de cacao

L'ISO 23275-1:2006 spécifie un mode opératoire permettant la détection des équivalents au beurre de cacao (EBC) dans le beurre de cacao (BC) et le chocolat de ménage par analyse chromatographique en phase gazeuse/liquide capillaire haute résolution (HR-GC) des triacylglycérols, et l'évaluation ultérieure des données par analyse de régression. La méthode s'applique à la détection de 2 % d'EBC incorporés dans du beurre de cacao, proportion correspondant à environ 0,4 % d'EBC dans le chocolat (dans l'hypothèse d'un taux de matières grasses de ce dernier égal à 30 %).

General Information

Status
Published
Publication Date
25-Oct-2006
Current Stage
9093 - International Standard confirmed
Start Date
28-Jul-2009
Completion Date
16-Jun-2020
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ISO 23275-1:2006 - Animal and vegetable fats and oils -- Cocoa butter equivalents in cocoa butter and plain chocolate
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ISO 23275-1:2006 - Corps gras d'origines animale et végétale -- Équivalents au beurre de cacao dans le beurre de cacao et dans le chocolat de ménage
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23275-1
First edition
2006-11-01
Animal and vegetable fats and oils —
Cocoa butter equivalents in cocoa butter
and plain chocolate —
Part 1:
Determination of the presence of cocoa
butter equivalents
Corps gras d'origines animale et végétale — Équivalents au beurre de
cacao dans le beurre de cacao et dans le chocolat de ménage —
Partie 1: Détermination de la présence d'équivalents au beurre de
cacao
Reference number
ISO 23275-1:2006(E)
ISO 2006
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 23275-1:2006(E)
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Published in Switzerland
ii © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO 23275-1:2006(E)
Contents Page

Foreword............................................................................................................................................................ iv

Introduction ........................................................................................................................................................ v

1 Scope ......................................................................................................................................................1

2 Terms and definitions ...........................................................................................................................1

3 Principle..................................................................................................................................................1

4 Reagents and materials ........................................................................................................................1

5 Apparatus ...............................................................................................................................................2

6 Sampling.................................................................................................................................................2

7 Preparation of test sample....................................................................................................................3

7.1 Preparation of cocoa butter CRM for calibration purposes and system suitability check............3

7.2 Preparation of chocolate sample .........................................................................................................3

8 Procedure ...............................................................................................................................................3

8.1 Fat extraction .........................................................................................................................................3

8.2 Separation of individual triacylglycerols by HR-GC ..........................................................................3

8.3 Identification...........................................................................................................................................3

9 Calculation..............................................................................................................................................4

9.1 Determination of response factors ......................................................................................................4

9.2 Calculation of percentages of triacylglycerols...................................................................................4

9.3 Decision if sample is pure cocoa butter..............................................................................................4

10 Procedural requirements ......................................................................................................................5

10.1 General considerations.........................................................................................................................5

10.2 System suitability ..................................................................................................................................5

11 Precision.................................................................................................................................................5

11.1 Interlaboratory test ................................................................................................................................5

11.2 Repeatability...........................................................................................................................................6

11.3 Reproducibility.......................................................................................................................................6

12 Test report ..............................................................................................................................................6

Annex A (informative) Results of interlaboratory test.....................................................................................7

Bibliography ......................................................................................................................................................12

© ISO 2006 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 23275-1:2006(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 23275-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal

and vegetable fats and oils.

ISO 23275 consists of the following parts, under the general title Animal and vegetable fats and oils — Cocoa

butter equivalents in cocoa butter and plain chocolate:
⎯ Part 1: Determination of the presence of cocoa butter equivalents
⎯ Part 2: Quantification of cocoa butter equivalents
iv © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO 23275-1:2006(E)
Introduction

“Cocoa butter equivalents” is the general term for fats used to replace cocoa butter in chocolate. They

resemble the chemical composition and physical properties of cocoa butter very closely, making them

therefore extremely difficult to quantify and even in some cases to detect. In principle, cocoa butter

equivalents must by definition be fats low in lauric acid, rich in symmetrical mono-unsaturated triacylglycerols

of the type 1,3-dipalmitoyl-2-oleoylglycerol, 1-palmitoyl-2-oleoyl-3-stearoylglycerol and 1,3-distearoyl-2-

oleoylglycerol, miscible with cocoa butter, and obtained only by refining and fractionation.

Within the European Union, the following vegetable fats, obtained from the plants listed below, may be used

[1]
singly or in blends, according to Directive 2000/36/EC :
⎯ illipé, Borneo tallow or tengkawang (Shorea spp.),
⎯ palm oil (Elaeis guineensis, Elaeis olifera),
⎯ sal (Shorea robusta),
⎯ shea (Butyrospermum parkii),
⎯ kokum gurgi (Garcinia indica), and
⎯ mango kernel (Mangifera indica).

This part of ISO 23275 specifies a procedure for the detection of these fats (restrictions are only made for

pure illipé fat samples) in cocoa butter and plain chocolate. ISO 23275-2 specifies a procedure allowing a

reliable quantification of these fats at the level of 5 %, complying with the statutory limit laid down in Directive

[1]
2000/36/EC of the European Parliament and the Council.

To facilitate the usage of both parts of ISO 23275, an analytical toolbox named “CoCal-1” has been

established. “CoCal-1” contains the validated methods for detection (part 1) and quantification (part 2) of

CBEs in plain chocolate, and also a certified cocoa butter reference material (IRMM-801) to calibrate the

analyst’s instruments and an electronic evaluation sheet for Microsoft Excel® to calculate the final result. An

analyst working on CBE detection and quantification has only to calibrate the gas chromatographic separation

system using IRMM-801, separate the triglyceride fractions of the sample in question, and use the electronic

evaluation sheet for subsequent data treatment to detect and quantify CBEs.

Information on “CoCal-1” is available on the website of the Institute for Reference Materials and

Measurements: http://www.irmm.jrc.be.
© ISO 2006 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23275-1:2006(E)
Animal and vegetable fats and oils — Cocoa butter equivalents
in cocoa butter and plain chocolate —
Part 1:
Determination of the presence of cocoa butter equivalents
1 Scope

This part of ISO 23275 specifies a procedure for the detection of cocoa butter equivalents (CBEs) in cocoa

butter (CB) and plain chocolate by high-resolution capillary gas liquid chromatography (HR-GC) of

triacylglycerols and subsequent data evaluation by regression analysis.

The method is applicable for the detection of 2 % CBE admixture to cocoa butter, corresponding to about

0,6 % CBE in chocolate (i.e. the assumed fat content of chocolate is 30 %).
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
cocoa butter equivalents
CBEs

fats detected in cocoa butter and plain chocolate according the procedure specified in this part of ISO 23275

NOTE The result is expressed as a qualitative result, i.e. CBEs present/CBEs not present (YES/NO).

3 Principle

Cocoa butter, or the fat obtained by solvent extraction from plain chocolate, is separated by HR-GC into

triacylglycerol fractions according to their molecular mass and degree of unsaturation. The presence of CBEs

is detected by linear regression analysis applied to individual triacylglycerol fractions of the fat analysed.

4 Reagents and materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise stated.

WARNING — Attention is drawn to the regulations which specify the handling of dangerous matter.

Technical, organizational and personal safety measures shall be followed.
[2]

4.1 Cocoa butter Certified Reference Material (CRM) IRMM-801 , for calibration purposes and system

suitability check.

4.2 Fat solvent, non-chlorinated solvents (e.g. diethyl ether, n-heptane, iso-octane).

© ISO 2006 – All rights reserved 1
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ISO 23275-1:2006(E)
5 Apparatus
5.1 Analytical balance, with a readability of 0,1 mg.
5.2 Drying oven, maintained at 55 °C.
A dry heater block may be used.

5.3 Food grater, i.e. a kitchen blender with a design featuring the motor above the receiving container to

avoid melting the samples .
5.4 Rotary evaporator.
Alternative evaporation procedures may be used.
5.5 Pipettes, of capacity 1 ml.
5.6 Volumetric flasks, of capacity 20 ml.

5.7 Microsyringe, with maximum volume 10 µl, graduated to 0,1 µl, or automatic sampler.

5.8 Gas chromatograph (GC), fitted with a cold on-column injection system and a flame ionization detector

(FID).

Alternative injection systems [e.g. a split injector, a programmed-temperature vaporizer (PTV) or a moving-

needle injector] may be used provided the same results are obtained as indicated in 10.2.

The separation and detection have been found to be satisfactory if the following experimental conditions are

followed:

⎯ GC column: 25 m to 30 m length, with 0,25 mm i.d., fused silica coated with thermostable 50 %

phenylmethylpolysiloxane to a film thickness of 0,1 µm to 0,15 µm.

⎯ temperature programme: 100 °C (initial temperature), programme rate 30 °C/min to 340 °C (final

temperature).
⎯ carrier gas: helium or hydrogen (purity W 99,999 %).

NOTE Suitable columns and alternative experimental conditions, used in an international collaborative study, are

listed in Annex A. Operating conditions may be changed to obtain optimum separation of cocoa butter triacylglycerols.

5.9 Chromatographic data system.
6 Sampling

A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or

changed during transport or storage.

Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 23275. A recommended sampling method is

given in ISO 5555.
1) Philips HR2833 is an example of suitable equipment available commercially.

This information is given for the convenience of the users of this part of ISO 23275 and does not constitute an

endorsement by ISO of this product.
2 © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO 23275-1:2006(E)
7 Preparation of test sample

7.1 Preparation of cocoa butter CRM for calibration purposes and system suitability check

Before opening and using the cocoa butter CRM (4.1), the ampoule shall be warmed in a drying oven (5.2)

until the contents have melted. When a clear solution is obtained, mix the contents by repeated inversion for

not less than 20 s. Then open and transfer the contents to a clean vial, which can be tightly sealed and

preserved in a cool place for future usage.
7.2 Preparation of chocolate sample

Chill approx. 200 g of chocolate until hard, and grate to fine granular condition using a mechanical device (5.3).

Mix thoroughly and preserve in tightly stoppered bottle in a cool place.
8 Procedure
8.1 Fat extraction

Separate the fat from 10 g to 40 g of grated chocolate (as described in 7.2) by extracting with two or three

100 ml portions of a fat solvent (4.2). Centrifuge and decant. Combine the extracts and evaporate most of the

fat solvent (5.4) then finally dry it under a stream of nitrogen.

Alternative extraction procedures may be used (e.g. by Soxhlet, by supercritical carbon dioxide or by using

microwaves) provided that the same results are obtained.
8.2 Separation of individual triacylglycerols by HR-GC

The test samples [cocoa butter, fat extracted from chocolate, cocoa butter CRM (4.1)] shall be warmed in a

drying oven (5.2) until completely melted. If the liquid sample contains sediment, filter the sample inside the

oven to obtain a clear filtrate. Pipettes (or similar equipment) used for transferring the sample during weighing

operations should be brought to a temperature of ca. 55 °C in a drying oven (5.2) in order to avoid partial fat

fractionation.

Weigh ca. 0,2 g of test sample in a 20 ml volumetric flask (5.6) and dilute to the mark with a suitable fat

solvent (4.2). Pipette (5.5) 1 ml of the resulting solution into another 20 ml volumetric flask and dilute to the

mark with the same solvent.

Inject 0,5 µl to 1,0 µl of the final test solution (ρ = 0,5 mg/ml) into the HR-GC system using the cold on-

fat
column injection system.

Alternative sample amounts and injectors may be used provided that the detection system employed gives a

linear response and the system suitability criteria (10.2) are met.
8.3 Identification

Identification of the five major triacylglycerol fractions [1,3-dipalmitoyl-2-oleoylglycerol (POP), 1-palmitoyl-2-

oleoyl-3-stearoylglycerol (POS), 1-palmitoyl-2,3-dioleoylglycerol (POO), 1,3-distearoyl-2-oleoylglycerol (SOS),

and 1-stearoyl-2,3-dioleoylglycerol (SOO)] is made by comparison of the retention times of the test samples

with those of the cocoa butter CRM (4.1). In general, triacylglycerols appear in order of increasing number of

carbon atoms and of increasing unsaturation for the same number of carbon atoms. The elution order of the

triacylglycerols of the cocoa butter CRM is given in the example chromatogram (Figure A.1).

© ISO 2006 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 23275-1:2006(E)
9 Calculation
9.1 Determination of response factors
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 23275-1
Première édition
2006-11-01
Corps gras d'origines animale et
végétale — Équivalents au beurre de
cacao dans le beurre de cacao et dans le
chocolat de ménage —
Partie 1:
Détermination de la présence
d'équivalents au beurre de cacao
Animal and vegetable fats and oils — Cocoa butter equivalents in cocoa
butter and plain chocolate —
Part 1: Determination of the presence of cocoa butter equivalents
Numéro de référence
ISO 23275-1:2006(F)
ISO 2006
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 23275-1:2006(F)
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l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,

veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
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quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit

de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
ii © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 23275-1:2006(F)
Sommaire Page

Avant-propos..................................................................................................................................................... iv

Introduction ........................................................................................................................................................ v

1 Domaine d'application.......................................................................................................................... 1

2 Termes et définitions............................................................................................................................ 1

3 Principe.................................................................................................................................................. 1

4 Réactifs et matériaux............................................................................................................................ 1

5 Appareillage .......................................................................................................................................... 2

6 Échantillonnage .................................................................................................................................... 3

7 Préparation de l’échantillon pour essai.............................................................................................. 3

7.1 Préparation du MRC beurre de cacao pour étalonnage et vérification de l’aptitude du

système.................................................................................................................................................. 3

7.2 Préparation de l’échantillon de chocolat............................................................................................ 3

8 Mode opératoire .................................................................................................................................... 3

8.1 Extraction de la matière grasse........................................................................................................... 3

8.2 Séparation des triacylglycérols individuels par HR-GC ................................................................... 3

8.3 Identification.......................................................................................................................................... 4

9 Calculs ................................................................................................................................................... 4

9.1 Détermination des facteurs de réponse ............................................................................................. 4

9.2 Calcul des pourcentages des triacylglycérols .................................................................................. 4

9.3 Décision relative à la pureté en beurre de cacao de l’échantillon................................................... 5

10 Exigences du mode opératoire ........................................................................................................... 5

10.1 Considérations générales.................................................................................................................... 5

10.2 Aptitude du système............................................................................................................................. 5

11 Fidélité ................................................................................................................................................... 6

11.1 Essai interlaboratoires ......................................................................................................................... 6

11.2 Répétabilité............................................................................................................................................ 6

11.3 Reproductibilité..................................................................................................................................... 6

12 Rapport d’essai ..................................................................................................................................... 6

Annexe A (informative) Résultats d'un essai interlaboratoires..................................................................... 7

Bibliographie .................................................................................................................................................... 13

© ISO 2006 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 23275-1:2006(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée

aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du

comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 23275-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 11,

Corps gras d'origines animale et végétale.

L'ISO 23275 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Corps gras d'origines animale et

végétale — Équivalents au beurre de cacao dans le beurre de cacao et dans le chocolat de ménage:

⎯ Partie 1: Détermination de la présence d'équivalents au beurre de cacao
⎯ Partie 2: Quantification des équivalents au beurre de cacao
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 23275-1:2006(F)
Introduction

L’expression «équivalents au beurre de cacao» est l’expression générale désignant les matières grasses

employées pour remplacer le beurre de cacao dans le chocolat. Leur composition chimique et leurs propriétés

physiques ressemblent très fortement à celles du beurre de cacao, ce qui les rend extrêmement difficiles à

quantifier et même, dans certains cas, à détecter. En principe, les équivalents au beurre de cacao doivent par

définition être des matières grasses pauvres en acide laurique, riches en triacylglycérols monoinsaturés

symétriques de type 1,3-dipalmitoyl-2-oléoyl-glycérol, 1-palmitoyl-2-oléoyl-3-stéaroyl-glycérol et

1,3-distéaroyl-2-oléoyl-glycérol, miscibles avec le beurre de cacao, et obtenues uniquement par raffinage et

fractionnement.

Dans l’Union Européenne, les matières grasses végétales suivantes, obtenues à partir des plantes

énumérées ci-dessous, peuvent être utilisées isolément ou en mélanges, conformément à la

[1]
Directive 2000/36/CE :
⎯ illipé, suif de Bornéo ou tengkawang (Shorea spp.),
⎯ huile de palme (Elaeis guineensis, Elaeis olifera),
⎯ sal (Shorea robusta),
⎯ karité (Butyrospermum parkii),
⎯ kokum gurgi (Garcinia indica), et
⎯ noyaux de mangue (Mangifera indica).

La présente partie de l'ISO 23275 spécifie un mode opératoire pour la détection de ces matières grasses

(seules existent des restrictions pour les échantillons de graisse d’illipé pure) dans le beurre de cacao et dans

le chocolat de ménage. L'ISO 23275-2 spécifie un mode opératoire permettant de réaliser une quantification

fiable de ces matières grasses au taux de 5 %, valeur conforme à la limite statutaire fixée par la

[1]
Directive 2000/36/CE du Parlement européen et du Conseil.

Pour faciliter l’utilisation de ces deux parties de l'ISO 23275, une boîte à outils d’analyse, nommée «CoCal-1»,

a été créée. «CoCal-1» contient, en tête des méthodes validées de détection (partie 1) et de quantification

(partie 2) des équivalents au beurre de cacao dans le chocolat de ménage, un matériau de référence certifié

de beurre de cacao (IRMM-801) permettant d’étalonner les instruments, et une fiche d’évaluation électronique

Microsoft Excel® permettant de calculer le résultat final. L’analyste chargé de la détection et de la

quantification des équivalents au beurre de cacao n’a plus qu’à étalonner le système de séparation par

chromatographie en phase gazeuse à l’aide du matériau de référence certifié IRMM-801, séparer les fractions

de triglycéride de l’échantillon en question, et utiliser la fiche d’évaluation électronique pour le traitement des

données afin de détecter et de quantifier les équivalents au beurre de cacao.

Des informations sur le «CoCal-1» peuvent être trouvées sur le site Internet de l’Institute for Reference

Materials and Measurements: http://www.irmm.jrc.be.
© ISO 2006 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 23275-1:2006(F)
Corps gras d'origines animale et végétale — Équivalents au
beurre de cacao dans le beurre de cacao et dans le chocolat de
ménage —
Partie 1:
Détermination de la présence d'équivalents au beurre de cacao
1 Domaine d'application

La présente partie de l'ISO 23275 spécifie un mode opératoire permettant la détection des équivalents au

beurre de cacao (EBC) dans le beurre de cacao (BC) et le chocolat de ménage par analyse

chromatographique en phase gazeuse/liquide capillaire haute résolution (HR-GC) des triacylglycérols, et

l’évaluation ultérieure des données par analyse de régression.

La méthode s’applique à la détection de 2 % d’EBC incorporés dans du beurre de cacao, proportion

correspondant à environ 0,4 % d’EBC dans le chocolat (dans l’hypothèse d’un taux de matières grasses de ce

dernier égal à 30 %).
2 Termes et définitions

Pour les besoins de la présente Norme internationale, les termes et définitions suivants s'appliquent.

2.1
équivalents au beurre de cacao
EBC

matières grasses détectées dans le beurre de cacao et le chocolat de ménage conformément au mode

opératoire recommandé dans la présente partie de l'ISO 23275

NOTE Le résultat est exprimé sous forme qualitative, à savoir EBC présents/EBC absents (OUI/NON).

3 Principe

Le beurre de cacao, ou la matière grasse obtenue au moyen d’une extraction par solvant à partir de chocolat

de ménage, est séparé en fractions de triacylglycérols par HR-GC en fonction de la masse moléculaire et du

degré d’insaturation de ceux-ci. La présence d’EBC est détectée par une analyse de régression linéaire

effectuée sur les fractions de triacylglycérols individuels issus de la matière grasse analysée.

4 Réactifs et matériaux

Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue, sauf indication contraire.

AVERTISSEMENT — L’attention des lecteurs est attirée sur les règles qui régissent la manipulation

des produits dangereux. Les mesures de sécurité sur les plans technique, organisationnel et

personnel doivent être suivies.
© ISO 2006 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 23275-1:2006(F)
[2]

4.1 Matériau de Référence Certifié (MRC) beurre de cacao IRMM-801 , pour étalonnage et vérification

de l'aptitude du système.

4.2 Solvant d'extraction, solvants non chlorés, par exemple éther diéthylique, n-heptane, iso-octane.

5 Appareillage
5.1 Balance d’analyse, avec une précision de lecture de 0,1 mg.
5.2 Étuve à dessiccation, maintenue à 55 °C
Il est possible d’utiliser un bloc chauffant à chaleur sèche.

5.3 Robot ménager, c'est-à-dire un appareil de cuisine dont le moteur est situé au-dessus du récipient

collecteur afin d’éviter de faire fondre les échantillons .
5.4 Évaporateur rotatif
D’autres méthodes d’évaporation peuvent être employées.
5.5 Pipettes, de 1 ml de capacité.
5.6 Fioles jaugées, de 20 ml de capacité.

5.7 Microseringue, volume maximal de 10 µl avec graduations de 0,1 µl, ou échantillonneur

automatique.

5.8 Chromatographe en phase gazeuse (GC), équipé d’un système d’injection à froid sur colonne et d’un

détecteur à ionisation de flamme (FID).

D’autres systèmes d’injection, par exemple un injecteur à débit divisé, un vaporisateur à température

programmée (VTP), ou un injecteur à aiguille mobile, peuvent être employés à condition que soient obtenus

les mêmes résultats que ceux indiqués en 10.2.

La séparation et la détection se sont avérées satisfaisantes en suivant les conditions expérimentales

ci-dessous:

⎯ colonne GC: 25 m à 30 m de longueur, avec un diamètre intérieur de 0,25 mm, en silice fondue revêtue

de poly(phénylméthylsiloxane) 50 % thermostable, sous forme d’un film d’épaisseur 0,1 µm à 0,15 µm;

⎯ programmation de température: 30 °C/min de 100 °C (température initiale) à 340 °C (température finale);

⎯ gaz vecteur: hélium ou hydrogène (pureté W 99,999 %).

NOTE Des types de colonnes appropriés ainsi que d’autres conditions expérimentales, utilisés lors d’une étude

comparative interlaboratoires internationale, sont énumérés dans l’Annexe A. Il est possible de modifier les conditions de

fonctionnement en vue d’obtenir une séparation optimale des triacylglycérols du beurre de cacao.

5.9 Système de traitement des données chromatographiques.
1) Philips HR 2833 est un exemple de produit disponible sur le marché.

Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs de la présente partie de l'ISO 23275 et

ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit
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ISO 23275-1:2006(F)
6 Échantillonnage

Il convient qu’un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire et qu’il n’ait pas été endommagé ou

modifié au cours du transport ou du stockage.

L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode indiquée dans la présente partie de l'ISO 23275. Une

méthode d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 5555.
7 Préparation de l’échantillon pour essai

7.1 Préparation du MRC beurre de cacao pour étalonnage et vérification de l’aptitude du

système

Avant d’ouvrir et d’utiliser le MRC beurre de cacao (4.1), l’ampoule doit être chauffée dans une étuve à

dessiccation (5.2) jusqu’à ce que son contenu ait fondu. À l’obtention d’une solution limpide, mélanger le

contenu de l’ampoule par retournements successifs pendant au moins 20 s, l’ouvrir et en verser le contenu

dans un flacon propre pouvant être hermétiquement fermé et conservé au froid en vue d’une utilisation

ultérieure.
7.2 Préparation de l’échantillon de chocolat

Réfrigérer environ 200 g de chocolat jusqu’à ce qu’il soit dur, puis le réduire en fins copeaux à l’aide d’un

dispositif mécanique (5.3). Bien mélanger et conserver au froid dans un flacon soigneusement fermé par un

bouchon.
8 Mode opératoire
8.1 Extraction de la matière grasse

Séparer la matière grasse à partir de 10 g à 40 g de chocolat râpé (de la façon décrite en 7.2) par extraction à

l’aide de deux ou trois portions de 100 ml d’un solvant d'extraction (4.2). Centrifuger et laisser décanter.

Réunir les extraits, évaporer (5.4) l’essentiel du solvant d'extraction, puis sécher le résidu sous courant

d’azote.

D’autres méthodes d’extraction peuvent être employées, en utilisant par exemple un extracteur de Soxhlet, le

dioxyde de carbone supercritique ou les micro-ondes, à condition que les mêmes résultats soient obtenus.

8.2 Séparation des triacylglycérols individuels par HR-GC

Les échantillons d’essai [beurre de cacao, matière grasse extraite du chocolat, MRC beurre de cacao (4.1)]

doivent être chauffés dans une étuve à dessiccation (5.2) jusqu’à ce qu’ils aient complètement fondu. Si

l’échantillon liquide contient des sédiments, filtrer l’échantillon à l’intérieur de l’étuve afin d’obtenir un filtrat

limpide. Il convient que les pipettes (ou tout instrument du même type) servant à transférer l’échantillon lors

des opérations de pesée soient amenées à une température d’environ 55 °C dans une étuve à

dessiccation (5.2) afin d’éviter un fractionnement partiel des matières grasses.

Peser environ 0,2 g d’échantillon d’essai dans une fiole jaugée de 20 ml (5.6) et compléter au volume avec un

solvant d'extraction approprié (4.2). Transférer à la pipette (5.5) 1 ml de la solution résultante dans une autre

fiole jaugée de 20 ml et compléter au volume avec le même solvant.

Injecter 0,5 µl à 1,0 µl de la solution d’essai finale (ρ = 0,5 mg/ml) dans le système HR-GC à l’aide du

dispositif d’injection à froid sur colonne.

D’autres quantités d’échantillon et injecteurs peuvent être employés à condition que le système de détection

utilisé fournisse une réponse linéaire et que les critères d’aptitude du système (10.2) soient remplis.

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ISO 23275-1:2006(F)
8.3 Identification

L’identification des cinq fractions principales de triacylglycérols [le 1,3-dipalmitoyl-2-oléoylglycérol (POP),

le 1-palmitoyl-2-oléoyl-3-stéaroylglycérol (POS), le 1-palmitoyl-2,3-dioléoyl-glycérol (POO), le 1,3-distéaroyl-

2-oléoylglycérol (SOS), et le 1-stéaroyl-2,3-dioléoyl-glycérol (SOO)] se fait en comparant les temps de

rétention des échantillons d’essai avec ceux du MRC beurre de cacao (4.1). En général, l’ordre d’apparition

des triacylglycérols suit un nombre d’atomes de carbone croissant et, pour un même nombre d’atomes de

carbone, un degré d’insaturation croissant. L’ordre d’élution des triacylglycérols du MR

...

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