ISO 6579:1990
(Main)Microbiology — General guidance on methods for the detection of Salmonella
Microbiology — General guidance on methods for the detection of Salmonella
Microbiologie — Directives générales concernant les méthodes de recherche des Salmonella
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
IS0
INTER NATIONAL
6579
STANDARD
Second edition
1990-06-01
Microbiology - General guidance on methods
for the detection of Salmonella
Microbiologie - Directives générales concernant les méthodes de recherche des
Salmonella
Reference number
IS0 6579 : 1990 (E)
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IS0 6579 : 1990 (E)
Contents Page
Foreword . iii
Introduction . iv
1 Scope . 1
2 Defihitions. . . . . , . . . . . . . . , . , . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
3 Principle . 1
4 Culture media, reagents and sera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . 1
3
5 Apparatus and glassware . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6 Sampling. . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . 3
7 Preparation of the test sample . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
8 Procedure . 3
9 Expression of results , . . . . . . . , . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
7
10 Testrepo .
11 Quality assurance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Annexes
a
A 8
Diagram of procedure. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B Composition and preparation of culture media and reagents . . . . . . . . . . . . . . . 9
C Specification for brilliant green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
15
D Standard method of streaking agar medium dishes . . . . . . . . . . . , . , . , . . . . . . .
O IS0 1990
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any
means, electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in
writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 CH-I211 Genève 20 O Switzerland
Printed in Switzerland
ii
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IS0 6579 : I990 (E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national standards bodies (IS0 member bodies). The work of preparing International
Standards is normally carried out through IS0 technical committees. Each member
body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for voting. Publication as an International Standard requires
approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
international Standard IS0 6579 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34,
Agricultural food products.
This second edition cancels and replaces the first edition (IS0 6579 : 1981 ), of which it
constitutes a technical revision.
Annexes A, B and C form an integral part of this international Standard. Annex D is for
information only.
iii
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IS0 6579 : 1990 (E)
Introduction
This International Standard is intended to provide general guidance for the examin-
ation of products not dealt with by existing International Standards and for the
consideration of bodies preparing reference microbiological methods of test for
application to foods or to animal feeding stuffs. Because of the large variety of pro-
ducts within this field of application, these guidelines may not be appropriate for some
it may be necessary to use different
products in every detail, and for other products
methods. Nevertheless, it is hoped that in all cases every attempt will be made to apply
the guidelines provided as far as possible and that deviations from them will only be
made if absolutely necessary for technical reasons.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken of all infor-
mation then available regarding the extent to which the guidelines have been followed
and the reasons for deviation from them in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and, for certain groups of
products, International Standards and/or national standards may already exist that do
not comply with these guidelines. In cases where International Standards already exist
for the product to be tested, they should be followed I), but it is hoped that when such
standards are reviewed they will be changed to comply with this International Standard
so that, eventually, the only remaining departures from these guidelines will be those
necessary for well-established technical reasons.
11 For meat and meat products, see IS0 3565 : 1975, Meat and meat products - Detection of
Salrnonellæ (Reference method). For milk and milk products, see IS0 6785 : 1985, Mi/k and milk
- Detection of Salmonella.
products
iv
I
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INTERNATIONAL STANDARD IS0 6R9 : 1990 (E)
Microbiology - General guidance on methods for the
detection of Salmonella
WARNING - In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for detecting Salmonella are
onlv undertaken in properlv equipped laboratories, under the control of a skilled microbiologist, and that great care is
. . .
taken in the disposal of all incubated materials.
1 Scope Incubation of the magnesium chloride malachite green medium
at 42 OC, and incubation of the selenite cystine medium at the
This International Standard gives general guidance on methods
specified temperature (see 8.3.2) for 18 h to 24 h.
for the detection of Salmonella.
Subject to the limitations discussed in the introduction, this 3.3 Plating out and recognition
International Standard is applicable to products intended for
human consumption or feeding of animals.
From the cultures obtained in 3.2, inoculation of two selective
solid media :
2 Definitions
- brilliant green/phenol red agar, unless the International
Standard appropriate to the product to be examined, or
For the purposes of this International Standard, the following
other specific considerations (for example the isolation of
definitions apply.
lactose-positive Salmonella), require substitution of some
other medium as the one for obligatory use;
2.1 Salmonella : Micro-organisms which form typical col-
onies on solid selective media and which display the bio-
-
any other solid selective medium (see 4.2.4.2).
chemical and serological characteristics described when tests
are carried out in accordance with this International Standard.
Incubation at the specified temperature (see 8.4.51, and
examination after 24 h and, if necessary, after 48 h to check for
2.2 detection of Salmonella : Determination of the pres-
the presence of colonies which, from their characteristics, are
ence or absence of these micro-organisms, in a particular mass
considered to be presumptive Salmonella.
of product, when tests are carried out in accordance with this
International Standard.
3.4 Confirmation
3 Principle
Subculturing of colonies of presumptive Salmonella, plated out
as described in 3.3, and confirmation by means of appropriate
In general, the detection of Salmonella necessitates four suc-
biochemical and serological tests.
cessive stages (see also annex A). 1)
3.1 Pre-enrichment in non-selective liquid
4 Culture media, reagents and sera
medium
4.1 Basic materials
Inoculation of buffered peptone water (also used as diluent)
with the test portion, and incubation at the specified tempera-
In order to improve the reproducibility of the results, it is
ture (see 8.21 for 16 h to 20 h.
recommended that dehydrated basic components or complete
dehydrated media be used for the preparation of culture media.
3.2 Enrichment in selective liquid media
The manufacturer's instructions shall be rigorously followed.
Inoculation of a magnesium chloride malachite green medium
and of a selenite cystine medium with the culture obtained The chemicals used for preparing the culture media and the
in 3.1. reagents shall be of recognized analytical grade.
1 i Sa/mone/ia may be present in small numbers and are often accompanied by considerably larger numbers of other members of Enterobacteriaceae
or of other families. Therefore, selective enrichment is necessary; furthermore, pre-enrichment is often necessary to permit detection of injured
Salmonella.
1
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IS0 ô579 : 1990 (E)
4.2.7 Urea agar (Christensen).
The water used shall be distilled or deionized water, and shall
be free from substances that might inhibit growth of micro-
organisms under the test conditions. See clause 8.7.
Measurements of pH shall be carried out by means of the pH-
4.2.8 Lys'lne decarboxylation medium.
meter (5.8), measurements being referred to a temperature of
1
25 OC.
See clause/8.8.
If the prepared culture media and prepared reagents are not
used immediately, they shall, unless otherwise specified, be
gent for detection of @-galactosidase (or pre-
kept in the dark at a temperature between O OC and 5 OC, but
discs, used in accordance with the manufac-
for no longer than 1 month, and in conditions that prevent any
change in their composition.
4.2 Culture media and reagents
for Voges-Proskauer reaction.
NOTE - Because of the large number of culture media and reagents,
it has been considered preferable, for the clarity of the text, to give
their Composition and preparation in annex B.
Non-selective pre-enrichment medium : buffered
4.2.1
peptone water.
See clause B. 1.
4.2.2 First selective enrichment medium : Rappaport-
Vassiliadis magnesium chloride malachite green medium
4.2.10.4 Potassium hydroxide solution.
(RV medium).
See clause 8.2.
4.2.11 qeagents for indole reaction.
4.2.3 Second selective enrichment medium : selenite
cystine medium.
medium (by Ljutov).
See clause 8.3.
4.2.4 Selective solid plating-out media.
4.2.4.1 First medium : phenol red/brilliant green agar
(Ede1 and Kampelmacher).
See clause 6.12.
See clause 8.4.
4.2.13 Saline solution.
This first medium is compulsory unless otherwise stated
(see 3.3).
See clause 6.13.
4.2.4.2 Second medium.
4.3 Sera
is left to the discretion of the
The choice of the second medium
Several types of agglutinant sera containing antibodies for one
testing laboratory, unless there is a specific International Stan-
or several O-antigens are available commercially, i.e. anti-sera
dard, relating to the product to be examined, which specifies
containiig one or more "O" groups (called monovalent or
the composition of this second medium.
polyvaleqt anti-0 sera), anti-Vi sera, and anti-sera containing
antibodies for one or several H-factors (called monovalent or
4.2.5 Nutrient agar.
See clause 0.5.
made to ensure that the anti-sera used
for the detection of all Salmonella
4.2.6 Triple sugar/iron agar (TSI agar). this objective may be obtained
a supplier recognized as com-
See clause 8.6. government agency).
2
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IS0 6579 : 1990 (E)
5 Apparatus and glassware 5.9 Culture bottles or flaskd), for sterilization and storage
of culture media and incubation of liquid media.
NOTE - Disposable apparatus is an acceptable alternative to reusable
glassware if it has suitable specifications.
5.10 Culture tubes, 8 mm in diameter and 160 mm in
Usual microbiological laboratory equipment and, in particular,
length, for the lysine decarboxylation medium.
the following.
5.11
Measuring cylinders, for preparation of the complete
5.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet steril-
media.
ization (autoclave), (autoclave either operating separately or
being part of a general apparatus for the preparation and
5.12 Graduated pipettes, of nominal capacities 10 ml and
distribution of media).
1 ml, graduated respectively in 0,5 ml and 0,l ml divisions.
Sterilize apparatus that will come into contact with the diluent,
the culture media or the sample, particularly plastic apparatus,
5.13 Petri dishes, of small size (90 mm to IC@ mm) andlor
except for apparatus that is supplied sterile, by one of the
large size (140 mm).
following methods:
a) in the oven by maintaining it at 170 OC to 175 OC for not
6 Sampling
less than 1 h;
Carry out sampling in accordance with the specific Inter-
b) in the autoclave by maintaining it at 121 OC f 1 OC for
not less than 20 min. national Standard appropriate to the product concerned. If
there is no specific International Standard, it is recommended
An autoclave is also necessary for the sterilization of culture
that the parties concerned come to an agreement on this
media and reagents. It shall be capable of being controlled at
subject .
121 OC f 1 OC, and at 115 OC f 1 OC, as indicated in annex B.
5.2 Drying cabinet or oven, ventilated by convection (for
7 Preparation of the test sample
drying the surface of agar plates), capable of being controlled
See the specific International Standard appropriate to the pro-
at 50 OC t 1 OC.
duct concerned. If there is no specific International Standard, it
is recommended that the parties concerned come to an agree-
5.3 Oven, capable of being controlled at 35 OC f 1 OC or
ment on this subject.
37 OC f 1 OC, depending on the temperature adoptedl) (for
maintaining the inoculated media, plates and tubes within one
of these temperature ranges).
8 Procedure
5.4 Water-bath, capable of being controlled at
8.1 Test portion and initial suspension
42,O OC f 0,l OC, or oven, capable of being controlled at
42,O OC f 0,5 OC (for maintaining inoculated liquid media
Refer to the International Standard appropriate to the product
within one of these temperature ranges).
under examination.
5.5 Water-baths (for heating and cooling solutions and
For preparation of the initial suspension, use as diluent the pre-
culture media to the appropriate temperatures), capable of
enrichment medium specified in 4.2.1.
being controlled at 45 OC f 1 OC, 55 OC f 1 OC and
70 OC f 1 OC.
In general, to prepare the initial suspension, add a 25 g test por-
tion to 225 ml of pre-enrichment medium (4.2.11, which is the
5.6 Water-bath, capable of being controlled at ratio of test portion to pre-enrichment medium specified in this
method. 3)
35 OC f 1 OC or 37 OC f 1 OC, depending on the tempera-
ture adopted 1).
If the prescribed test portion is other than 25 g, use the
necessary quantity of pre-enrichment medium to yield approxi-
5.7 Loops, made of platinum-iridium or nickel-chromium, of
mately a 1 : 10 dilution (mass to volume).
diameter approximately 3 mm.
NOTE - Dried, powdered, food products may need a special rehydra-
5.8 pH-meter, having an accuracy of calibration of
tion procedure to enhance the recovery of Salmonella. Two techniques
I 0,l pH unit at 25 OC. may be used for this purpose, that of immersion and that of agitation.
11 The temperature should be agreed between the parties concerned and recorded in the test report.
21 Bottles or flasks with non-toxic metal screw-caps may be used.
g test portion from a specified lot of food has to be examined, and when evidence is
31 To reduce the examination workload when more than one 25
available that compositing (pooling the test portions) does not affect the result for that particular food, the test portions may be composited. For
example, if 10 test portions of 25 g are to be examined, combine the 10 units to form a composite test portion of 250 g and add 2,25 litres of pre-
enrichment broth. Alternatively, the 0,l ml (RV medium) and 10 ml (selenite cystine medium) portions of the pre-enrichment broths from the
10 separate test portions (8.3.1) may be composited for enrichment in 0,l litre and 1 litre respectively of selective enrichment medium.
3
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IS0 6579 : 1990 (E)
Refer for this purpose to the International Standard appropriate to the
product under examination. If such a standard is not available, it is
recommended that the parties concerned come to an agreement on
this subject.
8.4.4 Aft Ir a total incubation period of 48 h (see 8.3.2 and
8.2 Non-selective pre-enrichment
8.4.31, repeat the procedure described in 8.4.1 to 8.4.3 using
the two inoculated enrichment media.
Incubate the initial suspension at the specified temperature, i.e.
at 35 OC or 37 OCI), for not less than 16 h and not more than
20 h.
8.4.5 After incubation for 20 h to 24 h, examine the dishes
Salmonella.
(8.4.4) for the presence of typical colonies of
8.3 Selective enrichment
Typical CO onies of Salmonella grown on phenol red/brilliant
green agar cause the colour of the medium to change from pink
8.3.1 Transfer 0,l ml of the culture obtained in 8.2 to a tube
to red.
containing 10 ml of the RV medium (4.2.2); transfer another
10 ml of the culture obtained in 8.2 to a flask containing 100 ml
2).
of selenite cystine medium (4.2.3) 8.4.6 If growth is slight or if no typical colonies of Salmonella
are presen I , reincubate at 35 OC or at 37 OC 1) for a further 18 h
8.3.2 Incubate the two inoculated media (8.3.1) for 18 h to to 24 h.
24 h as follows :
Re-exami e the plates for the presence of typical colonies of
a) the inoculated RV medium at 42 OC;
SaImonelJ.
b) the inoculated selenite cystine medium at the specified
temperature, i.e. at 35 OC or 37 OC1)3).
8.4 Plating out and identification
Sa/mone//a anti-serum may facilitate recognition
8.4.1 After incubation (see 8.3.2) for 18 h to 24 h, take, by
means of a loop (5.71, a streak from the culture in the RV
the surface of one large-size Petri dish
medium, and inoculate
containing the first selective plating-out medium (generally the
phenol red/brilliant green agar, see 4.2.4.11, so that well-
isolated colonies will be obtained.
8.5.1 S lection of colonies for confirmation
In the absence of large dishes, use two small dishes, one after
the other, using the same loop (see the note).
For conf rmation, take from each plate of each selective
medium see 8.4.5 and 8.4.6), five colonies considered to be
Proceed in the same way with the second selective plating-out
typical or1 i suspect.
medium (4.2.4.2) using a new loop and Petri dishes of ap-
propriate size.
If on one plate there are fewer than five typical or suspect
colonies, take for confirmation all the typical or suspect col-
NOTE - The following method of streaking is recommended when
onies.
phenol recUbrilliant green agar is used. Use one loop (5.7) for two
dishes. Take a droplet from the edge of the surface of the fluid.
Inoculate both dishes according to the two diagrams in annex D. Use
Streak t le selected colonies onto the surface of pre-dried
the whole dish; loop streaks should be spaced about 0,5 cm apart. (Do
nutrient 3gar plates (4.2.51, in a manner which will allow well-
not flame the loop or recharge it after making the first streak, nor when
isolated i;olonies to develop.
passing to the second dish.) When only one large dish is used, the
method of streaking should be as indicated for the first dish in annex D.
Incubate the inoculated plates at 35 OC or 37 OC?) for 18 h to
24 h.
8.4.2 Using the culture in the selenite cystine medium, repeat
the procedure described in 8.4.1 with the two selective plating-
Use pur I cultures for biochemical and serological confirmation.
out media.
enrichment medium.
10 separate test portions (8.3.1) may be composited for enrichment in 0,l litre
be indicated in the test report.
4
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IS0 6579 : 1990 (E)
Incubate for 24 h at 35 OC or 37 'Cl).
8.5.2 Biochemical confirmation
By means of an inoculating wire, inoculate the media specified A purple colour after incubation indicates a positive reaction.
in 8.5.2.1 to 8.5.2.6 with each of the cultures obtained from the
colonies selected in 8.5.1. A yellow colour indicates a negative reaction.
8.5.2.1 TSI agar (4.2.6)
8.5.2.4 Reagent for detection of fi-galactosidase (4.2.9)
Streak the agar slope surface and stab the butt.
Suspend a loopful of the suspected colony in a tube containing
0,25 ml of the saline solution (4.2.13).
Incubate for 24 h at 35 OC or 37 'Cl).
Add 1 drop of toluene and shake
...
NORME
IS0
I NTE R NATIONALE
6579
Deuxième édition
1990-06-01
Microbiologie - Directives générales
concernant les méthodes de recherche des
Saîmone//a
Microbiology - General guidance on methods for the detection of Salmonella
Numéro de référence
IS0 6579 : 1990 (Fi
---------------------- Page: 1 ----------------------
Sommaire
Page
Introduction .
1 Domaine d'application .
2 Définitions. .
...........................................................
3 Principe 1
4 Milieux de culture, réactifs et sérum . 1
5 Appareillage et verrerie .
3
I
6 Échantillonnage . 3
I
7 Préparation de l'échantillon pour essai . 3
8 Modeopératoire. . 3
9 Expression des résultats . 7
10 Rapport d'essai .
11 Assurance de la qualité . 7
Annexes
A Schéma du mode opératoire . 8
9
Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs .
B
C Spécifications pour le vert brillant. . 14
15
Méthode normalisée d'isolement en stries sur boîtes de milieu gélosé .
D
O IS0 1990
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni
utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 0 CH-I211 Genève 20 0 Suisse
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
IS6 6579 : 1990 (FI
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de I'ISO). L'élaboration
des Normes internationales est en général confiée aux comités techniques de I'ISO.
Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec 1'1S0 participent également aux travaux. L'ISO col-
labore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales
75 % au moins des comités membres votants.
requiert l'approbation de
IS0 6579 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
La Norme internationale
Produits agricoles alimentaires.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (IS0 6579 : 19811, dont
elle constitue une révision technique.
Les annexes A, B et C font partie intégrante de la présente Norme internationale.
L'annexe D est donnée uniquement à titre d'information.
iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
IS0 6579 : 1990 (FI
Introduction
La présente Norme internationale se propose de fournir des directives générales pour
l‘examen des produits non concernés dans les Normes internationales existant actuel-
lement et pour être prises en considération par les organismes élaborant des méthodes
d‘essai microbiologiques de référence destinées à être appliquées à des produits ali-
à des aliments pour animaux. En raison de la grande diversité des pro-
mentaires ou
duits entrant dans ce domaine d’application, il est possible que ces directives, dans
tous leurs détails, ne conviennent pas exactement à certains produits et que, pour cer-
tains autres produits, il puisse être nécessaire d’employer des méthodes différentes.
Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les cas, tous les efforts seront faits pour
appliquer, chaque fois qu‘il sera possible, les directives données et qu’on n’aura
recours à des dérogations que si cela est absolument nécessaire pour des raisons tech-
niques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu compte de tous
les renseignements disponibles à ce moment-là, à savoir dans quelle mesure les directi-
ves auront été suivies et les raisons pour lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger
dans le cas de produits particuliers.
L‘harmonisation des méthodes d‘essai ne peut pas être immédiate et, pour certains
groupes de produits, des Normes internationales etlou des normes nationales existent
peut-être déjà, qui ne concordent pas avec ces directives. Dans le cas où des Normes
internationales existent déjà pour le produit à contrôler, elles devront être appliquéesl),
mais il serait souhaitable que, lorsqu’elles viendront en révision, elles soient modifiées
de façon à se conformer à la présente Norme internationale si bien que, finalement, les
seules divergences restantes seront celles qui auront été nécessaires pour des raisons
techniques bien établies.
1) Pour la viande et les produits à base de viande, voir IS0 3565 : 1975, Viandes et produitas h
base de viande - Recherche des Salmonellæ (Méthode de référence/. Pour le lait et les produits
laitiers, voir IS0 6785 : 1985, Lait et produits laitiers - Recherche des Salmonella.
iv
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORM E I NTE R NAT1 0 NA LE
IS0 6579 : 1990 (Fi
Microbiologie - Directives générales concernant les
méthodes de recherche des Salmonella
PRÉCAUTIONS - Afin de sauvegarder la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que les essais de recherche
des Salmonella ne soient réalisés que dans les laboratoires équipés & cet effet et sous la surveillance d'un microbiologiste
expérimenté, et qu'un grand soin soit pris pour se débarrasser des éléments incubés.
1 Domaine d'application
Incubation du bouillon de vert malachite au chlorure de magné-
sium à 42 OC et incubation du bouillon au sélénite-cystine à la
La présente Norme internationale donne des directives généra-
température spécifiée (voir 8.3.2) durant 18 h à 24 h.
les concernant les méthodes de recherche des Salmonella.
3.3 isolement et identification
Compte tenu des remarques signalées dans l'introduction, la
présente Norme internationale est applicable aux produits des-
A partir des cultures obtenues en 3.2, ensemencement de deux
tinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale.
milieux sélectifs solides :
- gélose au rouge de phénol et au vert brillant, à moins
2 Définitions
que la Norme internationale concernant le produit à exami-
ner ou toute autre considération spécifique (par exemple
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les défini-
isolement de Salmonella lactose positif) ne nécessite la
tions suivantes s'appliquent.
substitution d'un autre milieu obligatoire;
2.1 Salmonella : Micro-organismes formant des colonies
-
un autre milieu sélectif solide (voir 4.2.4.2).
typiques sur des milieux sélectifs solides et possédant les carac-
téristiques biochimiques et sérologiques décrites lorsque l'essai
Incubation à la température spécifiée (voir 8.4.51, puis examen
est exécuté selon la présente Norme internationale.
après 24 h et, si nécessaire, après 48 h, pour contrôler si l'on
est en présence de colonies présumées être des Salmonella, en
2.2 recherche des Salmonella : Détermination de la pré-
raison de leurs caractéristiques.
sence ou de l'absence de ces micro-organismes, dans une
quantité déterminée de produit, lorsque l'essai est exécuté
3.4 Confirmation
selon la présente Norme internationale.
Repiquage des colonies présumées de Salmonella isolées en
3.3, et confirmation au moyen des essais biochimiques et séro-
3 Principe
logiques appropriés.
En général, la recherche de Salmonella nécessite quatre phases
successives (voir également annexe A). 1)
4 Milieux de culture, réactifs et sérum
3.1 Préenrichissement en milieu non sélectif
liquide 4.1 Composants de base
Ensemencement de la prise d'essai dans Veau peptonée tam-
Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recom-
ponnée (servant également de diluant), puis incubation à la
mandé d'utiliser, pour la préparation des milieux de culture, des
température spécifiée (voir 8.2) durant 16 h à 20 h.
composants de base déshydratés ou des milieux complets
déshydratés. Les prescriptions du fabricant doivent être suivies
scrupuleusement.
3.2 Enrichissement en milieux sélectifs liquides
Ensemencement d'un bouillon de vert malachite au chlorure de Les produits chimiques utilisés pour la préparation des milieux
magnésium et d'un bouillon au sélénite-cystine avec la culture de culture et des réactifs doivent être de qualité analytique
obtenue en 3.1. reconnue.
1) Les Salmonella peuvent, en effet, être présentes en petit nombre et sont souvent accompagnées d'un nombre beaucoup plus grand d'autres
micro-organismes appartenant à la famille des Enterobacteriaceae ou à d'autres familles. En conséquence, un enrichissement sélectif est nécessaire;
de plus, un préenrichissement est aussi souvent nécessaire afin de pouvoir rechercher les Salmoneiia ayant subi une altération.
1
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4.2.7 Gélose à l'urée (Christensen).
L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou déionisée, exempte
de substances susceptibles d'inhiber la croissance des micro-
organismes dans les conditions de l'essai. Voir article 6.7.
Les mesures de pH doivent être effectuées au moyen du
4.2.8 Milieu pour décarboxylation de la lysine.
pH-mètre (5.8) réglé à la température de 25 OC.
Voir article 6.8.
Si les milieux de culture préparés et les réactifs préparés ne sont
pas utilisés extemporanément, ils doivent, sauf spécifications
4.2.9 Réactif pour la recherche de la P-galactosidase (ou
contraires, être conservés à l'obscurité entre O OC et 5 OC, pen-
disques de papier tout préparés, utilisés selon les instruc-
dant 1 mois au maximum, dans des conditions évitant toute
tions du fabricant).
modification de leur composition.
Voir article 6.9.
4.2 Milieux de culture et réactifs
4.2.10 Réactifs pour la réaction de Voges-Proskauer.
NOTE - En raison du nombre important de milieux de culture et de
réactifs. il a été iuaé aréférable, pour la clarté du texte, de donner leur
.-.
Voir article 6.10.
compoSition et leur préparation dans l'annexe B.
4.2.10.1 Milieu VP.
4.2.1 Milieu de préenrichissement non sélectif eau
peptonée tamponnée.
4.2.10.2 Solution de créatine (N-amidinosarcosine).
Voir article B. 1.
4.2.10.3 Solution éthanolique de naphtol-I.
4.2.2 Premier milieu d'enrichissement sélectif : bouillon
au vert malachite au chlorure de magnésium (milieu RV).
4.2.10.4 Solution d'hydroxyde de potassium.
Voir article 8.2.
4.2.11 Réactifs pour la recherche de I'indole.
4.2.3 Deuxième milieu d'enrichissement sélectif : bouil-
Voir article B. 11.
lon au sélénite-cystine.
4.2.11.1 Milieu tryptone-tryptophane (de Ljutov).
Voir article 6.3.
4.2.11.2 Réactif de Kovacs.
4.2.4 Milieux d'isolement solides sélectifs.
4.2.12 Gélose nutritive semi-solide.
4.2.4.1 Premier milieu : gélose au rouge de phénol et au
vert brillant (Ede1 et Kampelmacher).
Voir article 6.12.
Voir article B.4.
4.2.13 Solution saline.
Ce premier milieu est obligatoire sauf indications contraires
(voir 3.3).
Voir article 8.13.
4.2.4.2 Deuxième milieu.
4.3 Sérums
Le choix du deuxième milieu est laissé ei l'initiative du labora-
On peut trouver dans le commerce plusieurs types de sérums
toire d'essais, sauf s'il existe une Norme internationale spécifi-
agglutinants contenant des anticorps contre un ou plusieurs
que concernant le produit à examiner et spécifiant la composi-
facteurs antigéniques O, c'est-à-dire des anti-sérums contenant
tion de ce deuxième milieu.
«O» (dénommés anti-sérums (
un ou plusieurs groupes
monovalents ou polyvalents), des anti-sérums Vi et des anti-
sérums contenant des anticorps contre un ou plusieurs facteurs
4.2.5 Gélose nutritive.
«H» (dénommés anti-sérums «HH monovalents ou polyvalents).
Voir article 8.5.
Tous les efforts devront être faits afin de s'assurer que les anti-
sérums utilisés conviennent pour la recherche de tous les
4.2.6 Gélose au citrate de fer et aux trois sucres sérotypes de Salmonella. Dans ce but, on pourra se servir
d'anti-sérums préparés par un fournisseur dont la compétence
(gélose TSII.
est reconnue (par exemple un organisme gouvernemental
approprié).
Voir article B.6.
2
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5 Appareillage et verrerie 5.9 Flacons de culturez), pour la stérilisation et la conser-
vation des milieux de culture et l'incubation des milieux liquides.
NOTE - Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que
la verrerie réutilisable, si les spécifications sont similaires.
5.10 Tubes de culture, de 8 mm de diamètre et 160 mm de
longueur, pour le milieu de décarboxylation à la lysine.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie, et notamment:
5.11
Éprouvettes graduées, pour la préparation des milieux
5.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche complets.
(four) ou en chaleur humide (autoclave), (autoclave auto-
5.12 Pipettes graduées, de 10 ml et 1 ml de capacités
nome ou faisant partie d'un appareillage pour préparer et répar-
nominales, graduées respectivement en 0,5 ml et 0,l ml.
tir les milieux).
Le matériel destiné à entrer en contact avec le diluant, les 5.13 Boîtes de Petri, de petites dimensions (90 mm à
milieux de culture et l'échantillon, sauf s'il est livré stérile (parti- 100 mm) et/ou de grandes dimensions (140 mm).
le matériel en plastique), doit être stérilisé par l'une
culièrement
des méthodes suivantes:
6 Échantillonnage
-
soit au four en le maintenant à une température de
Effectuer l'échantillonnage conformément à la Norme interna-
170 OC à 175 OC pendant au moins 1 h;
tionale spécifique du produit concerné. S'il n'y a pas de Norme
internationale spécifique disponible, il est recommandé que les
-
à l'autoclave en le maintenant à une température
soit
parties concernées se mettent d'accord à ce sujet.
de 121 OC I 1 OC pendant au moins 20 min.
Un autoclave est également nécessaire pour la stérilisation des
7 Préparation de l'échantillon pour essai
milieux de culture et des réactifs. II doit être réglable à
Voir la Norme internationale spécifique du produit concerné.
121 OC I 1 OC et à 115 OC f 1 OC comme cela est indiqué
n'y a pas de Norme internationale spécifique disponible, il
S'il
dans l'annexe B.
est recommandé que les parties concernées se mettent
d'accord à ce sujet.
5.2 Enceinte de séchage ou étuve ventilée par convection
(permettant de sécher la surface des milieux gélosés coulés en
boîte), réglable à 50 OC f 1 OC.
8 Mode opératoire
8.1 Prise d'essai et suspension mère
5.3 Étuve, réglable à 35 OC I 1 OC ou à 37 OC I 1 OC
selon la température retenue 1) (permettant de maintenir les
Se reporter à la Norme internationale concernant le produit à
milieux ensemencés, les boîtes et les tubes dans l'un ou l'autre
examiner.
de ces intervalles de températures).
Pour la préparation de la suspension mère, utiliser comme
diluant le milieu de préenrichissement spécifié en 4.2.1.
5.4 Bain d'eau, réglable à 42,O OC I 0,l OC, ou étuve,
réglable à 42,O OC f 0,5 OC (permettant de maintenir les En général, pour préparer la suspension mère, ajouter une prise
milieux liquides ensemencés dans l'un ou l'autre de ces interval- d'essai de 25 g dans 225 ml du milieu de préenrichissement
les de températures). (4.2.11, ce qui correspond au rapport prise d'essai/milieu de
préenrichissement spécifié dans la présente méthode.3)
5.5 Bains d'eau (permettant de réchauffer ou de refroidir les
Si la prise d'essai prescrite n'est pas de 25 g, utiliser la quantité
solutions et les milieux de culture aux températures appro-
nécessaire de milieu de préenrichissement pour obtenir
priées), réglables à 45 OC f 1 OC, à 55 OC f 1 OC et à
approximativement une dilution au 1 /IO (masse à volume).
7OoC I 1 OC.
NOTE - Les produits alimentaires séchés, en poudre, peuvent nécessiter
une opération de réhydratation spéciale pour améliorer la mise en évidence
5.6
Bain d'eau, réglable à 35 OC f 1 OC ou à 37 OC f 1 OC
des Sa/mone//a. A cet effet, deux techniques peuvent être utilisées, celle
selon la température retenue. 1)
par immersion et celle par agitation. Consulter la Norme internationale rela-
tive au produit examiné. En l'absence d'une telle norme, il est recommandé
que les parties concernées parviennent à un accord à ce sujet.
5.7 Anses bouclées, en platine iridié ou en nickel-chrome,
d'environ 3 mm de diamètre.
8.2 Préenrichissement non sélectif
5.8
pH-mètre ayant une précision de réglage de +. 0,l unité Incuber la suspension mère à la température spécifiée, soit
de pH à 25 OC. 35 OC ou 37 OCl), durant au moins 16 h et au plus 20 h.
1 i La température devra être fixée par les parties concernées et précisée dans le rapport d'essai.
2) Des bouteilles ou flacons à capsules métalliques à vis non toxiques peuvent être utilisés.
3) Afin de réduire la somme de travail d'examen, lorsqu'on doit examiner plus d'une prise d'essai de 25 g provenant d'un lot déterminé de produit ali-
mentaire, et lorsqu'on dispose de preuves indiquant qu'un mélange (réunissant les prises d'essai) ne modifie pas les résultats en ce qui concerne ce
10 prises d'essai de 25 g, combiner ces 10 unités
produit en particulier, les prises d'essai peuvent être mélangées. Par exemple, si l'on doit examiner
afin d'obtenir un échantillon composite de 250 g et ajouter 2,25 litres de bouillon de préenrichissement, ou bien encore réunir les portions de 0,l ml
(milieu RV) et de 10 ml (milieu au sélénite-cystin?) des bouillons de préenrichissement provenant des 10 orises d'essais séparées (voir 8.3.1) pour en
enrichir 0,l litre et 1 litre, respectivement, de milieu d'enrichissement sélectif.
3
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Si le développement est faible ou 'il n'y a pas de colo-
8.3 Enrichissement sélectif 8.4.6
nies typiques de Salmonella, incuber à ouveau les boîtes à
8.3.1 Transférer 0,l ml de la culture obtenue en 8.2 dans un 35 OC ou à 37 OC2) durant 18 h à 24 h.
7
tube contenant 10 ml du milieu RV (4.2.21, et 10 ml de la
Réexaminer les boîtes afin de rechercher lla présence de colo-
culture obtenue en 8.2 dans un flacon contenant 100 ml du
nies typiques de Salmonella.
milieu au sélénite-cystine (4.2.3) 1).
NOTE - II convient de soumettre toute colonie typique ou suspecte à
8.3.2 Incuber les deux milieux ensemencés (8.3.1) de la facon
une confirmation (8.51; en effet, la reconnaissdnce de colonies de Sal-
suivante :
monella est en grande partie une question d'ekpérience, et leur aspect
peut quelquefois varier non seulement d'une eijpèce à une autre, mais
a) le milieu RV à 42 OC;
également d'un lot de milieu de culture à un auire. A cet égard, I'agglu-
tination, à ce stade, des colonies avec un séruin anti-Sa/mone//a poly-
b) le milieu au sélénite-cystine à la température spécifiée,
valent peut faciliter la reconnaissance de colopies suspectes.
soit 35 OC ou 37 OC2)3).
8.5 Confirmations I
8.4 Isolement et identification
8.5.1 Choix des colonies pour les confirmations
8.4.1 Après 18 h à 24 h d'incubation (voir 8.3.21, ensemencer,
avec une anse (5.7) à partir de la culture dans le milieu RV, la
à partir de chaque boîte de
Pour les confirmations, prélever,
surface d'une grande boîte de Petri du premier milieu d'isole-
chacun des milieux sélectifs (voir 8.4.5 et 8.4.61, cinq colonies
ment sélectif (en général la gélose au rouge de phénol et au vert
considérées comme typiques ou suspectes.
brillant, voir 4.2.4.1 1, de facon à permettre le développement de
colonies bien isolées. S'il se trouve une boîte avec moins de cinp colonies typiques ou
suspectes, retenir toutes les colonies tyqiques ou suspectes.
À défaut de grandes boîtes, utiliser deux petites boîtes, l'une
après l'autre, en se servant de la même anse (voir la note).
Ensemencer les colonies sélectionnées spr la surface de boîtes
de gélose nutritive (4.2.51, préalablement séchées, de façon à
Opérer de même avec le deuxième milieu d'isolement sélectif
permettre le développement de colonies1 bien isolées.
(4.2.4.2) en se servant d'une nouvelle anse, et de boîtes de Petri
de dimensions appropriées.
Incuber les boîtes ainsi ensemencées 35 OC ou à 37 OC2)
durant 18 h à 24 h.
NOTE - La méthode suivante d'isolement en stries est recommandée
lorsqu'on emploie la gélose au rouge de phénol et au vert brillant. Utili-
Utiliser des cultures pures pour les confirmations biochimique
ser une anse (5.7) pour deux boîtes. Prélever une gouttelette à la sur-
et sérologique. I
face du liquide. Ensemencer les deux boîtes selon les deux diagrammes
~
de l'annexe D. Utiliser la totalité de la boîte; les stries devraient être
8.5.2 Confirmation biochimique '
espacées d'environ 0,5 cm. (Ne pas flamber et ne pas recharger l'anse
ni après avoir tracé la première strie, ni au moment de passer à la
A l'aide d'un fil à ensemencement, ensehencer les milieux indi-
seconde boîte.) Lorsqu'on utilise seulement une boîte de grandes
dimensions, appliquer la méthode d'isolement en stries indiquée pour qués en 8.5.2.1 à 8.5.2.6 avec chacune des cultures obtenues à
la première boîte en annexe D.
partir des colonies retenues en 8.5.1.
8.4.2 À partir de la culture dans le milieu au sélénite-cystine,
8.5.2.1 Gélose TSI (4.2.6)
répéter les opérations décrites en 8.4.1 avec les deux milieux
d'isolement sélectifs. Ensemencer la pente du milieu par dds stries et le culot par
piqûre.
I
8.4.3 Retourner les boîtes (8.4.1 et 8-4-21, les placer dans une
Incuber à 35 OC ou à 37 OC2) durant 24' h.
étuve (5.3) réglée à la température spécifiée, soit 35 OC ou
37 oc. 2)
Interpréter les phénomènes se produisadt, de la facon suivante :
8.4.4 Après une durée totale d'incubation de 48 h (voir 8.3.21,
Culot
répéter les opérations décrites de 8.4.1 à 8.4.3 inclus, à partir
jaune : glucose positif (fermenta-
des deux milieux d'enrichissement ensemencés.
tion ldu glucose)
8.4.5 Après 20 h à 24 h d'incubation, examiner les boîtes
rouge ou inchangé : glucose négatif (pas de fer-
(8.4.3 et 8.4.4), afin de rechercher la présence de colonies typi-
meltation du glucose)
ques de Salmonella. Les colonies typiques de Salmonella culti-
: forrhation de sulfure
noir
vées sur gélose au vert brillant et au rouge de phénol provo-
d'hydrogène
quent un virage du milieu du rose au rouge.
(milieu RV) et de 10 ml (milieu au sélénite-cystinel des bouillons de préenrichissement provenant des 10 prises d'essais séparées (voir 8.3.1) pour en
enrichir 0,l litre et 1 litre, respectivement, de milieu d'enrichissement sélectif.
La température devra être fixée par les parties concernées et précisée dans le rapport d'essai.
2)
Pour le bouillon au sélénite-cystine, il peut être intéressant, dans certains cas, d'élever à 42 OC la température d'inqubation. Cette modification
3)
devra être indiquée dans le rapport d'essai.
,
4
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Ajouter 0,25 ml du réactif pour la recherche de la
bulles ou fissures : formation de gaz à partir du
P-galactosidase et mélanger.
glucose
Replacer le tube au bain d'eau réglé à 35 OC ou à 37 OC!), l'y
laisser séjourner 24 h en l'examinant de temps en temps.
Pente de la gélose
Une couleur jaune indique une réaction positive. La réaction est
jaune : lactose et/ou saccharose
20 min. Dans le cas d'utilisation de
souvent visible au bout de
positifs (utilisation du lac-
disques en papier tout préparés (4.2.9), suivre les instructions
tose et/ou du saccharose)
du fabricant.
rouge ou inchangée : lactose et saccharose néga-
tifs (pas d'utilisation du lac-
8.5.2.5 Milieu pour la réaction de Voges-Proskauer (4.2.10)
tose ni du saccharose
Mettre en suspension une anse de la colonie suspecte dans un
Les cultures typiques de Salmonella correspondent à une pente
tube stérile contenant 0,2 ml du milieu VP (4.2.10.1).
alcaline (rouge) avec formation de gaz et un culot acide (jaune),
Incuber à 35 OC ou à 37 OC 1) durant 24 h.
avec (dans environ 90 % des cas) formation de sulfure d'hydro-
gène (noircissement de la gélose).
Après incubation, ajouter 2 gouttes de la solution de créatine
(4.2.10.2), 3 gouttes de la solution éthanolique de naphtol-I
Lorsqu'on isole une Salmonella lactose positif (voir 3.31, la
(4.2.10.3) et, ensuite, 2 gouttes de la solution d'hydroxyde de
pente de la gélose TSI est jaune. En conséquence, une confir-
potassium (4.2.10.41, en agitant après avoir ajouté chaque
mation préliminaire de cultures de Salmonella ne doit pas être
réactif.
basée uniquement sur les résultats obtenus à partir de la gélose
TSI (voir 8.5.3).
La formation d'une coloration rose à rouge brillant dans un
délai de 15 min indique une réaction positive.
8.5.2.2 Gélose à l'urée (4.2.7)
Ensemencer par des stries la pente de la gélose. 8.5.2.6 Milieu pour la recherche de I'indole (4.2.1 1)
Ensemencer un tube contenant 5 ml du milieu tryptone-
Incuber à 35 OC ou à 37 OC1) durant 24 h et examiner de temps
(4.2.1 1 .I) avec la colonie suspecte.
tryptophane
en temps.
Incuber à 35 OC ou à 37 OC1) durant 24 h.
En cas de réaction positive, la décomposition de l'urée produit
un dégagement d'ammoniac, faisant virer le rouge de phénol au
Après incubation, ajouter 1 ml du réactif de Kovacs (4.2.11.2).
rose, puis au rouge foncé. La réaction est souvent visible au
bout de 2 h à 4 h.
La formation d'un anneau rouge indique une réaction positive.
Un anneau jaune-brun indique une réaction négative.
8.5.2.3 Milieu de décarboxylation à la lysine (4.2.8)
Ensemencer le milieu juste au-dessous de la surface du liquide.
8.5.2.7 Interprétation des essais biochimiques
Incuber à 35 OC ou à 37 OC1) durant 24 h.
Les Salmonella donnent en général les réactions suivantesz) :
Une couleur violette après incubation indique une réaction
Pourcentage
posit ive.
Réaction d'ensemence-
positive ments
Une couleur jaune indique une réaction négative. Salmonella
ou de
négative présentant
-~ la réaction3'
8.5.2.4 Réactif pour la recherche de la P-galactosidase (4.2.9)
______
Glucose, TSI (formation d'acide)
Mettre en suspension une anse de la colonie suspecte dans un
(8.5.2.1) + 1 O0
tube contenant 0,25 ml de la solution saline (4.2.13).
Glucose, TSI (formation de gaz)
Ajouter 1 goutte de toluène et agiter le tube.
(8.5.2.1) + 91,9 4)
Mettre le tube au bain d'eau réglé à 35 OC ou à 37 OC 1) et l'y
Lactose, TSI
laisser séjourner quelques minutes. (8.5.2.11 - 99,2 5)
1) La température devra être fixée par les parties concernées et précisée dans le rapport d'essai
2) W. H. Ewing and M. M. Ball. The biochemicalreactions of members of the genus Salmonella (19661
National Communicable Disease Center,
Atlanta, Georgia, USA.
3)
Ces pourcentages indiquent seulement que toutes les souches de Salmonella ne donnent pas les réaction5 par + ou - Ces pourcentages peu-
vent varier d'un pays à un autre et d'un produit à un autre.
4) La Salmonella typhi est anaérogène.
51 Les Salmonella du sous-genre Ill (Arizona) donnent des réactions lactose positives ou négatives mais sont toujours /I-galactosidase positives. Les
Salmonella du sous-genre Il donnent une réaction lactose négative, mais peuvent donner une réaction /I-galactoçidase positive. Pour l'étude des SOU-
ches, il peut être utile d'effectuer des essais biochimiques complémentaires.
5
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Pourcentage S'il y a agglutination, la réaction est considérée comme posi-
Réaction I'ensemence-
tive.
positive ments
ou le Salmonella
Utiliser les sérums poly- et monovalents l'un après l'autre.
négative présentant
la réaction''
8.5.3.3 Mise en évidence des antigènes «Vi»
Saccharose, TSI
-
(8.5.2.1) 99,5
Opérer comme en 8.5.3.1, mais en utilisant une goutte de I'anti-
sérum Vi (4.3) au lieu de la solution saline.
Sulfure d'hydrogène, TSI
+
(8.5.2.1) 91,6
S'il y a agglutination, la réaction est considérée comme posi-
tive.
Décomposition de l'urée
-
(8.5.2.2) 100
8.5.3.4 Mise en évidence des antigènes «H»
Décarboxylation à la lysine
+
(8.5.2.3) 94,6
Ensemencer la gélose nutritive semi-solide (4.2.12) avec une
colonie pure non auto-agglutinable.
Réaction à la /%galactosidase
-
98,52)
(8.5.2.4)
Incuber à 35 OC ou à 37 OC3) durant 18 h à 24 h.
Réaction de Voges-Proskauer
Utiliser cette culture pour l'examen des antigènes «HN en opé- 0
-
(8.5.2.5) 1 O0
rant comme en 8.5.3.1, mais en utilisant une goutte de I'antisé-
rum «H» (4.3) au lieu de la solution saline.
Recherche de I'indole
-
98,9
(8.5.2.6)
S'il y a agglutination, la réaction est considérée comme posi-
tive.
8.5.3 Confirmation sérologique
8.5.4 Interprétation des réactions biochimiques et
«O», «Vi», ou «HD
La recherche de la présence des antigènes
sérologiques
des Salmonella est effectuée par une agglutination sur lame
Le tableau 1 donne I'intermétation des essais de confirmations
avec les sérums appropriés, à partir de colonies pures (8.5.1 1, et
(8.5.2 et 8.5.31, effectués'sur les colonies retenues (8.5.1).
après élimination des souches auto-agglutinables.
Tableau 1
8.5.3.1 Élimination des souches auto-agglutinables
Réactions Auto- Réactions
Déposer,
...
Questions, Comments and Discussion
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