SIST ISO 6579:1997
(Main)Microbiology -- General guidance on methods for the detection of Salmonella
Microbiology -- General guidance on methods for the detection of Salmonella
The methods proposed necessitate four successive stages: pre-enrichment in non-selective liquid medium, enrichment in selective liquid media, plating out and recognition, confirmation. Annex A gives a diagram of the procedure, annex B describes composition and preparation of culture media and reagents, annex C specifies brilliant green.
Microbiologie -- Directives générales concernant les méthodes de recherche des Salmonella
Mikrobiologija - Splošno navodilo o metodah za ugotavljanje prisotnosti salmonel
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
ISO
STANDARD
6579
Third edition
1993-09-01
Microbiology - General guidance on
methods for the detection of Salmonella
Microbiologie - Directives g&xSrales concemant /es methodes de
recherche des Salmonella
E!!!
Reference number
ISO 6579:1993(E)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 6579:1993(E)
Contents
Fage
1
1 .
Scope
1
....................................................................
2
Normative references
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Definitions *.,.,.
3
1
4 Principle .
............................................. 2
5
Culture media, reagents and sera
3
..........................................................
6 Apparatus and glassware
3
7 Sampling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
a Preparation of the test Sample
3
9 Procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.>
7
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.
10 Expression of results
7
11 Test report . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12 Quality assurance
Annexes
8
..,.,...............................,.........................
A Diagram of procedure
. 9
B Composition and preparation of culture media and reagents
. . . . . . .I. 15
C Specification for brilliant green
16
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
D Standard method of streaking agar plates
0 ISO 1993
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form or
by any means, electronie or mechanical, including photocopying and microfilm, without per-
mission in writing from the publisher.
international organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii
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ISO 6579:1993(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch mem.ber body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization. I
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 6579 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 34, Agricultural food products, Sub-Committee SC 9,
Microbiology.
This third edition cancels and replaces the second edition
(ISO 6579:1990), of which it constitutes a technical revision.
Annexes A, B and C form an integral part of this International Standard.
Annex D is for information only.
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ISO 6579:1993(E)
Introduction
This International Standard is intended to provide general guidance for the
examination of products not dealt with by existing International Standards
and to be taken into account by organizations preparing microbiological
methods of test for application to foods or to animal feeding stuffs. Be-
cause of the large variety of products within this field of application, these
guidelines may not be appropriate in evety detail for certain products, and
for other products it may be necessary to use different methods. Never-
theless, it is hoped that in all cases every attempt will be made to apply
the provided guidelines as far as possible and that deviations from them
will only be made if absolutely necessary for technical reasons.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken
of all information then available regarding the extent to which the guide-
lines have been followed and the reasons for deviation from them in the
case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain
groups of products, International Standards and/or national Standards may
already exist that do not comply with these guidelines. In cases where
International Standards already exist for the product to be tested, they
should be followed, but it is hoped that when such Standards are reviewed
they will be changed to comply with this International Standard so that,
eventually, the only remaining departures from these guidelines will be
those necessary for weil-established technical reasons.
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ISO 6579:1993(E)
INTERNATIONAL STANDARD
Microbiology - General guidance on methods for the
detection of SaImoneIla
WARNING
- In Order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
detecting Salmonella are only undertaken in properly equipped laboratories, under the control of a
skilled microbiologist, and that great care is taken in the disposal of all incubated materials.
3.1 Salmonella: Microorganisms which form typical
1 Scope
colonies on solid selective media and which display
the biochemical and serological characteristics de-
This International Standard gives general guidance on
scribed when tests are carried out in accordance with
methods for the detection of Salmonella.
this International Standard.
Subject to the limitations discussed in the Introduc-
tion, this International Standard is applicable to pro- 3.2 detection of Salmonella: Determination of the
ducts intended for human consumption or feeding of presence or absence of these microorganisms, in a
animals. particular mass of product, when tests are carried out
in accordance with this International Standard.
The incubation temperature (35 “C or 37 “C) shall be
agreed by the Parties concerned and shall be specified
in the test report.
4 Principle
The detection of Salmonella necessitates four suc-
2 Normative references
cessive stages (see also annex A).
The following Standards contain provisions which,
Salmonelle may ‘be present in small numbers
NOTE 1
through reference in this text, constitute provisions
and are often accompanied by considerably larger numbers
of this International Standard. At the time of publica- of other members of Entefobacteriacez? or of other families.
Therefore, selective enrichment is necessary; furthermore,
tion, the editions indicated were valid. All Standards
pre-enrichment is often necessary to permit detection of
are subject to revision, and Parties to agreements
injured Salmonek
based on this International Standard are encouraged
to investigate the possibility of applying the most re-
cent editions of the Standards indicated below.
4.1 Pre-enrichment in non-selective liquid
Members of IEC and ISO maintain registers of cur-
medium
rently valid International Standards.
Inoculation of buffered peptone water (also used as
ISO 6887: 1983, Microbiology - General guidance for
diluent) with the test portion, and incubation at 35 “C
the preparation o f dilutions for microbiological exam-
or 37 “C (as agreed) for 16 h to 20 h.
ina tion.
ISO 72 18: 1985, Microbiology - General guidance for
4.2 Enrichment in selective liquid media
microbiological examina tioi 1s.
Inoculation of magnesium chloride/malachite green
medium and of a selenitelcystine medium with the
3 Definitions
culture obtained in 4.1.
For the purposes of this nternational Standard, the Incubation of the magnesium chloride/malachite
following definitions apply. green medium at 42 “C for 24 h and incubation of the
1
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ISO 6579:1993(E)
selenitelcystine medium at 35 “C or 37 “C (as agreed) 5.2.4 Solid selective plating-out media
for 24 h and a further 24 h.
5.2.4.1 First medium: Phenol red/brilliant green
agar (Edel and Kampelmacher)
4.3 Plating out and recognition
See clause B.4.
From the cultures obtained in 4.2, inoculation of two
selective solid media:
This first medium is compulsory unless otherwise
stated (sec 4.3).
- Phenol redlbrilliant green agar, unless the Inter-
national Standard appropriate to the product to be
5.2.4.2 Second medium
examined, or other specific considerations (for ex-
ample the isolation of lactose-positive
The choice of the second medium is left to the dis-
Salmonella), require Substitution of some other
cretion of the testing laboratory, unless there is a
medium as the one for obligatory use;
specific International Standard relating to the product
to be examined, which specifies the composition of
- any other solid selective medium (see 5.2.4.2).
this second medium.
Incubation at 35 “C or 37 “C (as agreed), and exam-
ination after 24 h and, if necessary, after 48 h to
5.2.5 Nutrient agar
check for the presence of colonies which, from their
characteristics, are considered to be presumptive
See clause B.5.
Salmonella.
5.2.6 Triple sugar/iron agar (TSI agar)
4.4 Confirmation
See clause B.6.
Subculturing of colonies of presumptive Salmonella,
plated out as described in 4.3, and confirmation by
means of appropriate biochemical and serological
5.2.7 Urea agar (Christensen)
tests.
See clause B.7.
5 Culture media, reagents and sera
5.2.8 L-Lysine decarboxylation medium
5.1 General
See clause B.8.
For current laboratory practice, see ISO 7218.
5.2.9 Reagent for detection of fi-galactosidase (or
prepared Paper discs, used in accordance with the
5.2 Culture media and reagents manufacturer’s instructions)
NOTE 2 Because of the large number of culture media
See clause B.9.
and reagents, it has been considered preferable, for the
clarity of the text, to give their composition and preparation
in annex B. 5.2.10 Reagents for Voges-Proskauer (VP
reaction)
5.2.1 Non-selective pre-enrichment medium:
See clause B.10.
Buffered peptone water
5.2.10.1 VP medium
See clause B.l.
5.2.2 First selective enrichment medium: 5.2.10.2 Creatine solution (ALamidinosarcosine)
Rappaport-Vassiliadis magnesium
chloride/malachite green medi,um (RV medium)
5.2.10.3 1-Naphthol, ethanolic Solution
See clause B.2.
5.2.10.4 Potassium hydroxide Solution
5.2.3 Second selective enrichment medium:
Selenitelcystine medium 5.2.11 Reagents for indole reaction
See clause B.3.
See clause B.11.
2
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ISO 6579:1993(E)
5.2.11 .l Tryptone-tryptophan medium 6.6 Water bath, capable of operating at
35 “C + 1 “C or 37 “C + 1 “C, depending on the tem-
perature agreed.
5.2.11.2 Kovacs reagent (N,N-dicyclohexyl-
carbodiimide pentachlorophenol complex)
6.7 Loops, made of platinum/iridium or nickel/ chro-
mium, of diameter approximately 3 mm.
5.2.12 Semi-solid nutrient agar
6.8 pH-meter, having an accuracy of calibration of
See clause B.12.
+ 0,l pH unit at 25 “C.
5.2.13 Saline Solution
6.9 Culture bottles or flasks
See clause B.13.
NOTE 4 Bottles or flasks with non-toxic metallic or plastic
screw-taps may be used.
5.3 Sera
6.10 Culture tubes, 8 mm in diameter and
Several types of agglutinant sera containing anti-
160 mm in length.
bodies for one or several 0-antigens are available
commercially, i.e. anti-sera containing one or more
6.11 Measuring cylinders
“0” groups (called monovalent or polyvalent anti-0
sera), anti-Vi sera, and anti-sera containing antibodies
6.12 Graduated pipettes, of nominal capacities
for one or several H-factors (called monovalent or
10 ml and 1 ml, graduated respectively in 0,5 ml and
polyvalent anti-H sera).
0,l ml divisions.
Every attempt should be made to ensure that the
anti-sera used are adequate to provide for the de- 6.13 Petri dishes, of small size (diameter 90 mm to
tection of all Salmonella serotypes. Assistance to- 100 mm) and/or large size (diameter 140 mm).
wards this objective may be obtained by using
anti-sera prepared by a supplier recognized as com-
7 Sampling
Petent (for example, by an appropriate government
agency).
lt is important that the laboratory receive a Sample
which is truly representative and has not been dam-
aged or changed during transport or storage
6 Apparatus and glassware
Sampling is not patt of the method specified in this
NOTE 3 Disposable apparatus is an acceptable alterna-
International Standard. See the specific International
tive to reusable glassware if it has suitable specifications.
Standard dealing with the product concerned. If there
is no specific International Standard, it is rec-
Usual microbiological laboratory equipment and, in
ommended that the Parties concerned come to an
particular, the following.
agreement on this subject.
) or wet
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven
8 Preparation of the test Sample
sterilization (autoclave)
Prepare the test Sample in accordance with the spe-
See ISO 7218.
cific International Standard dealing with the product
concerned. If there is no specific International Stan-
dard, it is recommended that the Parties concerned
6.2 Drying cabinet or oven, ventilated by con-
come to an agreement on this subject.
vection, capable of operating between 37 “C + 1 “C
and 55 “C + 1 “C.
-
9 Procedure
6.3 Incubator, capable of operating at 35 “C -f: 1 “C
(See diagram in annex A.)
or 37 “C + 1 “C, depending on the temperature
agreed.
9.1 Test Portion and initia I Suspension
6.4 Water bath, capable of operating at
9.1.1 See ISO 6887 and the specific International
42,0 “C k 1 “C or incubator, capable of operating at
Standard dealing with the product concerned.
42,0 “C + 0,5 "C.
For preparation of the initial Suspension, use as di-
lution fluid the p,re-enrichment medium specified in
6.5 Water baths, capable of operating at
70 “C k 1 “C. 5.2.1.
45 “C + 1 “C, 55 “C + 1 “C and
3
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ISO 6579:1993(E)
9.1.2 In general, to prepare the initial Suspension,
9.4 Plating out and identification
add a 25 g test portion to 225 ml of pre-enrichment
medium (5.2.1), which is the ratio of test Portion to
9.4.1 Using the culture obtained in the RV medium,
pre-enrichment medium specified in this method.
after incubation for 24 h, inoculate, by means of a
loop (6.7), the surface of one large-size Petri dish
If the prescribed test Portion is other than 25 g, use
(6.13) containing the first selective plating-out me-
the necessary quantity of pre-enrichment medium to
dium (generally the Phenol red/briIIiant green agar, see
yield approximately a l/lO dilution (mass to volume).
5.2.4.1), so that weil-isolated colonies will be ob-
NOTES
tained.
5 To reduce the examination workload when more than
In the absence of large dishes, use two small dishes,
one 25 g test Portion from a specified Iot of food has to be
one after the other, using the same loop (see note 8).
examined, and when evidente is available that compositing
(pooling the test portions) does not affect the result for that
Proceed in the same way with the second selective
particular food, the test portions may be composited. For
plating-out medium (5.2.4.2) using a new loop and
example, if 10 test portions of 25 g are to be examined,
Petri dishes of appropriate size.
combine the 10 units to form a composite test Portion of
250 g and add 225 litres of pre-enrichment broth. Alterna-
NOTE 8 The following method of streaking is rec-
tively, the 0,l ml (RV medium) and 10 ml (selenitelcystine
ommended when Phenol red/brilliant green agar is used.
medium) portions of the pre-enrichment broths from the 10
Use one loop (6.7) for two dishes. Take a droplet from the
separate test portions (9.3.1) may be composited for
edge of the surface of the fluid. Inoculate both dishes ac-
enrichment in 0,l litre and 1 litre respectively of selective
cording to the two diagrams in annex D . Use the whole
enrichment medium.
dish; loop streaks should be spaced about 0,5 cm apart. (DO
not flame the loop or recharge it after making the first
6 Dried or powdered food products may need a special
streak, nor when passing to the second dish.) When only
rehydration procedure . to enhance the recovery of
one large dish is used, the method of streaking should be
Salmonelle. Two techniques may be used for this purpose,
as indicated for the first dish in annex D.
that of immersion and that of agitation. Refer for this pur-
pose to the specific International Standard dealing with the
product under examination. If such a Standard is not avail-
9.4.2 Using the culture obtained in the selenite/
able, it is recommended that the Parties concerned come
cystine medium after incubation for 24 h, repeat the
to an agreement on this subject.
procedure described in 9.4.1 with the two selective
plating-out media.
9.4.3 Invert the dishes (9.4.1) and (9.4.2) so that the
9.2 Non-selective pre-enrichment
bottom is uppermost, and place them in the incubator
(6.3) set at 35 “C or 37 “C (as agreed).
Incubate the initial Suspension at 35 “C or 37 “C (as
agreed) for not less than 16 h and not more than
20 h.
9.4.4 After a total incubation period of 48 h of the
selenitelcystine medium (see 9.3.2 and 9.4.3), repeat
the procedure described in 9.4.2 and 9.4.3.
9.3 Selective enrichment
9.4.5 After incubation for 20 h to 24 h, examine the
dishes (9.4.3 and 9.4.4) for the presence of typical
colonies of Salmonella. Typical colonies of Salmonella
9.3.1 Transfer 0,l ml of the culture obtained in 9.2
grown on Phenol red/brilliant green agar Cause the
to a tube containing 10 ml of the RV medium (5.2.2);
colour of the medium to Change from pink to red.
transfer 10 ml of the culture obtained in 9.2 to a flask
containing 100 ml of selenitelcystine medium (5.2.3).
9.4.6 If growth is slight or if no typical colonies of
Salmonella are present, reincubate at 35 “C or at
37 “C (as agreed) for a further 18 h to 24 h.
9.3.2 Incubate the two inoculated media (9.3.1) for
18 h to 24 h as follows:
Re-exam ine the plates for the presence of typical
colonies of Salmonella.
a) the inoculated RV medium at 42 “C for 24 h;
NOTE 9 Any typical or suspect colony should be sub-
b) the inoculated selenitelcystine medium at 35 “C
jected to a confirmation (9.5); the recognition of colonies of
or 37 “C (as agreed) for 24 h and a further 24 h.
Salmonella is to a large extent a matter of experience, and
their appearance may vary somewhat, not only from species
NOTE 7 For the selenitelcystine medium, it may, in some
to species, but also from batch to batch of medium. In this
cases, be advantageous to raise the incubation temperature
respect, agglutination, at this Stage, of colonies with
to 42 “C. This modification should be indicated in the test
polyvalent Salmonella anti-serum may facilitate recognition
report.
of suspected colonies.
4
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ISO 6579:1993(E)
,
9.4.7 Identification kits currently available commer- Typical Salmonelle cultures show alkaline (r-ed) slants
with gas formation and acid (yellow) butts, with (in
cially and permitting the identification of Salmonelle
may be used. about 90 % of the cases) formation of hydrogen sul-
fide (blackening of the agar).
When a lactose-positive Salmonelle is isolated (see
9.5 Confirmation
4.3), the TSI slant is yellow. Thus, preliminaty confir-
mation of Salmonella cultures shall not be based on
9.5.1 Selection of colonies for confirmation
the results of the TSI agar test only (see 9.5.3).
For confirmation, take from each dish of each selec-
tive medium (see 9.4.5 and 9.4.6), five colonies con- 9.5.2.2 Urea agar (52.7)
sidered to be typical or suspect.
Streak the agar slope surface.
If on one dish there are fewer than five typical or
suspect colonies, take for confirmation all the typical
Incubate at 35 “C or 37 “C (as agreed) for 24 h and
or suspect colonies.
examine at intervals.
Streak the selected colonies onto the surface of pre-
If the reaction is positive, splitting of Urea liberates
dried nutrient agar plates (5.2.5), in a manner which
ammonia, which changes the colour of Phenol red to
will allow weil-isolated colonies to develop.
rose-pink and later to deep cerise. The reaction is’of-
ten apparent after 2 h to 4 h.
Incubate the inoculated plates at 35 “C or 37 “C (as
.agreed) for 18 h to 24 h.
9.5.2.3 L-Lysine decarboxylation medium (5.2.8)
Use pure cultures for biochemical and serological
confirmation.
Inoculate just below the surface of the liquid medium.
Incubate at 35 “C or 37 “C (as agreed) for 24 h.
9.5.2 Biochemical confirmation
A purple colour after incubation indicates a positive
By means of an inoculating wire, inoculate the media
reaction.
specified in 9.5.2.1 to 9.5.2.6 with each of the cul-
tures obtained from the colonies selected in 9.5.1. A yellow colour indicates a negative reaction.
9.5.2.1 TSI agar (5.2.6)
9.5.2.4 Detection of fi-galactosidase (5.2.9)
Streak the agar slope surface and stab the butt.
Suspend a loopful of the suspected colony in a tube
containing 0,25 ml of the Saline Solution (5.2.13).
Incubate at 35 “C or 37 “C (as agreed) for 24 h.
Add 1 drop of toluene and Shake the tube.
Interpret the changes in the medium as follows:
Put the tube in a water bath (6.6) set at 35
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 6579:1997
01-december-1997
Mikrobiologija - Splošno navodilo o metodah za ugotavljanje prisotnosti salmonel
Microbiology -- General guidance on methods for the detection of Salmonella
Microbiologie -- Directives générales concernant les méthodes de recherche des
Salmonella
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 6579:1993
ICS:
07.100.30 Mikrobiologija živil Food microbiology
SIST ISO 6579:1997 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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Normative references
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4 Principle .
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Culture media, reagents and sera
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6 Apparatus and glassware
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7 Sampling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.
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Annexes
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A Diagram of procedure
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B Composition and preparation of culture media and reagents
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C Specification for brilliant green
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federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch mem.ber body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization. I
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 6579 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 34, Agricultural food products, Sub-Committee SC 9,
Microbiology.
This third edition cancels and replaces the second edition
(ISO 6579:1990), of which it constitutes a technical revision.
Annexes A, B and C form an integral part of this International Standard.
Annex D is for information only.
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SIST ISO 6579:1997
ISO 6579:1993(E)
Introduction
This International Standard is intended to provide general guidance for the
examination of products not dealt with by existing International Standards
and to be taken into account by organizations preparing microbiological
methods of test for application to foods or to animal feeding stuffs. Be-
cause of the large variety of products within this field of application, these
guidelines may not be appropriate in evety detail for certain products, and
for other products it may be necessary to use different methods. Never-
theless, it is hoped that in all cases every attempt will be made to apply
the provided guidelines as far as possible and that deviations from them
will only be made if absolutely necessary for technical reasons.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken
of all information then available regarding the extent to which the guide-
lines have been followed and the reasons for deviation from them in the
case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain
groups of products, International Standards and/or national Standards may
already exist that do not comply with these guidelines. In cases where
International Standards already exist for the product to be tested, they
should be followed, but it is hoped that when such Standards are reviewed
they will be changed to comply with this International Standard so that,
eventually, the only remaining departures from these guidelines will be
those necessary for weil-established technical reasons.
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SIST ISO 6579:1997
ISO 6579:1993(E)
INTERNATIONAL STANDARD
Microbiology - General guidance on methods for the
detection of SaImoneIla
WARNING
- In Order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
detecting Salmonella are only undertaken in properly equipped laboratories, under the control of a
skilled microbiologist, and that great care is taken in the disposal of all incubated materials.
3.1 Salmonella: Microorganisms which form typical
1 Scope
colonies on solid selective media and which display
the biochemical and serological characteristics de-
This International Standard gives general guidance on
scribed when tests are carried out in accordance with
methods for the detection of Salmonella.
this International Standard.
Subject to the limitations discussed in the Introduc-
tion, this International Standard is applicable to pro- 3.2 detection of Salmonella: Determination of the
ducts intended for human consumption or feeding of presence or absence of these microorganisms, in a
animals. particular mass of product, when tests are carried out
in accordance with this International Standard.
The incubation temperature (35 “C or 37 “C) shall be
agreed by the Parties concerned and shall be specified
in the test report.
4 Principle
The detection of Salmonella necessitates four suc-
2 Normative references
cessive stages (see also annex A).
The following Standards contain provisions which,
Salmonelle may ‘be present in small numbers
NOTE 1
through reference in this text, constitute provisions
and are often accompanied by considerably larger numbers
of this International Standard. At the time of publica- of other members of Entefobacteriacez? or of other families.
Therefore, selective enrichment is necessary; furthermore,
tion, the editions indicated were valid. All Standards
pre-enrichment is often necessary to permit detection of
are subject to revision, and Parties to agreements
injured Salmonek
based on this International Standard are encouraged
to investigate the possibility of applying the most re-
cent editions of the Standards indicated below.
4.1 Pre-enrichment in non-selective liquid
Members of IEC and ISO maintain registers of cur-
medium
rently valid International Standards.
Inoculation of buffered peptone water (also used as
ISO 6887: 1983, Microbiology - General guidance for
diluent) with the test portion, and incubation at 35 “C
the preparation o f dilutions for microbiological exam-
or 37 “C (as agreed) for 16 h to 20 h.
ina tion.
ISO 72 18: 1985, Microbiology - General guidance for
4.2 Enrichment in selective liquid media
microbiological examina tioi 1s.
Inoculation of magnesium chloride/malachite green
medium and of a selenitelcystine medium with the
3 Definitions
culture obtained in 4.1.
For the purposes of this nternational Standard, the Incubation of the magnesium chloride/malachite
following definitions apply. green medium at 42 “C for 24 h and incubation of the
1
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SIST ISO 6579:1997
ISO 6579:1993(E)
selenitelcystine medium at 35 “C or 37 “C (as agreed) 5.2.4 Solid selective plating-out media
for 24 h and a further 24 h.
5.2.4.1 First medium: Phenol red/brilliant green
agar (Edel and Kampelmacher)
4.3 Plating out and recognition
See clause B.4.
From the cultures obtained in 4.2, inoculation of two
selective solid media:
This first medium is compulsory unless otherwise
stated (sec 4.3).
- Phenol redlbrilliant green agar, unless the Inter-
national Standard appropriate to the product to be
5.2.4.2 Second medium
examined, or other specific considerations (for ex-
ample the isolation of lactose-positive
The choice of the second medium is left to the dis-
Salmonella), require Substitution of some other
cretion of the testing laboratory, unless there is a
medium as the one for obligatory use;
specific International Standard relating to the product
to be examined, which specifies the composition of
- any other solid selective medium (see 5.2.4.2).
this second medium.
Incubation at 35 “C or 37 “C (as agreed), and exam-
ination after 24 h and, if necessary, after 48 h to
5.2.5 Nutrient agar
check for the presence of colonies which, from their
characteristics, are considered to be presumptive
See clause B.5.
Salmonella.
5.2.6 Triple sugar/iron agar (TSI agar)
4.4 Confirmation
See clause B.6.
Subculturing of colonies of presumptive Salmonella,
plated out as described in 4.3, and confirmation by
means of appropriate biochemical and serological
5.2.7 Urea agar (Christensen)
tests.
See clause B.7.
5 Culture media, reagents and sera
5.2.8 L-Lysine decarboxylation medium
5.1 General
See clause B.8.
For current laboratory practice, see ISO 7218.
5.2.9 Reagent for detection of fi-galactosidase (or
prepared Paper discs, used in accordance with the
5.2 Culture media and reagents manufacturer’s instructions)
NOTE 2 Because of the large number of culture media
See clause B.9.
and reagents, it has been considered preferable, for the
clarity of the text, to give their composition and preparation
in annex B. 5.2.10 Reagents for Voges-Proskauer (VP
reaction)
5.2.1 Non-selective pre-enrichment medium:
See clause B.10.
Buffered peptone water
5.2.10.1 VP medium
See clause B.l.
5.2.2 First selective enrichment medium: 5.2.10.2 Creatine solution (ALamidinosarcosine)
Rappaport-Vassiliadis magnesium
chloride/malachite green medi,um (RV medium)
5.2.10.3 1-Naphthol, ethanolic Solution
See clause B.2.
5.2.10.4 Potassium hydroxide Solution
5.2.3 Second selective enrichment medium:
Selenitelcystine medium 5.2.11 Reagents for indole reaction
See clause B.3.
See clause B.11.
2
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SIST ISO 6579:1997
ISO 6579:1993(E)
5.2.11 .l Tryptone-tryptophan medium 6.6 Water bath, capable of operating at
35 “C + 1 “C or 37 “C + 1 “C, depending on the tem-
perature agreed.
5.2.11.2 Kovacs reagent (N,N-dicyclohexyl-
carbodiimide pentachlorophenol complex)
6.7 Loops, made of platinum/iridium or nickel/ chro-
mium, of diameter approximately 3 mm.
5.2.12 Semi-solid nutrient agar
6.8 pH-meter, having an accuracy of calibration of
See clause B.12.
+ 0,l pH unit at 25 “C.
5.2.13 Saline Solution
6.9 Culture bottles or flasks
See clause B.13.
NOTE 4 Bottles or flasks with non-toxic metallic or plastic
screw-taps may be used.
5.3 Sera
6.10 Culture tubes, 8 mm in diameter and
Several types of agglutinant sera containing anti-
160 mm in length.
bodies for one or several 0-antigens are available
commercially, i.e. anti-sera containing one or more
6.11 Measuring cylinders
“0” groups (called monovalent or polyvalent anti-0
sera), anti-Vi sera, and anti-sera containing antibodies
6.12 Graduated pipettes, of nominal capacities
for one or several H-factors (called monovalent or
10 ml and 1 ml, graduated respectively in 0,5 ml and
polyvalent anti-H sera).
0,l ml divisions.
Every attempt should be made to ensure that the
anti-sera used are adequate to provide for the de- 6.13 Petri dishes, of small size (diameter 90 mm to
tection of all Salmonella serotypes. Assistance to- 100 mm) and/or large size (diameter 140 mm).
wards this objective may be obtained by using
anti-sera prepared by a supplier recognized as com-
7 Sampling
Petent (for example, by an appropriate government
agency).
lt is important that the laboratory receive a Sample
which is truly representative and has not been dam-
aged or changed during transport or storage
6 Apparatus and glassware
Sampling is not patt of the method specified in this
NOTE 3 Disposable apparatus is an acceptable alterna-
International Standard. See the specific International
tive to reusable glassware if it has suitable specifications.
Standard dealing with the product concerned. If there
is no specific International Standard, it is rec-
Usual microbiological laboratory equipment and, in
ommended that the Parties concerned come to an
particular, the following.
agreement on this subject.
) or wet
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven
8 Preparation of the test Sample
sterilization (autoclave)
Prepare the test Sample in accordance with the spe-
See ISO 7218.
cific International Standard dealing with the product
concerned. If there is no specific International Stan-
dard, it is recommended that the Parties concerned
6.2 Drying cabinet or oven, ventilated by con-
come to an agreement on this subject.
vection, capable of operating between 37 “C + 1 “C
and 55 “C + 1 “C.
-
9 Procedure
6.3 Incubator, capable of operating at 35 “C -f: 1 “C
(See diagram in annex A.)
or 37 “C + 1 “C, depending on the temperature
agreed.
9.1 Test Portion and initia I Suspension
6.4 Water bath, capable of operating at
9.1.1 See ISO 6887 and the specific International
42,0 “C k 1 “C or incubator, capable of operating at
Standard dealing with the product concerned.
42,0 “C + 0,5 "C.
For preparation of the initial Suspension, use as di-
lution fluid the p,re-enrichment medium specified in
6.5 Water baths, capable of operating at
70 “C k 1 “C. 5.2.1.
45 “C + 1 “C, 55 “C + 1 “C and
3
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SIST ISO 6579:1997
ISO 6579:1993(E)
9.1.2 In general, to prepare the initial Suspension,
9.4 Plating out and identification
add a 25 g test portion to 225 ml of pre-enrichment
medium (5.2.1), which is the ratio of test Portion to
9.4.1 Using the culture obtained in the RV medium,
pre-enrichment medium specified in this method.
after incubation for 24 h, inoculate, by means of a
loop (6.7), the surface of one large-size Petri dish
If the prescribed test Portion is other than 25 g, use
(6.13) containing the first selective plating-out me-
the necessary quantity of pre-enrichment medium to
dium (generally the Phenol red/briIIiant green agar, see
yield approximately a l/lO dilution (mass to volume).
5.2.4.1), so that weil-isolated colonies will be ob-
NOTES
tained.
5 To reduce the examination workload when more than
In the absence of large dishes, use two small dishes,
one 25 g test Portion from a specified Iot of food has to be
one after the other, using the same loop (see note 8).
examined, and when evidente is available that compositing
(pooling the test portions) does not affect the result for that
Proceed in the same way with the second selective
particular food, the test portions may be composited. For
plating-out medium (5.2.4.2) using a new loop and
example, if 10 test portions of 25 g are to be examined,
Petri dishes of appropriate size.
combine the 10 units to form a composite test Portion of
250 g and add 225 litres of pre-enrichment broth. Alterna-
NOTE 8 The following method of streaking is rec-
tively, the 0,l ml (RV medium) and 10 ml (selenitelcystine
ommended when Phenol red/brilliant green agar is used.
medium) portions of the pre-enrichment broths from the 10
Use one loop (6.7) for two dishes. Take a droplet from the
separate test portions (9.3.1) may be composited for
edge of the surface of the fluid. Inoculate both dishes ac-
enrichment in 0,l litre and 1 litre respectively of selective
cording to the two diagrams in annex D . Use the whole
enrichment medium.
dish; loop streaks should be spaced about 0,5 cm apart. (DO
not flame the loop or recharge it after making the first
6 Dried or powdered food products may need a special
streak, nor when passing to the second dish.) When only
rehydration procedure . to enhance the recovery of
one large dish is used, the method of streaking should be
Salmonelle. Two techniques may be used for this purpose,
as indicated for the first dish in annex D.
that of immersion and that of agitation. Refer for this pur-
pose to the specific International Standard dealing with the
product under examination. If such a Standard is not avail-
9.4.2 Using the culture obtained in the selenite/
able, it is recommended that the Parties concerned come
cystine medium after incubation for 24 h, repeat the
to an agreement on this subject.
procedure described in 9.4.1 with the two selective
plating-out media.
9.4.3 Invert the dishes (9.4.1) and (9.4.2) so that the
9.2 Non-selective pre-enrichment
bottom is uppermost, and place them in the incubator
(6.3) set at 35 “C or 37 “C (as agreed).
Incubate the initial Suspension at 35 “C or 37 “C (as
agreed) for not less than 16 h and not more than
20 h.
9.4.4 After a total incubation period of 48 h of the
selenitelcystine medium (see 9.3.2 and 9.4.3), repeat
the procedure described in 9.4.2 and 9.4.3.
9.3 Selective enrichment
9.4.5 After incubation for 20 h to 24 h, examine the
dishes (9.4.3 and 9.4.4) for the presence of typical
colonies of Salmonella. Typical colonies of Salmonella
9.3.1 Transfer 0,l ml of the culture obtained in 9.2
grown on Phenol red/brilliant green agar Cause the
to a tube containing 10 ml of the RV medium (5.2.2);
colour of the medium to Change from pink to red.
transfer 10 ml of the culture obtained in 9.2 to a flask
containing 100 ml of selenitelcystine medium (5.2.3).
9.4.6 If growth is slight or if no typical colonies of
Salmonella are present, reincubate at 35 “C or at
37 “C (as agreed) for a further 18 h to 24 h.
9.3.2 Incubate the two inoculated media (9.3.1) for
18 h to 24 h as follows:
Re-exam ine the plates for the presence of typical
colonies of Salmonella.
a) the inoculated RV medium at 42 “C for 24 h;
NOTE 9 Any typical or suspect colony should be sub-
b) the inoculated selenitelcystine medium at 35 “C
jected to a confirmation (9.5); the recognition of colonies of
or 37 “C (as agreed) for 24 h and a further 24 h.
Salmonella is to a large extent a matter of experience, and
their appearance may vary somewhat, not only from species
NOTE 7 For the selenitelcystine medium, it may, in some
to species, but also from batch to batch of medium. In this
cases, be advantageous to raise the incubation temperature
respect, agglutination, at this Stage, of colonies with
to 42 “C. This modification should be indicated in the test
polyvalent Salmonella anti-serum may facilitate recognition
report.
of suspected colonies.
4
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SIST ISO 6579:1997
ISO 6579:1993(E)
,
9.4.7 Identification kits currently available commer- Typical Salmonelle cultures show alkaline (r-ed) slants
with gas formation and acid (yellow) butts, with (in
cially and permitting the identification of Salmonelle
may be used. about 90 % of the cases) formation of hydrogen sul-
fide (blackening of the agar).
When a lactose-positive Salmonelle is isolated (see
9.5 Confirmation
4.3), the TSI slant is yellow. Thus, preliminaty confir-
mation of Salmonella cultures shall not be based on
9.5.1 Selection of colonies for confirmation
the results of the TSI agar test only (see 9.5.3).
For confirmation, take from each dish of each selec-
tive medium (see 9.4.5 and 9.4.6), five colonies con- 9.5.2.2 Urea agar (52.7)
sidered to be typical or suspect.
Streak the agar slope surface.
If on one dish there are fewer than five typical or
suspect colonies, take for confirmation all the typical
Incubate at 35 “C or 37 “C (as agreed) for 24 h and
or suspect colonies.
examine at intervals.
Streak the selected colonies onto the surface of pre-
If the reaction is positive, splitting of Urea liberates
dried nutrient agar plates (5.2.5), in a manner which
ammonia, which changes the colour of Phenol red to
will allow weil-isolated colonies to develop.
rose-pink and later to deep cerise. The reaction is’of-
ten apparent after 2 h to 4 h.
Incubate the inoculated plates at 35 “C or 37 “C (as
.agreed) for 18 h to 24 h.
9.5.2.3 L-Lysine decarboxylation medium (5.2.8)
Use pure cultures for biochemical and serological
confirmation.
Inoculate just below the surface of the liquid medium.
Incubate at 35 “C or 37 “C (as agreed) for 24 h.
9.5.2 Biochemical confirmation
A purple colour after incubation indicates a positive
By means of an inoculating wire, inoculate the media
reaction.
specified in 9.5.2.1 to 9.5.2.6 with each of the cul-
tures obtained from the colonies selected in 9.5.1. A yellow colour indicates a negative reaction.
9.5.2.1 TSI agar (5.2.6)
9.5.2.4 Detection of fi-galactosidase (5.2.9)
Streak the agar slope surface and stab the butt.
Suspend a loopful of the suspected colony in a tube
containing 0,25 ml of the Saline Solution (5.2.13).
Incubate at 35 “C or 37 “C (as agreed) for 24 h.
Add 1 drop of toluene and Shake the tube.
Interpret the changes in the medium as follows:
Put the tube in a water bath (6.6) set at 35 “C or
Butt
37 “C (as agreed) and leave for several minutes.
yellow: glucose positive (fermen-
Add 0,25 ml of the reagent for detection of
tation of glucose)
fl-galactosidase and mix.
red or unchanged: glucose negative (no fer-
Replace the tube in the water bath set at 35 “C or
mentation of glucose)
37 “C (as agreed), leave for 24 h, examining the tube
at intervals.
formation of hydrogen sul-
black:
fide
A yellow colour indicates a positive reaction. The re-
action is often apparent after 20 min.
gas formation from
bubbles or Cracks:
glucose
If prepared Paper discs (5.2.9) are used, follow the
manufacturer’s instructions.
Slant surface
sucrose
yellow: lactose and/or
9.5.2.5 Medium for Voges-Proskauer (VP)
positive (lactose and/or
reaction (5.2.10)
sucrose used)
Suspend a loopful of the suspected colony in a sterile
red or unchanged:
lactose and sucrose nega-
tube containing 0,2 ml of the VP medium J5.2.10.1).
tive (neither lactose nor
Incubate at 35 “C or 37 “C (as agreed) for 24 h.
sucrose used)
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SIST ISO 6579:1997
ISO 6579:1993(E)
After incubation, add two drops of the creatine sol-
ution (5.2.10.2), three drops of the ethanolic Solution Table 1
of 1-naphthol (5.2.10.3) and then two drops of the
Percentage
potassium hydroxide Solution (5.2.10.4); Shake after
of
Positive
the addition of each reagent.
Salmonella
0r
Test’) inoculations
negative
showing
The formation of a pink to bright red colour within
reaction
the
15 min indicates a positive reaction.
reaction*)
TSI glucose (acid formation) 100
(9.5.2.1)
9.5.2.6 Medium for indole reaction (5.2.11)
TSI glucose (gas formation) 91,93)
(9.5.2.1)
Inoculate a tube containing 5 ml of the tryptone/
TSI lactose (9.5.2.1) 99,241
tryptophan medium (5.2.11 .l) with the suspected
TSI sucrose (9.5.2.1) 99,5
colony.
TSI hydrogen sulfide (9.5.2.1) 91,6
lncubate at 35 “C or 37 “C (as agreed) for 24 h.
Urea splitting (9.5.2.2) 99
Lysine decarboxylation (9.5.2.3) 94,65)
After incubation, add 1 ml of the Kovacs reagent
/&Galactosidase reaction (9.5.2.4) 98,541
(5.2.11.2).
Voges-Proskauer reaction (9.5.2.5) 100
The formation of a red ring indicates a positive re-
Indole reaction (9.5.2.6) 98,9
action.
1) Ewing W. H. and Ball M. M., The biochemical reactions of
A yellow-brown ring indicates a negative reaction.
members of the genus Salmonella. National Communicable
Disease Center, Atlanta, Georgia, USA (1966).
2) These percentages indicate only that not all strains of
Salmonella show the reactions marked + or -. These per-
9.5.2.7 Interpretation of the biochemical tests
centages may vary from country to country and from food
product to food product.
Salmonella generally s Ihow the reactions given in 3) Salmonella typhi is anaerogenic.
table 1.
4) The Salmonella subgenus Ill (Arizona) gives positive or
negative lactose reactions but is always
b-galactosidase-positive. The Salmonella subgenus I I gives a
negative lactose reaction, but gives a positive fl-galactosidase
reaction. For the study of strains, it may be useful to carry out
complementary biochemical tests.
9.5.3 Serological confirmation
5) S. paratyphi A is negative.
The detection of the presence of Salmonelle 0-, Vi-
and H-antigens is tested by slide agglutination with
the appropriate sera, from pure colonies (9.5.1) and
after auto-agglutinable strains have been eliminated.
9.5.3.2 Examination for 0-antigens
Using one pure colony recognized as non-auto-
agglutinable, proceed according to 9.5.3.1, using one
9.5.3.1 Elimination of auto-agglutinable strains
drop of the anti-0 Serum (5.3) instead of the Saline
Solution.
Place one drop of the Saline Solution (5.2.13) onto a
carefully cleaned glass slide.
lt agglutination occurs, the reaction is considered
positive.
Disperse in this drop part of the colony to be tested,
so as to obtain a homogeneous and turbid suspen-
Use the poly- and monovalent sera one after the
sion.
other.
Rock the slide gently for 30 s to 60 S.
Observe the res& against a dark background, prefer-
9.5.3.3 Examination for Vi-antigens
ably with the aid of a magnifying glass.
Proceed according to 9.5.3.1, but using one drop of
If the bacteria have clumped into more or less distinct
the anti-Vi Serum (5.3) instead of the Saline solution.
units, the strain is considered auto-agglutinable, and
shall not be submitted to the following tests as the
If agglutination occurs, the reaction is considered
detection of the antigens is impossible.
positive.
6
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SIST ISO 6579:1997
to a recognized Salmonelle reference centre for de-
9.5.3.4 Examination for H-antigens
finitive typing.
Inoculate the semi-solid nutrient agar (5.2.12) with a
This dispatch shall be accompanied by all possible in-
pure non-auto-agglutinable colony.
formation concerning the strain(s).
Incubate the medium at 35 “C or 37 “C (as agreed) for
18 h to 24 h.
10 Expression of results
Use this culture for examination for the H-antigens,
In accordance with the results of the interpretation,
proceeding according to 9.5.3.1, but using one drop
indicate the presence or absence of Salmonella in a
of the anti-H Serum (5.3) instead of the Saline Solution.
test Portion of x g of product.
If agglutination occurs, the reaction is considered
positive.
11 Test report
9.5.4 Interpretation of biochemical and
The test report shall specify the method used and the
serological reactions
results obtained. lt shall also mention all operating
conditions not specified in this International Standard,
Table 2 gives the interpretation of the confirmatoty
or regarded as optional, together with details of any
tests (9.5.2 and 9.5.3) carried out on the colonies used
incidents which may have influenced the results.
(9.5.1).
lt shall specify, in particular, the incubation tempera-
ture used, i.e. 35 “C or 37 “C, and, in the case of the
Table 2
selenitelcystine medium, whether the temperature
Biochemical Auto- Serological
was raised to 42 “C.
Interpretation
reactions agglutination reactions
I
The test report shall also state whether a positive re-
sult was obtained only when using a plating-out me-
’ 1 Typical 1 No / kG$fcZ- / Zj~~ELYL)
dium (5.2.4) not specified in this International
Standard.
Typical No All reactions
negative
The test report shall include all information necessary
for the complete identification of the Sample.
Ty pica I Yes Not tested
May be
(see 9.5.3.1)
Salmonella
12 Quality assurance
No typical re- No 0-, Vi- or H-
actions antigen posi-
To check
...
NORME ISO
6579
INTERNATIONALE
Troisième édition
1993-09-01
- Directives générales
Microbiologie
concernant- les méthodes de recherche des
Salmonella
Microbiology - General guidance on methods for the detection of
Salmonella
Numéro de référence
ISO 6579:1993(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 6579:1993(F)
Sommaire
Page
1 Domaine d’application . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
2 Reférences normatives .,. 1
3 Définitions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .~. 1
4 Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
5 Milieux de culture, réactifs et serum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
6 Appareillage et verrerie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
7 Échantillonnage 3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8 Préparation de l’échantillon pour essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
4
9 Mode opératoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10 Expression des resultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
11 Rapport d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
12 Assurance de la qualité .,.,. 8
Annexes
A Schema du mode opératoire ,.,.*. 9
B Composition et préparation des milieux de culture et des
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
reactif s
. . . . . . . .*.*.*.*. 17
C Spécifications pour le vert brillant
D Methode normalisée d’isolement en stries sur boîtes de milieu
18
gélosé .,.,.,.,,.~.
0 60 1993
Droits de reproduction reserves. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord ecrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une féderation
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’elaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comite membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comite technique crée à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore etroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptes par les comités techniques
sont soumis aux comites membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mites membres votants.
La Norme internationale ISO 6579 a éte Alaboree par le comite technique
lSO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comite SC 9,
Microbiologie.
Cette troisiéme edition annule et remplace la deuxieme edition
(ISO 6579:1990), dont elle constitue une révision technique.
Les annexes A, B et C font partie intégrante de la présente Norme inter-
nationale. L’annexe D est donnée uniquement à titre d’information.
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 6579:1993(F)
Introduction
La présente Norme internationale se propose de fournir des directives
générales pour l’examen de produits non concernes par les Normes
internationales existant actuellement, et à prendre en considération par les
organismes élaborant des méthodes d’essais microbiologiques destinees
à être appliquées à des produits alimentaires ou a des aliments pour ani-
maux. En raison de la grande diversité des produits entrant dans ce do-
maine d’application, il est possible que ces directives, dans tous leurs
détails, ne conviennent pas exactement a certains produits et que, pour
certains autres produits, il puisse être nécessaire d’employer des metho-
des différentes. Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les cas, tous
les efforts seront faits pour appliquer, chaque fois qu’il sera possible, les
directives données, et qu’on n’aura recours à des dérogations que si cela
est absolument nécessaire pour des raisons techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-la, a savoir
dans quelle mesure les directives auront éte suivies et les raisons pour
lesquelles il aura ete necessaire d’y déroger dans le cas de produits parti-
culiers.
L’harmonisation des methodes d’essai ne peut pas être immediate et,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales existent
déjà pour le produit à contrôler. Elles devront être appliquées, mais il serait
souhaitable que, lorsqu’elles viendront en révision, elles soient alignées
sur la présente Norme internationale, si bien que finalement les seules
divergences restantes seront celles qui sont necessaires pour des raisons
techniques bien etablies.
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 6579:1993(F)
Microbiologie - Directives générales concernant les
méthodes de recherche des Sahonek
AVERTISSEMENT - Afin de sauvegarder la sante du personnel de laboratoire, il est essentiel que
les essais de recherche des Salmonella ne soient réalises que dans les laboratoires 6quipes à cet
effet et sous la surveillance d’un microbiologiste experimente, et qu’un grand soin soit pris pour
se debarrasser des 6lements incubes.
1 Domaine d’application 3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
La présente Norme internationale donne des directi-
les définitions suivantes s’appliquent.
ves générales concernant les methodes de recherche
des Salmonella.
3.1 Salmonella: Micro-organismes formant des colo-
Compte tenu des remarques signalées dans I’intro-
nies typiques sur des milieux sélectifs solides et pos-
duction, la présente Norme internationale est applica-
biochimiques et
sedant les caractéristiques
ble aux produits destines à la consommation humaine
sérologiques decrites lorsque l’essai est exécute se-
ou à l’alimentation animale.
lon la presente Norme internationale.
La température d’incubation retenue (35 “C ou 37 “C)
3.2 recherche des Salmonella: Determination de la
doit faire l’objet d’un accord entre les parties concer-
présence ou de l’absence de ces micro-organismes,
nees et doit être notee dans le rapport d’essai.
dans une quantité determinee de produit, lorsque
l’essai est execute selon la presente Norme interna-
tionale.
2 Références normatives
4 Principe
Les normes suivantes contiennent des dispositions
La recherche de Salmonella necessite quatre phases
qui, par suite de la reférence qui en est faite, consti-
successives (voir également annexe A).
tuent des dispositions valables pour la présente
Norme internationale. Au moment de la publication,
NOTE 1 Les Salmonella peuvent, en effet, être présentes
les editions indiquées étaient en vigueur. Toute en petit nombre et sont souvent accompagnées d’un nom-
bre beaucoup plus grand d’autres micro-organismes appar-
norme est sujette à révision et les parties prenantes
tenant à la famille des Enterobacteriacezz ou à d’autres
des accords fondes sur la présente Norme internatio-
familles. En consequence, un enrichissement sélectif est
nale sont invitées a rechercher la possibilité d’appli-
nécessaire; de plus, un préenrichissement est aussi souvent
quer les éditions les plus récentes des normes
nécessaire afin de pouvoir rechercher les Salmonella ayant
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO
subi une altération.
possédent le registre des Normes internationales en
vigueur a un moment donne.
4.1 Préenrichissement en milieu non sélectif
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales liquide
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique. Ensemencement de la prise d’essai dans l’eau
peptonée tamponnee (servant également de diluant),
I SO 72 18: 1985, Microbiologie - Directives générales puis incubation à 35 “C ou 37 “C (selon accord) durant
pour les examens microbiologiques. 16 h à 20 h.
---------------------- Page: 5 ----------------------
5.2.2 Premier milieu d’enrichissement sblectif:
4.2 Enrichissement en milieux sélectifs
bouillon au vert malachite au chlorure de
liquides
magnbsium (milieu RV).
Ensemencement d’un bouillon de vert malachite au
Voir article B.2.
chlorure de magnésium et d’un bouillon au sélénite-
cystine avec la culture obtenue en 4.1.
5.2.3 Deuxieme milieu d’enrichissement sélectif:
Incubation du bouillon de vert malachite au chlorure
bouillon au sélénite-cystine.
de magnésium 8 42 “C pendant 24 h et incubation du
bouillon au sélénite-cystine à 35 “C ou 37 “C (selon
Voir article B.3.
accord) durant 24 h et 24 h supplementaires.
5.2.4 Milieux d’isolement selectifs solides.
4.3 Isolement et identification
À partir des cultures obtenues en 4.2, ensemen- 5.2.4.1 Premier milieu: gélose au rouge de
cement de deux milieux selectifs solides: phenol et au vert brillant (Edel et Kampelmacher).
- gélose au rouge de phénol et au vert brillant, à
Voir article B.4.
moins que la Norme internationale concernant le
Ce premier milieu est obligatoire sauf indications
produit à examiner ou toute autre considération
contraires (voir 4.3).
specifique (par exemple isolement de Salmonella
lactose positif) ne nécessite la substitution d’un
autre milieu obligatoire;
5.2.4.2 Deuxième milieu.
- un autre milieu sélectif solide (voir 5.2.4.2).
Le choix du deuxieme milieu est laisse à l’initiative du
laboratoire d’essais, sauf s’il existe une Norme inter-
Incubation a 35 “C ou 37 “C (selon accord) puis exa-
nationale spécifique concernant le produit à examiner
men après 24 h et, si nécessaire, aprés 48 h, pour
et spécifiant la composition de ce deuxieme milieu.
contrôler si l’on est en présence de colonies présu-
mees être des Salmonella, en raison de leurs carac-
téristiques.
5.2.5 Gélose nutritive.
Voir article B.5.
4.4 Confirmation
Repiquage des colonies présumées de Salmonella
5.2.6 Gélose au citrate de fer et aux trois sucres
isolees en 4.3, et confirmation au moyen des essais
(gelose TSI).
biochimiques et sérologiques appropries.
Voir article B.6.
5 Milieux de culture, réactifs et sérum
5.2.7 Gélose a l’urée (Christensen).
Voir article 8.7.
5.1 Généralités
5.2.8 Milieu pour décarboxylation de la L-lysine.
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
I’ISO 7218.
Voir article B.8.
5.2 Milieux de culture et réactifs
5.2.9 Réactif pour la recherche de la
fl-galactosidase, disques de papier tout préparés,
NOTE 2 En raison du nombre important de milieux de
(utilises selon les instructions du fabricant).
culture et de réactifs, il a été jugé préférable pour la clarté
du texte, de donner leur composition et leur préparation
Voir article B.9.
dans l’annexe B.
5.2.10 Réactifs pour la réaction de
5.2.1 Milieu de preenrichissement non selectif:
eau peptonbe tamponnbe. Voges-Proskauer (VP).
Voir article B.10.
Voir article B.1.
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
5.2.10.1 Milieu VP. 6.2 Enceinte de séchage ou étuve, ventilee par
convection réglable entre 37 OC * 1 OC et
55 “C * 1 “C.
5.2.10.2 Solution de créatine
(A/-amidinosarcosine).
6.3 Étuve, réglable à 35 “C & 1 “C ou 37 “C + 1 “C,
selon la température retenue.
5.2.10.3 Solution éthanolique de naphtol-1.
6.4 Bain d’eau, réglable à 42,0 “C k 0,l “C, ou
5.2.10.4 Solution d’hydroxyde de potassium.
étuve, réglable à 42,0 “C If: 0,5 “C.
5.2.11 Réactifs pour la recherche de l’indole.
6.5 Bains d’eau, réglables à 45 “C * 1 OC, à
55 OC * 1 OC et à 70 OC * 1 OC.
Voir article B.11.
6.6 Bain d’eau, réglable à 35 “C + 1 “C ou à
5.2.11 .l Milieu tryptone-tryptophane.
37 OC + 1 OC, selon la température retenue.
5.2.11.2 Réactif de Kovacs (complexe de N,
6.7 Anses bouclées, en platine iridie ou en nickel-
N-dicyclohexylcarbodiimide pentachlorophénol).
chrome, d’environ 3 mm de diametre.
5.2.12 Gélose nutritive semi-solide.
6.8 pH-metre, ayant une precision de réglage de
+ 0,l unité de pH à 25 “C.
Voir article B.12.
6.9 Flacons de culture.
5.2.13 Solution saline.
NOTE 4 Des bouteilles ou flacons à capsules métalliques
Voir article B.13.
ou en matiére plastique à vis non toxiques peuvent être
utilisés.
5.3 Sérums
6.10 Tubes de culture, de 8 mm de diametre et
160 mm de longueur.
On peut trouver dans le commerce plusieurs types
de serums agglutinants contenant des anticorps
contre un ou plusieurs facteurs antigéniques 0,
6.11 Éprouvettes graduées.
c’est-à-dire des anti-serums contenant un ou plusieurs
groupes ((0)) (dénommés anti-sérums ((0))
6.12 Pipettes graduées, de 10 ml et 1 ml de capa-
monovalents ou polyvalents), des anti-sérums Vi et
cites nominales, graduées respectivement en 0,5 ml
des anti-serums contenant des anticorps contre un ou
et 0,l ml.
plusieurs facteurs c
monovalents ou polyvalents).
6.13 Boîtes de Petri, de petites dimensions (dia-
Tous les efforts devront être faits afin de s’assurer mètre de 90 mm à 100 mm) et/ou de grandes di-
que les anti-serums utilisés conviennent pour la re- mensions (diamètre de 140 mm).
cherche de tous les sérotypes de SaImonella. Dans
ce but, on pourra se servir d’anti-sérums préparés par
7 Échantillonnage
un fournisseur dont la competence est reconnue (par
exemple, par un organisme gouvernemental appro-
.
II est important que le laboratoire reçoive un échan-
.
pné)
tillon reellement représentatif, non endommagé ou
modifie lors du transport et de l’entreposage.
6 Appareillage et verrerie
L’echantillonnage ne fait pas partie de la methode
spécifiée dans la présente Norme internationale. Voir
NOTE 3 Le matériel à usage unique est acceptable au
la Norme internationale spécifique du produit
même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications
concerne. S’il n’y a pas de Norme internationale spé-
sont similaires.
cifique disponible, il est recommande que les parties
concernees se mettent d’accord à ce sujet.
Materiel courant de laboratoire de microbiologie, et
.
en particulier, ce suit.
Y
8 Préparation de l’échantillon pour essai
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur se-
Préparer l’échantillon pour essai conformement à la
che (four) ou en chaleur humide (autoclave).
Norme internationale spécifique du produit concerne.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique,
Voir I’ISO 7218.
3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 6579:1993(F)
il est recommandé que les parties concernées se
9.3 Enrichissement sélectif
mettent d’accord à ce sujet.
9.3.1 Transferer 0,l ml de la culture obtenue en 9.2
dans un tube contenant 10 ml du milieu RV (5.2.2),
et 10 ml de la culture obtenue en 9.2 dans un flacon
9 Mode opératoire
contenant 100 ml du milieu au selénite-cystine
(5.2.3).
(Voir le schema en annexe A.)
9.3.2 Incuber les deux milieux ensemences (9.3.1)
de la façon suivante:
9.1 Prise d’essai et suspension mère
a) le milieu RV à 42 OC, pendant 24 h;
b) le milieu au sélénite-cystine à 35 “C ou à 37 “C
9.1.1 Voir I’ISO 6887 et la Norme internationale
(selon accord) pendant 24 h et 24 h supplémen-
concernant le produit à examiner.
taires.
Pour la préparation de la suspension mère, utiliser
NOTE 7 Pour le bouillon au sélénite-cystine, il peut être
comme diluant le milieu de préenrichissement spéci-
intéressant, dans certains cas, d’élever a 42 “C la tempéra-
fie en 5.2.1.
ture d’incubation. Cette modification devra être indiquée
dans le rapport d’essai.
9.1.2 En général, pour préparer la suspension mère,
ajouter une prise d’essai de 25 g dans 225 ml du mi-
9.4 Isolement et identification
lieu de préenrichissement (5.2.1), ce qui correspond
au rapport prise d’essai/milieu de préenrichissement
9.4.1 À partir de la culture obtenue dans le milieu
spécifié dans la présente méthode.
RV après 24 h d’incubation, ensemencer avec une
anse (6.7) la surface d’une grande boîte de Petri
Si la prise d’essai prescrite n’est pas de 25 g, utiliser
(6.13) du premier milieu d’isolement sélectif (en gé-
la quantité nécessaire de milieu de préenrichissement
neral la gélose au rouge de phénol et au vert brillant,
pour obtenir approximativement une dilution au l/lO
voir 5.2.4.1), de façon à permettre le développement
(masse à volume).
de colonies bien isolees.
NOTES
À défaut de grandes boîtes, utiliser deux petites boî-
5 Afin de réduire la somme de travail d’examen, lorsqu’on
tes, l’une après l’autre, en se servant de la même
doit examiner plus d’une prise d’essai de 25 g provenant
anse (voir note 8).
d’un lot déterminé de produit alimentaire, et lorsqu’on dis-
pose de preuves indiquant qu’un mélange (réunissant les
Opérer de même avec le deuxième milieu d’iso-
prises d’essai) ne modifie pas les résultats en ce qui
lement sélectif (5.2.4.2) en se servant d’une nouvelle
concerne ce produit en particulier, les prises d’essai peu-
anse, et de boîtes de Petri de dimensions appro-
vent être mélangées. Par exemple, si l’on doit examiner
priées.
10 prises d’essai de 25 g, combiner ces 10 unités afin
d’obtenir un échantillon composite de 250 g et ajouter
NOTE 8 La méthode suivante d’isolement en stries est
2,25 litres de bouillon de préenrichissement ou bien encore
recommandée lorsqu’on emploie la gélose au rouge de
réunir les portions de 0,l ml (milieu RV) et de 10 ml (milieu
phenol et au vert brillant. Utiliser une anse (6.7) pour deux
au sélénite-cystine) des bouillons de préenrichissement
boîtes. Prélever une gouttelette à la surface du liquide. En-
provenant des 10 prises d’essais séparées (voir 9.3.1) pour
semencer les deux boîtes selon les deux diagrammes de
en enrichir 0,l litre et 1 litre, respectivement, de milieu
l’annexe D. Utiliser la totalite de la boîte; les stries devraient
d’enrichissement sélectif.
être espacées d’environ 0,5 cm. (Ne pas flamber et ne pas
recharger l’anse ni après avoir trace la première strie, ni au
6 Les produits alimentaires séchés ou en poudres peuvent
moment de passer a la seconde boîte.) Lorsqu’on utilise
nécessiter une opération de réhydratation speciale pour
seulement une boîte de grandes dimensions, appliquer la
améliorer la mise en évidence des Salmonella. A cet effet,
méthode d’isolement en stries indiquée pour la première
deux techniques peuvent être utilisées, celle par immersion
boîte en annexe D.
et celle par agitation. Consulter la Norme internationale re-
lative au produit examine. En l’absence d’une telle norme,
il est recommande que les parties concernées parviennent
9.4.2 À partir de la culture obtenue dans le milieu au
à un accord à ce sujet.
sélénite-cystine aprés 24 h d’incubation, répéter les
opérations decrites en 9.4.1 avec les deux milieux
d’isolement selectifs.
9.2 Préenrichissement non sélectif
9.4.3 Retourner les boîtes (9.4.1) et (9.4.2), les pla-
cer dans une étuve (6.3) réglée à 35 “C ou à 37 “C
Incuber la suspension mere à 35 “C ou à 37 “C (selon
(selon accord).
accord), durant au moins 16 h et au plus 20 h.
4
---------------------- Page: 8 ----------------------
9.4.4 Apres une duree totale d’incubation du milieu
9.5.2.1 Gélose TSI (5.2.6)
sélénite-cystine de 48 h (voir 9.3.21, répéter les opé-
rations decrites en 9.4.2 et 9.4.3 .
Ensemencer la pente du milieu en stries et le culot
par piqûre.
9.4.5 Apres 20 h à 24 h d’incubation, examiner les
Incuber à 35 “C ou à 37 “C (selon accord) durant
boîtes (9.4.3 et 9.4.4), afin de rechercher la présence
24 h.
de colonies typiques de Salmonella. Les colonies ty-
piques de Salmonella cultivées sur gélose au vert
Interpréter les phénomènes se produisant, de la façon
brillant et au rouge de phénol provoquent un virage
suivante:
du milieu du rose au rouge.
Culot
9.4.6 Si le développement est faible ou s’il n’y a pas
glucose positif (fermen-
jaune:
de colonies typiques de Salmonella, incuber à nou-
tation du glucose)
veau les boîtes à 35 “C ou à 37 “C (selon accord), du-
rant 18 h à 24 h.
rouge ou inchangé: glucose néga tif (pas de
fermentation glucose)
du
Reexaminer les boîtes afin de rechercher la présence
de colonies typiques de Salmonella.
noir: formation de sulfure d’hy-
drogène s
NOTE 9 II convient de soumettre toute colonie typique
ou suspecte à une confirmation (9.5); en effet, la recon-
naissance de colonies de Salmonella est en grande partie bulles ou fissures: formation de gaz à partir
une question d’expérience et leur aspect peut quelquefois
du glucose
varier non seulement d’une espéce à une autre, ,mais
également d’un lot de milieu de culture à un autre. A cet Pente de la gélose
égard, l’agglutination, à ce stade, des colonies avec un sé-
rum anti-Salmonella polyvalent peut faciliter la reconnais- jaune: lactose et/ou saccharose
sance de colonies suspectes. positifs (utilisation du lac-
tose et/ou du saccharose)
9.4.7 Les galeries d’identification, actuellement dis-
rouge ou inchan- lactose et saccharose ne-
ponibles dans le commerce et permettant d’identifier
.
. gatifs (pas d’utilisation du
les Salmonella, peuvent être utilisees. gée
lactose ni du saccharose)
9.5 Confirmations Les cultures typiques de Salmonella correspondent à
une pente alcaline (rouge) avec formation de gaz et
un culot acide (jaune), avec (dans environ 90 % des
9.5.1 Choix des colonies pour les confirmations
cas) formation de sulfure d’hydrogéne (noircissement
de la gélose).
Pour les confirmations, prelever, à partir de chaque
boîte de chacun des milieux sélectifs (voir 9.4.5 et
Lorsqu’on isole une Salmonella lactose positif (voir
9.4.6 ), cinq colonies considerées comme typiques ou
4.3), la pente de la gélose TSI est jaune. En consé-
suspectes.
quence, une confirmation préliminaire de cultures de
Salmonella ne doit pas être basee uniquement sur les
S’il se trouve une boîte avec moins de cinq colonies
resultats obtenus à partir de la gélose TSI (voir
typiques ou suspectes, retenir toutes les colonies ty-
9.5.3).
piques ou suspectes.
Ensemencer les colonies selectionnées sur la surface
9.5.2.2 Gélose & l’urée (5.2.7)
de boîtes de gélose nutritive (5.2.5), préalablement
séchées, de façon à permettre le développement de
Ensemencer en stries la pente de la gélose.
colonies bien isolees.
Incuber à 35 OC ou à 37 “C (selon accord) durant
Incuber les boîtes ainsi ensemencees à 35 “C ou à
24 h et examiner de temps en temps.
37 “C (selon accord) durant 18 h à 24 h.
En cas de reaction positive, la décomposition de I’uree
Utiliser des cultures pures pour les confirmations bio-
produit un dégagement d’ammoniac, faisant virer le
chimiques et sérologiques.
rouge de phénol au rose, puis au rouge fonce. La re-
action est souvent visible au bout de 2 h à 4 h.
9.5.2 Confirmations biochimiques
9.5.2.3 Milieu de décarboxylation & la L-lysine
A l’aide d’un fil à ensemencement, ensemencer les (5.2.8)
milieux indiqués en 9.5.2.1 à 9.5.2.6 avec chacune
Ensemencer le milieu liquide juste au-dessous de la
des cultures obtenues à partir des colonies retenues
en 9.5.1. surface.
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 6579:1993(F)
Incuber à 35 “C ou à 37 “C (selon accord) durant
La formation d’un anneau rouge indique une réaction
24 h.
positive.
Une couleur violette aprés incubation indique une re-
Un anneau jaune-brun indique une reaction négative.
action positive.
Une couleur jaune indique une réaction négative.
9.5.2.7 Interprétation des essais biochimiques
9.5.2.4 Recherche de la /Ggalactosidase (5.2.9)
Les Salmonella donnent en général les reactions indi-
quées dans le tableau 1.
Mettre en suspension une anse de la colonie sus-
pecte dans un tube contenant 0,25 ml de la solution
Tableau 1
saline (5.2.13).
Pourcentage
Ajouter 1 goutte de toluene et agiter le tube.
d’ensemen-
Réaction cements
Placer le tube dans le bain d’eau (6.6) réglé à 35 “C
positive de
Essail)
ou à 37 “C (selon accord) et l’y laisser séjourner quel-
ou Salmonella
négative
ques minutes. presentant
la
reactionz)
Ajouter 0,25 ml du reactif pour la recherche de la
/‘Ggalactosidase et mélanger.
Glucose, TSI (formation d’acide)
+ 100
(9.521)
Replacer le tube dans le bain d’eau réglé à 35 “C ou
à 37 “C (selon accord), l’y laisser séjourner 24 h en
Glucose, TSI (formation de gaz) 91,93)
(9.521)
l’examinant de temps en temps.
Lactose, TSI (9.521) 99,241
Une couleur jaune indique une reaction positive. La
Saccharose, TSI (9.5.2.1) 99,5
réaction est souvent visible au bout de 20 min.
Sulfure d’hydrogène, TSI (9.5.2.1) 91,6
Dans le cas d’utilisation de disques en papier tout Décomposition de I’uree (9.5.2.2) 99
prépares (5.2.9), suivre les instructions du fabricant.
Décarboxylation à la lysine (9.5.2.3) 94,65)
Reaction à la j?-galactosidase 98,541
(9.5.2.4)
9.5.2.5 Milieu pour la réaction de
Reaction de Voges-Proskauer 100
Voges-Proskauer (VP) (5.2.10)
(9.5.2.5)
-
Recherche de I’indole (9.5.2.6) 98,9
Mettre en suspension une anse de la colonie sus-
pecte dans un tube stérile contenant 0,2 ml du milieu
1) W. H. Ewing and M. M. Bali. The biochemical feactions of
VP (5.2.10.1).
members of the genus Salmonella. National Communicable
Disease Center, Atlanta, Georgia, USA (1966).
Incuber à 35 “C ou à 37 “C (selon accord) durant
2) Ces pourcentages indiquent seulement que toutes les
24 h.
souches de Salmonella ne donnent pas les reactions par + ou
-. Ces pourcentage peuvent varier d’un pays à un autre et d’un
Apres incubation, ajouter deux gouttes de la solution
produit à un autre.
de créatine (5.2.10.2), trois gouttes de la solution
3) La Salmonella typhi est anaerogène.
éthanolique de naphtol-1 (5.2.10.3) et, ensuite, deux
4) Les Salmonella du sous-genre Ill (Arizona) donnent des ré-
gouttes de la solution d’hydroxyde de potassium
actions lactose positives ou négatives mais sont toujours
(5.2.10.4), en agitant après avoir ajoute chaque réactif.
j?-galactosidase positives. Les Salmonella du sous-genre II
donnent une reaction lactose négative, mais donnent une re-
La formation d’une coloration rose à rouge brillant
action b-galactosidase positive. Pour l’étude des souches, il
dans un delai de 15 min indique une réaction positive.
peut être utile d’effectuer des essais biochimiques complé-
mentaires.
5) S. paratyphi A est négatif.
9.5.2.6 Milieu pour la recherche de I’indole
(5.2.11)
Ensemencer un tube contenant 5 ml du milieu
tryptone-tryptophane (5.2.11 .l) avec la colonie sus-
9.5.3 Confirmation sérologique
pecte.
La recherche de la présence des antigènes «O)),
Incuber à 35 “C ou à 37 “C (selon accord) durant
«Vi)), ou «HN des Salmonella est effectuee par une
24 h.
agglutination sur lame avec les sérums appropries, à
Apres incubation, ajouter 1 ml du reactif de Kovacs partir de colonies pures (9.5.1), et aprés elimination
des souches auto-agglutinables.
(5.2.11.2).
6
---------------------- Page: 10 ----------------------
9.5.3.1 Élimination des souches 9.5.4 InterpWation des rdactions biochimiques
auto-agglutinables et sérologiques
Le tableau 2 donne l’interprétation des essais de
Déposer, sur une lame de verre parfaitement propre,
confirmation (9.5.2 et 9.5.3), effectues sur les colo-
1 goutte de la solution saline (5.2.13).
nies retenues (9.5.1).
Disperser, dans cette goutte, une fraction de la colo-
nie à tester, de manière à obtenir une suspension
Tableau 2
homogène et trouble.
Rbactions Auto- Rbactions .
Intebrpr&ation
biochimiques agglutination sbrologiques
Faire osciller la lame durant 30 s à 60 s.
I
Typiques Non
Observer le resultat sur fond noir, de préférence à
l’aide d’une loupe.
Si les bactéries se sont rassemblées en masses plus
ou moins distinctes, la souche est considerée comme
auto-agglutinable et ne doit pas être soumise aux es-
sais suivants, la mise en evidence des antigènes étant
rendue impossible.
9.5.3.2 Mise en Evidence des antigenes «O»
À partir d’une colonie pure reconnue non auto-
tives
agglutinable, opérer comme en 9.5.3.1, mais en utili-
I I
sant une goutte de I’anti-serum ((0)) (5.3) au lieu de
Toutes les Ne sont pas
Pas de réac- Non
la solution saline. rbactions né- considMes
tions typi-
ga tives comme 6tant
ques
des
S’il y a agglutination, la réaction est considerée
Salmonella
comme positive.
Utiliser les serums poly et monovalents l’un aprés
9.5.5 Confirmation dbfinitive
l’autre.
Les souches considerees comme etant des
Salmonella ou comme pouvant être des Salmonella
9.5.3.3 Mise
...
NORME ISO
6579
INTERNATIONALE
Troisième édition
1993-09-01
- Directives générales
Microbiologie
concernant- les méthodes de recherche des
Salmonella
Microbiology - General guidance on methods for the detection of
Salmonella
Numéro de référence
ISO 6579:1993(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 6579:1993(F)
Sommaire
Page
1 Domaine d’application . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
2 Reférences normatives .,. 1
3 Définitions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .~. 1
4 Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
5 Milieux de culture, réactifs et serum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
6 Appareillage et verrerie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
7 Échantillonnage 3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8 Préparation de l’échantillon pour essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
4
9 Mode opératoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10 Expression des resultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
11 Rapport d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
12 Assurance de la qualité .,.,. 8
Annexes
A Schema du mode opératoire ,.,.*. 9
B Composition et préparation des milieux de culture et des
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
reactif s
. . . . . . . .*.*.*.*. 17
C Spécifications pour le vert brillant
D Methode normalisée d’isolement en stries sur boîtes de milieu
18
gélosé .,.,.,.,,.~.
0 60 1993
Droits de reproduction reserves. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord ecrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une féderation
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’elaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comite membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comite technique crée à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore etroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptes par les comités techniques
sont soumis aux comites membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mites membres votants.
La Norme internationale ISO 6579 a éte Alaboree par le comite technique
lSO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comite SC 9,
Microbiologie.
Cette troisiéme edition annule et remplace la deuxieme edition
(ISO 6579:1990), dont elle constitue une révision technique.
Les annexes A, B et C font partie intégrante de la présente Norme inter-
nationale. L’annexe D est donnée uniquement à titre d’information.
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 6579:1993(F)
Introduction
La présente Norme internationale se propose de fournir des directives
générales pour l’examen de produits non concernes par les Normes
internationales existant actuellement, et à prendre en considération par les
organismes élaborant des méthodes d’essais microbiologiques destinees
à être appliquées à des produits alimentaires ou a des aliments pour ani-
maux. En raison de la grande diversité des produits entrant dans ce do-
maine d’application, il est possible que ces directives, dans tous leurs
détails, ne conviennent pas exactement a certains produits et que, pour
certains autres produits, il puisse être nécessaire d’employer des metho-
des différentes. Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les cas, tous
les efforts seront faits pour appliquer, chaque fois qu’il sera possible, les
directives données, et qu’on n’aura recours à des dérogations que si cela
est absolument nécessaire pour des raisons techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-la, a savoir
dans quelle mesure les directives auront éte suivies et les raisons pour
lesquelles il aura ete necessaire d’y déroger dans le cas de produits parti-
culiers.
L’harmonisation des methodes d’essai ne peut pas être immediate et,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales existent
déjà pour le produit à contrôler. Elles devront être appliquées, mais il serait
souhaitable que, lorsqu’elles viendront en révision, elles soient alignées
sur la présente Norme internationale, si bien que finalement les seules
divergences restantes seront celles qui sont necessaires pour des raisons
techniques bien etablies.
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 6579:1993(F)
Microbiologie - Directives générales concernant les
méthodes de recherche des Sahonek
AVERTISSEMENT - Afin de sauvegarder la sante du personnel de laboratoire, il est essentiel que
les essais de recherche des Salmonella ne soient réalises que dans les laboratoires 6quipes à cet
effet et sous la surveillance d’un microbiologiste experimente, et qu’un grand soin soit pris pour
se debarrasser des 6lements incubes.
1 Domaine d’application 3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
La présente Norme internationale donne des directi-
les définitions suivantes s’appliquent.
ves générales concernant les methodes de recherche
des Salmonella.
3.1 Salmonella: Micro-organismes formant des colo-
Compte tenu des remarques signalées dans I’intro-
nies typiques sur des milieux sélectifs solides et pos-
duction, la présente Norme internationale est applica-
biochimiques et
sedant les caractéristiques
ble aux produits destines à la consommation humaine
sérologiques decrites lorsque l’essai est exécute se-
ou à l’alimentation animale.
lon la presente Norme internationale.
La température d’incubation retenue (35 “C ou 37 “C)
3.2 recherche des Salmonella: Determination de la
doit faire l’objet d’un accord entre les parties concer-
présence ou de l’absence de ces micro-organismes,
nees et doit être notee dans le rapport d’essai.
dans une quantité determinee de produit, lorsque
l’essai est execute selon la presente Norme interna-
tionale.
2 Références normatives
4 Principe
Les normes suivantes contiennent des dispositions
La recherche de Salmonella necessite quatre phases
qui, par suite de la reférence qui en est faite, consti-
successives (voir également annexe A).
tuent des dispositions valables pour la présente
Norme internationale. Au moment de la publication,
NOTE 1 Les Salmonella peuvent, en effet, être présentes
les editions indiquées étaient en vigueur. Toute en petit nombre et sont souvent accompagnées d’un nom-
bre beaucoup plus grand d’autres micro-organismes appar-
norme est sujette à révision et les parties prenantes
tenant à la famille des Enterobacteriacezz ou à d’autres
des accords fondes sur la présente Norme internatio-
familles. En consequence, un enrichissement sélectif est
nale sont invitées a rechercher la possibilité d’appli-
nécessaire; de plus, un préenrichissement est aussi souvent
quer les éditions les plus récentes des normes
nécessaire afin de pouvoir rechercher les Salmonella ayant
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO
subi une altération.
possédent le registre des Normes internationales en
vigueur a un moment donne.
4.1 Préenrichissement en milieu non sélectif
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales liquide
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique. Ensemencement de la prise d’essai dans l’eau
peptonée tamponnee (servant également de diluant),
I SO 72 18: 1985, Microbiologie - Directives générales puis incubation à 35 “C ou 37 “C (selon accord) durant
pour les examens microbiologiques. 16 h à 20 h.
---------------------- Page: 5 ----------------------
5.2.2 Premier milieu d’enrichissement sblectif:
4.2 Enrichissement en milieux sélectifs
bouillon au vert malachite au chlorure de
liquides
magnbsium (milieu RV).
Ensemencement d’un bouillon de vert malachite au
Voir article B.2.
chlorure de magnésium et d’un bouillon au sélénite-
cystine avec la culture obtenue en 4.1.
5.2.3 Deuxieme milieu d’enrichissement sélectif:
Incubation du bouillon de vert malachite au chlorure
bouillon au sélénite-cystine.
de magnésium 8 42 “C pendant 24 h et incubation du
bouillon au sélénite-cystine à 35 “C ou 37 “C (selon
Voir article B.3.
accord) durant 24 h et 24 h supplementaires.
5.2.4 Milieux d’isolement selectifs solides.
4.3 Isolement et identification
À partir des cultures obtenues en 4.2, ensemen- 5.2.4.1 Premier milieu: gélose au rouge de
cement de deux milieux selectifs solides: phenol et au vert brillant (Edel et Kampelmacher).
- gélose au rouge de phénol et au vert brillant, à
Voir article B.4.
moins que la Norme internationale concernant le
Ce premier milieu est obligatoire sauf indications
produit à examiner ou toute autre considération
contraires (voir 4.3).
specifique (par exemple isolement de Salmonella
lactose positif) ne nécessite la substitution d’un
autre milieu obligatoire;
5.2.4.2 Deuxième milieu.
- un autre milieu sélectif solide (voir 5.2.4.2).
Le choix du deuxieme milieu est laisse à l’initiative du
laboratoire d’essais, sauf s’il existe une Norme inter-
Incubation a 35 “C ou 37 “C (selon accord) puis exa-
nationale spécifique concernant le produit à examiner
men après 24 h et, si nécessaire, aprés 48 h, pour
et spécifiant la composition de ce deuxieme milieu.
contrôler si l’on est en présence de colonies présu-
mees être des Salmonella, en raison de leurs carac-
téristiques.
5.2.5 Gélose nutritive.
Voir article B.5.
4.4 Confirmation
Repiquage des colonies présumées de Salmonella
5.2.6 Gélose au citrate de fer et aux trois sucres
isolees en 4.3, et confirmation au moyen des essais
(gelose TSI).
biochimiques et sérologiques appropries.
Voir article B.6.
5 Milieux de culture, réactifs et sérum
5.2.7 Gélose a l’urée (Christensen).
Voir article 8.7.
5.1 Généralités
5.2.8 Milieu pour décarboxylation de la L-lysine.
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
I’ISO 7218.
Voir article B.8.
5.2 Milieux de culture et réactifs
5.2.9 Réactif pour la recherche de la
fl-galactosidase, disques de papier tout préparés,
NOTE 2 En raison du nombre important de milieux de
(utilises selon les instructions du fabricant).
culture et de réactifs, il a été jugé préférable pour la clarté
du texte, de donner leur composition et leur préparation
Voir article B.9.
dans l’annexe B.
5.2.10 Réactifs pour la réaction de
5.2.1 Milieu de preenrichissement non selectif:
eau peptonbe tamponnbe. Voges-Proskauer (VP).
Voir article B.10.
Voir article B.1.
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
5.2.10.1 Milieu VP. 6.2 Enceinte de séchage ou étuve, ventilee par
convection réglable entre 37 OC * 1 OC et
55 “C * 1 “C.
5.2.10.2 Solution de créatine
(A/-amidinosarcosine).
6.3 Étuve, réglable à 35 “C & 1 “C ou 37 “C + 1 “C,
selon la température retenue.
5.2.10.3 Solution éthanolique de naphtol-1.
6.4 Bain d’eau, réglable à 42,0 “C k 0,l “C, ou
5.2.10.4 Solution d’hydroxyde de potassium.
étuve, réglable à 42,0 “C If: 0,5 “C.
5.2.11 Réactifs pour la recherche de l’indole.
6.5 Bains d’eau, réglables à 45 “C * 1 OC, à
55 OC * 1 OC et à 70 OC * 1 OC.
Voir article B.11.
6.6 Bain d’eau, réglable à 35 “C + 1 “C ou à
5.2.11 .l Milieu tryptone-tryptophane.
37 OC + 1 OC, selon la température retenue.
5.2.11.2 Réactif de Kovacs (complexe de N,
6.7 Anses bouclées, en platine iridie ou en nickel-
N-dicyclohexylcarbodiimide pentachlorophénol).
chrome, d’environ 3 mm de diametre.
5.2.12 Gélose nutritive semi-solide.
6.8 pH-metre, ayant une precision de réglage de
+ 0,l unité de pH à 25 “C.
Voir article B.12.
6.9 Flacons de culture.
5.2.13 Solution saline.
NOTE 4 Des bouteilles ou flacons à capsules métalliques
Voir article B.13.
ou en matiére plastique à vis non toxiques peuvent être
utilisés.
5.3 Sérums
6.10 Tubes de culture, de 8 mm de diametre et
160 mm de longueur.
On peut trouver dans le commerce plusieurs types
de serums agglutinants contenant des anticorps
contre un ou plusieurs facteurs antigéniques 0,
6.11 Éprouvettes graduées.
c’est-à-dire des anti-serums contenant un ou plusieurs
groupes ((0)) (dénommés anti-sérums ((0))
6.12 Pipettes graduées, de 10 ml et 1 ml de capa-
monovalents ou polyvalents), des anti-sérums Vi et
cites nominales, graduées respectivement en 0,5 ml
des anti-serums contenant des anticorps contre un ou
et 0,l ml.
plusieurs facteurs c
monovalents ou polyvalents).
6.13 Boîtes de Petri, de petites dimensions (dia-
Tous les efforts devront être faits afin de s’assurer mètre de 90 mm à 100 mm) et/ou de grandes di-
que les anti-serums utilisés conviennent pour la re- mensions (diamètre de 140 mm).
cherche de tous les sérotypes de SaImonella. Dans
ce but, on pourra se servir d’anti-sérums préparés par
7 Échantillonnage
un fournisseur dont la competence est reconnue (par
exemple, par un organisme gouvernemental appro-
.
II est important que le laboratoire reçoive un échan-
.
pné)
tillon reellement représentatif, non endommagé ou
modifie lors du transport et de l’entreposage.
6 Appareillage et verrerie
L’echantillonnage ne fait pas partie de la methode
spécifiée dans la présente Norme internationale. Voir
NOTE 3 Le matériel à usage unique est acceptable au
la Norme internationale spécifique du produit
même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications
concerne. S’il n’y a pas de Norme internationale spé-
sont similaires.
cifique disponible, il est recommande que les parties
concernees se mettent d’accord à ce sujet.
Materiel courant de laboratoire de microbiologie, et
.
en particulier, ce suit.
Y
8 Préparation de l’échantillon pour essai
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur se-
Préparer l’échantillon pour essai conformement à la
che (four) ou en chaleur humide (autoclave).
Norme internationale spécifique du produit concerne.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique,
Voir I’ISO 7218.
3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 6579:1993(F)
il est recommandé que les parties concernées se
9.3 Enrichissement sélectif
mettent d’accord à ce sujet.
9.3.1 Transferer 0,l ml de la culture obtenue en 9.2
dans un tube contenant 10 ml du milieu RV (5.2.2),
et 10 ml de la culture obtenue en 9.2 dans un flacon
9 Mode opératoire
contenant 100 ml du milieu au selénite-cystine
(5.2.3).
(Voir le schema en annexe A.)
9.3.2 Incuber les deux milieux ensemences (9.3.1)
de la façon suivante:
9.1 Prise d’essai et suspension mère
a) le milieu RV à 42 OC, pendant 24 h;
b) le milieu au sélénite-cystine à 35 “C ou à 37 “C
9.1.1 Voir I’ISO 6887 et la Norme internationale
(selon accord) pendant 24 h et 24 h supplémen-
concernant le produit à examiner.
taires.
Pour la préparation de la suspension mère, utiliser
NOTE 7 Pour le bouillon au sélénite-cystine, il peut être
comme diluant le milieu de préenrichissement spéci-
intéressant, dans certains cas, d’élever a 42 “C la tempéra-
fie en 5.2.1.
ture d’incubation. Cette modification devra être indiquée
dans le rapport d’essai.
9.1.2 En général, pour préparer la suspension mère,
ajouter une prise d’essai de 25 g dans 225 ml du mi-
9.4 Isolement et identification
lieu de préenrichissement (5.2.1), ce qui correspond
au rapport prise d’essai/milieu de préenrichissement
9.4.1 À partir de la culture obtenue dans le milieu
spécifié dans la présente méthode.
RV après 24 h d’incubation, ensemencer avec une
anse (6.7) la surface d’une grande boîte de Petri
Si la prise d’essai prescrite n’est pas de 25 g, utiliser
(6.13) du premier milieu d’isolement sélectif (en gé-
la quantité nécessaire de milieu de préenrichissement
neral la gélose au rouge de phénol et au vert brillant,
pour obtenir approximativement une dilution au l/lO
voir 5.2.4.1), de façon à permettre le développement
(masse à volume).
de colonies bien isolees.
NOTES
À défaut de grandes boîtes, utiliser deux petites boî-
5 Afin de réduire la somme de travail d’examen, lorsqu’on
tes, l’une après l’autre, en se servant de la même
doit examiner plus d’une prise d’essai de 25 g provenant
anse (voir note 8).
d’un lot déterminé de produit alimentaire, et lorsqu’on dis-
pose de preuves indiquant qu’un mélange (réunissant les
Opérer de même avec le deuxième milieu d’iso-
prises d’essai) ne modifie pas les résultats en ce qui
lement sélectif (5.2.4.2) en se servant d’une nouvelle
concerne ce produit en particulier, les prises d’essai peu-
anse, et de boîtes de Petri de dimensions appro-
vent être mélangées. Par exemple, si l’on doit examiner
priées.
10 prises d’essai de 25 g, combiner ces 10 unités afin
d’obtenir un échantillon composite de 250 g et ajouter
NOTE 8 La méthode suivante d’isolement en stries est
2,25 litres de bouillon de préenrichissement ou bien encore
recommandée lorsqu’on emploie la gélose au rouge de
réunir les portions de 0,l ml (milieu RV) et de 10 ml (milieu
phenol et au vert brillant. Utiliser une anse (6.7) pour deux
au sélénite-cystine) des bouillons de préenrichissement
boîtes. Prélever une gouttelette à la surface du liquide. En-
provenant des 10 prises d’essais séparées (voir 9.3.1) pour
semencer les deux boîtes selon les deux diagrammes de
en enrichir 0,l litre et 1 litre, respectivement, de milieu
l’annexe D. Utiliser la totalite de la boîte; les stries devraient
d’enrichissement sélectif.
être espacées d’environ 0,5 cm. (Ne pas flamber et ne pas
recharger l’anse ni après avoir trace la première strie, ni au
6 Les produits alimentaires séchés ou en poudres peuvent
moment de passer a la seconde boîte.) Lorsqu’on utilise
nécessiter une opération de réhydratation speciale pour
seulement une boîte de grandes dimensions, appliquer la
améliorer la mise en évidence des Salmonella. A cet effet,
méthode d’isolement en stries indiquée pour la première
deux techniques peuvent être utilisées, celle par immersion
boîte en annexe D.
et celle par agitation. Consulter la Norme internationale re-
lative au produit examine. En l’absence d’une telle norme,
il est recommande que les parties concernées parviennent
9.4.2 À partir de la culture obtenue dans le milieu au
à un accord à ce sujet.
sélénite-cystine aprés 24 h d’incubation, répéter les
opérations decrites en 9.4.1 avec les deux milieux
d’isolement selectifs.
9.2 Préenrichissement non sélectif
9.4.3 Retourner les boîtes (9.4.1) et (9.4.2), les pla-
cer dans une étuve (6.3) réglée à 35 “C ou à 37 “C
Incuber la suspension mere à 35 “C ou à 37 “C (selon
(selon accord).
accord), durant au moins 16 h et au plus 20 h.
4
---------------------- Page: 8 ----------------------
9.4.4 Apres une duree totale d’incubation du milieu
9.5.2.1 Gélose TSI (5.2.6)
sélénite-cystine de 48 h (voir 9.3.21, répéter les opé-
rations decrites en 9.4.2 et 9.4.3 .
Ensemencer la pente du milieu en stries et le culot
par piqûre.
9.4.5 Apres 20 h à 24 h d’incubation, examiner les
Incuber à 35 “C ou à 37 “C (selon accord) durant
boîtes (9.4.3 et 9.4.4), afin de rechercher la présence
24 h.
de colonies typiques de Salmonella. Les colonies ty-
piques de Salmonella cultivées sur gélose au vert
Interpréter les phénomènes se produisant, de la façon
brillant et au rouge de phénol provoquent un virage
suivante:
du milieu du rose au rouge.
Culot
9.4.6 Si le développement est faible ou s’il n’y a pas
glucose positif (fermen-
jaune:
de colonies typiques de Salmonella, incuber à nou-
tation du glucose)
veau les boîtes à 35 “C ou à 37 “C (selon accord), du-
rant 18 h à 24 h.
rouge ou inchangé: glucose néga tif (pas de
fermentation glucose)
du
Reexaminer les boîtes afin de rechercher la présence
de colonies typiques de Salmonella.
noir: formation de sulfure d’hy-
drogène s
NOTE 9 II convient de soumettre toute colonie typique
ou suspecte à une confirmation (9.5); en effet, la recon-
naissance de colonies de Salmonella est en grande partie bulles ou fissures: formation de gaz à partir
une question d’expérience et leur aspect peut quelquefois
du glucose
varier non seulement d’une espéce à une autre, ,mais
également d’un lot de milieu de culture à un autre. A cet Pente de la gélose
égard, l’agglutination, à ce stade, des colonies avec un sé-
rum anti-Salmonella polyvalent peut faciliter la reconnais- jaune: lactose et/ou saccharose
sance de colonies suspectes. positifs (utilisation du lac-
tose et/ou du saccharose)
9.4.7 Les galeries d’identification, actuellement dis-
rouge ou inchan- lactose et saccharose ne-
ponibles dans le commerce et permettant d’identifier
.
. gatifs (pas d’utilisation du
les Salmonella, peuvent être utilisees. gée
lactose ni du saccharose)
9.5 Confirmations Les cultures typiques de Salmonella correspondent à
une pente alcaline (rouge) avec formation de gaz et
un culot acide (jaune), avec (dans environ 90 % des
9.5.1 Choix des colonies pour les confirmations
cas) formation de sulfure d’hydrogéne (noircissement
de la gélose).
Pour les confirmations, prelever, à partir de chaque
boîte de chacun des milieux sélectifs (voir 9.4.5 et
Lorsqu’on isole une Salmonella lactose positif (voir
9.4.6 ), cinq colonies considerées comme typiques ou
4.3), la pente de la gélose TSI est jaune. En consé-
suspectes.
quence, une confirmation préliminaire de cultures de
Salmonella ne doit pas être basee uniquement sur les
S’il se trouve une boîte avec moins de cinq colonies
resultats obtenus à partir de la gélose TSI (voir
typiques ou suspectes, retenir toutes les colonies ty-
9.5.3).
piques ou suspectes.
Ensemencer les colonies selectionnées sur la surface
9.5.2.2 Gélose & l’urée (5.2.7)
de boîtes de gélose nutritive (5.2.5), préalablement
séchées, de façon à permettre le développement de
Ensemencer en stries la pente de la gélose.
colonies bien isolees.
Incuber à 35 OC ou à 37 “C (selon accord) durant
Incuber les boîtes ainsi ensemencees à 35 “C ou à
24 h et examiner de temps en temps.
37 “C (selon accord) durant 18 h à 24 h.
En cas de reaction positive, la décomposition de I’uree
Utiliser des cultures pures pour les confirmations bio-
produit un dégagement d’ammoniac, faisant virer le
chimiques et sérologiques.
rouge de phénol au rose, puis au rouge fonce. La re-
action est souvent visible au bout de 2 h à 4 h.
9.5.2 Confirmations biochimiques
9.5.2.3 Milieu de décarboxylation & la L-lysine
A l’aide d’un fil à ensemencement, ensemencer les (5.2.8)
milieux indiqués en 9.5.2.1 à 9.5.2.6 avec chacune
Ensemencer le milieu liquide juste au-dessous de la
des cultures obtenues à partir des colonies retenues
en 9.5.1. surface.
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ISO 6579:1993(F)
Incuber à 35 “C ou à 37 “C (selon accord) durant
La formation d’un anneau rouge indique une réaction
24 h.
positive.
Une couleur violette aprés incubation indique une re-
Un anneau jaune-brun indique une reaction négative.
action positive.
Une couleur jaune indique une réaction négative.
9.5.2.7 Interprétation des essais biochimiques
9.5.2.4 Recherche de la /Ggalactosidase (5.2.9)
Les Salmonella donnent en général les reactions indi-
quées dans le tableau 1.
Mettre en suspension une anse de la colonie sus-
pecte dans un tube contenant 0,25 ml de la solution
Tableau 1
saline (5.2.13).
Pourcentage
Ajouter 1 goutte de toluene et agiter le tube.
d’ensemen-
Réaction cements
Placer le tube dans le bain d’eau (6.6) réglé à 35 “C
positive de
Essail)
ou à 37 “C (selon accord) et l’y laisser séjourner quel-
ou Salmonella
négative
ques minutes. presentant
la
reactionz)
Ajouter 0,25 ml du reactif pour la recherche de la
/‘Ggalactosidase et mélanger.
Glucose, TSI (formation d’acide)
+ 100
(9.521)
Replacer le tube dans le bain d’eau réglé à 35 “C ou
à 37 “C (selon accord), l’y laisser séjourner 24 h en
Glucose, TSI (formation de gaz) 91,93)
(9.521)
l’examinant de temps en temps.
Lactose, TSI (9.521) 99,241
Une couleur jaune indique une reaction positive. La
Saccharose, TSI (9.5.2.1) 99,5
réaction est souvent visible au bout de 20 min.
Sulfure d’hydrogène, TSI (9.5.2.1) 91,6
Dans le cas d’utilisation de disques en papier tout Décomposition de I’uree (9.5.2.2) 99
prépares (5.2.9), suivre les instructions du fabricant.
Décarboxylation à la lysine (9.5.2.3) 94,65)
Reaction à la j?-galactosidase 98,541
(9.5.2.4)
9.5.2.5 Milieu pour la réaction de
Reaction de Voges-Proskauer 100
Voges-Proskauer (VP) (5.2.10)
(9.5.2.5)
-
Recherche de I’indole (9.5.2.6) 98,9
Mettre en suspension une anse de la colonie sus-
pecte dans un tube stérile contenant 0,2 ml du milieu
1) W. H. Ewing and M. M. Bali. The biochemical feactions of
VP (5.2.10.1).
members of the genus Salmonella. National Communicable
Disease Center, Atlanta, Georgia, USA (1966).
Incuber à 35 “C ou à 37 “C (selon accord) durant
2) Ces pourcentages indiquent seulement que toutes les
24 h.
souches de Salmonella ne donnent pas les reactions par + ou
-. Ces pourcentage peuvent varier d’un pays à un autre et d’un
Apres incubation, ajouter deux gouttes de la solution
produit à un autre.
de créatine (5.2.10.2), trois gouttes de la solution
3) La Salmonella typhi est anaerogène.
éthanolique de naphtol-1 (5.2.10.3) et, ensuite, deux
4) Les Salmonella du sous-genre Ill (Arizona) donnent des ré-
gouttes de la solution d’hydroxyde de potassium
actions lactose positives ou négatives mais sont toujours
(5.2.10.4), en agitant après avoir ajoute chaque réactif.
j?-galactosidase positives. Les Salmonella du sous-genre II
donnent une reaction lactose négative, mais donnent une re-
La formation d’une coloration rose à rouge brillant
action b-galactosidase positive. Pour l’étude des souches, il
dans un delai de 15 min indique une réaction positive.
peut être utile d’effectuer des essais biochimiques complé-
mentaires.
5) S. paratyphi A est négatif.
9.5.2.6 Milieu pour la recherche de I’indole
(5.2.11)
Ensemencer un tube contenant 5 ml du milieu
tryptone-tryptophane (5.2.11 .l) avec la colonie sus-
9.5.3 Confirmation sérologique
pecte.
La recherche de la présence des antigènes «O)),
Incuber à 35 “C ou à 37 “C (selon accord) durant
«Vi)), ou «HN des Salmonella est effectuee par une
24 h.
agglutination sur lame avec les sérums appropries, à
Apres incubation, ajouter 1 ml du reactif de Kovacs partir de colonies pures (9.5.1), et aprés elimination
des souches auto-agglutinables.
(5.2.11.2).
6
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9.5.3.1 Élimination des souches 9.5.4 InterpWation des rdactions biochimiques
auto-agglutinables et sérologiques
Le tableau 2 donne l’interprétation des essais de
Déposer, sur une lame de verre parfaitement propre,
confirmation (9.5.2 et 9.5.3), effectues sur les colo-
1 goutte de la solution saline (5.2.13).
nies retenues (9.5.1).
Disperser, dans cette goutte, une fraction de la colo-
nie à tester, de manière à obtenir une suspension
Tableau 2
homogène et trouble.
Rbactions Auto- Rbactions .
Intebrpr&ation
biochimiques agglutination sbrologiques
Faire osciller la lame durant 30 s à 60 s.
I
Typiques Non
Observer le resultat sur fond noir, de préférence à
l’aide d’une loupe.
Si les bactéries se sont rassemblées en masses plus
ou moins distinctes, la souche est considerée comme
auto-agglutinable et ne doit pas être soumise aux es-
sais suivants, la mise en evidence des antigènes étant
rendue impossible.
9.5.3.2 Mise en Evidence des antigenes «O»
À partir d’une colonie pure reconnue non auto-
tives
agglutinable, opérer comme en 9.5.3.1, mais en utili-
I I
sant une goutte de I’anti-serum ((0)) (5.3) au lieu de
Toutes les Ne sont pas
Pas de réac- Non
la solution saline. rbactions né- considMes
tions typi-
ga tives comme 6tant
ques
des
S’il y a agglutination, la réaction est considerée
Salmonella
comme positive.
Utiliser les serums poly et monovalents l’un aprés
9.5.5 Confirmation dbfinitive
l’autre.
Les souches considerees comme etant des
Salmonella ou comme pouvant être des Salmonella
9.5.3.3 Mise
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.