ISO 23305:2020

Fortified milk powders, infant formula and adult nutritionals — Determination of total biotin by liquid chromatography coupled with immunoaffinity column clean-up extraction

This document specifies a method for the quantitative determination of biotin and/or biocytin in fortified milk powders, infant formula and adult nutritionals in solid (i.e. powders) or liquid (i.e. ready-to-feed liquids and liquid concentrates) forms using liquid chromatography coupled with immunoaffinity column clean-up extraction. Precision data from an interlaboratory study is given in Annex B. A comparison between data obtained with the method in this document and EN 15607 is given in Annex C.

Poudres de lait fortifié, formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes — Détermination de la teneur en biotine totale par chromatographie liquide après une purification sur colonne d'immunoaffinité

Le présent document spécifie une méthode de détermination quantitative de la teneur en biotine et/ou biocytine dans les poudres de lait fortifié, les formules infantiles et les produits nutritionnels pour adultes sous formes solides (c'est-à-dire, poudres) ou liquides (c'est-à-dire, liquides et concentrés liquides prêts à l'emploi) par chromatographie liquide après purification sur colonne d'immunoaffinité. Les données de fidélité extraites d'un essai interlaboratoires sont indiquées à l'Annexe B. Une comparaison des données obtenues avec la méthode du présent document et l'EN 15607 est indiquée à l'Annexe C.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 13-Apr-2020
• ICS: 67.100.10 - Milk and processed milk products
• Technical Committee: ISO/TC 34 - Food products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/WG 14 - Vitamins, carotenoids and other nutrients
• Current Stage: 6060 - International Standard published
• Start Date: 14-Apr-2020
• Due Date: 06-Oct-2019
• Completion Date: 14-Apr-2020

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23305
First edition
2020-04
Fortified milk powders, infant
formula and adult nutritionals —
Determination of total biotin by
liquid chromatography coupled with
immunoaffinity column clean-up
extraction
Poudres de lait fortifié, formules infantiles et produits nutritionnels
pour adultes — Détermination de la teneur en biotine totale
par chromatographie liquide après une purification sur colonne
d'immunoaffinité
Reference number
ISO 23305:2020(E)
©
ISO 2020

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ISO 23305:2020(E)

COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
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ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: [phone]
Fax: [phone]
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
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ISO 23305:2020(E)

Contents Page
Foreword .iv
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Terms and definitions .1
4 Principle .1
5 Reagents and materials .2
5.1 General . 2
5.2 Reagent preparation. 2
5.3 Standard preparation . 3
5.4 Calculation of concentration . 4
6 Apparatus .4
7 Procedure.5
7.1 Sample preparation . 5
7.2 Chromatography . 6
7.3 Quality control . 7
8 Calculations.7
9 Precision .8
9.1 General . 8
9.2 Repeatability . 8
9.3 Reproducibility . 8
10 Uncertainty of measurement .8
11 Limit of quantitation .9
Annex A (informative) Example chromatograms .10
Annex B (informative) Precision data .12
Annex C (informative) Comparison between this document and EN 15607 .14
Bibliography .16
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ISO 23305:2020(E)

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, in collaboration with
AOAC INTERNATIONAL. It is being published by ISO and separately by AOAC INTERNATIONAL. The
method described in this document is equivalent to the AOAC Official Method 2016.02: Determination
of Total Biotin by Liquid Chromatography Coupled with Immunoaffinity Column Cleanup Extraction:
Multilaboratory Testing, Final Action 2016.02.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23305:2020(E)
Fortified milk powders, infant formula and adult
nutritionals — Determination of total biotin by liquid
chromatography coupled with immunoaffinity column
clean-up extraction
WARNING — The use of this method can involve hazardous materials, operations and equipment.
This method does not purport to address all the safety problems associated with its use. It is the
responsibility of the user of this method to establish appropriate safety and health practices
and determine the applicability of regulatory limitations prior to use.
1 Scope
This document specifies a method for the quantitative determination of biotin and/or biocytin in
fortified milk powders, infant formula and adult nutritionals in solid (i.e. powders) or liquid (i.e.
ready-to-feed liquids and liquid concentrates) forms using liquid chromatography coupled with
immunoaffinity column clean-up extraction.
Precision data from an interlaboratory study is given in Annex B. A comparison between data obtained
with the method in this document and EN 15607 is given in Annex C.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
adult nutritional
nutritionally complete, specially formulated food, consumed in liquid form, which may constitute the
sole source of nourishment, made from any combination of milk, soy, rice, whey, hydrolysed protein,
starch and amino acids, with and without intact protein
3.2
infant formula
breast-milk substitute specially manufactured to satisfy, by itself, the nutritional requirements of
infants during the first months of life up to the introduction of appropriate complementary feeding
[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
4 Principle
The sample is dispersed in sodium phosphate buffer and autoclaved at 121 °C ± 2 °C for 25 min. The
sample is cooled to room temperature and then diluted to 100 ml in a volumetric flask. The extract
is centrifuged and filtered using a glass microfibre filter. Clear filtrate is collected for clean-up and
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extraction. A biotin immunoaffinity column is mounted onto a solid phase extraction (SPE) manifold. A
disposable syringe barrel is connected to the immunoaffinity column as a reservoir. The buffer in the
affinity column is drained and the sample filtrate is loaded through the reservoir and allowed to flow
through by gravity. The column is washed with phosphate-buffered saline (PBS) followed by water. Air
is passed through the column to remove residual liquid.
Biotin and/or biocytin from the column is eluted with methanol and collected in a vial. The eluate is
evaporated to dryness using a heating block set at 85 °C ± 5 °C under a gentle stream of nitrogen and
the sample is re-constituted in 1 ml of water. The biotin and biocytin in the reconstituted sample are
analysed simultaneously by HPLC using a photodiode array (PDA) set at 200 nm. Identification of peaks
is based on absolute retention time. Quantification is by multipoint external calibration using peak area
responses of the analytes. A spectrum scan (200 nm to 350 nm) can be used for the purity and identity
confirmation as required.
5 Reagents and materials
5.1 General
During the analysis, unless otherwise stated, only use reagents of recognized analytical grade and
distilled or demineralized water or water of equivalent purity.
5.1.1 Laboratory reagent grade water.
5.1.2 Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (CAS # 13472-35-0).
5.1.3 Disodium hydrogen phosphate dihydrate (CAS # 10028-24-7).
5.1.4 Sodium hydroxide (CAS #1310-73-2).
5.1.5 Methanol, HPLC grade (CAS # 67-56-1).
5.1.6 Acetonitrile, HPLC grade (CAS # 75-05-8).
5.1.7 Ortho-phosphoric acid, mass fraction w (H PO ) = 85 % (CAS # 7664-38-2).
3 4
1)
5.1.8 PBS, pH = 7,4 (Thermo Scientific or equivalent).
1)
5.1.9 Biotin, purity ≥ 99 % (Cat. No. B4501 Sigma Chemical or equivalent).
1)
5.1.10 Biocytin, purity ≥ 98 % (Cat. No. B4261 Sigma Chemical or equivalent).
5.2 Reagent preparation
5.2.1 Sodium hydroxide, substance concentration c = 2 mol/l.
Weigh 80 g of sodium hydroxide into a 1 l volumetric flask, dissolve and make up to the mark with water.
1) This is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product. Equivalent products may be
used if they can be shown to lead to the same results.
2 © ISO 2020 – All rights reserved

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5.2.2 Sodium phosphate buffer, c = 0,15 mol/l.
Weigh 9,15 g of sodium dihydrogen phosphate dihydrate and 16,31 g of disodium hydrogen phosphate
dihydrate into a 1 l volumetric flask, dissolve and make up to the mark with water. Adjust the pH to 7
with 2 mol/l sodium hydroxide.
5.2.3 Phosphoric acid, w = 0,1 %.
Into a 1 l volumetric flask, transfer 500 ml water. Add 1,2 ml of ortho-phosphoric acid. Mix and make up
to the mark with water.
5.2.4 Mobile phase A, 0,1 % phosphoric acid in water.
5.2.5 Mobile phase B, 100 % acetonitrile.
5.2.6 Mobile phase C, 80 % acetonitrile.
5.3 Standard preparation
5.3.1 Stock standard biotin, mass concentration ρ = 100 μg/ml.
Weigh 25 mg biotin standard in a 250 ml amber volumetric flask. Add 150 ml water and sonicate at
room temperature for 90 min with occasional shaking. Make up to volume with water.
5.3.2 Stock standard biocytin, ρ = 100 μg/ml.
Weigh 10 mg biocytin standard in a 100 ml amber volumetric flask. Add 60 ml water and sonicate at
room temperature for 90 min with occasional shaking. Make up to volume with water.
5.3.3 Mixed intermediate standard, ρ = 100 μg/100 ml.
Dilute 1 ml each of stock standards to 100 ml with water.
5.3.4 Calibration standard 1, ρ = 1,0 μg/100 ml.
Dilute 100 μl mixed intermediate standard to 10 ml with water.
5.3.5 Calibration standard 2, ρ = 2,5 μg/100 ml.
Dilute 250 μl mixed intermediate standard to 10 ml with water.
5.3.6 Calibration standard 3, ρ = 5,0 μg/100 ml.
Dilute 500 μl mixed intermediate standard to 10 ml with water.
5.3.7 Calibration standard 4, ρ = 7,5 μg/100 ml.
Dilute 750 μl mixed intermediate standard to 10 ml with water.
5.3.8 Calibration standard 5, ρ = 10 μg/100 ml.
Dilute 1 ml mixed intermediate standard to 10 ml with water.
5.3.9 Calibration standard 6, ρ = 20 μg/100 ml.
Dilute 2 ml mixed intermediate standard to 10 ml with water.
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5.4 Calculation of concentration
The concentrations given in 5.3 are indicative only. Calculate the actual concentrations of biotin and
biocytin in each calibration standard, in μg/100 ml, using Formula (1). Calibration standards should be
bracketed at the beginning and at the end of an analytical run.
()mP××10×V
1 is
ρ = (1)
(biotin/biocytin)
()V×10
where
m is the mass o
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 23305
Première édition
2020-04
Poudres de lait fortifié, formules
infantiles et produits nutritionnels
pour adultes — Détermination
de la teneur en biotine totale par
chromatographie liquide après
une purification sur colonne
d'immunoaffinité
Fortified milk powders, infant formula and adult nutritionals —
Determination of total biotin by liquid chromatography coupled with
immunoaffinity column clean-up extraction
Numéro de référence
ISO 23305:2020(F)
©
ISO 2020

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ISO 23305:2020(F)

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
Fax: [phone]
E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
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ISO 23305:2020(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs et matériaux . 2
5.1 Généralités . 2
5.2 Préparation des réactifs . 3
5.3 Préparation des solutions étalons . 3
5.4 Calcul de la concentration . 4
6 Appareillage . 4
7 Mode opératoire. 5
7.1 Préparation de l’échantillon . 5
7.2 Chromatographie . 7
7.3 Contrôle qualité . 7
8 Calculs . 8
9 Fidélité . 9
9.1 Généralités . 9
9.2 Répétabilité . 9
9.3 Reproductibilité . 9
10 Incertitude de mesure . 9
11 Limites de quantification . 9
Annexe A (informative) Exemples de chromatogrammes .10
Annexe B (informative) Données de fidélité .12
Annexe C (informative) Comparaison entre le présent document et l’EN 15607 .14
Bibliographie .16
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ISO 23305:2020(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, en
collaboration avec l’AOAC INTERNATIONAL. Il est publié par l’ISO, et séparément par l’AOAC
INTERNATIONAL. La méthode décrite dans le présent document est l’équivalent de la méthode officielle
de l’AOAC 2016.02: Determination of Total Biotin by Liquid Chromatography Coupled with Immunoaffinity
Column Cleanup Extraction: Multilaboratory Testing, Final Action 2016.02.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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NORME INTERNATIONALE ISO 23305:2020(F)
Poudres de lait fortifié, formules infantiles et produits
nutritionnels pour adultes — Détermination de la teneur
en biotine totale par chromatographie liquide après une
purification sur colonne d'immunoaffinité
AVERTISSEMENT — La présente méthode peut impliquer l’utilisation de produits dangereux
et la mise en œuvre de modes opératoires et d’appareillage à caractère dangereux. La
présente méthode n’est pas destinée à traiter de tous les problèmes de sécurité liés à son
utilisation. Il incombe à l’utilisateur de la présente méthode d’établir, avant de l’utiliser, des
pratiques d’hygiène et de sécurité appropriées et de déterminer l’applicabilité des restrictions
réglementaires.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de détermination quantitative de la teneur en biotine
et/ou biocytine dans les poudres de lait fortifié, les formules infantiles et les produits nutritionnels
pour adultes sous formes solides (c’est-à-dire, poudres) ou liquides (c’est-à-dire, liquides et concentrés
liquides prêts à l’emploi) par chromatographie liquide après purification sur colonne d’immunoaffinité.
Les données de fidélité extraites d’un essai interlaboratoires sont indiquées à l’Annexe B. Une
comparaison des données obtenues avec la méthode du présent document et l’EN 15607 est indiquée à
l’Annexe C.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
produit nutritionnel pour adultes
aliment spécialement formulé, complet sur le plan nutritionnel, consommé sous forme liquide, qui peut
constituer la seule source d’alimentation, constitué de n’importe quelle combinaison de lait, soja, riz,
lactosérum, protéine hydrolysée, amidon et acides aminés, avec et sans protéine intacte
3.2
formule infantile
substitut du lait maternel spécialement fabriqué pour satisfaire, à lui seul, les besoins nutritionnels
des nourrissons pendant les premiers mois de leur vie jusqu’à l’introduction d’une alimentation
complémentaire appropriée
[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
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ISO 23305:2020(F)

4 Principe
Dispersion de l’échantillon dans un tampon phosphate de sodium et passage à l’autoclave à 121 °C ± 2 °C
pendant 25 min. Refroidissement de l’échantillon à température ambiante puis dilution à 100 ml dans
une fiole jaugée. Centrifugation et filtration de l’extrait à l’aide d’un filtre en microfibres de verre.
Collecte du filtrat limpide en vue de sa purification et de son extraction. Montage d’une colonne
d’immunoaffinité pour la biotine sur un collecteur d’extraction en phase solide (SPE). Raccordement
d’un corps de seringue jetable à la colonne d’immunoaffinité en tant que réservoir. Élimination du
tampon présent dans la colonne d’affinité, dépôt du filtrat d’échantillon à travers le réservoir et
écoulement par gravité. Lavage de la colonne avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
puis avec de l’eau. Introduction d’air dans la colonne pour éliminer le liquide résiduel.
Élution de la biotine et/ou biocytine de la colonne avec du méthanol et collecte dans un flacon.
Évaporation à sec de l’éluat à l’aide d’un bloc chauffant réglé à 85 °C ± 5 °C sous un léger flux d’azote
et reconstitution de l’échantillon dans 1 ml d’eau. Analyse simultanée par CLHP de la biotine et de
la biocytine dans l’échantillon reconstitué à l’aide d’un détecteur à barrette de diodes (PDA) réglé à
200 nm. Identification des pics d’après le temps de rétention absolu. Quantification par étalonnage
externe multipoint à l’aide des réponses des aires de pic des analytes. Possibilité d’utiliser un spectre
(200 nm à 350 nm) pour confirmer la pureté et l’identité selon les exigences.
5 Réactifs et matériaux
5.1 Généralités
Pendant l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnue, et de l’eau distillée ou déminéralisée ou de l’eau d’une pureté équivalente.
5.1.1 Eau de qualité pour laboratoire.
5.1.2 Dihydrogénophosphate de sodium dihydraté (CAS n° 13472-35-0).
5.1.3 Hydrogénophosphate de disodium dihydraté (CAS n° 10028-24-7).
5.1.4 Hydroxyde de sodium (CAS n° 1310-73-2).
5.1.5 Méthanol, de qualité CLHP (CAS n° 67-56-1).
5.1.6 Acétonitrile, de qualité CLHP (CAS n° 75-05-8).
5.1.7 Acide orthophosphorique, fraction massique w (H PO ) = 85 % (CAS n° 7664-38-2).
3 4
1)
5.1.8 PBS, pH = 7,4 (Thermo Scientific ou équivalent).
1)
5.1.9 Biotine, pureté ≥ 99 % (réf. B4501 Sigma Chemical ou équivalent).
1)
5.1.10 Biocytine, pureté ≥ 98 % (réf. B4261 Sigma Chemical ou équivalent).
1) Il s’agit d’un exemple d’un produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée par
souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de
l’ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux
mêmes résultats.
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5.2 Préparation des réactifs
5.2.1 Hydroxyde de sodium, concentration c = 2 mol/l.
Peser 80 g d’hydroxyde de sodium dans une fiole jaugée de 1 l, dissoudre et compléter au volume avec
de l’eau.
5.2.2 Tampon phosphate de sodium, c = 0,15 mol/l.
Peser 9,15 g de dihydrogénophosphate de sodium dihydraté et 16,31 g d’hydrogénophosphate de
disodium dihydraté dans une fiole jaugée de 1 l, dissoudre et compléter au volume avec de l’eau. Ajuster
le pH à 7 avec la solution d’hydroxyde de sodium à 2 mol/l.
5.2.3 Acide phosphorique, w = 0,1 %.
Dans une fiole jaugée de 1 l, transvaser 500 ml d’eau. Ajouter 1,2 ml d’acide orthophosphorique.
Mélanger et compléter au volume avec de l’eau.
5.2.4 Phase mobile A, 0,1 % d’acide phosphorique dans l’eau.
5.2.5 Phase mobile B, 100 % d’acétonitrile.
5.2.6 Phase mobile C, 80 % d’acétonitrile.
5.3 Préparation des solutions étalons
5.3.1 Solution mère étalon de biotine, concentration massique ρ = 100 μg/ml.
Dans une fiole jaugée ambrée de 250 ml, peser 25 mg de l’étalon de biotine. Ajouter 150 ml d’eau et
passer au bain à ultrasons à température ambiante pendant 90 min en agitant occasionnellement.
Compléter au volume avec de l’eau.
5.3.2 Solution mère étalon de biocytine, ρ = 100 μg/ml.
Dans une fiole jaugée de 100 ml, peser 10 mg d’étalon de biocytine. Ajouter 60 ml d’eau et passer au
bain à ultrasons à température ambiante pendant 90 min en agitant occasionnellement. Compléter au
volume avec de l’eau.
5.3.3 Solution étalon intermédiaire mixte, ρ = 100 μg/100 ml.
Diluer 1 ml de chaque solution mère étalon dans 100 ml d’eau.
5.3.4 Solution d’étalonnage 1, ρ = 1,0 μg/100 ml.
Diluer 100 μl de solution étalon intermédiaire mixte dans 10 ml d’eau.
5.3.5 Solution d’étalonnage 2, ρ = 2,5 μg/100 ml.
Diluer 250 μl de solution étalon intermédiaire mixte dans 10 ml d’eau.
5.3.6 Solution d’étalonnage 3, ρ = 5,0 μg/100 ml.
Diluer 500 μl de solution étalon intermédiaire mixte dans 10 ml d’eau.
© ISO 2020 – Tous droits réservés 3

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ISO 23305:2020(F)

5.3.7 Solution d’étalonnage 4, ρ = 7,5 μg/100 ml.
Diluer 750 μl de solution étalon intermédiaire mixte dans 10 ml d’eau.
5.3.8 Solution d’étalonnage 5, ρ = 10 μg/100 ml.
Diluer 1 ml de solution étalon intermédiaire mixte dans 10 ml d’eau.
5.3.9 Solution d’étalonnage 6, ρ = 20 μg/100 ml.
Diluer 2 ml de solution étalon intermédiaire mixte dans 10 ml d’eau.
5.4 Calcul de la concentration
Les concentrations données en 5.3 sont purement indicatives. Calculer les concentrations réelles
en biotine et en biocytine dans chaque solution d’étalonnage, en μg/100 ml, d’après la Formule (1). Il
convient d’injecter les solutions d’étalonnage au début et en fin de cycle d’analyse.
mP××10×V
()
1 is
ρ = (1)
()biotine/biocytine
V×10
()
où
m est la masse de biotine ou de biocytine, en mg;
1
P est le pourcentage de pureté indiqué par le certificat d’analyse ou vérifié par les
monographies de l’USP/BP/Ph Eur;
V est le volume de solution étalon intermédiaire mixte pour la solution d’étalonnage, en ml;
is
V est le volume de solution mère étalon, V = 250 ml pour la biotine et V = 100 ml pour la
biocytine.
6 Appareillage
Appareillage et verrerie de laboratoire habituels et, en particulier, les éléments suivants.
6.1 Système CLHP, constitué d’un détecteur PDA, d’un système de pompe à gradient basse pression,
d’une unité d’injection d’échantillons, d’une unité de dégazage e
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