ISO 11290-2:2017
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 2: Enumeration method
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 2: Enumeration method
ISO 11290-2:2017 specifies a horizontal method for - the enumeration of L. monocytogenes, and - the enumeration of Listeria spp. (including L. monocytogenes). ISO 11290-2:2017 is applicable to - products intended for human consumption and for the feeding of animals, and - environmental samples in the area of food production and food handling.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes et de Listeria spp. — Partie 2: Méthode de dénombrement
ISO 11290-2:2017 spécifie une méthode horizontale pour: - le dénombrement de L. monocytogenes; et - le dénombrement de Listeria spp. (y compris L. monocytogenes). ISO 11290-2:2017 s'applique aux: - produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale; et - échantillons de l'environnement de production et de distribution des aliments.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11290-2
Second edition
2017-05
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection
and enumeration of Listeria
monocytogenes and of Listeria spp. —
Part 2:
Enumeration method
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes et de
Listeria spp. —
Partie 2: Méthode de dénombrement
Reference number
ISO 11290-2:2017(E)
©
ISO 2017
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ISO 11290-2:2017(E)
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ISO 11290-2:2017(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Initial suspension . 2
4.3 Surface plating . 2
4.4 Incubation . 2
4.5 Confirmation . 3
4.6 Enumeration . 3
5 Culture media and reagents . 3
6 Equipment and consumables . 3
7 Sampling . 3
8 Preparation of test sample . 4
9 Procedure. 4
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions . 4
9.2 Inoculation and incubation . 4
9.3 Enumeration of characteristic colonies . 4
9.4 Confirmation of L. monocytogenes or Listeria spp. . 5
9.4.1 Selection of colonies for confirmation . 5
9.4.2 Confirmation of L. monocytogenes . 6
9.4.3 Confirmation of Listeria spp. . 9
9.5 Interpretation of morphological and physiological properties and of the
biochemical reactions .10
9.6 Additional characterization of isolated strains (optional) .10
10 Expression of results .10
11 Performance characteristics of the method .10
11.1 Method validation study .10
11.2 Repeatability limit .11
11.3 Reproducibility limit .11
12 Test report .11
13 Quality assurance .12
Annex A (normative) Diagram of procedure .13
Annex B (normative) Composition and preparation of media and reagents .14
Annex C (informative) Distinction of Listeria spp. from other genera .22
Annex D (informative) Reactions for the identification of Listeria species .23
Annex E (informative) Results of interlaboratory studies for enumeration of
Listeria monocytogenes .25
Bibliography .28
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ISO 11290-2:2017(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,
as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the
Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www . i so .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the
agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 11290-2:1998), which has been technically
revised. It also incorporates the amendment ISO 11290-2:1998/Amd.1:2004.
The main changes, compared to ISO 11290-2:1998, are the following.
— The enumeration of Listeria monocytogenes has been modified as listed below.
— Primary suspension with buffered peptone water, half-Fraser broth with or without supplements,
and all appropriate diluents referred to in ISO 6887 (all parts).
— Resuscitation step deleted.
— Microscopic aspect, catalase and CAMP test for confirmation are optional.
— Inclusion of new performance characteristics.
— Moreover, enumeration of Listeria spp. has been included in the scope and the title changed
accordingly.
A list of parts in the ISO 11290 series can be found on the ISO website.
iv © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 11290-2:2017(E)
Introduction
The main changes, listed in the foreword, introduced in this document compared to ISO 11290-2:1998
[28]
are considered as major (see ISO 17468 ). The technical changes were assessed and were considered
to have no significant effect on the method performance characteristics or test results.
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate
in every detail for certain products for which it may be necessary to use different or specific methods.
Nevertheless, in all cases, this horizontal method is intended to be applied as far as possible and
deviations from this only be made for justified technical reasons.
When this document is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from it in
the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain groups of products
International Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this
horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply
with this document so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will
be those necessary for well-established technical reasons.
© ISO 2017 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11290-2:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection and enumeration of Listeria monocytogenes
and of Listeria spp. —
Part 2:
Enumeration method
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests
for detecting L. monocytogenes and Listeria spp. are only undertaken in properly equipped
laboratories, under the control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the
disposal of all incubated materials. Persons using this document should be familiar with
normal laboratory practice. This document does not purport to address all of the safety aspects,
if any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate
safety and health practices. In particular, it is strongly recommended that tests for detecting
L. monocytogenes are undertaken in laboratories providing biosafety level 2 conditions. It is
strongly recommended that female laboratory staff are made aware of the particular risk to the
developing foetus presented by infection of the mother through exposure to L. monocytogenes
and Listeria spp., and that pregnant personnel and persons with recognized underlying
conditions or diseases that impair cell-mediated immunity do not manipulate cultures of
L. monocytogenes and Listeria spp.
1 Scope
This document specifies a horizontal method for
— the enumeration of L. monocytogenes, and
— the enumeration of Listeria spp. (including L. monocytogenes).
This document is applicable to
— products intended for human consumption and for the feeding of animals, and
— environmental samples in the area of food production and food handling.
It is possible that certain additionally described Listeria species may not be enumerated or confirmed
[3],[6],[9],[11]
by this method.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
© ISO 2017 – All rights reserved 1
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ISO 11290-2:2017(E)
ISO 11290-1, Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of
Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
Listeria monocytogenes
microorganisms which form typical colonies on solid selective media described and which display the
morphological, physiological and biochemical characteristics described when the analysis is carried
out in accordance with this document
3.2
enumeration of Listeria monocytogenes
determination of the number of colony-forming units (cfu) of Listeria monocytogenes, per gram, per
millilitre, per square centimetre, or per sampling device when the analysis is carried out in accordance
with this document
3.3
Listeria spp.
microorganisms which form typical colonies on solid selective media and which display the
morphological, physiological and biochemical characteristics described when tests are carried out in
accordance with this document
3.4
enumeration of Listeria spp.
determination of the number of colony-forming units (cfu) of Listeria spp per gram, per millilitre, per
square centimetre, or per sampling device, when the analysis is carried out in accordance with this
document
4 Principle
4.1 General
Within the limits of this document, the enumeration of L. monocytogenes and of Listeria spp. requires
five successive steps, as described in the flowchart in Annex A.
4.2 Initial suspension
Preparation of the initial suspension in an appropriate diluent according to the sample type.
4.3 Surface plating
[13],[14]
Surface plating on Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti of a specified quantity of the
test sample for liquid products or of the initial suspension for other products and/or decimal dilutions
if required.
4.4 Incubation
Incubation of the Petri dishes at 37 °C and examination after 24 h and after a further 24 h.
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ISO 11290-2:2017(E)
4.5 Confirmation
Confirmation of presumptive colonies of L. monocytogenes and/or of presumptive Listeria spp. by means
of appropriate morphological and/or biochemical tests.
4.6 Enumeration
From the number of confirmed colonies, calculation of the number of L. monocytogenes and/or of
Listeria spp. per gram, per millilitre, per square centimetre, or per sampling device.
5 Culture media and reagents
For current laboratory practices, refer to ISO 11133.
Composition of culture media and reagents and their preparation are described in Annex B.
6 Equipment and consumables
Usual microbiological laboratory apparatus (as specified in ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave).
As specified in ISO 7218.
6.2 Drying cabinet or incubator, capable of being maintained between 25 °C and 50 °C.
6.3 Incubators, capable of operating at 37 °C ± 1 °C and 25 °C ± 1 °C (optional).
6.4 Water bath, capable of operating at 47 °C to 50 °C.
6.5 Sterile loops, approximately 3 mm in diameter or 10 µl, and inoculating needle or wire.
6.6 Glass or plastic spreaders, sterile.
6.7 pH meter, capable of being read to the nearest 0,01 pH unit at 25 °C, enabling measurements to be
made which are accurate to ± 0,1 pH unit.
6.8 Total-delivery graduated pipettes or automatic pipettes, of nominal capacities 1 ml and 10 ml.
6.9 Petri dishes, of diameter 90 mm and/or 140 mm.
6.10 Microscope, preferably with phase-contrast, and with slides and cover slips.
6.11 Refrigerator, capable of operating at 5 °C ± 3 °C.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. If there is no specific International
Standard dealing with sampling of the product concerned, it is recommended that the parties
concerned come to an agreement on this subject. For food and feed samples, refer to ISO/TS 17728. For
[23]
environmental samples, use ISO 18593 and see Reference .
It is important that the laboratory receives a sample which is truly representative and has not been
damaged or changed during transport or storage (see ISO 7218).
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ISO 11290-2:2017(E)
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard dealing with the product
concerned [see ISO 6887 (all parts) and ISO 18593]. If there is no specific International Standard, it is
recommended that the parties concerned come to an agreement on this subject.
9 Procedure
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions
Buffered peptone water, as well as other appropriate diluents referred to in ISO 6887 (all parts) and any
specific International Standard appropriate to the product concerned, may be used as diluent for the
initial suspension.
Half-Fraser broth (as specified in ISO 11290-1), supplemented with selective agents or not, may be used
as a diluent for the initial suspension when both the detection method (as specified in ISO 11290-1) and
this enumeration method are carried out on the same test sample. The selective agents should be added
(if required) to the suspension preferentially after enumeration, prior to the detection method.
If supplemented half-Fraser is used, inoculate the plates as soon as possible, up to 45 min.
9.2 Inoculation and incubation
9.2.1 Distribute, by means of a sterile pipette (6.8), 0,1 ml of the initial suspension (or sample if liquid)
and 0,1 ml of further decimal dilutions each inoculated onto the surface of a small dish (90 mm) of Agar
Listeria according to Ottaviani and Agosti (see B.2).
When, for certain products, it is desirable to estimate low numbers of L. monocytogenes and/or Listeria
spp., the limits of detection may be raised by a factor of 10 by examining 1 ml of the test sample if the
initial product is liquid, or 1 ml of the initial suspension for the other products. Distribute the 1 ml of
inoculum either on the surface of a large Petri dish (140 mm) or over the surface of three small dishes
(90 mm), dried beforehand if necessary in the incubator (6.2). If only the initial suspension is used, also
prepare duplicate plates using an additional three small Petri dishes or one large dish of medium (see
ISO 7218).
Repeat the procedure using 0,1 ml of the initial suspension (or sample if liquid) and 0,1 ml of further
decimal dilutions if necessary each inoculated onto the surface of a small dish (90 mm) of agar medium.
9.2.2 Carefully spread the inoculum as quickly as possible over the surface of the agar plate without
touching the sides of the dish with the spreader (6.6). Use a fresh sterile spreader for each dilution. Leave
the plates closed and upright for about 15 min at ambient temperature for the inoculum to be absorbed
into the agar.
It is possible to use the same spreader for all the dishes of a given sample, by beginning with the higher
dilution.
9.2.3 Incubate the Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti plates prepared in 9.2.2 inverted at
37 °C (6.3) for 24 h ± 2 h and for an additional incubation at 37°C for 24 ± 2h.
9.3 Enumeration of characteristic colonies
9.3.1 After incubation for 24 h ± 2 h (before excessive development of colonies with large and
overlapping opaque halos, which may make reading difficult), and for an additional 24 h ± 2 h (which
may allow better development of colonies and of an opaque halo), examine the Petri dishes (9.2.3) for
the presence of presumptive colonies of L. monocytogenes (see 9.3.2) and/or Listeria spp. (see 9.3.3).
4 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 11290-2:2017(E)
9.3.2 Consider as L. monocytogenes the blue-green colonies surrounded by an opaque halo (typical
colonies). Colonies of L. ivanovii are also blue-green and surrounded by an opaque halo.
NOTE 1 Some strains of L. monocytogenes exposed to stress conditions, particularly acid stress, may show a
very weak halo (or even no halo).
NOTE 2 Some rare L. monocytogenes are characterized by a slow PIPLC (phosphatidyl inositol phospholipase
C) activity. Such bacteria are detected when the total duration of incubation is more than, for example, 4 days.
[10]
Some of these strains could be pathogenic. No L. monocytogenes strains have been described as PIPLC negative.
9.3.3 Consider as presumptive Listeria spp. the blue-green colonies with or without opaque halo.
NOTE Some organisms other than Listeria spp. may produce blue colonies on this medium. See Annex C.
9.3.4 Count all the colonies presumed to be L. monocytogenes (9.3.2) on each Petri dish containing
less than 150 L. monocytogenes characteristic colonies, or less than 360 L. monocytogenes characteristic
colonies if 140 mm Petri dishes are used.
9.3.5 Count all the colonies presumed to be Listeria spp. (9.3.3.) on each Petri dish containing less than
150 Listeria spp. characteristic colonies, or less than 360 Listeria spp. characteristic colonies if 140 mm
Petri dishes are used.
In case of mixed cultures of blue-green colonies with or without opaque halo, or in case of blue-
green colonies with large and overlapping opaque halos, it is preferable to count the colonies on each
Petri dish containing less than 100 Listeria spp. characteristic colonies, or less than 240 Listeria spp.
characteristic colonies if 140 mm Petri dishes are used.
9.4 Confirmation of L. monocytogenes or Listeria spp.
9.4.1 Selection of colonies for confirmation
9.4.1.1 Consider each group of three 90 mm Petri dishes used for the initial suspension as one dish.
If on one dish there are fewer than five presumptive colonies, take all of them for confirmation.
9.4.1.2 For confirmation of presumptive L. monocytogenes, take from each Petri dish, representing each
dilution, five colonies in total, representative for each colony type (e.g. with large halo and small halo).
Streak the selected colonies onto the surface of pre-dried plates of a non-selective agar, for example
blood agar, nutrient agar, tryptone soya yeast extract agar (TSYEA) (B.1) in a manner which will allow
isolated colonies to develop.
Use of blood agar for pure culture enables interpretation of haemolysis, when positive, already at
that stage (see 9.4.2.5 and Annex D). If streaking on blood agar does not show haemolysis, then the
haemolysis test shall be done by stabbing (9.4.2.5.2) or in liquid medium (9.4.2.5.3).
Place the Petri dishes in the incubator set at 37°C for 18 h to 24 h or until growth is satisfactory.
If the colonies are not isolated, pick a typical L. monocytogenes colony onto another non-selective dish.
Carry out the following tests (9.4.2) from colonies of a pure culture on the non-selective agar.
9.4.1.3 For confirmation of presumptive Listeria spp. take, from each Petri dish, representing each
dilution, five colonies in total, representative for each colony type (e.g. large and small colonies, with or
without halo).
For confirmation of Listeria spp. use plates of TSYEA.
© ISO 2017 – All rights reserved 5
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ISO 11290-2:2017(E)
Streak the selected colonies onto the surface of pre-dried plates of TSYEA (B.1), in a manner which will
allow isolated colonies to develop.
Place the Petri dishes in the incubator set at 37°C for 18 h to 24 h or until growth is satisfactory.
Typical colonies on TSYEA of Listeria spp. are 1 mm to 2 mm in diameter, convex, colourless and opaque
with an entire edge. When the plates are held to the light (artificial or natural) at about 45 degree angle,
colonies exhibit a blue-grey colour and a granular surface.
If the colonies are not isolated, pick a typical Listeria spp. colony onto another non-selective dish.
Carry out the following tests (9.4.3) from typical colonies of a pure culture on TSYEA.
9.4.2 Confirmation of L. monocytogenes
9.4.2.1 General
Carry out the confirmation tests for L. monocytogenes. Appropriate positive and negative control strains
for each of the confirmation tests shall be used.
Perform at minimum the mandatory tests as listed (in bold) in Table 1.
Table 1 — Confirmation tests for L. monocytogenes
Tests L. monocytogenes confirmation tests Results
Mandatory Beta-haemolysis (9.4.2.4) +
L-Rhamnose (9.4.2.7) +
D-Xylose (9.4.2.7) -
Optional Microscopic aspect (9.4.3.4) Slim short rods or coccobacilli
Catalase (9.4.2.2) +
Motility at 25 °C (9.4.2.3) +
CAMP test (9.4.2.6) +
Details on results for confirmation tests can be found in Annex D.
NOTE An alternative procedure as mentioned in ISO 7218 can be used to confirm the isolate as Listeria
monocytogenes, providing the suitability of the relevant procedure is verified.
If shown to be reliable, miniaturized galleries for the biochemical identification of Listeria monocytogenes
may be used (see ISO 7218).
Rare strains of L. monocytogenes do not show beta-haemolysis or a positive reaction to the CAMP
test under the conditions described in this document. If typical colonies on Agar Listeria according to
Ottaviani and Agosti with PIPLC activity even if it is low, are negative for haemolysis, it is recommended
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11290-2
Deuxième édition
2017-05
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche et le
dénombrement de Listeria
monocytogenes et de Listeria spp. —
Partie 2:
Méthode de dénombrement
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of
Listeria spp. —
Part 2: Enumeration method
Numéro de référence
ISO 11290-2:2017(F)
©
ISO 2017
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ISO 11290-2:2017(F)
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© ISO 2017, Publié en Suisse
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 11290-2:2017(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Suspension mère . 2
4.3 Ensemencement en surface . 2
4.4 Incubation . 2
4.5 Confirmation . 3
4.6 Dénombrement . 3
5 Milieux de culture et réactifs . 3
6 Matériel et consommables . 3
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
9 Mode opératoire. 4
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions . 4
9.2 Inoculation et incubation . 4
9.3 Dénombrement des colonies caractéristiques . 5
9.4 Confirmation de L. monocytogenes ou Listeria spp. . 5
9.4.1 Sélection des colonies pour confirmation . 5
9.4.2 Confirmation de L. monocytogenes . 6
9.4.3 Confirmation de Listeria spp. . 10
9.5 Interprétation des propriétés morphologiques et physiologiques et des
réactions biochimiques.11
9.6 Caractérisation supplémentaire de souches isolées (facultative) .11
10 Expression des résultats.11
11 Caractéristiques de performance de la méthode .11
11.1 Étude de validation de la méthode .11
11.2 Limite de répétabilité .11
11.3 Limite de reproductibilité .12
12 Rapport d’essai .12
13 Assurance qualité .12
Annexe A (normative) Logigramme du mode opératoire .13
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux et des réactifs .14
Annexe C (informative) Distinction de Listeria spp. des autres genres .22
Annexe D (informative) Réactions pour l’identification des espèces de Listeria .23
Annexe E (informative) Résultats des études interlaboratoires pour le dénombrement de
Listeria monocytogenes .25
Bibliographie .28
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ISO 11290-2:2017(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien
suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ foreword .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires
— Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le
comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, de l’Organisation
internationale de normalisation (ISO), conformément à l’accord de coopération technique entre l’ISO et
le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11290-2:1998) qui a fait l’objet
d’une révision technique. Elle intègre également l’amendement ISO 11290-2:1998/Amd.1:2004.
Les principales modifications par rapport à ISO 11290-2:1998 sont les suivantes.
— Le dénombrement de Listeria monocytogenes a été modifiée comme indiqué ci-dessous.
— Suspension mère en eau peptonée tamponnée, bouillon Fraser-demi avec ou sans suppléments, et
tout diluant approprié auquel il est fait référence dans l’ISO 6887 (toutes les parties).
— Suppression de l’étape de revivification.
— L’aspect microscopique, la réaction à la catalase et le test de CAMP sont facultatifs pour la
confirmation.
— Inclusion de nouvelles caractéristiques de performance.
— En outre, le dénombrement des Listeria spp. a été inclus dans le domaine d’application et le titre
modifié en conséquence.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 11290 est disponible sur le site web de l’ISO.
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ISO 11290-2:2017(F)
Introduction
Les principales modifications, énumérées dans l’avant-propos, introduites dans ce document
[28
comparativement à l’ISO 11290-2:1998, sont considérées comme majeures (voir l’ISO 17468 ). Les
modifications techniques ont été évaluées et considérées comme n’ayant pas d’effet significatif sur les
caractéristiques de performance de la méthode ou sur les résultats des essais.
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible que cette méthode horizontale
ne convienne pas exactement, dans tous ses détails, pour certains produits pour lesquels il peut être
nécessaire d’employer des méthodes différentes ou spécifiques. Néanmoins, cette méthode horizontale
est destinée à être appliquée chaque fois qu’il sera possible et l’on n’aura recours à des dérogations que
pour des raisons techniques justifiées.
Lorsque le présent document sera réexaminé, il sera tenu compte de tous les renseignements disponibles
à ce moment-là, à savoir dans quelle mesure cette méthode horizontale aura été suivie et les raisons
pour lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être réalisée de façon immédiate et, pour certains
groupes de produits, des Normes internationales et/ou des normes nationales qui ne concordent pas
avec cette présente méthode horizontale existent peut-être déjà. Lorsque de telles normes viendront en
révision, il serait souhaitable de les aligner avec le présent document et de ne conserver que les seules
divergences justifiées indispensables pour des raisons techniques bien établies.
© ISO 2017 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 11290-2:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche et le dénombrement de
Listeria monocytogenes et de Listeria spp. —
Partie 2:
Méthode de dénombrement
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel
que les essais de détection des L. monocytogenes et Listeria spp. ne soient réalisés que dans
des laboratoires équipés à cet effet, sous le contrôle d’un microbiologiste expérimenté, et
qu’un grand soin soit pris lors de l’élimination de tous les éléments incubés. Il convient que
les utilisateurs du présent document maîtrisent les pratiques courantes de laboratoire. Le
présent document ne prétend pas aborder la totalité des aspects liés à la sécurité qui pourraient
découler de son utilisation. Il est de la responsabilité de l’utilisateur d’établir les pratiques de
sécurité et de santé appropriées. Il est en particulier fortement recommandé que les essais de
recherche de L. monocytogenes soient réalisés dans des laboratoires appliquant des conditions
de biosécurité de niveau 2. II est fortement recommandé que le personnel de laboratoire féminin
soit informé du risque particulier pour le fœtus en développement dû à l’infection de la mère par
le biais d’une exposition aux L. monocytogenes et Listeria spp., et que les femmes enceintes ainsi
que le personnel de laboratoire souffrant de pathologies sous-jacentes ou affectant l’immunité
cellulaire ne manipulent pas les cultures de L. monocytogenes et Listeria spp.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour:
— le dénombrement de L. monocytogenes; et
— le dénombrement de Listeria spp. (y compris L. monocytogenes).
Le présent document s’applique aux:
— produits destinés à la consommation humaine ou à l’alimentation animale; et
— échantillons de l’environnement de production et de distribution des aliments.
Il est possible que cette méthode ne permette pas de dénombrer ou de confirmer certaines espèces de
[3],[6],[9],[11]
Listeria récemment décrites .
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
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ISO 11290-2:2017(F)
ISO 11290-1, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le
dénombrement de Listeria monocytogenes et de Listeria spp. — Partie 1: Méthode de recherche
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ .
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp.
3.1
Listeria monocytogenes
micro-organismes formant des colonies typiques sur des milieux sélectifs solides et possédant les
caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques décrites lorsque les essais sont
effectués conformément au présent document
3.2
dénombrement de Listeria monocytogenes
détermination du nombre d’unités formant colonies (UFC) de Listeria monocytogenes, par gramme,
par millilitre, par centimètre carré ou par dispositif de prélèvement, lorsque l’analyse est exécutée
conformément au présent document
3.3
Listeria spp.
micro-organismes formant des colonies typiques sur des milieux sélectifs solides et possédant les
caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques décrites lorsque les essais sont
effectués conformément au présent document
3.4
dénombrement de Listeria spp.
détermination du nombre d’unités formant colonies (UFC) de Listeria spp., par gramme, par millilitre,
par centimètre carré ou par dispositif de prélèvement, lorsque l’analyse est exécutée conformément au
présent document
4 Principe
4.1 Généralités
Dans le cadre du présent document, le dénombrement de L. monocytogenes et de Listeria spp. nécessite
cinq étapes successives, comme décrit dans le logigramme de l’Annexe A.
4.2 Suspension mère
Préparation de la suspension mère dans un diluant approprié selon le type d’échantillon.
4.3 Ensemencement en surface
[13],[14]
Ensemencement en surface sur gélose Listeria selon Ottaviani et Agosti , d’une quantité
déterminée de l’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou de la suspension mère dans le cas
d’autres produits et/ou de dilutions décimales si nécessaire.
4.4 Incubation
Incubation des boîtes de Petri à 37 °C et examen après 24 h et après 24 h supplémentaires.
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ISO 11290-2:2017(F)
4.5 Confirmation
Confirmation des colonies présumées de L. monocytogenes et/ou de Listeria spp. par des essais
morphologiques et/ou biochimiques appropriés.
4.6 Dénombrement
À partir du nombre de colonies confirmées, calcul du nombre de L. monocytogenes et/ou de Listeria spp.
par gramme, par millilitre, par centimètre carré ou par dispositif de prélèvement.
5 Milieux de culture et réactifs
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l’ISO 11133.
La composition des milieux de culture et des réactifs et leur préparation sont décrites à l’Annexe B.
6 Matériel et consommables
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (comme précisé dans l’ISO 7218) et, en particulier, ce
qui suit.
6.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave).
Comme spécifié dans l’ISO 7218.
6.2 Enceinte de séchage ou étuve, pouvant être maintenue à une température comprise entre 25 °C
et 50 °C.
6.3 Étuves, réglables à 37 °C ± 1 °C et 25 °C ± 1 °C (facultatives).
6.4 Bain d’eau, réglable de 47 °C à 50 °C.
6.5 Anses bouclées stériles d’environ 3 mm de diamètre ou de 10 µl, et aiguille ou fil à ensemencer.
6.6 Étaleurs en verre ou en matière plastique, stériles.
6.7 pH-mètre, ayant une précision de lecture de ±0,01 unité pH à 25 °C, permettant de réaliser des
mesures précises à ±0,1 unité pH.
6.8 Pipettes graduées à écoulement total ou pipettes automatiques, de capacités nominales de
1 ml et 10 ml.
6.9 Boîtes de Petri, de 90 mm et/ou 140 mm de diamètre.
6.10 Microscope, de préférence à contraste de phase, avec lames et lamelles couvre-objet.
6.11 Réfrigérateur, réglable à 5 °C ± 3 °C.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode indiquée dans le présent document. S’il n’existe aucune
Norme internationale spécifique pour l’échantillonnage du produit concerné, il convient que les parties
concernées se mettent d’accord à ce sujet. Pour les échantillons d’aliments, consulter l’ISO/TS 17728.
Pour les échantillons d’environnement, voir l’ISO 18593 et voir la Référence [23].
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ISO 11290-2:2017(F)
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou
modifié lors du transport ou du stockage (voir l’ISO 7218).
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique appropriée
au produit concerné [voir l’ISO 6887 (toutes les parties) et l’ISO 18593]. S’il n’existe pas de Norme
internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.
9 Mode opératoire
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions
De l’eau peptonée tamponnée, aussi bien qu’un autre diluant approprié décrit dans l’ISO 6887 (toutes
les parties) ou dans la Norme internationale spécifique du produit concerné, peut être utilisée comme
diluant pour la suspension mère.
Le bouillon Fraser-demi (comme précisé dans l’ISO 11290-1), avec ou sans supplément d’agents
sélectifs, peut être utilisé comme diluant pour la suspension mère lorsque la méthode de recherche
(comme précisée dans l’ISO 11290-1) et la présente méthode de dénombrement sont réalisées sur le
même échantillon pour essai. Il convient d’ajouter les agents sélectifs (si nécessaire) à la suspension, de
préférence après le dénombrement et avant la méthode de recherche.
Si le bouillon Fraser-demi avec supplément est utilisé, ensemencer les boîtes le plus tôt possible, et
jusqu’à 45 min.
9.2 Inoculation et incubation
9.2.1 Répartir, à l’aide d’une pipette stérile (6.8), 0,1 ml de la suspension mère (ou de l’échantillon s’il
s’agit d’un liquide) et 0,1 ml des dilutions décimales suivantes, chacune ensemencée à la surface d’une
petite boîte (90 mm) de gélose Listeria selon Ottaviani et Agosti (voir B.2).
Lorsque, pour certains produits, il est souhaitable d’estimer de faibles nombres de L. monocytogenes
et/ou de Listeria spp., les limites de détection peuvent être augmentées d’un facteur 10 en examinant
1 ml de l’échantillon pour essai si le produit initial est liquide ou 1 ml de la suspension mère pour
les autres produits. Répartir le volume de 1 ml d’inoculum sur la surface d’une grande boîte de Petri
(140 mm) ou sur la surface de trois petites boîtes (90 mm), préalablement séchées si nécessaire dans
une étuve (6.2). Si uniquement la suspension mère est ensemencée, préparer alors des boîtes en double
en utilisant trois autres petites boîtes de Petri ou une autre grande boîte de milieu (voir l’ISO 7218).
Répéter l’opération en utilisant 0,1 ml de la suspension mère (ou de l’échantillon s’il s’agit d’un liquide)
et 0,1 ml des dilutions décimales suivantes, si nécessaire, chacune ensemencée à la surface d’une petite
boîte (90 mm) de milieu gélosé.
9.2.2 Étaler soigneusement l’inoculum le plus rapidement possible sur la surface de la boîte de gélose
en évitant de toucher les bords de la boîte avec l’étaleur (6.6). Utiliser un nouvel étaleur stérile pour
chaque dilution. Laisser les boîtes fermées couvercle au-dessus pendant environ 15 min à température
ambiante pour permettre à l’inoculum d’être absorbé dans la gélose.
Il est possible d’utiliser le même étaleur pour toutes les boîtes d’un échantillon donné, en commençant
par la dilution la plus élevée.
9.2.3 Incuber les boîtes de gélose Listeria selon Ottaviani et Agosti préparées en 9.2.2 retournées à
37 °C (6.3) pendant 24 h ± 2 h et pour une incubation supplémentaire à 37 °C pendant 24 h ± 2 h.
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ISO 11290-2:2017(F)
9.3 Dénombrement des colonies caractéristiques
9.3.1 Après incubation pendant 24 h ± 2 h (avant tout développement excessif de colonies avec
des halos opaques de grande taille et se chevauchant, susceptibles de rendre la lecture difficile), et
pendant 24 h ± 2 h supplémentaires (qui peuvent favoriser le développement de colonies et d’un halo
opaque), examiner les boîtes de Petri (9.2.3) pour détecter les colonies présumées de L. monocytogenes
(voir en 9.3.2) et/ou de Listeria spp. (voir 9.3.3).
9.3.2 Considérer comme L. monocytogenes les colonies bleues-vertes entourées d’un halo opaque
(colonies typiques). Les colonies de L. ivanovii sont également bleues-vertes et entourées d’un halo opaque.
NOTE 1 Certaines souches de L. monocytogenes exposées à des conditions de stress, en particulier à un stress
acide, peuvent être entourées d’un halo très faible (ou même ne montrer aucun halo).
NOTE 2 De rares souches de L. monocytogenes sont caractérisées par une activité PI-PLC (phosphatidylinositol
phospholipase C) lente. De telles bactéries sont détectées lorsque la durée totale de l’incubation est plus longue,
[10]
par exemple 4 jours. Certaines de ces souches peuvent être pathogènes . Aucune souche de L. monocytogenes
n’a été décrite comme étant négative à la phosphatidylinositol phospholipase C.
9.3.3 Considérer comme des Listeria spp. présomptives les colonies bleues-vertes avec ou sans
halo opaque.
NOTE Certains organismes autres que Listeria spp. peuvent donner des colonies bleues sur ce milieu. Voir
l’Annexe C.
9.3.4 Compter toutes les colonies présumées de L. monocytogenes (9.3.2) dans chaque boîte de Petri
contenant moins de 150 colonies caractéristiques de L. monocytogenes, ou moins de 360 colonies
caractéristiques de L. monocytogenes si des boîtes de Petri de 140 mm sont utilisées.
9.3.5 Compter toutes les colonies présumées de Listeria spp. (9.3.3.) dans chaque boîte de
Petri contenant moins de 150 colonies caractéristiques de Listeria spp., ou moins de 360 colonies
caractéristiques de Listeria spp. si des boîtes de Petri de 140 mm sont utilisées.
En cas de cultures mixtes de colonies bleues-vertes avec ou sans halo opaque, ou en cas de colonies
bleues-vertes avec des halos opaques de grande taille et se chevauchant, il est préférable de compter
les colonies dans chaque boîte de Petri contenant moins de 100 colonies caractéristiques de Listeria
spp., ou moins de 240 colonies caractéristiques de Listeria spp. si des boîtes de Petri de 140 mm sont
utilisées.
9.4 Confirmation de L. monocytogenes ou Listeria spp.
9.4.1 Sélection des colonies pour confirmation
9.4.1.1 Considérer chaque groupe de trois boîtes de Petri de 90 mm utilisé pour la suspension mère
comme une boîte.
Si une boîte présente moins de cinq colonies présumées, les prélever toutes pour la confirmation.
9.4.1.2 Pour la confirmation de L. monocytogenes présumées, prélever, à partir de chaque boîte de
Petri, représentant chaque dilution, cinq colonies au total, représentatives de chaque type de colonie
(par exemple, avec un halo de grande taille et avec un halo de petite taille).
Isoler les colonies sélectionnées à la surface de boîtes préalablement séchées de gélose non sélective,
par exemple de la gélose au sang, de la gélose nutritive, de la gélose tryptone soja et extrait de levure
(TSYEA) (B.1), de façon à permettre le développement de colonies isolées.
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L’utilisation de gélose au sang en culture pure permet d’interpréter l’hémolyse, si positive, dès ce
stade (voir 9.4.2.5 et Annexe D). Si l’isolement sur gélose au sang ne présente pas d’hémolyse, alors la
recherche de l’hémolyse doit être réalisée par piqûre (9.4.2.5.2) ou dans un milieu liquide (9.4.2.5.3).
Placer les boîtes de Petri dans l’étuve réglée à 37 °C pendant 18 h à 24 h ou jusqu’à un développement
satisfaisant.
Si les colonies ne sont pas isolées, repiquer une colonie typique de L. monocytogenes sur une autre boîte
non sélective.
Effectuer les essais suivants (9.4.2) à partir de colonies d’une culture pure sur gélose non sélective.
9.4.1.3 Pour la confirmation de Listeria spp. présumées, prélever, à partir de chaque boîte de Petri,
représentant chaque dilution,
...
Questions, Comments and Discussion
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