ISO 20639:2015

Infant formula and adult nutritionals — Determination of pantothenic acid by ultra high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry method (UHPLC-MS/MS)

ISO 20639:2015 specifies a method for the quantitative determination of pantothenic acid, excluding bound forms, in infant formula and adult nutritionals (i.e. powders) using ultra high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry method (UHPLC-MS/MS).

Formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes — Détermination de la teneur en acide pantothénique par chromatographie liquide à ultra haute performance et spectrométrie de masse en tandem (CLUHP-SM/SM)

ISO 20639:2015 internationale spécifie une méthode de détermination de la teneur en acide pantothénique, excluant les formes liées, dans les formules infantiles et les produits nutritionnels pour adultes (poudres) par chromatographie liquide ultra haute performance et spectrométrie de masse en tandem (CLUHP-SM/SM).

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 08-Nov-2015
• ICS: 67.050 - General methods of tests and analysis for food products
• Technical Committee: ISO/TC 34 - Food products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/WG 14 - Vitamins, carotenoids and other nutrients
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 23-Apr-2021

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20639
First edition
2015-11-01
Infant formula and adult
nutritionals — Determination
of pantothenic acid by ultra high
performance liquid chromatography
and tandem mass spectrometry
method (UHPLC-MS/MS)
Formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes —
Détermination de la teneur en acide pantothénique par
chromatographie liquide à ultra haute performance et spectrométrie
de masse en tandem (CLUHP-SM/SM)
Reference number
ISO 20639:2015(E)
ISO 2015
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20639:2015(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2015, Published in Switzerland

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. [phone]
Fax [phone]
[e-mail]
www.iso.org
ii © ISO 2015 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20639:2015(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

3 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

4 Reagents and materials ................................................................................................................................................................................. 1

5 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 3

6 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

6.1 Sample preparation ............................................................................................................................................................................ 3

6.1.1 General...................................................................................................................................................................................... 3

6.1.2 Dry blended powder samples ............................................................................................................................... 3

6.1.3 Wet blended powder samples .............................................................................................................................. 4

6.1.4 Liquid samples ................................................................................................................................................................... 4

6.2 Extraction .................................................................................................................................................................................................... 4

6.3 Analysis.......................................................................................................................................................................................................... 4

6.3.1 Chromatographic analysis ....................................................................................................................................... 4

6.3.2 UHPLC conditions ........................................................................................................................................................... 4

6.3.3 MS/MS conditions........................................................................................................................................................... 5

6.3.4 Identification ....................................................................................................................................................................... 5

7 Calculations................................................................................................................................................................................................................ 5

Annex A (informative) Examples of chromatograms ......................................................................................................................... 6

Annex B (informative) Precision data ................................................................................................................................................................. 7

Bibliography ................................................................................................................................................................................................................................ 8

© ISO 2015 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20639:2015(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2. www.iso.org/directives

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received. www.iso.org/patents

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical

Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products in collaboration with AOAC

INTERNATIONAL. It is being published by ISO and separately by AOAC INTERNATIONAL. The method

described in this International Standard is equivalent to the AOAC Official Method 2012.16: Pantothenic

acid (vitamin B ) in infant formula and adult/pediatric nutritional formula ultra high pressure liquid

chromatography — tandem mass spectrometry method.
iv © ISO 2015 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 20639:2015(E)
Infant formula and adult nutritionals — Determination
of pantothenic acid by ultra high performance liquid
chromatography and tandem mass spectrometry method
(UHPLC-MS/MS)

WARNING — The use of this International Standard can involve hazardous materials, operations

and equipment. This International Standard does not purport to address all the safety problems

associated with its use. It is the responsibility of the user of this International Standard to

establish appropriate safety and health practices and determine the applicability of regulatory

limitations prior to use.
1 Scope

This International Standard specifies a method for the quantitative determination of pantothenic

acid, excluding bound forms, in infant formula and adult nutritionals (i.e. powders) using ultra high

performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry method (UHPLC-MS/MS).

2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
adult nutritional

nutritionally complete, specially formulated food, consumed in liquid form, which may constitute the

sole source of nourishment, made from any combination of milk, soy, rice, whey, hydrolysed protein,

starch and amino acids, with and without intact protein
2.2
infant formula

breast-milk substitute specially manufactured to satisfy, by itself, the nutritional requirements of

infants during the first months of life up to the introduction of appropriate complementary feeding

[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
3 Principle

Pantothenic acid is extracted using a 0,4 mol/l ammonium acetate buffer solution. After filtration, the

final solution is subjected to ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

(UHPLC-MS/MS).
4 Reagents and materials

During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and

distilled or demineralized water or water of equivalent purity.
© ISO 2015 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 20639:2015(E)
4.1 Standards
4.1.1 Calcium d-pantothenate, Sigma or equivalent CAS 137-08-6.
13 15 1)
4.1.2 Calcium pantothenate-[ C , N ], IsoSciences or equivalent CAS 356786-94-2.
6 2

4.2 α-Amylase, Sigma A3176 , from porcine pancreas, about 25 U/mg or equivalent.

4.3 Solvents
4.3.1 Acetonitrile, LC grade or equivalent.
4.4 Ammonium acetate, ACS grade, > 98 % (Fluka 9690) .
4.5 Acetic acid, ACS grade.
4.6 Formic acid, ACS grade.
4.7 1 % Formic acid in water, ACS grade.
4.8 Preparation of standard solutions

4.8.1 Pantothenic acid (PA) stock solution, ρ = 250 μg/ml. Weigh 54,5 mg of calcium pantothenate

(4.1.1) into a 200 ml volumetric flask (take into account the moisture content given in the supplier’s

certificate or dry to constant mass at 105 °C) and dilute to volume with water. Store aliquots at −20 °C.

4.8.2 Pantothenic acid intermediate solution, ρ = 10 μg/ml. Transfer 1 ml of PA stock solution

(4.8.1) into a 25 ml volumetric flask and dilute to volume with water. Sto
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20639
Première édition
2015-11-01
Formules infantiles et produits
nutritionnels pour adultes —
Détermination de la teneur en acide
pantothénique par chromatographie
liquide à ultra haute performance et
spectrométrie de masse en tandem
(CLUHP-SM/SM)
Infant formula and adult nutritionals — Determination of
pantothenic acid by ultra high performance liquid chromatography
and tandem mass spectrometry method (UHPLC-MS/MS)
Numéro de référence
ISO 20639:2015(F)
ISO 2015
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20639:2015(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2015, Publié en Suisse

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. [phone]
Fax [phone]
[e-mail]
www.iso.org
ii © ISO 2015 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20639:2015(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

3 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 1

4 Réactifs et matériaux ....................................................................................................................................................................................... 1

5 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 3

6 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 3

6.1 Préparation de l’échantillon ........................................................................................................................................................ 3

6.1.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 3

6.1.2 Échantillons de poudre mélangés à sec ....................................................................................................... 3

6.1.3 Échantillons de poudre issus d’un mélange par voie humide .................................................. 4

6.1.4 Échantillons liquides .................................................................................................................................................... 4

6.2 Extraction .................................................................................................................................................................................................... 4

6.3 Analyse ........................................................................................................................................................................................................... 4

6.3.1 Analyse chromatographique .................................................................................................................................. 4

6.3.2 Conditions CLUHP ........................................................................................................................................................... 4

6.3.3 Conditions SM/SM .......................................................................................................................................................... 5

6.3.4 Identification ....................................................................................................................................................................... 5

7 Calculs .............................................................................................................................................................................................................................. 5

Annexe A (informative) Exemples de chromatogrammes .............................................................................................................. 7

Annexe B (informative) Données de fidélité ................................................................................................................................................. 8

Bibliographie .............................................................................................................................................................................................................................. 9

© ISO 2015 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20639:2015(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer

un engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à

l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes

de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —

Informations supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, en

collaboration avec l’AOAC INTERNATIONAL. Le document est publié par l’ISO et séparément par l’AOAC

INTERNATIONAL. La méthode décrite dans la présente Norme internationale est équivalente à la

Méthode officielle de l’AOAC 2012.16: Acide pantothénique (vitamine B ) dans les formules infantiles et les

produits nutritionnels pour adultes/pédiatriques par chromatographie liquide ultra haute performance et

spectrométrie de masse en tandem.
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 20639:2015(F)
Formules infantiles et produits nutritionnels pour
adultes — Détermination de la teneur en acide
pantothénique par chromatographie liquide à ultra
haute performance et spectrométrie de masse en tandem
(CLUHP-SM/SM)

AVERTISSEMENT — L’utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer des

matériaux, des opérations et des équipements dangereux. La présente Norme internationale

n’a pas pour but d’aborder tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Avant d’utiliser

la présente Norme internationale, il incombe à l’utilisateur d’établir des pratiques appropriées

de sécurité et de protection de la santé et de déterminer l’applicabilité des restrictions

réglementaires.
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la teneur en acide

pantothénique, excluant les formes liées, dans les formules infantiles et les produits nutritionnels pour

adultes (poudres) par chromatographie liquide ultra haute performance et spectrométrie de masse en

tandem (CLUHP-SM/SM).
2 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

2.1
produit nutritionnel pour adultes

aliment complet sur le plan nutritionnel, spécialement formulé, consommé sous forme liquide, pouvant

constituer la seule source d’alimentation, constitué de n’importe quelle combinaison de lait, soja, riz,

lactosérum, protéine hydrolysée, amidon et acides aminés, avec et sans protéine intacte

2.2
formule infantile

substitut du lait maternel spécialement fabriqué pour satisfaire, par lui-même, les besoins nutritionnels

des nourrissons pendant les premiers mois de la vie jusqu’à l’introduction d’une alimentation

complémentaire appropriée
[SOURCE: Norme Codex 72-1981]
3 Principe

Extraction de l’acide pantothénique au moyen d’une solution tampon d’acétate d’ammonium à 0,4 mol/l.

Après filtration, analyse de la solution finale par chromatographie liquide ultra haute performance et

spectrométrie de masse en tandem (CLUHP-SM/SM).
4 Réactifs et matériaux

Au cours de l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique

reconnue et de l’eau distillée ou déminéralisée ou de l’eau de pureté équivalente.

© ISO 2015 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 20639:2015(F)
4.1 Étalons
4.1.1 d-pantothénate de calcium, Sigma ou l’équivalent CAS 137-08-6.
13 15 1)

4.1.2 Pantothénate de calcium-[ C , N ], IsoSciences ou l’équivalent CAS 356786-94-2.

6 2

4.2 α-Amylase, Sigma A3176 , issue de pancréas porcin, environ 25 U/mg ou l’équivalent.

4.3 Solvants
4.3.1 Acétonitrile, qualité CL ou l’équivalent.
4.4 Acétate d’ammonium, qualité ACS, > 98 % (Fluka 9690) .
4.5 Acide acétique, qualité ACS.
4.6 Acide formique, qualité ACS.
4.7 Acide formique à 1 % dans l’eau, qualité ACS.
4.8 Préparation des solutions étalons

4.8.1 Solution mère d’acide pantothénique (AP), ρ = 250 μg/ml. Peser 54,5 mg de pantothénate de

calcium (4.1.1) dans une fiole jaugée de 200 ml (tenir compte de la teneur en humidité indiquée sur le

certificat du fournisseur ou sécher jusqu’à masse constante à 105 °C) et compléter au volume avec de

l’eau. Conserver des aliquotes à −20 °C.

4.8.2 Solution intermédiaire d’acide pantothénique, ρ = 10 μg/ml. Transférer 1 ml de solution

mère d’AP (4.8.1) dans une fiole jaugée de 25 ml et compléter au volume avec de l’eau. Conserver des

aliquotes à −20 °C.
13 15

4.8.3 Solution mère de pantothénate de calcium-[ C , N ] [EI (étalon interne)], ρ = 20 μg/ml.

6 2
13 15

Peser 5,0 mg de pantothénate de calcium-[ C , N ] (4.1.2) dans une fiole jaugée de 250 ml et compléter

6 2
au volume avec de l’eau. Conserver des aliquotes à −20 °C.

4.8.4 Solutions pour la courbe d’étalonnage à cinq points. Transférer des volumes appropriés

de solution intermédiaire d’AP (10 μg/ml) (4.8.2) da
...