ISO 20638:2015

Infant formula — Determination of nucleotides by liquid chromatography

ISO 20638:2015 specifies a method for the quantitative determination of 5′-mononucleotides in infant formula in solid (i.e. powders) or liquid (i.e. ready-to-feed liquids and liquid concentrates) forms using liquid chromatography.

Formules infantiles — Détermination de la teneur en nucléotides par chromatographie liquide

ISO 20638:2015 spécifie une méthode de dosage des 5′‑mononucléotides dans les formules infantiles sous forme solide (c'est-à-dire les poudres) ou liquide (c'est-à-dire les liquides prêts à servir et les liquides concentrés) par chromatographie liquide.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 08-Nov-2015
• ICS: 67.050 - General methods of tests and analysis for food products
• Technical Committee: ISO/TC 34 - Food products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/WG 14 - Vitamins, carotenoids and other nutrients
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 23-Apr-2021

Relations

• Consolidated By: ISO/IEEE 11073-10101:2020 - Health informatics — Device interoperability — Part 10101: Point-of-care medical device communication — Nomenclature
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20638
First edition
2015-11-01
Infant formula — Determination of
nucleotides by liquid chromatography
Formules infantiles — Détermination de la teneur en nucléotides par
chromatographie liquide
Reference number
ISO 20638:2015(E)
ISO 2015
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ISO 20638:2015(E)
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written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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ISO 20638:2015(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

3 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

4 Reagents and materials ................................................................................................................................................................................. 1

5 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 4

6 Sample preparation ........................................................................................................................................................................................... 4

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 5

7.1 Extraction .................................................................................................................................................................................................... 5

7.2 Chromatography .................................................................................................................................................................................... 5

8 Calculations................................................................................................................................................................................................................ 6

9 Results ............................................................................................................................................................................................................................. 8

Annex A (informative) Examples of chromatograms ........................................................................................................................... 9

Annex B (informative) Precision data ..............................................................................................................................................................10

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................14

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ISO 20638:2015(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2. www.iso.org/directives

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received. www.iso.org/patents

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical

Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products in collaboration with AOAC

INTERNATIONAL. It is being published by ISO and separately by AOAC INTERNATIONAL. The method

described in this International Standard is equivalent to the AOAC Official Method 2011.20: Nucleotides

in infant formula.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20638:2015(E)
Infant formula — Determination of nucleotides by liquid
chromatography

WARNING — The use of this International Standard can involve hazardous materials, operations

and equipment. This International Standard does not purport to address all the safety problems

associated with its use. It is the responsibility of the user of this International Standard to

establish appropriate safety and health practices and determine the applicability of regulatory

limitations prior to use.
1 Scope

This International Standard specifies a method for the quantitative determination of 5′-mononucleotides

in infant formula in solid (i.e. powders) or liquid (i.e. ready-to-feed liquids and liquid concentrates)

forms using liquid chromatography.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
infant formula

breast-milk substitute specially manufactured to satisfy, by itself, the nutritional requirements of

infants during the first months of life up to the introduction of appropriate complementary feeding

[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
3 Principle

The sample is dissolved in high-salt solution to inhibit protein and fat interactions. The

5′-mononucleotides — uridine 5′-monophosphate (UMP), inosine 5′-monophosphate (IMP), adenosine

5′-monophosphate (AMP), guanosine 5′-monophosphate (GMP), and cytidine 5′-monophosphate

(CMP) — are separated from the sample matrix by strong-anion exchange solid-phase extraction (SPE),

followed by chromatographic analysis using a C18 stationary phase with gradient elution, UV detection,

[1]

and quantitation by an internal standard technique using thymidine 5′-monophosphate (TMP).

4 Reagents and materials

During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and

distilled or demineralized water or water of equivalent purity.

4.1 Standards, ≥ 99 % pure (Sigma or equivalent). Nucleotide sodium salts or sodium salt hydrates

may be substituted if free acid forms are not readily available.
4.1.1 TMP, thymidine 5′-monophosphate, CAS No. 365-07-1.
4.1.2 AMP, adenosine 5′-monophosphate, CAS No. 61-19-8.
4.1.3 CMP, cytidine 5′-monophosphate, CAS No. 63-37-6.

1) This is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of

users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products

may be used if they can be shown to lead to the same results.
© ISO 2015 – All rights reserved 1
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ISO 20638:2015(E)
4.1.4 GMP, guanosine 5′-monophosphate, CAS No. 85-32-5.
4.1.5 IMP, inosine 5′-monophosphate, CAS No. 131-99-7.
4.1.6 UMP, uridine 5′-monophosphate, CAS No. 58-97-9.
4.2 Potassium bromide (KBr).
4.3 Potassium dihydrogen phosphate (KH PO ).
2 4
4.4 Orthophosphoric acid (H PO ).
3 4
4.5 Potassium hydroxide (KOH).
4.6 Ethylenediaminetetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA).
4.7 Sodium chloride (NaCl).
4.8 Methanol (CH OH).
4.9 Reagent preparation

4.9.1 Standardizing buffer (KH PO , c = 0,25 mol/l, pH = 3,5). Dissolve 34,0 g KH PO (4.3) in 900 ml

2 4 2 4
water and adjust pH to 3,5 with orthophosphoric acid (4.4). Dilute to 1 l.

4.9.2 Extraction solution (NaCl, c = 1 mol/l, EDTA c = 4 mmol/l). Dissolve 58,5 g NaCl (4.7) and 1,5 g

EDTA (4.6). Dilute in 1 l water.

4.9.3 Wash solution (KBr, c = 0,3 mol/l). Dissolve 3,6 g KBr (4.2) in 100 ml water.

4.9.4 Eluent solution (KH PO , c = 0,5 mol/l, pH = 3,0). Dissolve 6,8 g KH PO (4.3) in 90 ml water

2 4 2 4
and adjust pH to 3,0 with orthophosphoric acid (4.4). Dilute to 100 ml.

4.9.5 Mobile phase A (KH PO , c = 10 mmol/l, pH = 5,6). Dissolve 1,4 g KH PO (4.3) in 900 ml water

2 4 2 4

and adjust pH to 5,6 ± 0,1 with KOH solution (10 % m/v). Dilute to 1 l with water. Make daily as microbial

growth often occurs at room temperature in phosphate buffers that contain little or no organic solvent.

4.9.6 Mobile phase B, 100 % methanol (4.8).
4.10 Standard preparation

4.10.1 Stock standard solutions, ρ approximately 1 mg/ml. Accurately weigh approximately 50 mg

each nucleotide 5′-monophosphate into separate 50 ml volumetric flasks. Add 40 ml water, mix until

dissolved, and make to volume with water.

4.10.2 Purity standard solutions. Pipette 1,0 ml each stock standard (4.10.1) into separate 50 ml

volumetric flasks, make to volume with standardizing buffer (4.9.1), and measure absorbance at the

appropriate λ to determine the concentration of each nucleotide stock standard. See Table 1 and

max
References [1] and [2].
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ISO 20638:2015(E)

Table 1 — UV absorbance maxima and extinction coefficients for nucleotide 5′-monophosphates

max 1%
Nucleotide 5′-monophosphate
1cm
Adenosine 5′-monophosphate 257 428,6
Cytidine 5′-monophosphate 280 390,9
Guanosine 5′-monophosphate 254 392,0
Inosine 5′-monophosphate 249 356,5
Uridine 5′-monophosphate 262 312,7
Thymidine 5′-monophosphate 267 288,5

4.10.3 Internal standard solution, ρ approximately 80 μg/ml. Dilute 4 ml TMP stock standard (4.10.1)

into 50 ml water.

4.10.4 Working standard solution, ρ approximately 40 μg/ml. Pipette 2 ml each stock standard (4.10.1)

(AMP, CMP, GMP, IMP, and UMP) into a single 50 ml volumetric flask and make to volume with water.

4.10.5 Calibration standard solutions. See Table 2 for nominal nucleotide concentrations of the

calibration standard solutions.

4.10.5.1 Calibration standard 1. Pipette 0,25 ml working standard (4.10.4) and 1 ml internal standard

(4.10.3) into a 25 ml volumetric flask and make to volume with water.

4.10.5.2 Calibration standard 2. Pipette 0,5 ml working standard (4.10.4) and 1 ml internal standard

(4.10.3) into a 25 ml volumetric flask and make to volume with water.

4.10.5.3 Calibration standard 3. Pipette 2 ml working standard (4.10.4) and 1 ml internal standard

(4.10.3) into a 25 ml volumetric flask and make to volume with water.

4.10.5.4 Calibration standard 4. Pipette 5 ml working standard (4.10.4) and 1 ml internal standard

(4.10.3) into a 25 ml volumetric flask and make to volume with water.
Table 2 — Nominal concentration of calibration standards
Concentration of each nucleotide:
Calibration Concentration of TMP
AMP, CMP, GMP,IMP, UMP
solution μg/ml
μg/ml
1 0,4 3,2
2 0,8 3,2
3 3,2 3,2
4 8,0 3,2
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ISO 20638:2015(E)
5 Apparatus
Usual laboratory glassware and equipment and, in particular, the following.

5.1 HPLC system, equipped with pump, sample injector unit with a 50 μl injection loop, degasser unit,

column oven, and photodiode array detector.
2) 2)
5.2 C18 column, Gemini C18, 5 μm, 4,6 mm × 250 mm (Phenomenex ).
5.3 Spectrophotometer, capable of digital readout to 3 decimal places.
5.4 pH-meter.
5.5 Centrifuge.
5.6 Centrifuge tubes, Amicon Ultra MWCO 3k, 4 ml (Millipore) .
5.7 Polypropylene centrifuge tubes, capacity 50 ml.
5.8 Disposable syringes, capacity 3 ml.
5.9 Syringe filters, 0,2 μm with cellulose acetate membranes.
5.10 SPE vacuum manifold.

5.11 Polypropylene strong-anion exchange SPE cartridges, 6 ml × 1 000 mg, Chromabond SB .

5.12 Filter membranes, 0,45 μm nylon.
6 Sample preparation
a) Shake or mix sample container prior to opening.

b) Accurately weigh approximately 1 g powder or 10 ml ready-to-feed/liquid milk infant formula into

a 50 ml centrifuge tube.
c) Add 30 ml extraction solution (4.9.2).
d) Add 1,0 ml TMP internal standard (4.10.3).
e) Cap the tube and vortex mix until powder dissolved.
f) Allow sample to stand for 10 min to ensure complete hydration.
g) Dilute to a final volume of approximately 50 ml with water.
h) Cap the tube and vortex mix.

i) For starch based products, transfer 2 × 4 ml of prepared sample to two separate ultra centrifuge

tubes and centrifuge at 3 500g for 60 min, then
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20638
Première édition
2015-11-01
Formules infantiles — Détermination
de la teneur en nucléotides par
chromatographie liquide
Infant formula — Determination of nucleotides by liquid
chromatography
Numéro de référence
ISO 20638:2015(F)
ISO 2015
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ISO 20638:2015(F)
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ISO 20638:2015(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Termes et definitions ....................................................................................................................................................................................... 1

3 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 1

4 Réactifs et matériaux ....................................................................................................................................................................................... 1

5 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 3

6 Préparation des échantillons .................................................................................................................................................................. 4

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 5

7.1 Extraction .................................................................................................................................................................................................... 5

7.2 Chromatographie .................................................................................................................................................................................. 5

8 Calculs .............................................................................................................................................................................................................................. 6

9 Résultats ........................................................................................................................................................................................................................ 8

Annexe A (informative) Exemples de chromatogrammes .............................................................................................................. 9

Annexe B (informative) Données de fidélité ..............................................................................................................................................10

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................14

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ISO 20638:2015(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer

un engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à

l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes

de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —

Informations supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, en

collaboration avec l’AOAC INTERNATIONAL. Le document est publié par l’ISO et séparément par l’AOAC

INTERNATIONAL. La méthode décrite dans la présente Norme internationale est équivalente à la

Méthode officielle de l’AOAC 2011.20: Nucléotides dans les formules infantiles.
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NORME INTERNATIONALE ISO 20638:2015(F)
Formules infantiles — Détermination de la teneur en
nucléotides par chromatographie liquide

AVERTISSEMENT — L’utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer des

matériaux, des opérations et des équipements dangereux. La présente Norme internationale

n’a pas pour but d’aborder tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Avant d’utiliser

la présente Norme internationale, il incombe à l’utilisateur d’établir des pratiques appropriées

de sécurité et de protection de la santé et de déterminer l’applicabilité des restrictions

réglementaires.
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale spécifie une méthode de dosage des 5′‑mononucléotides dans les

formules infantiles sous forme solide (c’est-à-dire les poudres) ou liquide (c’est-à-dire les liquides prêts

à servir et les liquides concentrés) par chromatographie liquide.
2 Termes et definitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

2.1
formule infantile

substitut du lait maternel spécialement fabriqué pour satisfaire, par lui-même, les besoins nutritionnels

des nourrissons pendant les premiers mois de la vie jusqu’à l’introduction d’une alimentation

complémentaire appropriée
[SOURCE: Norme Codex 72-1981]
3 Principe

Dissolution de l’échantillon dans une solution à forte teneur en sels afin d’inhiber les interactions entre

protéines et matières grasses. Séparation des 5’‑mononucléotides — uridine 5’‑monophosphate (UMP),

inosine 5’‑monophosphate (IMP), adénosine 5’‑monophosphate (AMP), guanosine 5’‑monophosphate

(GMP) et cytidine 5’-monophosphate (CMP) — de la matrice d’échantillon par extraction en phase

solide (SPE) par échange d’anions fort, suivie d’une analyse chromatographique utilisant une phase

stationnaire C18 avec élution à gradient, détection UV et quantification par étalonnage interne utilisant

[1]
de la thymidine 5’-monophosphate (TMP) .
4 Réactifs et matériaux

Au cours de l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique

reconnus et de l’eau distillée ou déminéralisée ou de l’eau de pureté équivalente.

4.1 Étalons, purs à ≥ 99 % (Sigma ou l’équivalent). Les sels sodiques ou sels sodiques hydratés de

nucléotides peuvent être substitués aux formes acides libres si celles-ci ne sont pas facilement disponibles.

4.1.1 TMP, thymidine 5’-monophosphate, n° CAS 365-07-1.

1) Ceci est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée par souci

de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à

l’égard de ces produits. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes

résultats.
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ISO 20638:2015(F)
4.1.2 AMP, adénosine 5’-monophosphate, n° CAS 61-19-8.
4.1.3 CMP, cytidine 5’-monophosphate, n° CAS 63-37-6.
4.1.4 GMP, guanosine 5’‑monophosphate, n° CAS 85‑32‑5.
4.1.5 IMP, inosine 5’-monophosphate, n° CAS 131-99-7.
4.1.6 UMP, uridine 5’-monophosphate, n° CAS 58-97-9.
4.2 Bromure de potassium (KBr).
4.3 Dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ).
2 4
4.4 Acide orthophosphorique (H PO ).
3 4
4.5 Hydroxyde de potassium (KOH).
4.6 Acide éthylènediaminetétraacétique, sel disodique dihydraté (EDTA).
4.7 Chlorure de sodium (NaCl).
4.8 Méthanol (CH OH).
4.9 Préparation du réactif

4.9.1 Tampon de normalisation (KH PO , c = 0,25 mol/l, pH = 3,5). Dissoudre 34,0 g de KH PO (4.3)

2 4 2 4

dans 900 ml d’eau et ajuster le pH à 3,5 à l’aide d’acide orthophosphorique (4.4). Compléter à 1 l.

4.9.2 Solution d’extraction (NaCl, c = 1 mol/l, EDTA c = 4 mmol/l). Dissoudre 58,5 g de NaCl (4.7) et

1,5 g d’EDTA (4.6). Diluer dans 1 l d’eau.

4.9.3 Solution de lavage (KBr, c = 0,3 mol/l). Dissoudre 3,6 g de KBr (4.2) dans 100 ml d’eau.

4.9.4 Solution d’élution (KH PO , c = 0,5 mol/l, pH = 3,0). Dissoudre 6,8 g de KH PO (4.3) dans 90 ml

2 4 2 4

d’eau et ajuster le pH à 3,0 à l’aide d’acide orthophosphorique (4.4). Compléter à 100 ml.

4.9.5 Phase mobile A (KH PO , c = 10 mmol/l, pH = 5,6). Dissoudre 1,4 g de KH PO (4.3) dans 900 ml

2 4 2 4

d’eau et ajuster le pH à 5,6 ± 0,1 à l’aide d’une solution de KOH (10 % m/v). Compléter à 1 l avec de l’eau.

Fabriquer la solution quotidiennement, car une croissance microbienne survient souvent à température

ambiante dans les tampons phosphate contenant peu ou pas de solvant organique.
4.9.6 Phase mobile B, méthanol à 100 % (4.8).
4.10 Préparation de l’étalon

4.10.1 Solutions étalons mères, ρ environ 1 mg/ml. Peser avec précision environ 50 mg de chaque

nucléotide 5’‑monophosphate dans des fioles jaugées de 50 ml séparées. Ajouter 40 ml d’eau, mélanger

jusqu’à dissolution et compléter au volume avec de l’eau.

4.10.2 Solutions étalons de pureté. Transférer à l’aide d’une pipette 1,0 ml de chaque solution

étalon mère (4.10.1) dans des fioles jaugées de 50 ml séparées, compléter au volume avec le tampon de

2 © ISO 2015 – Tous droits réservés
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ISO 20638:2015(F)

normalisation (4.9.1) et mesurer l’absorbance à la λ appropriée afin de déterminer la concentration

max

de chaque solution étalon mère de nucléotide. Voir Tableau 1 et Références [1] et [2].

Tableau 1 — Maxima d’absorbance dans l’UV et coefficients d’extinction des nucléotides

5’-monophosphates
max
Nucléotide 5’-monophosphate E
1cm
Adénosine 5’-monophosphate 257 428,6
Cytidine 5’-monophosphate 280 390,9
Guanosine 5’-monophosphate 254 392,0
Inosine 5’-monophosphate 249 356,5
Uridine 5’-monophosphate 262 312,7
Thymidine 5’-monophosphate 267 288,5

4.10.3 Solution étalon interne, ρ environ 80 µg/ml. Diluer 4 ml de solution étalon mère de TMP

(4.10.1) dans 50 ml d’eau.

4.10.4 Solution étalon de travail, ρ environ 40 µg/ml. Transférer 2 ml de chaque solution étalon mère

(4.10.1) (AMP, CMP, GMP, IMP et UMP) à l’aide d’une pipette dans une seule fiole jaugée de 50 ml et

compléter au volume avec de l’eau.

4.10.5 Solutions d’étalonnage. Se reporter au Tableau 2 pour connaître les concentrations nominales

de nucléotide des solutions d’étalonnage.

4.10.5.1 Solution d’étalonnage 1. Transférer 0,25 ml d’étalon de travail (4.10.4) et 1 ml d’étalon interne

(4.10.3) à l’aide d’une pipette dans une fiole jaugée de 25 ml et compléter au volume avec de l’eau.

4.10.5.2 Solution d’étalonnage 2. Transférer 0,5 ml d’étalon de travail (4.10.4) et 1 ml d’étalon interne

(4.10.3) à l’aide d’une pipette dans une fiole jaugée de 25 ml et compléter au volume avec de l’eau.

4.10.5.3 Solution d’étalonnage 3. Transférer 2 ml d’étalon de travail (4.10.4) et 1 ml d’étalon interne

(4.10.3) à l’aide d’une pipette dans une fiole jaugée de 25 ml et compléter au volume avec de l’eau.

4.10.5.4 Solution d’étalonnage 4. Transférer 5 ml d’étalon de travail (4.10.4) et 1 ml d’étalon interne

(4.10.3) à l’aide d’une pipette dans une fiole jaugée de 25 ml et compléter au volume avec de l’eau.

Tableau 2 — Concentration nominale des solutions d’étalonnage
Concentration de chaque nucléotide:
Concentration de TMP
Solution
AMP, CMP, GMP, IMP, UMP
d’étalonnage
μg/ml
μg/ml
1 0,4 3,2
2 0,8 3,2
3 3,2 3,2
4 8,0 3,2
5 Appareillage

Verrerie et équipement de laboratoire habituels et, en particulier, les éléments suivants.

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ISO 20638:2015(F)

5.1 Système de CLHP, composé d’une pompe, d’une unité d’injection d’échantillons avec boucle

d’injection de 50 μl, d’une unité de dégazage, d’un four pour colonne et d’un détecteur à réseau de

photodiodes.
5.2 Colonne C18, Gemini C18, 5 μm, 4,6 mm× 250 mm (Phenomenex ).
5.3 Spectrophotomètre, capable d’une lecture numérique à 3 décimales.
5.4 pH-mètre.
5.5 Centrifugeuse.
5.6 Tubes de centrifugation, Amicon Ultra MWCO 3k, 4 ml (Millipore) .
5.7 Tubes de centrifugation en polypropylène, capacité 50 ml.
5.8 Seringues jetables, capacité 3 ml.
5.9 Filtres seringue, 0,2 μm avec membranes en acétate de cellulose.
5.10 Extracteur sous vide pour SPE.

5.11 Cartouches de SPE par échange d’anions fort en polypropylène, 6 ml × 1 000 mg,

Chromabond SB .
5.12 Membranes filtres, 0,45 μm nylon.
6 Préparation des échantillons
a) Agiter ou mélanger le récipient d’échantillon avant ouverture.

b) Peser avec précision environ 1 g de poudre ou 10 ml de formule infantile, à base de lait, prête à

servir/liquide, dans un tube de centrifugation de 50 ml.
c) Ajouter 30 ml de solution d’extraction (4.9.2).
d) Ajouter 1,0 ml d’étalon interne de TMP (4.10.3).

e) Boucher le tube et le mélanger au vortex jusqu’à ce que la poudre soit dissoute.

f) Laisser l’échantillon reposer 10 min pour garantir son hydratation complète.
g) Compléter à un volume final d’environ 50 ml avec de l’eau.
h) Boucher le tube et mélanger au vortex.

i) Pour les produits à base d’amidon, transférer 2 × 4 ml d’échantillon préparé dans deux tubes

d’ultracentrifugation séparés et centrifuger à 3 500 g pendant 60 min, puis regrouper le filtrat

des deu
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