ISO 13366-1:2008

Milk — Enumeration of somatic cells — Part 1: Microscopic method (Reference method)

ISO 13366-1|IDF 148-1:2008 specifies a microscopic method (reference method) for the counting of somatic cells in both raw and chemically preserved milk. ISO 13366-1|IDF 148-1:2008 is applicable for the counting of somatic cells in cows' milk, provided that the eventually mentioned prerequisites are met. This method is suitable for preparing standard test samples and determining reference method values that are required for calibrating mechanized and automated cell-counting methods.

Lait — Dénombrement des cellules somatiques — Partie 1: Méthode au microscope (Méthode de référence)

L'ISO 13366IFIL 148-1:2008 spécifie une méthode de comptage au microscope (méthode de référence) des cellules somatiques dans le lait cru et dans le lait additionné de conservateurs chimiques. L'ISO 13366IFIL 148-1:2008 est applicable au comptage des cellules somatiques dans le lait de vache sous réserve que les conditions préalables éventuellement mentionnées soient satisfaites. La présente méthode convient pour la préparation d'échantillons étalons et la détermination de valeurs de référence nécessaires pour l'étalonnage des méthodes de comptage de cellules mécanisées et automatisées.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 06-Feb-2008
• ICS: 67.100.10 - Milk and processed milk products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 02-Jun-2022

Relations

• Revises: ISO 13366-1:1997 - Milk — Enumeration of somatic cells — Part 1: Microscopic method
• Effective Date: 15-Apr-2008

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13366-1
IDF
148-1
Second edition
2008-02-15

Milk — Enumeration of somatic cells —
Part 1:
Microscopic method (Reference method)
Lait — Dénombrement des cellules somatiques —
Partie 1: Méthode au microscope (Méthode de référence)




Reference numbers
ISO 13366-1:2008(E)
IDF 148-1:2008(E)
©
ISO and IDF 2008

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ISO 13366-1:2008(E)
IDF 148-1:2008(E)
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©  ISO and IDF 2008
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Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail [e-mail] E-mail [e-mail]
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Published in Switzerland
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ISO 13366-1:2008(E)
IDF 148-1:2008(E)
Contents Page
Foreword. iv
Foreword. v
1 Scope .1
2 Terms and definitions .1
3 Principle.1
4 Reagents.1
4.1 Dye solutions .1
4.2 Phosphate Buffer Solution (PBS).3
5 Apparatus .4
6 Sampling.4
7 Preparation of test sample.4
7.1 Storage.4
7.2 Preparation .5
8 Procedure .5
8.1 Preparation of the smear and staining .5
8.2 Determination.6
9 Calculation and expression of results.10
9.1 Rectangular shape counting in successive fields .10
9.2 Rectangular shape counting in bands .11
9.3 Circular shape counting in successive fields.11
9.4 Expression of results .12
10 Precision.12
10.1 Repeatability.12
10.2 Reproducibility.12
11 Test report .13
Annex A (informative) Collaborative trial.14
Annex B (informative) Staining for goats' milk .15
Annex C (informative) Poisson distribution .16
Bibliography .17
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ISO 13366-1:2008(E)
IDF 148-1:2008(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 13366-1|IDF 148-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee
SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO
and IDF.
This second edition of ISO 13366-1|IDF 148-1 cancels and replaces the first edition (ISO 13366-1:1997), of
which it constitutes a technical revision.
ISO 13366 consists of the following parts, under the general title Milk — Enumeration of somatic cells:
⎯ Part 1: Microscopic method (Reference method)
⎯ Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters

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ISO 13366-1:2008(E)
IDF 148-1:2008(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit organization representing the dairy sector worldwide.
IDF membership comprises National Committees in every member country as well as regional dairy
associations having signed a formal agreement on cooperation with IDF. All members of IDF have the right to
be represented at the IDF Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in
the development of standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the
National Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of
the IDF National Committees casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 13366-1|IDF 148-1 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee
ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF
and ISO.
All work was carried out by the Joint ISO-IDF Action Team Automated methods of the Standing Committee on
Quality assurance, statistics of analytical data and sampling under the aegis of its project leaders, Mrs. S.
Orlandini (IT) and Mr. H.J.C.M. van den Bijgaart (NL).
This edition of ISO 13366-1|IDF 148-1 cancels and replaces IDF 148A:1995.
ISO 13366 consists of the following parts, under the general title Milk — Enumeration of somatic cells:
⎯ Part 1: Microscopic method (Reference method)
⎯ Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters

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ISO 13366-1:2008(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 148-1:2008(E)

Milk — Enumeration of somatic cells —
Part 1:
Méthode au microscope (Méthode de référence)
1 Scope
This part of ISO 13366|IDF 148 specifies a microscopic method (reference method) for the counting of
somatic cells in both raw and chemically preserved milk.
This part of ISO 13366|IDF 148 is applicable for the counting of somatic cells in cows' milk, provided that the
eventually mentioned prerequisites are met.
This method is suitable for preparing standard test samples and determining reference method values that are
required for calibrating mechanized and automated cell-counting methods.
WARNING — The use of this standard may involve hazardous materials, operations and equipment.
This standard does not purport to address all of the safety problems associated with its use. It is the
responsibility of the user of this standard to establish appropriate safety and health practices and
determine the applicability of regulatory limitations prior to use.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
somatic cells
those cells with nuclei, that is all leucocytes and epithelial cells, determined according to the procedure
described in this part of ISO 13366|IDF 148
3 Principle
A test portion of milk to be examined is spread over a slide to form a smear. The smear is dried. During this
process, the cells are stained. Subsequently, the stained cells are counted using a microscope. The number
of cells counted in a defined area are multiplied by a working factor, to give the number of cells per millilitre.
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or deionized water
or water of equivalent purity.
4.1 Dye solutions
WARNING — Tetrachloroethane is poisonous. Ethidium bromide is mutagenic. Proper actions for
deactivation should be taken in case of spilling. Preparation and application of the dye solution shall
be carried out in a fume cupboard, using protective equipment.
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ISO 13366-1:2008(E)
IDF 148-1:2008(E)
4.1.1 Modified Newman-Lampert stain solution (Levowitz-Weber modification)
4.1.1.1 Components
Ethanol, 95 % (volume fraction) 54,0 ml
a
40,0 ml
Tetrachloroethane
Methylene blue 0,6 g
Acetic acid, glacial 6,0 ml
a
Xylene can be used as an alternative in the same
volume amount as mentioned for tetrachloroethane.
4.1.1.2 Preparation
Mix the ethanol and the tetrachloroethane and stopper the bottle. Heat the mixture in a water bath (5.1) set at
65 °C. Add the methylene blue under a fume cupboard and carefully mix. Cool the mixture in a refrigerator to
4 °C.
Then add the glacial acetic acid and carefully mix again. Pass the obtained solution through an appropriate
filter (5.2) into an airtight bottle and store it as such.
Filter the Newman-Lampert stain solution again before use.
4.1.2 Ethidium bromide stain solution
4.1.2.1 Stain stock solution
4.1.2.1.1 Composition
Ethidium bromide 0,25 g
Demineralized water 100 ml
4.1.2.1.2 Preparation
Dissolve the ethidium bromide in demineralized water preheated to 40 °C. Cool the solution to room
temperature. Adjust to 100 ml with demineralized water.
The ethidium bromide stain stock solution can be kept for two months at a maximum when stored in the dark
at 2 °C ± 2 °C.
4.1.2.2 Buffer solution
4.1.2.2.1 Composition
Potassium hydrogenphthalate 0,51 g
Potassium hydroxide 0,162 g
Demineralized water 100 ml
4.1.2.2.2 Preparation
Separately dissolve the potassium hydrogenphthalate and the potassium hydroxide in the demineralized
water.
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ISO 13366-1:2008(E)
IDF 148-1:2008(E)
The buffer solution can be kept for two months at a maximum when stored in the dark at 2 °C ± 2 °C.
4.1.2.3 Ethidium bromide stain working solution
4.1.2.3.1 Components
a
Ethidium bromide stain stock solution (4.1.2.1) 2 ml
Buffer solution (4.1.2.2) 8 ml
Triton X-100 0,1 ml
Demineralized water 90 ml
a
A high temperature may reduce the staining capability of
ethidium bromide.
4.1.2.3.2 Preparation
Successively add the ethidium bromide stain stock solution, the buffer solution and the Triton X-100 to the
demineralized water and carefully mix.
Freshly prepare the ethidium bromide stain working solution directly before use.
4.2 Phosphate Buffer Solution (PBS)
4.2.1 Components
NaCl 8 g
KCl 0,2 g
1,15 g
Na HPO⋅7H O
2 4 2
KH PO 0,2 g
2 4
Demineralized water 1 000 ml
4.2.2 Preparation
Dissolve the salts in demineralized water. Adjust to 1 000 ml with the remaining demineralized water.
Adjust the pH to 7,2 ± 0,1.
NOTE It is also possible to use a commercially available phosphate buffer solution with pH = 7,2.
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ISO 13366-1:2008(E)
IDF 148-1:2008(E)
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 Water baths, capable of maintaining a temperature of 40 °C ± 2 °C, 50 °C ± 2 °C and 65 °C ± 2 °C.
5.2 Filter, resistant to the solvents used, with a pore size of 10 µm to 12 µm.
5.3 Microscope, with a magnification of 500× to 1 000×. Objectives for oil immersion can be used.
When using ethidium bromide, the microscope shall have fluorescence equipment.
5.4 Microsyringe, for dispensing a fixed volume of 0,01 ml of milk, with a maximum tolerance of 2 %.
5.5 Micrometer, to be certified.

2 2
5.6 Slides, premarked with an outline shape (rectangular or circular), with an area of 1 cm ± 5 % (95 mm
2
to 105 mm ), or a standard slide with a template of dimensions 20 mm × 5 mm or having a diameter, d, of
11,28 mm.
5.6.1 Selection of slides
Preferably, work with a fixed premarked area or a template, in order to avoid the recalculation of the working
factor with each counting.
5.6.2 Shapes
For a rectangular shape, the upper and lower internal widths, on the one hand, and the left and right internal
heights, on the other hand, should not differ by more than 0,2 mm.
For a circular shape, the vertical and horizontal internal diameters should not differ by more than 0,2 mm.
6 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 13366|IDF 148. A recommended sampling
method is given in ISO 707|IDF 50.
If using automatic samplers, they shall have been validated properly.
7 Preparation of test sample
7.1 Storage
Prior to testing or preservation, store the test samples at a temperature of 4 °C ± 2 °C.
Analyse the test samples within 6 h after sampling. In the case of longer storage, add chemical preservatives
such as boric acid, bronopol or potassium dichromate. The final concentration of boric acid shall not exceed
0,6 g per 100 ml of test sample. The final concentration of bronopol shall not exceed 0,05 g per 100 ml of test
sample. The final concentration of potassium dichromate shall not exceed 0,1 g per 100 ml of test sample.
Store the thus preserved test samples at a temperature of 4 °C ± 2 °C for no longer than 6 days.
For environmental reasons, it is recommended to restrict the use of potassium dichromate to samples that
require a long shelf life only.
4 © ISO and IDF 2008 – All rights reserved

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ISO 13366-1:2008(E)
IDF 148-1:2008(E)
7.2 Preparation
Heat the test sample (see 7.1) in a water bath (5.1) set at 40 °C. Mix the test sample carefully. Cool the
sample to the temperature at which the microsyringe (5.4) has been calibrated, for example to 20 °C.
Dilute test samples with an estimated somatic cell count of above 1 000 000 cells/ml with a phosphate buffer
solution (4.2) to obtain a somatic cell count of about 500 000 cells/ml for each diluted test sample.
V
s
d=
VV×
sb
where
d is the dilution factor to obtain an appropriate somatic cell account in the test sample of about
500 000 cells/ml;
V is the volume, in ml, of the test sample;
s
V is the volume, in ml, of the buffer used for diluting the test sample.
b
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 13366-1
FIL
148-1
Deuxième édition
2008-02-15

Lait — Dénombrement des cellules
somatiques —
Partie 1:
Méthode au microscope (Méthode de
référence)
Milk — Enumeration of somatic cells —
Part 1: Microscopic method (Reference method)




Numéros de référence
ISO 13366-1:2008(F)
FIL 148-1:2008(F)
©
ISO et FIL 2008

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ISO 13366-1:2008(F)
FIL 148-1:2008(F)
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ISO copyright office Fédération Internationale de Laiterie
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Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail [e-mail] E-mail [e-mail]
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Publié en Suisse

ii © ISO et FIL 2008 – Tous droits réservés

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ISO 13366-1:2008(F)
FIL 148-1:2008(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Avant-propos. v
1 Domaine d'application.1
2 Termes et définitions.1
3 Principe.1
4 Réactifs .1
4.1 Solutions colorantes .2
4.2 Solution tampon de phosphate (PBS) .3
5 Appareillage .4
6 Échantillonnage .4
7 Préparation des échantillons à analyser.4
7.1 Stockage .4
7.2 Préparation .5
8 Mode opératoire.5
8.1 Préparation du film et de la coloration .5
8.2 Détermination.6
9 Calcul et expression des résultats.10
9.1 Comptage par champs successifs des formes rectangulaires .10
9.2 Comptage par bandes des formes rectangulaires.11
9.3 Comptage par champs successifs des formes circulaires .11
9.4 Expression des résultats .12
10 Fidélité .12
10.1 Répétabilité.12
10.2 Reproductibilité.13
11 Rapport d'essai .13
Annexe A (informative) Essai interlaboratoires .14
Annexe B (informative) Coloration pour lait de chèvre.15
Annexe C (informative) Loi de Poisson.16
Bibliographie .17
© ISO et FIL 2008 - Tous droits réservés iii

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ISO 13366-1:2008(F)
FIL 148-1:2008(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 13366-1|FIL 148-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers et par la Fédération internationale de laiterie (FIL). Elle est publiée
conjointement par l'ISO et la FIL.
Cette deuxième édition de l'ISO 13366-1|FIL 148-1 annule et remplace la première édition
(l'ISO 13366-1:1997), qui a fait l'objet d'une révision technique.
L'ISO 13366 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait — Dénombrement des
cellules somatiques:
⎯ Partie 1: Méthode au microscope (Méthode de référence)
⎯ Partie 2: Lignes directrices pour la mise en œuvre des compteurs fluoro-opto-électroniques

iv © ISO et FIL 2008 - Tous droits réservés

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ISO 13366-1:2008(F)
FIL 148-1:2008(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération Internationale de Laiterie) est une organisation sans but lucratif représentant le secteur
laitier mondial. Les membres de la FIL se composent des Comités Nationaux dans chaque pays membre et
des associations laitières régionales avec lesquelles la FIL a signé des accords de coopération. Tout membre
de la FIL a le droit de faire partie des Comités permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux
techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et
d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d'Action et les Comités permanents sont
soumis aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux de la FIL votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 13366-1|FIL 148-1 a été élaborée par par la Fédération Internationale de Laiterie (FIL) et le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée
conjointement par la FIL et l'ISO.
Tous les travaux ont été effectués par le groupe de travail conjoint ISO-FIL Méthodes automatisées du Comité
plénier Assurance qualité, statistiques des données analytiques et échantillonnage, sous l'égide de ses chefs
de projet, Madame S. Orlandini (Italie) et Monsieur H.J.C.M. van den Bijgaart (Pays-Bas).
Cette édition de l'ISO 13366-1|FIL 148-1 annule et remplace la FIL 148A:1995.
L'ISO 13366 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait — Dénombrement des
cellules somatiques:
⎯ Partie 1: Méthode au microscope (Méthode de référence)
⎯ Partie 2: Lignes directrices pour la mise en œuvre des compteurs fluoro-opto-électroniques
© ISO et FIL 2008 - Tous droits réservés v

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ISO 13366-1:2008(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 148-1:2008(F)

Lait — Dénombrement des cellules somatiques —
Partie 1:
Méthode au microscope (Méthode de référence)
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 13366|FIL 148 spécifie une méthode de comptage au microscope (méthode de
référence) des cellules somatiques dans le lait cru et dans le lait additionné de conservateurs chimiques.
La présente partie de l'ISO 13366|FIL 148 est applicable au comptage des cellules somatiques dans le lait de
vache sous réserve que les conditions préalables éventuellement mentionnées soient satisfaites.
La présente méthode convient pour la préparation d'échantillons étalons et la détermination de valeurs de
référence nécessaires pour l'étalonnage des méthodes de comptage de cellules mécanisées et automatisées.
AVERTISSEMENT — L'utilisation de la présente norme peut impliquer l'utilisation de produits et la
mise en œuvre de modes opératoires et d'appareillages à caractère dangereux. La présente norme n'a
pas pour but d'aborder tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Il incombe à l'utilisateur
de la présente norme d'établir, avant de l'utiliser, des pratiques d'hygiène et de sécurité appropriées et
de déterminer l'applicabilité des restrictions réglementaires.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
cellules somatiques
cellules à noyau, c'est-à-dire ensemble des leucocytes et cellules épithéliales, déterminées selon le mode
opératoire décrit dans la présente partie de l'ISO 13366|FIL 148
3 Principe
Une prise d'essai du lait à examiner est étalée sur une lame de microscope sous la forme d'un film. Le film est
séché pendant que les cellules sont colorées. Les cellules colorées sont ensuite comptées au microscope. Le
nombre de cellules comptées sur une surface définie est multiplié par un facteur de travail; on obtient ainsi le
nombre de cellules par millilitre.
4 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, sauf spécification contraire, et de l'eau
distillée ou déminéralisée ou bien de l'eau de pureté équivalente.
© ISO et FIL 2008 - Tous droits réservés 1

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ISO 13366-1:2008(F)
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4.1 Solutions colorantes
AVERTISSEMENT — Le tétrachloréthane est toxique. Le bromure d'éthidium est mutagène. En cas de
renversement accidentel, il convient de mener les actions appropriées en vue de la désactivation. La
préparation et l'application de la solution colorante doivent être réalisées dans une hotte fermée en
utilisant un équipement de protection.
4.1.1 Solution colorante Newman-Lampert modifiée (modification Levowitz-Weber)
4.1.1.1 Composants
Éthanol, 95 % (fraction volumique) 54,0 ml
a
40,0 ml
Tétrachloréthane
Bleu de méthylène 0,6 g
Acide acétique, glacial 6,0 ml
a
Le xylène peut remplacer le tétrachloréthane
(même volume que celui mentionné pour ce dernier).
4.1.1.2 Préparation
Mélanger l'éthanol et le tétrachloréthane, et boucher le flacon. Chauffer le mélange dans un bain-marie (5.1)
réglé à 65 °C. Ajouter le bleu de méthylène sous une hotte et mélanger soigneusement. Refroidir le mélange
dans un réfrigérateur à 4 °C.
Puis ajouter l'acide acétique glacial et mélanger à nouveau soigneusement. Faire passer la solution obtenue
au travers d'un filtre approprié (5.2) dans un flacon étanche à l'air et la stocker telle quelle.
Filtrer la solution colorante Newman-Lampert à nouveau avant utilisation.
4.1.2 Solution colorante au bromure d'éthidium
4.1.2.1 Solution mère colorante
4.1.2.1.1 Composition
Bromure d'éthidium 0,25 g
Eau déminéralisée 100 ml
4.1.2.1.2 Préparation
Dissoudre le bromure d'éthidium dans de l'eau déminéralisée chauffée au préalable à 40 °C. Refroidir la
solution à température ambiante. Compléter à 100 ml avec de l'eau déminéralisée.
La solution mère colorante de bromure d'éthidium peut être conservée pendant deux mois au maximum
lorsqu'elle est stockée à l'abri de la lumière à une température de 2 °C ± 2 °C.
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4.1.2.2 Solution tampon
4.1.2.2.1 Composition
Hydrogénophtalate de potassium 0,51 g
Potasse caustique 0,162 g
Eau déminéralisée 100 ml
4.1.2.2.2 Préparation
Dissoudre séparément l'hydrogénophtalate de potassium et la potasse caustique dans l'eau déminéralisée.
La solution tampon peut être conservée pendant deux mois au maximum lorsqu'elle est stockée à l'abri de la
lumière à une température de 2 °C ± 2 °C.
4.1.2.3 Solution colorante de travail au bromure d'éthidium
4.1.2.3.1 Composants
a
2 ml
Solution mère colorante (bromure d'éthidium) (4.1.2.1)
Solution tampon (4.1.2.2) 8 ml
Triton X-100 0,1 ml
Eau déminéralisée 90 ml
a
Une température élevée peut réduire le pouvoir colorant du bromure
d'éthidium.
4.1.2.3.2 Préparation
Ajouter successivement la solution mère colorante (bromure d'éthidium), la solution tampon et le Triton X-100
dans l'eau déminéralisée et mélanger soigneusement.
Préparer la solution colorante de travail (bromure d'éthidium) extemporanément.
4.2 Solution tampon de phosphate (PBS)
4.2.1 Composants
NaCl 8 g
KCl 0,2 g
Na HPO ,7H O 1,15 g
2 4 2
KH PO 0,2 g
2 4
Eau déminéralisée 1 000 ml
4.2.2 Préparation
Dissoudre les sels dans une quantité d'eau déminéralisée. Compléter à 1 000 ml avec le reste d'eau
déminéralisée.
Ajuster le pH à 7,2 ± 0,1.
NOTE Il est également possible d'utiliser une solution tampon de phosphate de pH = 7,2 vendue dans le commerce.
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5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Bains-marie, capables de maintenir une température de 40 °C ± 2 °C, 50 °C ± 2 °C et 65 °C ± 2 °C.
5.2 Filtre, résistant aux solvants utilisés, de porosité comprise entre 10 µm et 12 µm.
5.3 Microscope, grossissement entre ×500 et ×1 000. Des objectifs pour immersion dans l'huile peuvent
être utilisés.
Lors de l'utilisation de bromure d'éthidium, le microscope doit comporter un équipement à fluorescence.
5.4 Microseringue, permettant de distribuer un volume fixe de 0,01 ml de lait, avec une tolérance
maximale de 2 %.
5.5 Micromètre, devant être certifié.
5.6 Lames, prémarquées, ayant une zone d'étalement de forme rectangulaire ou circulaire d'une surface
2 2 2
égale à 1 cm ± 5 % (95 mm à 105 mm ), ou lame standard avec un gabarit de dimensions 20 mm × 5 mm
ou ayant un diamètre, d, de 11,28 mm.
5.6.1 Choix des lames
Il est préférable de travailler avec une surface prémarquée fixe ou un gabarit afin d'éviter de recalculer le
facteur de travail pour chaque comptage.
5.6.2 Formes
Dans le cas d'une forme rectangulaire, il convient que les largeurs intérieures (supérieure et inférieure), d'une
part, et les hauteurs intérieures (gauche et droite), d'autre part, ne diffèrent pas de plus de 0,2 mm.
Dans le cas d'une forme circulaire, il convient que les diamètres intérieurs (vertical et horizontal) ne diffèrent
pas de plus de 0,2 mm.
6 Échantillonnage
Il convient qu'un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire et qu'il n'ait été ni endommagé ni
modifié au cours du transport ou du stockage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode indiquée dans la présente partie de l'ISO 13366|FIL 148.
Une méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 707|FIL 50.
Si des échantillonneurs automatiques sont utilisés, ils doivent avoir fait l'objet d'une validation appropriée.
7 Préparation des échantillons à analyser
7.1 Stockage
Avant l'analyse ou la conservation, stocker les échantillons à une température de 4 °C ± 2 °C.
Analyser les échantillons dans les 6 h suivant le prélèvement. En cas de stockage prolongé, ajouter des
agents de conservation chimiques, par exemple de l'acide borique, du bronopol ou du bichromate de
potassium. La concentration finale d'acide borique ne doit pas dépasser 0,6 g par 100 ml d'échantillon. La
concentration finale de bronopol ne doit pas être supérieure à 0,05 g par 100 ml d'échantillon. La
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concentration finale de bichromate de potassium ne doit pas dépasser 0,1 g par 100 ml d'échantillon. Stocker
les échantillons ainsi conservés à une température de 4 °C ± 2 °C pendant une durée ne dépassant pas
6 jours.
Pour des raisons de respect de l'environnement, il est recommandé de limiter l'usage du bichromate de
potassium aux échantillons devant avoir une durée de conservation importante.
7.2 Préparation
Chauffer l'échantillon à analyser (voir 7.1) dans un bain-marie (5.1) réglé à 40 °C. Mélanger soigneusement
l'échantillon pour essai. Refroidir l'échantillon à la température à laquelle la microseringue (5.4) a été
étalonnée, par exemple à 20 °C.
Diluer les échantillons dans lesquels le nombre estimé de cellules somatiques est supérieur à
1 000 000 cellules/ml avec une solution tampon de phosphate (4.2) afin d'obtenir un nombre de cellules
somatiques d'environ 500 000 cellules/ml pour chaque échantillon pour essai dilué.
V
s
d=
VV×
sb
où
d est le facteur de dilution permettant d'obtenir un nombre de cellules somatiques d'environ
500 000 cellules/ml dans l'échantillon;
V est le volume, en millilitres, de l'échantillon pour essai;
s
V est le volume, en millilitres, de la solution tampon utilisée pour diluer l'échantil
...