ISO 18252:2006

Anhydrous milk fat — Determination of sterol composition by gas liquid chromatography (Routine method)

ISO 18252|IDF 200:2006 specifies a routine gas liquid chromatographic method for the determination of the sterol composition in anhydrous milk fat extracted from dairy products directly on the unsaponifiable matter, without purification and derivatization.

Matière grasse anhydre du lait — Détermination de la composition stérolique par chromatographie liquide en phase gazeuse (Méthode de routine)

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 02-Feb-2006
• ICS: 67.100.01 - Milk and milk products in general
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 06-Jan-2022

Standards Content (Sample)

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 18252
IDF
200
Первое издание
2006-02-01

Жир молочный обезвоженный.
Определение стеринового состава
методом газожидкостной
хроматографии (стандартный метод)
Anhydrous milk fat – Determination of sterol composition by gas liquid
chromatography (Routine method)



Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочные номера
ISO 18252:2006(R)
IDF 200:2006(R))
©
ISO и IDF 2006

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 18252:2006(R)
IDF 200:2006(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или вывести на экран, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на загрузку интегрированных шрифтов в компьютер, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.


ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ


©  ISO и IDF 2006
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO или IDF по соответствующему адресу, указанному ниже.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Brussels
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail [e-mail] E-mail [e-mail]
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Опубликовано в Швейцарии

ii © ISO и IDF 2006 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 18252:2006(R)
IDF 200:2006(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .1
4 Принцип.2
5 Реагенты.2
6 Аппаратура.3
7 Отбор проб.5
8 Приготовление пробы для испытания.6
9 Процедура.6
9.1 Стандартные растворы стеринов.6
9.2 Испытуемый образец .6
9.3 Омыление .6
9.4 Экстракция неомыляемого вещества .6
9.5 Качественный анализ .7
9.6 Количественный анализ .7
10 Прецизионность.8
10.1 Межлабораторное испытание.8
10.2 Повторяемость .9
10.3 Воспроизводимость .9
11 Протокол испытания.9
Приложение А (информативное) Пример газожидкостного хроматографического анализа.10
Приложение В (информативное) Результаты межлабораторного испытания .11
Библиография.13


© ISO и IDF 2006 - Все права сохраняются iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 18252:2006(R)
IDF 200:2006(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией
национальных организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных
стандартов обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член,
заинтересованный в деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть
представленным в этом комитете. Международные правительственные и неправительственные
организации, имеющие связи с ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации
в области электротехники, ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной
электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются по правилам, указанным в Директивах ISO/IEC,
Часть 2.
Главная задача технических комитетов состоит в разработке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Обращается внимание на возможность патентования некоторых элементов данного международного
стандарта. ISO не несет ответственности за идентификацию какого-либо или всех таких патентных
прав.
Международный стандарт ISO 18252|IDF 200 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34,
Пищевые продукты, Подкомитетом SC 5, Молоко и молочные продукты, и Международной
федерацией молочных продуктов (IDF). Он публикуется совместно ISO и IDF.
iv © ISO и IDF 2006 - Все права сохраняются

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 18252:2006(R)
IDF 200:2006(R)
Предисловие
Международная федерация производства молочных продуктов (IDF) является всемирной
федерацией молочного сектора в национальных комитетах каждой страны-члена IDF. Каждый
национальный комитет имеет право быть представленным в постоянных комитетах IDF, выполняющих
техническую работу. IDF сотрудничает с ISO в разработке стандартных методов анализа и отбора
образцов молока и молочных продуктов.
Проекты международных стандартов, принятые рабочими группами и постоянными комитетами
рассылаются национальным комитетам на голосование. Их опубликование в качестве международных
стандартов требует одобрения не менее 50 % национальных комитетов, принимающих участие в
голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего международного стандарта могут быть
объектом патентных прав. ISO не может нести ответственность за идентификацию какого-либо одного
или всех патентных прав.
Международный стандарт ISO 18252IDF 200 подготовлен Международной федерацией молочных
продуктов (IDF) и Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом SC 5, Молоко
и молочные продукты. Этот стандарт публикуется совместно ISO и IDF.
Вся работа проделана совместной группой экспертов ISO-IDF по Гармонизации Постоянного комитета
по Основным компонентам молока при поддержке руководителей этого проекта, г-жи M. Juarez (ES) и
г-жи G. Contarini (IT).

© ISO и IDF 2006 - Все права сохраняются v

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 18252:2006(R)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ
IDF 200:2006(R)

Жир молочный обезвоженный. Определение стеринового
состава методом газожидкостной хроматографии
(стандартный метод)
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Использование этого международного стандарта может включать
вредные материалы, операции и оборудование. Целью стандарта не является рассмотрение
всех проблем безопасности, связанных с его использованием. Установление правил по
безопасности и защите здоровья и определение применимости регулирующих ограничений
перед его использованием входит в обязанности пользователя этого стандарта.
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает стандартный метод газожидкостной
хроматографии для определения стеринового состава в обезвоженном молочном жире,
экстрагированном из молочных продуктов непосредственно на неомыляемом веществе, без очистки и
дериватизации.
Первой целью этого международного стандарта является количественная оценка холестерина,
который составляет около 98 % стериновой фракции в чистом молочном жире. Кроме того в случае
анализа молочного жира в смеси растительных жиров установленная процедура позволяет сделать
оценку наиболее важных фитостеринов. Процедура подтверждена на образцах молочного жира,
содержащих приблизительно от 28 % до 32 % растительного жира.
Из-за отсутствия этапа очистки, которая позволяет полностью удалить интерферирующие соединения
из неомыляемого вещества, особое внимание следует обратить при использовании этого метода на
проверку чистоты молока неизвестного происхождения. В случае сомнительных результатов можно
использовать эталонный метод, описанный в ISO 12078IDF 159.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы являются обязательными при применении данного
документа. Для жестких ссылок применяется только цитированное издание документа. Для плавающих
ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного ссылочного документа
(включая любые изменения).
ISO 3696:1987, Вода для лабораторного анализа. Технические условия и методы испытания
ISO 14156IDF 172, Молоко и молочные продукты. Методы экстракции липидов и липорастворимых
составов
3 Термины и определения
Применительно к этому документу используются следующие термины и определения.
3.1
стериновый состав
sterol composition
массовая доля веществ, определенная процедурой, установленной в этом международном стандарте
© ISO и IDF 2006 - Все права сохраняются 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 18252:2006(R)
IDF 200:2006(R)
ПРИМЕЧАНИЕ Стериновый состав можно выражать или в миллиграммах на 100 г жира или в процентах
общего содержания стерина.
4 Принцип
5α−холестан добавляют к испытуемому образцу в качестве внутреннего эталона. Жир омыляется
раствором гидроксида калия в метаноле. Неомыляемое вещество экстрагируют диэтиловым эфиром.
Его концентрируют и определяют методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Отдельные
стерины идентифицируют путем сличения со временем удержания эталонного образца. Стерины
определяют количественно посредством ссылки на внутренний эталон.
5 Реагенты
Используют реагенты только признанной аналитической чистоты, если нет других указаний.
5.1 Вода, соответствующая классу 2 согласно ISO 3696:1987.
5.2 Этанол (C H OH), абсолютный.
2 5
5.3 Метанол (CH OH), содержащий массовую долю воды u 0,5 %.
3
5.4 Реагент омыления, раствор гидроксида калия в метаноле, c(KOH) = 2 моль/л.
Растворяют 11,2 г KOH в 100 мл метанола (5.3) и хорошо перемешивают.
5.5 Сульфат натрия (Na SO ), безводный.
2 4
5.6 Диэтиловый эфир (C H OC H ), не содержащий пероксидов.
2 5 2 5
5.7 n-Гексан [CH (CH ) CH ].
3 2 4 3
5.8 5α-Холестан, чистотой 99 %.
5.9 Стандартный раствор 5α-холестана.
Точно отвешивают 60 мг 5α-холестана (5.8) в 100-мл мерную колбу с одной меткой (6.4). Разбавляют
до метки 100 мл n-гексаном( 5.7)/этанолом (5.2) в отношении 1:10 или n-гексаном (5.7) и
перемешивают.
Стандартный раствор 5α-холестана можно хранить в холодильнике в течение 1 месяца.
5.10 Холестерин, чистотой 99 %.
5.11 Стандартный раствор холестерина.
Точно отвешивают 60 мг холестерина (5.10) в 100-мл мерную колбу с одной меткой (6.4). Разбавляют
до метки 100 мл этанолом (5.2) или n-гексаном (5.7) и перемешивают.
Стандартный раствор холестерина можно хранить в холодильнике в течение 1 месяца.
5.12 Кампестерин, чистотой 65 %.
2 © ISO и IDF 2006 - Все права сохраняются

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 18252:2006(R)
IDF 200:2006(R)
5.13 Стандартный раствор кампестерина.
Точно отвешивают 10 мг кампестерина (5.12) в 100-мл мерную колбу с одной меткой (6.4). Разбавляют
до метки 100 мл n-гексаном (5.7) и перемешивают.
Стандартный раствор кампестерина можно хранить в холодильнике в течение 1 месяца.
5.14 Стигмастерин, чистотой 95 %.
5.15 Стандартный раствор стигмастерина.
Точно отвешивают 10 мг стигмастерина (5.14) в 100-мл мерную колбу с одной меткой (6.4). Разбавляют
до метки 100 мл n-гексаном (5.7) и перемешивают.
Стандартный раствор стигмастерина можно хранить в холодильнике в течение 1 месяца.
5.16 β-Ситостерин, чистотой 95 %.
5.17 Стандартный раствор β-ситостерина.
Точно отвешивают 10 мг β-ситостерина (5.16) в 100-мл мерную колбу с одной меткой (6.4). Разбавляют
до метки 100 мл n-гексаном (5.7) и перемешивают.
Стандартный раствор β-ситостерина можно хранить в холодильнике в течение 1 месяца.
ПРИМЕЧАНИЕ Поскольку стандартные растворы фитостеринов (5.13, 5.15 and 5.17) используются только для
количественной оценки, их можно заменить стеринами, приготовленными из соевого масла, включающими
кампестерин, стигмастерин и β-ситостерин в качестве главных компонентов.
6 Аппаратура
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Поскольку определение включает использование летучих
воспламеняемых растворителей, применяемые электрические приборы должны
соответствовать законодательству относительно опасностей при использовании таких
растворителей.
Обычная лабораторная аппаратура и, в частности, следующая.
6.1 Сушильный шкаф, поддерживаемый при температуре от 50 °C до 70 °C.
6.2 Аналитические весы, взвешивающие с точностью до 1 мг, при считываемости до 0,1 мг.
6.3 Круглодонные колбы, с шлифованным горлом, емкостью 100 мл.
6.4 Мерные колбы с одной меткой, емкостью 100 мл.
6.5 Мерные пипетки, емкостью 10 мл.
6.5 Пипетки с одной меткой, емкостью 1 мл.
6.7 Водяная баня, поддерживаемая при 50 °C ± 2 °C и при кипении.
6.8 Дефлегматор, для присоединения к круглодонной колбе (6.3).
6.9 Делительные воронки, емкостью 100 мл.
6.10 Дозатор растворителей или мерные цилиндры, емкостью 10 мл и 20 мл.
© ISO и IDF 2006 - Все права сохраняются 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 18252:2006(R)
IDF 200:2006(R)
6.11 Дистилляционный или выпарной аппарат (например, роторный вакуумный выпарной аппарат),
для дистилляции или выпаривания растворителей, поддерживающий все температуры вплоть до
кипения.
6.12 Стеклянные воронки, диаметром 100 мм.
6.13 Сухая фильтровальная бумага, гофрированная, высокой прочности, диаметром 200 мм.
6.14 Ампулы, конусообразная внутренняя часть, емкостью 5 мл and 10 мл.
6.15 Источник азота, с чистотой газа как минимум 99 %.
6.16 Пробирка, с завинчивающейся крышкой на политетрафторэтиленовой прокладке, емкостью
50 мл.
6.17 Газожидкостная хроматография.
6.17.1 Инжектор.
Инжектор испарительного типа (щелевой/бесщелевой), который оснащен термостойкой перегородкой,
поддерживается при температуре на 30 °C выше максимальной температуры печи. В случае холодного
инжектора, встроенного в колонку, инжектор поддерживается при температуре на несколько градусов
ниже температуры кипения растворителя.
6.17.2 Печь, работающая при температуре, запрограммированной на диапазон от 50 °C до 320 °C.
6.17.3 Колонка, капиллярная колонка из кварцевого стекла.
Для получения успешного разделения стерина можно использовать различные типы стационарной
фазы, толщину пленки, длину и диаметр колонки. В любом случае выбранная колонка должна
обеспечивать полное разделение между пиком растворителя и 5α-холестаном (т.е. 5α-холестан не
должен элюировать при расширении линии растворителя), так же как и разрешение по базисной линии
между пиками холестерина, каместерина, стигмасетрина и β-ситосетрина. Более того, никакого
размывания базисной линии не должно появиться в ходе всего газохроматографического (GC) цикла.
Пример правильного GC профиля, полученного при использовании
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18252
IDF
200
First edition
2006-02-01

Anhydrous milk fat — Determination of
sterol composition by gas liquid
chromatography (Routine method)
Matière grasse anhydre du lait — Détermination de la composition
stérolique par chromatographie liquide en phase gazeuse (Méthode de
routine)




Reference numbers
ISO 18252:2006(E)
IDF 200:2006(E)
©
ISO and IDF 2006

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 18252:2006(E)
IDF 200:2006(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. Neither the ISO Central
Secretariat nor the IDF accepts any liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies
and IDF national committees. In the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the ISO Central Secretariat at the
address given below.


©  ISO and IDF 2006
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO or IDF at the respective
address below.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Brussels
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail [e-mail] E-mail [e-mail]
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Published in Switzerland

ii © ISO and IDF 2006 – All rights reserved

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 18252:2006(E)
IDF 200:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Terms and definitions .1
4 Principle.2
5 Reagents.2
6 Apparatus .3
7 Sampling.5
8 Preparation of test sample.5
9 Procedure .5
9.1 Sterol standard solutions .5
9.2 Test portion .6
9.3 Saponification .6
9.4 Extraction of the unsaponifiable matter.6
9.5 Qualitative analysis .6
9.6 Quantitative analysis.7
10 Precision.8
10.1 Interlaboratory test .8
10.2 Repeatability.8
10.3 Reproducibility.8
11 Test report .9
Annex A (informative) Example of the gas-liquid chromatographic analysis.10
Annex B (informative) Results of an interlaboratory trial .11
Bibliography .13

© ISO and IDF 2006 – All rights reserved iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 18252:2006(E)
IDF 200:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 18252⎪IDF 200 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and
IDF.
iv © ISO and IDF 2006 – All rights reserved

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 18252:2006(E)
IDF 200:2006(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National
Committee in every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF
Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in the development of
standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the
National Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of
the IDF National Committees casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 18252⎪IDF 200 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee
ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF
and ISO.
All work was carried out by the Joint ISO-IDF Action Team on Fat, of the Standing Committee on Main
components in milk, under the aegis of its project leaders, Mrs. M. Juarez (ES) and Mrs. G. Contarini (IT).

© ISO and IDF 2006 – All rights reserved v

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 18252:2006(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 200:2006(E)

Anhydrous milk fat — Determination of sterol composition by
gas liquid chromatography (Routine method)
WARNING — The use of this International Standard may involve hazardous materials, operations and
equipment. This standard does not purport to address all the safety problems associated with its use.
It is the responsibility of the user of this standard to establish safety and health practices and
determine the applicability of regulatory limitations prior to use.
1 Scope
This International Standard specifies a routine gas liquid chromatographic method for the determination of the
sterol composition in anhydrous milk fat extracted from dairy products directly on the unsaponifiable matter,
without purification and derivatization.
The first goal of this International Standard is the quantitative evaluation of cholesterol, which represents
about 98 % of the sterol fraction of pure milk fat. Moreover, in the case of analysis of milk fat in a mixture of
vegetable fats, the specified procedure allows the evaluation of the most important phytosterols. The
procedure has been validated on milk fat samples containing approximately 28 % to 32 % of vegetable fat.
Due to the absence of the purification step, which allows the complete removal of interfering compounds from
the unsaponifiable matter, particular care should be taken when applying this method to the verification of the
purity of milk fat of unknown origin. In the case of suspicious results, the reference method described in
ISO 12078⎪IDF 159 can be used.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 14156⎪IDF 172, Milk and milk products — Extraction methods for lipids and liposoluble compounds
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
sterol composition
mass fraction of substances determined by the procedure specified in this International Standard
NOTE The sterol composition can be expressed either as milligrams per 100 g of fat, or as percent of total sterol
content.
© ISO and IDF 2006 – All rights reserved 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 18252:2006(E)
IDF 200:2006(E)
4 Principle
5α−cholestane is added to the test sample as the internal standard. The fat is saponified with methanolic
potassium hydroxide. Unsaponifiable matter is extracted by diethyl ether. It is concentrated and determined by
capillary gas-liquid chromatography. Individual sterols are identified by comparison with the retention time of
the reference standard sample. Sterols are quantified by reference to the internal standard.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
5.1 Water, complying with grade 2 in accordance with ISO 3696:1987.
5.2 Ethanol (C H OH), absolute.
2 5
5.3 Methanol (CH OH), containing a mass fraction of water of u 0,5 %.
3
5.4 Saponification reagent, potassium hydroxide methanolic solution, c(KOH) = 2 mol/l.
Dissolve 11,2 g of KOH in 100 ml of methanol (5.3) and mix well.
5.5 Sodium sulfate (Na SO ), anhydrous.
2 4
5.6 Diethyl ether (C H OC H ), free from peroxides.
2 5 2 5
5.7 n-Hexane [CH (CH ) CH ].
3 2 4 3
5.8 5α-Cholestane, of purity 99 %.
5.9 5α-Cholestane standard solution.
Accurately weigh about 60 mg of 5α-cholestane (5.8) into a 100 ml one-mark volumetric flask (6.4). Dilute to
the 100 ml mark with n-hexane( 5.7)/ethanol (5.2) with a ratio of 1:10 or n-hexane (5.7) and mix.
The 5α-cholestane standard solution may be stored in a refrigerator for one month.
5.10 Cholesterol, of purity 99 %.
5.11 Cholesterol standard solution.
Accurately weigh about 60 mg of cholesterol (5.10) into a 100 ml one-mark volumetric flask (6.4). Dilute to the
100 ml mark with ethanol (5.2) or n-hexane (5.7) and mix.
The cholesterol standard solution may be stored in a refrigerator for one month.
5.12 Campesterol, of purity 65 %.
5.13 Campesterol standard solution.
Accurately weigh about 10 mg of campesterol (5.12) into a 100 ml one-mark volumetric flask (6.4). Dilute to
the 100 ml mark with n-hexane (5.7) and mix.
The campesterol standard solution may be stored in a refrigerator for one month.
5.14 Stigmasterol, of purity 95 %.
2 © ISO and IDF 2006 – All rights reserved

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 18252:2006(E)
IDF 200:2006(E)
5.15 Stigmasterol standard solution.
Accurately weigh about 10 mg of stigmasterol (5.14) into a 100 ml one-mark volumetric flask (6.4). Dilute to
the 100 ml mark with n-hexane (5.7) and mix.
The stigmasterol standard solution may be stored in a refrigerator for one month.
5.16 β-Sitosterol, of purity 95 %.
5.17 β-Sitosterol standard solution.
Accurately weigh about 10 mg of β-sitosterol (5.16) into a 100 ml one-mark volumetric flask (6.4). Dilute to the
100 ml mark with n-hexane (5.7) and mix.
The β-sitosterol standard solution may be stored in a refrigerator for one month.
NOTE Since the phytosterol standard solutions (5.13, 5.15 and 5.17) are used only for a qualitative evaluation, they
may be replaced by sterols prepared from soya oil having campesterol, stigmasterol and β-sitosterol as major components.
6 Apparatus
WARNING — Since the determination involves the use of volatile flammable solvents, electrical
apparatus employed shall comply with the legislation relating to the hazards in using such solvents.
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 Drying oven, capable of being maintained at a temperature of between 50 °C and 70 °C.
6.2 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 1 mg, with a readability of 0,1 mg.
6.3 Round-bottomed flasks, with ground neck, of capacity 100 ml.
6.4 One-mark volumetric flasks, of capacity 100 ml.
6.5 Graduated pipettes, of capacity 10 ml.
6.5 One-mark pipettes, of capacity 1 ml.
6.7 Water bath, capable of being maintained at 50 °C ± 2 °C and of boiling.
6.8 Reflux condenser, to fit the round-bottomed flask (6.3).
6.9 Separating funnels, of capacity 100 ml.
6.10 Solvent dispenser or graduated cylinders, of capacities 10 ml and 20 ml.
6.11 Distillation or evaporation apparatus (e.g. rotary vacuum evaporator), for distilling or evaporating
solvents, maintaining all temperatures up to boiling.
6.12 Glass funnels, of diameter 100 mm.
6.13 Dry filter paper, folded, fast grade, of diameter 200 mm.
6.14 Vials, cone shaped inside, of capacities 5 ml and 10 ml.
6.15 Nitrogen supply, with gas purity of at least 99 %.
© ISO and IDF 2006 – All rights reserved 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 18252:2006(E)
IDF 200:2006(E)
6.16 Test tube, with PTFE-lined screw cap, of capacity 50 ml.
6.17 Gas liquid chromatography.
6.17.1 Injector.
Maintain the vaporizing type injector (split/splitless), which is equipped with a thermo-stable septum, at a
temperature of 30 °C above the maximum oven temperature. In the case of a cold on-column injector,
maintain the injector at a temperature several degrees below the boiling point of the solvent.
6.17.2 Oven, capable of being run with the temperature programmed between 50 °C and 320 °C.
6.17.3 Column, fused silica capillary column.
Different types of stationary phase, film thickness, column length, and diameter may be used to successfully
obtain sterol separation. In any case, the selected column shall produce both a complete separation between
the solvent peak and 5α-cholestane (i.e. 5α-cholestane shall not elute in the broadening of the solvent) and a
baseline resolution among the cholesterol, campesterol, stigmasterol and β-sitosterol peaks. Moreover, no
baseline bleeding shall appear during the whole gas chromatographic (GC) run.
An example of a correct GC profile, obtained by using the operati
...