SIST ISO 21458:2010
Water quality - Determination of glyphosate and AMPA - Method using high performance liquid chromatography (HPLC) and fluorometric detection
Water quality - Determination of glyphosate and AMPA - Method using high performance liquid chromatography (HPLC) and fluorometric detection
This International Standard specifies a method for the determination of glyphosate and its major metabolite, aminomethylphosphonic acid (AMPA), in drinking water, ground water and surface water. The lowest limit of determination is about 0,05 µg/l. This method may be applicable to other types of waters provided the method is validated for each case.
Qualité de l'eau - Dosage du glyphosate et de l'AMPA - Méthode par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) et détection fluorimétrique
L'ISO 21458:2008 sp�cifie une m�thode permettant de doser le glyphosate ainsi que son principal m�tabolite, l'acide aminom�thylphosphonique (AMPA), dans l'eau potable, l'eau souterraine et l'eau de surface. La limite de quantification est d'environ 0,05 �g/l. Il est possible d'appliquer cette m�thode � d'autres types d'eau � condition que la m�thode soit � chaque fois valid�e.
Kakovost vode - Določevanje glifosata in AMPA - Metoda s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) s fluorometrijsko detekcijo
Ta mednarodni standard določa metodo določevanja glifosata ter njegovega glavnega metabolita, aminometilfosfonske kisline (AMPA), v pitni vodi ter podtalni in površinski vodi. Najnižja meja določevanja je približno 0,05 µg/l. Ta metoda se lahko uporablja za druge vrste voda, pod pogojem, da je potrjena za vsak primer.
General Information
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21458
First edition
2008-12-15
Water quality — Determination of
glyphosate and AMPA — Method using
high performance liquid chromatography
(HPLC) and fluorometric detection
Qualité de l'eau — Dosage du glyphosate et de l'AMPA — Méthode par
chromatographie liquide à haute performance (CLHP) et détection
fluorimétrique
Reference number
ISO 21458:2008(E)
©
ISO 2008
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electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
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ISO 21458:2008(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Principle. 1
4 Interferences . 2
5 Reagents. 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling. 4
8 Procedure . 5
9 Calibration . 6
10 Evaluation. 8
11 Expression of results . 9
12 Test report . 9
Annex A (informative) Internal standard generally used. 10
Annex B (informative) Precision data. 11
Annex C (informative) Chromatograms . 12
Bibliography . 14
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ISO 21458:2008(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 21458 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 2, Physical,
chemical and biochemical methods.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21458:2008(E)
Water quality — Determination of glyphosate and AMPA —
Method using high performance liquid chromatography (HPLC)
and fluorometric detection
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health
practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions. Some of the solvents
used in the procedure are toxic and dangerous. Exercise caution when handling them.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard
be carried out by suitably trained staff.
When this method is applied to its analysis, surface water shall be tested for additional and for
multiplicative interferences.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of glyphosate and its major metabolite,
aminomethylphosphonic acid (AMPA), in drinking water, ground water and surface water. The lowest limit of
determination is about 0,05 µg/l. This method may be applicable to other types of waters provided the method
is validated for each case.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 6058, Water quality — Determination of calcium content — EDTA titrimetric method
ISO 6059, Water quality — Determination of the sum of calcium and magnesium — EDTA titrimetric method
ISO 8466-1, Water quality — Calibration and evaluation of analytical methods and estimation of performance
characteristics — Part 1: Statistical evaluation of the linear calibration function
3 Principle
This method is based on derivatization of glyphosate and AMPA (see Table 1) by using 9-fluorenylmethyl
chloroformate (FMOCCl) in basic conditions followed by analysis using liquid chromatography on a polar
phase linked to a fluorescence detector.
The quantification of the compounds is performed by using external calibration or by internal standard
calibration or by applying the standard addition method. The compounds are identified by comparing the
retention times or by using the standard addition method.
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ISO 21458:2008(E)
Table 1 — Compounds determined by this method
Molar mass
Name Molecular formula CAS No.
g/mol
Glyphosate
C H NOP 169,1 1071-83-6
3 8 5
N-(phosphonomethyl)glycine
AMPA
CH NOP 111,0 1066-51-9
6 3
Aminomethylphosphonic acid
4 Interferences
Substances that produce a response at the selected wavelengths and for which the retention times are
identical to those of the compounds to be analysed may cause overlapping peaks during the determination. It
is necessary to take this into account especially when testing water samples other than ground water or
drinking water samples.
The presence of divalent cations, such as calcium, copper, iron, and zinc, may lead in some cases to an
underestimation of glyphosate and AMPA due to complex formation (see Reference [9]), in which case
pretreatment is required (see 8.1).
The presence of free chlorine used in treated waters may cause losses of glyphosate by oxidation, in which
case sodium thiosulfate is used to mitigate its effects (see Clause 7).
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical or HPLC grade, if available, unless otherwise specified. Reagents
shall not contain any substance that interferes with the compounds to be analysed.
5.1 Water, complying with grade 1 as defined in ISO 3696, or better.
5.2 Sodium thiosulfate, Na S O , CAS No.: 7772-98-7.
2 2 3
5.3 Acetonitrile, CH CN, HPLC grade, CAS No.: 75-05-8.
3
5.4 Diethyl ether, C H O, CAS No.: 60-29-7.
4 10
5.5 Reference substances (see Table 1).
5.5.1 Glyphosate, purity > 97 % mass fraction, CAS No.: 1071-83-6.
5.5.2 AMPA, purity > 97 % mass fraction, CAS No.: 1066-51-9.
5.5.3 Internal standard, purity > 97 % mass fraction (see Annex A for typical compounds).
Commercially available solutions may be used, e.g. 10 µg/ml in water.
5.5.4 Stock solution of glyphosate and AMPA, 1,0 g/l.
Using glyphosate (5.5.1) and AMPA (5.5.2), prepare a stock solution containing 1,0 g/l of each compound in
water (5.1), e.g. dissolve 20 mg of each compound in water (5.1) in a 20 ml one-mark volumetric flask (6.8).
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 1 year.
2 © ISO 2008 – All rights reserved
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ISO 21458:2008(E)
5.5.5 Intermediate concentration solution of glyphosate and AMPA, 30 µg/l.
Proceed with subsequent dilutions of stock solution of glyphosate and AMPA (5.5.4) in order to obtain a mass
concentration of 30 µg/l.
NOTE The solution can be obtained by adding 200 µl of stock solution (5.5.4) to 20 ml of water (5.1) in a one-mark
volumetric flask (6.8); then adding 60 µl of this solution to 20 ml of water (5.1) in another one-mark volumetric flask (6.8).
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 1 week.
5.5.6 Stock solution of internal standard, 30 µg/l.
Dissolve an internal standard (5.5.3) in water (5.1) and dilute to obtain a mass concentration of 30 µg/l in a
one-mark volumetric flask (6.8).
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 1 week.
5.6 Potassium hydroxide solution, c(KOH) = 3 mol/l, CAS No.: 1310-58-3,.
Dissolve 16,8 g of potassium hydroxide in 70 ml to 80 ml of water (5.1) in a 100 ml one-mark volumetric flask
(6.8) and make up to the mark with water.
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 3 months.
5.7 Hydrochloric acid, c(HCl) = 4 mol/l, CAS No.: 7647-01-0.
To 340 ml of water (5.1), slowly add 160 ml of concentrated HCl (37 % mass fraction) under magnetic stirrer
agitation in a 500 ml one-mark volumetric flask (6.8).This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about
3 months.
5.8 Potassium dihydrogenphosphate solution, c(KH PO ) = 0,05 mol/l, pH 5,4, CAS No.: 7778-77-0.
2 4
Dissolve 6,8 g ± 0,05 g of potassium dihydrogenphosphate in 1 000 ml of water. Adjust to pH = 5,4 ± 0,05 with
potassium hydroxide solution (5.6).
This solution may be stored for about 1 week.
5.9 Oxalic acid dihydrate solution, ρ(C H O⋅2 H O) = 100 g/l, CAS No.: 6153-56-6.
2 2 4 2
Dissolve 50 g ± 0,05 g of oxalic acid dihydrate in 500 ml of water.
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 2 months.
5.10 Mobile phase.
Mix 300 ml acetonitrile (5.3) and 700 ml of potassium dihydrogenphosphate buffer (5.8).
This solution can be stored for about 1 week.
5.11 Sodium tetraborate decahydrate solution, c(Na B O⋅10 H O) = 0,05 mol/l, CAS No.: 1303-96-4.
2 4 7 2
Dissolve 19 g ± 0,1 g of sodium tetraborate decahydrate in 1 000 ml of water.
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 1 month.
5.12 9-Fluorenylmethyl chloroformate solution, ρ(C H ClO ) = 1 mg/ml, CAS No.: 28920-43-6.
15 11 2
Dissolve 50 mg of 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOCCl; 97 % mass fraction) in 50 ml of acetonitrile (5.3).
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 2 weeks.
© ISO 2008 – All rights reserved 3
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ISO 21458:2008(E)
5.13 Phosphoric acid, 85 % (acidimetric), CAS No.: 7664-38-2.
6 Apparatus
Equipment or components that may come into contact with the sample shall be free from any residue that
could cause unacceptable interference in the blanks.
The use of glassware may cause losses of glyphosate by adsorption. Consequently, the use of disposable
materials is recommended wherever possible (see 6.1 and 6.2). For the same reason, check that any filters
used for samples prior to HPLC analysis do not lead to losses of substances.
6.1 Disposable plastic test tubes with screw caps, of capacity about 20 ml, for the derivatization.
6.2 Polyolefin bottles, of capacity about 50 ml, for sampling.
6.3 Syringe, for the standard solution of glyphosate and AMPA at the mass concentration 30 µg/l (5.5.5)
and internal standard at a mass concentration of 30 µg/l (5.5.6).
6.4 Analytical column: polar phase column: e.g. silica-bonded NH type chromatographic column,
2
particle size 3 µm to 5 µm, inner diameter 2 mm to 4,6 mm, length 250 mm. A suitable guard-column is
recommended.
Other types of columns may be used, e.g. reverse phase C column, material with particle size 3 µm to 5 µm
18
inner diameter 2 mm to 4,6 mm, length 250 mm. See elution conditions in Figure C.2 when using C column.
18
6.5 Vials, standard 2 ml vials with polytetrafluoroethylene caps.
CAUTION — Do not clean vials with any detergent or corrosive agents before use.
6.6 High performance liquid chromatograph (HPLC), including:
6.6.1 System, allowing the elution of mobile phase (5.10) with either manual or automatic injection
designed for analytical work.
6.6.2 Degassing system.
6.6.3 HPLC column oven with temperature control unit, 35 °C.
6.6.4 Fluorescence detector, λ = 260 nm; λ = 310 nm.
exc em
6.7 pH meter.
[10]
class A, of capacities 20 ml, 100 ml, 500 ml.
6.8 One-mark volumetric flasks, ISO 1042
CAUTION — Do not clean one-mark volumetric flasks with any detergent or corrosive agents before
use.
7 Sampling
Fill the polyolefin bottles (6.2) to the top with the water to be analysed.
For samples containing free chlorine, add about 2 mg of sodium thiosulfate (5.2) or any other chlorine
reducing agent per 100 ml of sample.
The water samples to be analysed may be stored in the dark at 4 °C ± 2 °C for 1 week or frozen in polyolefin
bottles (6.2) for 1 month. The freezer temperature should be at least −20 °C.
4 © ISO 2008 – All rights reserved
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ISO 21458:2008(E)
8 Procedure
8.1 Pretreatment
Determine the water hardness as specified in ISO 6058 and/or ISO 6059. If the measure of hardness,
c(CaCO ), exceeds 3 mmol/l, a sample pretreatment is recommended, in order to release any test substance
3
complexed with divalent cations (Reference [9]). Two preferred pretreatment procedures are proposed (8.1.1
and 8.1.2), the choice of which is left to the user. A third option for pretreatment can be suitable in some cases
(8.1.3).
8.1.1 First option for pretreatment
Adjust 3 ml of sample to pH 1 with about 200 µl of hydrochloric acid (5.7). Shake the mixture vigorously and
wait for 1 min. Adjust the sample to between pH 6 and pH 7 with potassium hydroxide solution (5.6). Then
proceed as specified in 8.2.
8.1.2 Second option for pretreatment
Add 300 µl of oxalic acid dihydrate solution (5.9) to 30 ml of sample. Check that the pH is between 2 to 3.
Shake the mixture vigorously and wait for 1 h. Neutralize the sample with potassium hydroxide solution (5.6).
Then proceed as specified in 8.2.
8.1.3 Third option for pretreatment
Add 0,625 ml of sodium tetraborate decahydrate buffer (5.11) and 50 µl of EDTA (1 g/l, pH = 9 adjusted by the
addition of potassium hydroxide) to 4 ml sample. Shake the mixture. Store it for 24 h at 4 °C ± 3 °C. Without
shaking, take 3 ml of the clear sample. Then proceed as described in 8.2.
8.2 Derivati
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 21458:2010
01-september-2010
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHJOLIRVDWDLQ$03$0HWRGDVWHNRþLQVNR
NURPDWRJUDILMRYLVRNHORþOMLYRVWL +3/& VIOXRURPHWULMVNRGHWHNFLMR
Water quality - Determination of glyphosate and AMPA - Method using high performance
liquid chromatography (HPLC) and fluorometric detection
Qualité de l'eau - Dosage du glyphosate et de l'AMPA - Méthode par chromatographie
liquide à haute performance (CLHP) et détection fluorimétrique
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 21458:2008
ICS:
13.060.50 3UHLVNDYDYRGHQDNHPLþQH Examination of water for
VQRYL chemical substances
SIST ISO 21458:2010 en,fr
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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SIST ISO 21458:2010
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SIST ISO 21458:2010
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21458
First edition
2008-12-15
Water quality — Determination of
glyphosate and AMPA — Method using
high performance liquid chromatography
(HPLC) and fluorometric detection
Qualité de l'eau — Dosage du glyphosate et de l'AMPA — Méthode par
chromatographie liquide à haute performance (CLHP) et détection
fluorimétrique
Reference number
ISO 21458:2008(E)
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ISO 2008
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SIST ISO 21458:2010
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SIST ISO 21458:2010
ISO 21458:2008(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Principle. 1
4 Interferences . 2
5 Reagents. 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling. 4
8 Procedure . 5
9 Calibration . 6
10 Evaluation. 8
11 Expression of results . 9
12 Test report . 9
Annex A (informative) Internal standard generally used. 10
Annex B (informative) Precision data. 11
Annex C (informative) Chromatograms . 12
Bibliography . 14
© ISO 2008 – All rights reserved iii
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SIST ISO 21458:2010
ISO 21458:2008(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 21458 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 2, Physical,
chemical and biochemical methods.
iv © ISO 2008 – All rights reserved
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SIST ISO 21458:2010
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21458:2008(E)
Water quality — Determination of glyphosate and AMPA —
Method using high performance liquid chromatography (HPLC)
and fluorometric detection
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health
practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions. Some of the solvents
used in the procedure are toxic and dangerous. Exercise caution when handling them.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard
be carried out by suitably trained staff.
When this method is applied to its analysis, surface water shall be tested for additional and for
multiplicative interferences.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of glyphosate and its major metabolite,
aminomethylphosphonic acid (AMPA), in drinking water, ground water and surface water. The lowest limit of
determination is about 0,05 µg/l. This method may be applicable to other types of waters provided the method
is validated for each case.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 6058, Water quality — Determination of calcium content — EDTA titrimetric method
ISO 6059, Water quality — Determination of the sum of calcium and magnesium — EDTA titrimetric method
ISO 8466-1, Water quality — Calibration and evaluation of analytical methods and estimation of performance
characteristics — Part 1: Statistical evaluation of the linear calibration function
3 Principle
This method is based on derivatization of glyphosate and AMPA (see Table 1) by using 9-fluorenylmethyl
chloroformate (FMOCCl) in basic conditions followed by analysis using liquid chromatography on a polar
phase linked to a fluorescence detector.
The quantification of the compounds is performed by using external calibration or by internal standard
calibration or by applying the standard addition method. The compounds are identified by comparing the
retention times or by using the standard addition method.
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SIST ISO 21458:2010
ISO 21458:2008(E)
Table 1 — Compounds determined by this method
Molar mass
Name Molecular formula CAS No.
g/mol
Glyphosate
C H NOP 169,1 1071-83-6
3 8 5
N-(phosphonomethyl)glycine
AMPA
CH NOP 111,0 1066-51-9
6 3
Aminomethylphosphonic acid
4 Interferences
Substances that produce a response at the selected wavelengths and for which the retention times are
identical to those of the compounds to be analysed may cause overlapping peaks during the determination. It
is necessary to take this into account especially when testing water samples other than ground water or
drinking water samples.
The presence of divalent cations, such as calcium, copper, iron, and zinc, may lead in some cases to an
underestimation of glyphosate and AMPA due to complex formation (see Reference [9]), in which case
pretreatment is required (see 8.1).
The presence of free chlorine used in treated waters may cause losses of glyphosate by oxidation, in which
case sodium thiosulfate is used to mitigate its effects (see Clause 7).
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical or HPLC grade, if available, unless otherwise specified. Reagents
shall not contain any substance that interferes with the compounds to be analysed.
5.1 Water, complying with grade 1 as defined in ISO 3696, or better.
5.2 Sodium thiosulfate, Na S O , CAS No.: 7772-98-7.
2 2 3
5.3 Acetonitrile, CH CN, HPLC grade, CAS No.: 75-05-8.
3
5.4 Diethyl ether, C H O, CAS No.: 60-29-7.
4 10
5.5 Reference substances (see Table 1).
5.5.1 Glyphosate, purity > 97 % mass fraction, CAS No.: 1071-83-6.
5.5.2 AMPA, purity > 97 % mass fraction, CAS No.: 1066-51-9.
5.5.3 Internal standard, purity > 97 % mass fraction (see Annex A for typical compounds).
Commercially available solutions may be used, e.g. 10 µg/ml in water.
5.5.4 Stock solution of glyphosate and AMPA, 1,0 g/l.
Using glyphosate (5.5.1) and AMPA (5.5.2), prepare a stock solution containing 1,0 g/l of each compound in
water (5.1), e.g. dissolve 20 mg of each compound in water (5.1) in a 20 ml one-mark volumetric flask (6.8).
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 1 year.
2 © ISO 2008 – All rights reserved
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ISO 21458:2008(E)
5.5.5 Intermediate concentration solution of glyphosate and AMPA, 30 µg/l.
Proceed with subsequent dilutions of stock solution of glyphosate and AMPA (5.5.4) in order to obtain a mass
concentration of 30 µg/l.
NOTE The solution can be obtained by adding 200 µl of stock solution (5.5.4) to 20 ml of water (5.1) in a one-mark
volumetric flask (6.8); then adding 60 µl of this solution to 20 ml of water (5.1) in another one-mark volumetric flask (6.8).
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 1 week.
5.5.6 Stock solution of internal standard, 30 µg/l.
Dissolve an internal standard (5.5.3) in water (5.1) and dilute to obtain a mass concentration of 30 µg/l in a
one-mark volumetric flask (6.8).
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 1 week.
5.6 Potassium hydroxide solution, c(KOH) = 3 mol/l, CAS No.: 1310-58-3,.
Dissolve 16,8 g of potassium hydroxide in 70 ml to 80 ml of water (5.1) in a 100 ml one-mark volumetric flask
(6.8) and make up to the mark with water.
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 3 months.
5.7 Hydrochloric acid, c(HCl) = 4 mol/l, CAS No.: 7647-01-0.
To 340 ml of water (5.1), slowly add 160 ml of concentrated HCl (37 % mass fraction) under magnetic stirrer
agitation in a 500 ml one-mark volumetric flask (6.8).This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about
3 months.
5.8 Potassium dihydrogenphosphate solution, c(KH PO ) = 0,05 mol/l, pH 5,4, CAS No.: 7778-77-0.
2 4
Dissolve 6,8 g ± 0,05 g of potassium dihydrogenphosphate in 1 000 ml of water. Adjust to pH = 5,4 ± 0,05 with
potassium hydroxide solution (5.6).
This solution may be stored for about 1 week.
5.9 Oxalic acid dihydrate solution, ρ(C H O⋅2 H O) = 100 g/l, CAS No.: 6153-56-6.
2 2 4 2
Dissolve 50 g ± 0,05 g of oxalic acid dihydrate in 500 ml of water.
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 2 months.
5.10 Mobile phase.
Mix 300 ml acetonitrile (5.3) and 700 ml of potassium dihydrogenphosphate buffer (5.8).
This solution can be stored for about 1 week.
5.11 Sodium tetraborate decahydrate solution, c(Na B O⋅10 H O) = 0,05 mol/l, CAS No.: 1303-96-4.
2 4 7 2
Dissolve 19 g ± 0,1 g of sodium tetraborate decahydrate in 1 000 ml of water.
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 1 month.
5.12 9-Fluorenylmethyl chloroformate solution, ρ(C H ClO ) = 1 mg/ml, CAS No.: 28920-43-6.
15 11 2
Dissolve 50 mg of 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOCCl; 97 % mass fraction) in 50 ml of acetonitrile (5.3).
This solution may be stored at 4 °C ± 3 °C for about 2 weeks.
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SIST ISO 21458:2010
ISO 21458:2008(E)
5.13 Phosphoric acid, 85 % (acidimetric), CAS No.: 7664-38-2.
6 Apparatus
Equipment or components that may come into contact with the sample shall be free from any residue that
could cause unacceptable interference in the blanks.
The use of glassware may cause losses of glyphosate by adsorption. Consequently, the use of disposable
materials is recommended wherever possible (see 6.1 and 6.2). For the same reason, check that any filters
used for samples prior to HPLC analysis do not lead to losses of substances.
6.1 Disposable plastic test tubes with screw caps, of capacity about 20 ml, for the derivatization.
6.2 Polyolefin bottles, of capacity about 50 ml, for sampling.
6.3 Syringe, for the standard solution of glyphosate and AMPA at the mass concentration 30 µg/l (5.5.5)
and internal standard at a mass concentration of 30 µg/l (5.5.6).
6.4 Analytical column: polar phase column: e.g. silica-bonded NH type chromatographic column,
2
particle size 3 µm to 5 µm, inner diameter 2 mm to 4,6 mm, length 250 mm. A suitable guard-column is
recommended.
Other types of columns may be used, e.g. reverse phase C column, material with particle size 3 µm to 5 µm
18
inner diameter 2 mm to 4,6 mm, length 250 mm. See elution conditions in Figure C.2 when using C column.
18
6.5 Vials, standard 2 ml vials with polytetrafluoroethylene caps.
CAUTION — Do not clean vials with any detergent or corrosive agents before use.
6.6 High performance liquid chromatograph (HPLC), including:
6.6.1 System, allowing the elution of mobile phase (5.10) with either manual or automatic injection
designed for analytical work.
6.6.2 Degassing system.
6.6.3 HPLC column oven with temperature control unit, 35 °C.
6.6.4 Fluorescence detector, λ = 260 nm; λ = 310 nm.
exc em
6.7 pH meter.
[10]
class A, of capacities 20 ml, 100 ml, 500 ml.
6.8 One-mark volumetric flasks, ISO 1042
CAUTION — Do not clean one-mark volumetric flasks with any detergent or corrosive agents before
use.
7 Sampling
Fill the polyolefin bottles (6.2) to the top with the water to be analysed.
For samples containing free chlorine, add about 2 mg of sodium thiosulfate (5.2) or any other chlorine
reducing agent per 100 ml of sample.
The water samples to be analysed may be stored in the dark at 4 °C ± 2 °C for 1 week or frozen in polyolefin
bottles (6.2) for 1 month. The freezer temperature should be at least −20 °C.
4 © ISO 2008 – All rights reserved
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SIST ISO 21458:2010
ISO 21458:2008(E)
8 Procedure
8.1 Pretreatment
Determine the water hardness as specified in ISO 6058 and/or ISO 6059. If the measure of hardness,
c(CaCO ), exceeds 3 mmol/l, a sample pretreatment is recommended, in order to release any test substance
3
complexed with divalent cations (Reference [9]). Two preferred pretreatment procedures are proposed (8.1.1
and 8.1.2), the choice of which is left to the user. A third option for pretreatment can be suitable in some cases
(8.1.3).
8.1.1 First option for pretreatment
Adjust 3 ml of sample to pH 1 with about 200 µl of hydrochloric acid (5.7). Shake the mixture vigorously and
wait for 1 min. Adjust the sample to between pH 6 and pH 7 with potassium hydroxide solution (5.6). Then
proceed as specified in 8.2.
8.1.2 Second option for pretreatment
Add 300 µl of oxalic acid dihydrate solution (5.9) to 30 ml of sample. Ch
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21458
Première édition
2008-12-15
Qualité de l'eau — Dosage du glyphosate
et de l'AMPA — Méthode par
chromatographie liquide à haute
performance (CLHP) et détection
fluorimétrique
Water quality — Determination of glyphosate and AMPA — Method
using high performance liquid chromatography (HPLC) and fluorometric
detection
Numéro de référence
ISO 21458:2008(F)
©
ISO 2008
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ISO 21458:2008(F)
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Publié en Suisse
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ISO 21458:2008(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Principe. 1
4 Interférences . 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 4
7 Échantillonnage . 5
8 Mode opératoire . 5
9 Étalonnage. 7
10 Évaluation. 8
11 Expression des résultats . 9
12 Rapport d'essai . 9
Annexe A (informative) Étalon interne généralement utilisé . 10
Annexe B (informative) Données de fidélité . 11
Annexe C (informative) Chromatogrammes . 12
Bibliographie . 14
© ISO 2008 – Tous droits réservés iii
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ISO 21458:2008(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 21458 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 2,
Méthodes physiques, chimiques et biochimiques.
iv © ISO 2008 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 21458:2008(F)
Qualité de l'eau — Dosage du glyphosate et de l'AMPA —
Méthode par chromatographie liquide à haute performance
(CLHP) et détection fluorimétrique
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n'a pas pour but de traiter
tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l'utilisateur
d'établir des pratiques appropriées en matière d'hygiène et de sécurité et de s'assurer de la
conformité à la réglementation nationale en vigueur. Certains des solvants utilisés dans le mode
opératoire sont toxiques et dangereux. Les manipuler avec précaution.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais conduits conformément à la présente
Norme internationale soient exécutés par du personnel ayant reçu une formation adéquate.
L'application de la méthode à l'analyse de l'eau de surface doit faire l'objet de contrôles des
interférences complémentaires.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode permettant de doser le glyphosate ainsi que son
principal métabolite, l'acide aminométhylphosphonique (AMPA), dans l'eau potable, l'eau souterraine et l'eau
de surface. La limite de quantification est d'environ 0,05 µg/l. Il est possible d'appliquer cette méthode à
d'autres types d'eau à condition que la méthode soit à chaque fois validée.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 6058, Qualité de l'eau — Dosage du calcium — Méthode titrimétrique à l'EDTA
ISO 6059, Qualité de l'eau — Dosage de la somme du calcium et du magnésium — Méthode titrimétrique à
l'EDTA
ISO 8466-1, Qualité de l'eau — Étalonnage et évaluation des méthodes d'analyse et estimation des
caractères de performance — Partie 1: Évaluation statistique de la fonction linéaire d'étalonnage
3 Principe
La présente méthode repose sur la dérivation en milieu basique du glyphosate et de l'AMPA (voir Tableau 1)
avec du 9-fluorenylméthyl chloroformate (FMOC-Cl), suivie d'une analyse par chromatographie liquide sur
une colonne à phase polaire, reliée à un détecteur de fluorescence.
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ISO 21458:2008(F)
Les composés sont quantifiés par étalonnage externe ou étalonnage interne ou encore par la méthode des
ajouts dosés. Les composés sont identifiés en comparant les temps de rétention ou en appliquant la méthode
des ajouts dosés.
Tableau 1 — Composés dosés à l'aide de cette méthode
Masse molaire
Nom Formule moléculaire Numéro CAS
g/mol
Glyphosate
C H NOP 169,1 1071-83-6
3 8 5
N-(phosphonométhyl)
glycine
AMPA
CH NOP 111,0 1066-51-9
6 3
acide
aminométhylphosphonique
4 Interférences
Les substances répondant aux longueurs d'ondes choisies et dont les temps de rétention sont identiques aux
composés à analyser peuvent provoquer des interférences au cours du dosage. Il est nécessaire d'en tenir
compte, surtout lors de l'analyse des échantillons d'eau autres que des échantillons d'eau souterraine ou
d'eau potable.
La présence de cations divalents, tels que le calcium, le cuivre, le fer ou le zinc, peut conduire dans certains
cas à une sous-estimation de la teneur en glyphosate et en AMPA suite à la formation de complexes (voir
Référence [9]), auquel cas un traitement préalable est nécessaire (voir 8.1).
La présence de chlore libre utilisé dans les eaux traitées peut provoquer des pertes de glyphosate par
oxydation; dans ce cas le thiosulfate de sodium est utilisé pour atténuer ses effets (voir Article 7).
5 Réactifs
Utiliser des réactifs de qualité analytique reconnue ou de qualité CLHP, s'ils sont disponibles, sauf
spécification contraire. Les réactifs ne doivent contenir aucune substance susceptible d'interférer avec les
composés à analyser.
5.1 Eau, de qualité 1 telle que définie dans l'ISO 3696, ou de qualité supérieure.
5.2 Thiosulfate de sodium, Na S O , n° CAS 7772-98-7.
2 2 3
5.3 Acétonitrile, CH CN, de qualité CLHP, n° CAS 75-05-8.
3
5.4 Éther diéthylique, C H O, n° CAS 60-29-7.
4 10
5.5 Substances de référence (voir Tableau 1).
5.5.1 Glyphosate, de pureté > 97 % en fraction massique, n° CAS 1071-83-6.
5.5.2 AMPA, de pureté > 97 % en fraction massique, n° CAS 1066-51-9.
5.5.3 Étalon interne, de pureté > 97 % en fraction massique (voir Annexe A pour les composés principaux).
Il est possible d'utiliser des solutions disponibles dans le commerce d'une concentration de 10 µg/ml dans
l'eau, par exemple.
2 © ISO 2008 – Tous droits réservés
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ISO 21458:2008(F)
5.5.4 Solution mère de glyphosate et d'AMPA, 1,0 g/l.
À l'aide de glyphosate (5.5.1) et d'AMPA (5.5.2), préparer une solution mère contenant 1,0 g/l de chacun des
composés dans de l'eau (5.1), par exemple par dissolution de 20 mg de chacun des composés dans l'eau
(5.1), dans une fiole jaugée (6.8) de 20 ml.
Cette solution peut être stockée à 4 °C ± 3 °C pendant environ un an.
5.5.5 Solution de concentration intermédiaire de glyphosate et d'AMPA, 30 µg/l.
Pour obtenir une solution à 30 µg/l, procéder à des dilutions successives de la solution mère de glyphosate et
d'AMPA (5.5.4).
NOTE Il est possible d'obtenir cette solution en ajoutant 200 µl de la solution mère (5.5.4) à 20 ml d'eau (5.1) dans
une fiole jaugée (6.8); puis en ajoutant 60 µl de la solution ainsi obtenue à 20 ml d'eau (5.1), dans une autre fiole
jaugée (6.8).
Cette solution peut être stockée à 4 °C ± 3 °C pendant environ une semaine.
5.5.6 Solution mère d'étalon interne, 30 µg/l.
Dissoudre l'étalon interne (5.5.3) dans de l'eau (5.1) et diluer pour obtenir une concentration massique de
30 µg/l, dans une fiole jaugée (6.8).
Cette solution peut être stockée à 4 °C ± 3 °C pendant environ une semaine.
5.6 Solution d'hydroxyde de potassium, c(KOH) = 3 mol/l, (n° CAS 1310-58-3).
Dissoudre 16,8 g d'hydroxyde de potassium dans environ 70 ml à 80 ml d'eau (5.1),dans une fiole jaugée
(6.8) de 100 ml et diluer au trait avec de l'eau.
Cette solution peut être stockée à 4 °C ± 3 °C pendant environ trois mois.
5.7 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 4 mol/l, n° CAS 7647-01-0.
Ajouter lentement à 340 ml d'eau (5.1) 160 ml d'HCl concentré (37 % en fraction massique) dans une fiole
jaugée (6.8) de 500 ml, en agitant à l'aide d'un barreau magnétique. Cette solution peut être stockée à
4 °C ± 3 °C pendant environ trois mois.
5.8 Solution de dihydrogénophosphate de potassium, c(KH PO ) = 0,05 mol/l, pH 5,4,
2 4
n° CAS 7778-77-0.
Dissoudre 6,8 g ± 0,05 g de dihydrogénophosphate de potassium dans 1 000 ml d'eau. Ajuster avec la
solution d'hydroxyde de potassium (5.6) pour obtenir un pH de 5,4 ± 0,05.
Cette solution peut être stockée pendant environ une semaine.
5.9 Solution d'acide oxalique dihydraté, ρ(C H O ,2 H O) = 100 g/l, n° CAS 6153-56-6.
2 2 4 2
Dissoudre 50 g ± 0,05 g d'acide oxalique dihydraté dans 500 ml d'eau.
Cette solution peut être stockée à 4 °C ± 3 °C pendant environ deux mois.
5.10 Phase mobile.
Mélanger 300 ml d'acétonitrile (5.3) et 700 ml de tampon de dihydrogénophosphate de potassium (5.8).
Cette solution peut être stockée pendant environ une semaine.
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ISO 21458:2008(F)
5.11 Solution de tétraborate de sodium décahydraté, c(Na B O ,10 H O) = 0,05 mol/l, n° CAS 1303-96-4.
2 4 7 2
Dissoudre 19 g ± 0,1 g de tétraborate de sodium décahydraté dans 1 000 ml d'eau.
Cette solution peut être stockée à 4 °C ± 3 °C pendant environ un mois.
5.12 Solution de 9-fluorenylméthyl chloroformate, ρ(C H ClO ) = 1 mg/ml, n° CAS 28920-43-6.
15 11 2
Dissoudre 50 mg de 9-fluorenylméthyl chloroformate (FMOC-Cl; 97 % en fraction massique) dans 50 ml
d'acétonitrile (5.3).
Cette solution peut être stockée à 4 °C ± 3 °C pendant environ deux semaines.
5.13 Acide phosphorique, 85 % (acidimétrique), n° CAS 7664-38-2.
6 Appareillage
Le matériel ou les composés susceptibles d'entrer en contact avec l'échantillon doivent être exempts de tout
résidu qui pourrait provoquer une interférence inacceptable dans les blancs.
L'utilisation de verrerie peut provoquer des pertes de glyphosate par adsorption. Il est par conséquent
recommandé d'utiliser des matériaux à usage unique, dans la mesure du possible (voir 6.1 et 6.2). Pour la
même raison, contrôler que les filtres susceptibles d'être utilisés pour les échantillons avant l'analyse par
CLHP ne conduisent pas à des pertes de substances.
6.1 Tubes d'essai en plastique à usage unique avec bouchon à vis, d'une capacité d'environ 20 ml
pour la dérivation.
6.2 Bouteilles en polyoléfine, d'une capacité d'environ 50 ml, pour l'échantillonnage.
6.3 Seringue, pour la solution étalon de glyphosate et d'AMPA, de concentration massique de 30 µg/l
(5.5.5), et pour l'étalon interne de concentration massique de 30 µg/l (5.5.6).
6.4 Colonne analytique: colonne à phase polaire: par exemple colonne chromatographique de silice
greffée NH , dont le diamètre des particules de silice est compris entre 3 µm et 5 µm, d'un diamètre intérieur
2
compris entre 2 mm et 4,6 mm et d'une longueur de 250 mm. Il recommandé d'utiliser une colonne de garde
adaptée.
Il est possible d'utiliser d'autres types de colonnes, par exemple une colonne à phase inversée C , dont le
18
diamètre des particules de garnissage est compris entre 3 µm et 5 µm, d'un diamètre intérieur compris entre
2 mm et 4,6 mm et d'une longueur de 250 mm. Voir les conditions d'élution à la Figure C.2 lors de l'utilisation
d'une colonne C .
18
6.5 Flacons pour passeur automatique, de 2 ml, avec bouchon en polytétrafluoréthylène.
ATTENTION — Ne pas nettoyer les flacons avec un détergent ou des agents corrosifs avant utilisation.
6.6 Chromatographe liquide à haute performance (CLHP), comprenant:
6.6.1 Dispositif, permettant l'élution de la phase mobile (5.10) par injection manuelle ou automatique,
conçu pour le travail analytique.
6.6.2 Système de dégazage.
6.6.3 Four de colonne CLHP avec unité de régulation de la température, à 35 °C.
6.6.4 Détecteur de fluorescence, λ = 260 nm; λ = 310 nm.
exc em
4 © ISO 2008 – Tous droits réservés
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ISO 21458:2008(F)
6.7 pH-mètre.
[10]
6.8 Fioles jaugées, ISO 1042, classe A, de capacité 20 ml, 100 ml, 500 ml.
ATTENTION — Ne pas nettoyer les fioles jaugées avec un détergent ou des agents corrosifs avant
utilisation.
7 Échantillonnage
Remplir à ras bord les bouteilles en polyoléfine (6.2) avec l'eau à analyser.
Dans le cas d'échantillons contenant du chlore libre, ajouter environ 2 mg de thiosulfate de sodium (5.2) ou de
tout autre agent réducteur du chlore par 100 ml d'échantillon.
Les échantillons d'eau à analyser peuvent être stockés à l'abri de la lumière à 4 °C ± 2 °C pendant une
semaine ou congelés dans des bouteilles en polyoléfine (6.2) jusqu'à un mois. Il convient que la température
de congélation soit d'au moins −20 °C.
8 Mode opératoire
8.1 Traitement préalable
Déterminer la dureté de l'eau comme spécifié dans l'ISO 6058 et/ou l'ISO 6059. Si la dureté, c(CaCO ), est
3
supérieure à 3 mmol/l, il est recommandé de procéder à un traitement préalable de l'échantillon pour libérer la
partie de la substance d'essai susceptible de participer à une complexation avec des cations divalents
(Référence [9]). Deux méthodes de traitement préalable sont proposées (8.1.1 et 8.1.2), au choix de
l'utilisateur. Une troisième option de traitement préalable peut être appropriée dans certains cas (8.1.3).
8.1.1 Première option de traitement préalable
Ajuster 3 ml d'échantillon à pH 1 avec environ 200 µl d'acide chlorhydrique (5.7). Agiter le mélange
énergiquement et attendre 1 min. Neutraliser l'échantillon entre pH 6 et pH 7 avec la solution d'hydroxyde de
potassium (5.6). Procéder ensuite comme spécifié en 8.2.
8.1.2 Seconde option de traitement préalable
Ajouter à 30 ml d'échantillon 300 µl de solution d'acide oxalique dihydraté (5.9). Vérifier que le pH se situe
entre 2 et 3. Agiter le mélange énergiquement et attendre 1 h. Neutraliser l'échantillon avec la solution
d'hydroxyde de potassium (5.6). Procéder ensuite comme spécifié en 8.2.
8.1.3 Troisième option de traitement préalable
Ajout
...
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