Water quality - Determination of glyphosate and AMPA - Method using high performance liquid chromatography (HPLC) with tandem mass spectrometric detection

This International Standard specifies a method for the determination of dissolved fraction of glyphosate
and its major metabolite, aminomethylphosphonic acid (AMPA), in drinking water, ground water, and
surface water at concentrations of 0,03 μg/l to 1,5 μg/l. It does not apply to marine or salty water. This
method can be applicable to other types of waters, provided the method is validated for each case.

Qualité de l'eau - Détermination du glyphosate et de l'AMPA - Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) avec détection par spectrométrie de masse en tandem

L'ISO 16308:2014 sp�cifie une m�thode de d�termination de la fraction dissoute de glyphosate et de son principal m�tabolite, l'acide aminom�thylphosphonique (AMPA) dans l'eau potable, l'eau souterraine et l'eau de surface � des concentrations de 0,03 �g/l � 1,5 �g/l. Elle ne s'applique pas � l'eau de mer ou � l'eau sal�e. Cette m�thode peut s'appliquer � d'autres types d'eaux � condition qu'elle soit valid�e pour chaque cas.

Kakovost vode - Določevanje glifosata in AMPA - Metoda tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) s sklopljeno masno spektrometrijo

Ta mednarodni standard določa metodo za določevanje raztopljenega dela glifosata in njegovega glavnega metabolita, aminometilfosfonske kisline (AMPA), v pitni vodi, podtalnici in površinski vodi pri koncentracijah med 0,03 μg/l in 1,5 μg/l. Ne uporablja se za morsko ali slano vodo. Ta metoda se lahko uporablja za druge vrste voda pod pogojem, da je potrjena za vsak posamezen primer.

General Information

Status
Published
Public Enquiry End Date
30-Apr-2014
Publication Date
06-May-2018
Technical Committee
Current Stage
6060 - National Implementation/Publication (Adopted Project)
Start Date
25-Apr-2018
Due Date
30-Jun-2018
Completion Date
07-May-2018

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ISO 16308:2014 - Water quality -- Determination of glyphosate and AMPA -- Method using high performance liquid chromatography (HPLC) with tandem mass spectrometric detection
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SIST ISO 16308:2018
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ISO 16308:2014 - Qualité de l'eau -- Détermination du glyphosate et de l'AMPA -- Méthode par chromatographie en phase liquide a haute performance (CLHP) avec détection par spectrométrie de masse en tandem
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16308
First edition
2014-09-15
Water quality — Determination of
glyphosate and AMPA — Method
using high performance liquid
chromatography (HPLC) with tandem
mass spectrometric detection
Qualité de l’eau — Détermination du glyphosate et de l’AMPA —
Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance
(CLHP) avec détection par spectrométrie de masse en tandem
Reference number
ISO 16308:2014(E)
ISO 2014
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16308:2014(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2014

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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
ISO copyright office
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Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2014 – All rights reserved
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ISO 16308:2014(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

4 Interferences ............................................................................................................................................................................................................ 2

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 4

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 5

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 5

8.1 Pre-treatment (Suspended particular matter) ............................................................................................................ 5

8.2 Chelate break and derivatization ............................................................................................................................................ 5

8.3 Pre-concentration ................................................................................................................................................................................. 6

8.4 Chromatographic determination............................................................................................................................................. 7

8.5 Identification and confirmation of the analytes ......................................................................................................... 8

8.6 Blank control monitoring............................................................................................................................................................... 8

9 Calibration .................................................................................................................................................................................................................. 8

9.1 Concentration ranges ........................................................................................................................................................................ 8

9.2 Matrix-matched calibration ......................................................................................................................................................... 8

9.3 Internal standard calibration ..................................................................................................................................................... 9

10 Expression of results .....................................................................................................................................................................................10

11 Test report ................................................................................................................................................................................................................10

Annex A (informative) Performance data ....................................................................................................................................................11

Annex B (informative) Examples of chromatographic conditions ......................................................................................14

Annex C (informative) Examples of chromatograms ........................................................................................................................15

Annex D (informative) Analysis of gluphosinate ...................................................................................................................................16

Annex E (informative) Pre-treatment of hard water samples .................................................................................................20

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................22

© ISO 2014 – All rights reserved iii
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ISO 16308:2014(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers

to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 2, Physical,

chemical and biochemical methods.
iv © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 16308:2014(E)
Introduction

Glyphosate [N-(phosphonomethyl)glycine] is a non-selective broad-spectrum herbicide. The efficiency

of this compound makes it a top selling and one of the most widely used herbicides in the world since

it entered the market in 1974. Together with its main degradation product, aminomethylphosphonic

acid (AMPA), glyphosate is one of the most detected substances in water bodies in many developed

countries. Note also that AMPA can be released during sewage treatment, e.g. due to breakdown of

detergent formulations for textiles.

Glyphosate and AMPA belong to the aminophosphonate family and have specific physico-chemical

properties that require the development of complex analytical methods for analysis and detection. The

difficulty in analysis is mainly linked to the high solubility of glyphosate and AMPA and their chelating

nature. To solve these problems, their pre-column derivatization with 9-fluorenylmethylchloroformate

(FMOC-Cl) to form less polar derivatives allows a better separation using liquid chromatography.

Gluphosinate, another aminophosphonate, is less commonly subject to regulation and can be determined

simultaneously, provided it can be demonstrated that there is no interference with the sample under

analysis.

There is currently an International Standard for the determination by liquid chromatography and

fluorometric detection; however, the determination by HPLC–ESI–MS/MS can be much more specific

(unambiguous identification) and more sensitive (limits of quantification of approximately 30 ng/l for

both glyphosate and AMPA). This International Standard is based on this analytical technique and is

intended for laboratories involved in the regulatory control of the aquatic environment. Many such

laboratories are now equipped with this kind of apparatus.
© ISO 2014 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16308:2014(E)
Water quality — Determination of glyphosate and AMPA
— Method using high performance liquid chromatography
(HPLC) with tandem mass spectrometric detection

WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory

practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if

any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and

health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.

IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International

Standard be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope

This International Standard specifies a method for the determination of dissolved fraction of glyphosate

and its major metabolite, aminomethylphosphonic acid (AMPA), in drinking water, ground water, and

surface water at concentrations of 0,03 µg/l to 1,5 µg/l. It does not apply to marine or salty water. This

method can be applicable to other types of waters, provided the method is validated for each case.

2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated

references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods

ISO 5667-3, Water quality — Sampling — Part 3: Preservation and handling of water samples

ISO 8466-1, Water quality — Calibration and evaluation of analytical methods and estimation of performance

characteristics — Part 1: Statistical evaluation of the linear calibration function

3 Principle
Glyphosate and AMPA (dissolved fraction after filtration) are derivatized using

9-fluorenylmethylchloroformate (FMOC-Cl) (5.17) to lower their polarity and increase the retention

of compound in a separation on a reverse phase column (e.g. C18) as well as to improve the mass

spectrometric detection. If the mass spectrometer has sufficient detection capability, it is possible to

omit the solid phase extraction and to analyse the analytes by direct injection (see 8.2.1).

The derivatized sample is purified by liquid/liquid extraction and then concentrated by solid phase

extraction (SPE).

The analysis is performed by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass

spectrometry via an electrospray source (HPLC–ESI–MS/MS), using matrix-matched calibration.

© ISO 2014 – All rights reserved 1
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ISO 16308:2014(E)
Table 1 — Substances addressed
Molecular mass
Name Formula CAS-RN
g/mol
Glyphosate
C H NO P 169,1 1071–83–6
3 8 5
N-(phosphonomethyl)glycine
AMPA
CH NO P 111,0 1066–51–9
6 3
Aminomethylphosphonic acid
CAS-RN Chemical Abstracts Service Registry Number

NOTE Gluphosinate, belonging to the aminophosphonate family, can be determined simultaneously, provided

it can be demonstrated that there is no interference with the sample (matrix) subject to analysis.

4 Interferences

This method is validated for hard water containing up to 3,2 mmol/l of the sum of calcium and

magnesium. For waters with a higher calcium and magnesium content, it may be necessary to increase

the concentration of EDTA-Na (5.16) at the derivatization step (see Annex D).

It can prove necessary to include the acidification step described in Annex D even for some water types

below 3,2 mmol/l of the sum of calcium and magnesium. The laboratory shall check the necessity of this

procedure for its routine samples.

The presence of free chlorine, e.g. in treated waters, can cause losses of glyphosate by oxidation.

Consequently sodium thiosulfate shall be used (see Clause 7).
5 Reagents

Unless otherwise stated, all reagents and solvents shall be of sufficient purity, e.g. “for trace analysis”.

5.1 Deionized water.
5.2 Ultra-pure water, complying with grade 1 of ISO 3696.
5.3 Nitrogen, N , purity ≥ 99,996 % volume fraction.
5.4 Laboratory detergent, alkaline.
5.5 Sodium thiosulfate, Na S O .
2 2 3
5.6 Acetonitrile, C H N, HPLC grade.
2 3
5.7 Methanol, CH O, HPLC grade.
5.8 Ethanol, C H O, 95 %, HPLC grade mass fraction.
2 6
5.9 Ethyl acetate, C H O , HPLC grade.
4 8 2
5.10 Ammonium acetate, C H O N.
2 7 2
5.11 Triethylamine, C H N.
6 15
5.12 Ammonium hydroxide, NH OH 28 % mass fraction.
4 ,
2 © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 16308:2014(E)
5.13 Formic acid, CH O .
2 2
5.14 Hydrochloric acid, HCl, 300 g/l.
5.15 Glacial acetic acid, C H O .
2 4 2

5.16 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), disodium salt dihydrate, C H N O Na ·2H O, with a

10 14 2 8 2 2
minimum purity of 99 % mass fraction.

5.17 9-Fluorenylmethyl chloroformate,(FMOC-Cl), C H ClO , with a minimum purity of 97 % mass

15 11 2
fraction.

FMOC-Cl is used to prepare the derivatization reagent, FMOC-Cl solution, 50 mg/ml, in acetonitrile

(5.6). This solution can be stored at −18 °C ± 3 °C for 6 months.

For direct injection (8.2.1), use a FMOC-Cl solution of 0,5 mg/ml in acetonitrile.

5.18 Reference substances, according to Table 1.

5.18.1 Glyphosate, N-(phosphonomethyl)glycine, C H NO P, purity > 98 % mass fraction.

3 8 5
5.18.2 AMPA, aminomethylphosphonic acid, CH NO P, purity > 98 % mass fraction.
6 3
13 15

5.18.3 1,2- C , N-labelled glyphosate, surrogate standard, purity > 98 % mass fraction.

13 15
5.18.4 C, N-labelled AMPA, surrogate standard, purity > 98 % mass fraction.
5.19 Calibration solutions.

Individual stock solutions of glyphosate (5.18.1) and AMPA (5.18.2), 100 mg/l, prepared in ultra-pure

water (5.2). These solutions can be stored at 4 °C ± 3 °C for 1 month.
-13 15 13 15

Individual stock solutions of 1,2 C , N-labelled glyphosate (5.18.3) and C, N-labelled AMPA

(5.18.4) 100 mg/l, prepared in ultra-pure water (5.2). These solutions can be stored at 4 °C ± 3 °C for

1 month.
13 15 13 15

Multi-substance working solution of surrogates: 1,2- C , N-labelled glyphosate and C, N-labelled

AMPA, 20 µg/l, prepared in ultra-pure water (5.2). This solution can be stored at 4 °C ± 3 °C for 1 month.

NOTE Stock and calibration solutions can be stored longer, provided the adequate justifications are given

regarding stability.

5.20 Triethylammonium acetate buffer, 0,1 % triethylamine (5.11) solution adjusted to pH 9,5 with

glacial acetic acid (5.15) (mobile phase).
5.21 Sodium tetraborate, decahydrate, Na B O ·10H O.
2 4 7 2
5.22 Borate-Na buffer, 0,05 mol/l; pH = 9,2.

Dissolve 19 ± 0,1 g of sodium tetraborate (5.21), decahydrate in 1 l of water (5.1). This solution can be

stored for approximately 1 mo at 4 °C ± 3 °C.
2+ 2+

5.23 Mineral water, containing less than 3,2 mmol/l divalent cations (Mg and total Ca ), for preparing

matrix-matched calibration.
© ISO 2014 – All rights reserved 3
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ISO 16308:2014(E)
6 Apparatus

The material or any parts that are likely come into contact with the sample shall be free from any residue

that could cause unacceptable interference in the blanks.

Glass and plastics containers can be used for sampling and for all steps before derivatization. Glass vials

(6.10) and glass test tubes (6.11) shall be used after the derivatization step.
6.1 Usual laboratory glassware, or apparatus and in particular the following.

6.2 Glass, polyethene (PE) or polypropene (PP) bottles, minimum 50 ml, for sampling.

6.3 Glass, polyethene (PE) or polypropene (PP) syringe, 50 ml, for sample filtration.

6.4 Single use filter for syringe, diameter 25 mm, with a hydrophilic membrane, 0,45 µm, e.g. from

regenerated cellulose.

6.5 Glass, or single use PE or PP conical bottomed tubes, approximately 50 ml, for derivatization.

6.6 Micropipettes, adjustable from 100 µl to 500 µl.
6.7 pH-meter.
6.8 SPE cartridges, e.g. Oasis HLB Waters, 60 mg, 3 ml, or equivalent.
6.9 Centrifugation device, capable of 6 500 m .

6.10 Glass vials, suitable for autosampler, with caps and polytetrafluoroethene (PTFE) or silicon rubber

septa.
6.11 Glass test tube, 15 ml or smaller.
®1)

6.12 Reversed phase column, e.g. XBridge C18 column [Waters, 50 mm × 2,1 mm internal diameter

(i.d.) 2,5 µm, column] with guard column (Waters, 10 mm × 2,1 mm i.d. 2,5 µm).

A column whose stationary phase is alkali proof (pH 9 to pH 9,5) is highly recommended.

® 1)

NOTE A Gemini -NX column (Phenomenex) with similar dimensions is also suitable. Other columns can be

used, provided the separation conditions are adjusted.

6.13 High performance liquid chromatograph (HPLC), consisting of 6.13.1 to 6.13.5.

6.13.1 Injector, manual or automated.
6.13.2 Gradient pump.
6.13.3 Thermoregulation oven, for HPLC column.

6.13.4 Mass spectrometer, with triple quadrupole analyser and an electrospray source.

® ® ®

1) Oasis HLB , XBridge C18 and Gemini -NX are examples of suitable products available commercially. This

information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO

of these products.
4 © ISO 2014 – All rights reserved
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ISO 16308:2014(E)
6.13.5 Data acquisition and processing system.
7 Sampling

If the sampling bottles are not for single use, rinse the sample bottles (6.2) with deionized water (5.1),

then clean with a laboratory detergent (5.4). Rinse with water (5.1), then with ultra-pure water (5.2),

and finally with 95 % ethanol (5.8).

Perform the sampling in accordance with ISO 5667-3 in these bottles (6.2) (approximately 50 ml).

For samples suspected of containing free chlorine, add about 2 mg of sodium thiosulfate (5.5) or any

other chlorine reducing agent per 100 ml of sample.

Store the samples according to ISO 5667-3 at 3 °C ± 2 °C and pre-treat within 24 h.

8 Procedure
8.1 Pre-treatment (Suspended particular matter)
Place filter (6.4) on syringe (6.3). Rinse with 5 ml of ultra-pure water (5.2).

Filter the sample (approximately 50 ml), discard the first 5 ml. Collect the filtrate in a conical bottomed

tube (6.5).

Store the filtered samples at 4 °C ± 3 °C for one week maximum before the derivatization step.

8.2 Chelate break and derivatization
8.2.1 General

Adapt the derivatization step to the kind analytical step which follows derivatization:

— using a mass spectrometer with sufficient detection capability, no pre-concentration is needed and

the derivatized sample is injected directly after derivatization according to 8.2.2;

— otherwise, a pre-concentration step can be useful to reach the intended limit of quantification (LOQ)

performance, and derivatization shall be performed according to 8.2.3.
8.2.2 Chelate break and derivatization for direct injection

Place, e.g. 5 ml of the sample (different sample amounts requires the use of the equivalent amounts of

the following reagents) in a 25 ml Erlenmeyer flask with glass stopper, add the magnetic stir bar.

-13 15

Add 50 µl of a 20 µg/l multi-substances aqueous solution (5.19) of 1,2 C , N-labelled glyphosate

13 15

(5.18.3) and C, N-labelled AMPA (5.18.4) in ultra-pure water (5.2) as derivatization surrogate.

Add 100 µl EDTA-Na (5.16) [0,1 mol/l solution in ultra-pure water (5.2)], shake, and allow to stand for

10 min in the closed flask.

Add, e.g. 2 ml of the borate-Na buffer (5.22) 0,05 mol/l and stir for 30 min at 400 min to adjust to

pH 9,0 to pH 9,5.

Add 400 µl of FMOC-Cl solution (5.17 for direct injection); stir for 4 h with 400 min and wait for approx.

12 h (overnight).
Neutralize the solution with 30 % hydrochloric acid (5.14).
Filter and use for analysis (8.4).
© ISO 2014 – All rights reserved 5
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ISO 16308:2014(E)

The final volume of the pre-treated sample shall be considered when calculating the final result.

NOTE Valve switching of the eluate flow behind the column before and after passing of the analytes into the

waste is a good choice to protect the ion source of the MS/MS detector from contamination.

8.2.3 Chelate break and derivatization prior to pre-concentration

Use, e.g. a micropipette (6.6), PP or PE pipette, place 5 ml sample in, for example, a conical bottomed PP

tube (6.5).
-13 15

Add 50 µl of a 20 µg/l multi-substances aqueous solution of 1,2 C , N-labelled glyphosate (5.18.3)

13 15

and C, N-labelled AMPA (5.18.4) in ultra-pure water (5.2) as derivatization surrogate.

Add 325 µl of borate-Na buffer (5.22) and shake.

Add 200 µl EDTA-Na (5.16) [0,1 mol/l solution in ultra-pure water (5.2)], shake and allow to stand for

5 min. Addition of EDTA allows glyphosate and AMPA to be released from the complexes with divalent

2+ 2+
cations (e.g. Ca , Mg ).

Add 4,5 ml acetonitrile (5.6). Shake well for 1 min to homogenize (there shall be no phase separation

during this step of the procedure).
Add 0,6 ml of FMOC-Cl solution (5.17) and shake again.

Allow to stand for 30 min in the dark at room temperature (20 °C to 25 °C) for reaction.

After derivatization, excess FMOC-Cl and reaction byproducts (e.g. FMOC-OH) are removed during pre-

concentration (8.3).

If the water is hard, c(CaCO ) > 3 mmol/l, an additional sample pre-treatment is recommended (see

Annex E).
8.3 Pre-concentration
8.3.1 Liquid/liquid extraction of analytes derivates

Concentrate the analytical sample to approximately 5 ml under a nitrogen flow (20 ml/min to 40 ml/min)

at room temperature to remove acetonitrile. The evaporation of the acetonitrile shall be completed

and should not exceed 60 min. A FMOC-Cl (reagent excess) and FMOC-OH (byproduct) precipitate may

crystallize on the tube wall.

Transfer the solution from the plastic tube in a glass test tube (6.11). Rinse the plastic tube with

approximately 500 µl of ultra-pure water (5.2) and transfer into the glass tube.

Extract three times with 1,5 ml of ethyl acetate (5.9). If necessary, centrifuge for 20 s at 6 500 m after

each extraction to separate the two phases. Eliminate the supernatant with a Pasteur pipette (use a new

pipette for each extraction).

Then concentrate the aqueous phase under a nitrogen flow for 15 min to evaporate the remaining ethyl

acetate, shaking the tube every 5 min.
The final volume shall be approximately 6 ml.

The extract is then acidified to pH 3 with formic acid (5.13) to prevent any possible reaction with the

residual FMOC-Cl and to allow the further pre-concentration of the extracts with SPE (8.3.2). For this

purpose, add 100 µl of a 5 % volume fraction solution of formic acid (5.13) in ultra-pure water (5.2),

adjust the volume to 6 ml with ultra-pure water (5.2) if necessary, and then homogenize for 1 min.

6 © ISO 2014 – All rights reserved
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ISO 16308:2014(E)
8.3.2 Solid phase extraction
8.3.2.1 General requirements

Use SPE cartridges (6.8) containing, e.g. 60 mg of 60 μm polystyrene-divinylbenzene polymeric solid

phase. The recovery shall be checked on a regular basis.
NOTE 1 Oasis HLB® (60 µm, 60 mg, 3 ml, Waters), or equivalent may be used.
NOTE 2 Online SPE purification and concentration is allowed.
8.3.2.2 Cartridges conditioning

Rinse with 2 × 500 µl of methanol (5.7) and with 2 × 500 µl aqueous solution of 0,1 % volume fraction

formic acid (5.13).
8.3.2.3 Purification

Pass 6 ml of acidified aqueous extract (pH 3) through the cartridge with an approximately 1 ml/min

flow rate.

Rinse the SPE tube with 1 ml of an aqueous 0,1 % volume fraction solution of formic acid (5.13), then

with 2 × 500 µl ultra-pure water (5.2).

Dry cartridge under vacuum or under a gentle stream of nitrogen during approximately 1 min to remove

the main part of the water.

Elute with 3 × 700 µl of methanol (5.7): 20 g/l ammonium hydroxide (5.12) in ultra-pure water (5.2)

(70:30 volume fraction).

Collect the eluate in a glass test tube (6.11) and reduce under a nitrogen flow until the methanol is

removed. Final volume shall be approximately 0,7 ml.

NOTE Residues of methanol can cause degradation in chromatographic conditions, resulting in split peaks.

Adjust to 1 ml with ultra-pure water (5.2). The purified extract can be stored for 48 h at 4 °C ± 3 °C

maximum prior to analysis due to the stability of the FMOC derivatives in water.
8.4 Chromatographic determination
8.4.1 General requirements
Use equipment in accordance with the instructions provided by the manufacturer.

Check the required system stability regularly. Adjust and optimize instrument parameter settings in

accordance with the manufacturer’s instructions.

Due to the use of a buffered mobile phase, it is recommended that the analytical column and the

chromatographic system be rinsed according to the manufacturer’s instructions on a regular basis.

8.4.2 Chromatographic conditions

Separate the glyphosate and AMPA derivatives by HPLC using a reversed phase column and appropriate

chromatographic conditions. The pH of the mobile phase shall be alkaline (pH 9 to pH 9,5) in order

to have better chromatographic performances (peak symmetry close to 1 and narrow peaks), which

implies the use of a particular column (hybrid stationary phase).
Examples of appropriate chromatographic conditions are shown in Annexes B to D.
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ISO 16308:2014(E)
8.5 Identification and confirmation of the analytes

Identification of target compounds is achieved by comparing their retention time to the retention time

of the referenced substance, and their single reaction monitoring (SRM) negative ionization mode mass

spectra with the reference substances. Table 2 gives the characteristic transitions used.

Table 2 — ESI–MS/MS detection
Analytes Quantifying transition Qualifying transition
Glyphosate-FMOC 390 > 168 390 > 150
AMPA-FMOC 332 > 110 332 > 136
-13 15
1,2 C , N-labelled glyphosate–FMOC 393 > 171 393 > 153
13 15
C, N-labelled AMPA–FMOC 334 > 112 334 > 138

The ratios between the quantifying and the qualifying transitions depend on the SRM conditions (i.e.

collision energy and gas pressure in the collision cell). These ratios shall be determined using reference

substances and checked for the samples to lie within ±20 % of the observed value for the reference

substance, using the same equipment optimization.
Examples of chromatograms are given in Annex C.
8.6 Blank control monitoring

Blank controls are obtained with the application of procedure to a mineral water (5.23) spiked with

-13 15 13 15

1,2 C , N-labelled glyphosate (5.18.3) and C, N-labelled AMPA (5.18.4) only. Blank controls and

samples shall be treated and analysed simultaneously. The residual content of both glyphosate and

AMPA should be lower than 1/3 of the limits of quantification (LOQs).
...

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 16308:2018
01-junij-2018
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHJOLIRVDWDLQ$03$0HWRGDWHNRþLQVNH
NURPDWRJUDILMHYLVRNHORþOMLYRVWL +3/& VVNORSOMHQRPDVQRVSHNWURPHWULMR

Water quality - Determination of glyphosate and AMPA - Method using high performance

liquid chromatography (HPLC) with tandem mass spectrometric detection
Qualité de l'eau - Détermination du glyphosate et de l'AMPA - Méthode par
chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) avec détection par
spectrométrie de masse en tandem
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 16308:2014
ICS:
13.060.50 3UHLVNDYDYRGHQDNHPLþQH Examination of water for
VQRYL chemical substances
71.040.50 Fizikalnokemijske analitske Physicochemical methods of
metode analysis
SIST ISO 16308:2018 en,fr

2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16308
First edition
2014-09-15
Water quality — Determination of
glyphosate and AMPA — Method
using high performance liquid
chromatography (HPLC) with tandem
mass spectrometric detection
Qualité de l’eau — Détermination du glyphosate et de l’AMPA —
Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance
(CLHP) avec détection par spectrométrie de masse en tandem
Reference number
ISO 16308:2014(E)
ISO 2014
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COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2014

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
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Fax + 41 22 749 09 47
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Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

4 Interferences ............................................................................................................................................................................................................ 2

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 4

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 5

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 5

8.1 Pre-treatment (Suspended particular matter) ............................................................................................................ 5

8.2 Chelate break and derivatization ............................................................................................................................................ 5

8.3 Pre-concentration ................................................................................................................................................................................. 6

8.4 Chromatographic determination............................................................................................................................................. 7

8.5 Identification and confirmation of the analytes ......................................................................................................... 8

8.6 Blank control monitoring............................................................................................................................................................... 8

9 Calibration .................................................................................................................................................................................................................. 8

9.1 Concentration ranges ........................................................................................................................................................................ 8

9.2 Matrix-matched calibration ......................................................................................................................................................... 8

9.3 Internal standard calibration ..................................................................................................................................................... 9

10 Expression of results .....................................................................................................................................................................................10

11 Test report ................................................................................................................................................................................................................10

Annex A (informative) Performance data ....................................................................................................................................................11

Annex B (informative) Examples of chromatographic conditions ......................................................................................14

Annex C (informative) Examples of chromatograms ........................................................................................................................15

Annex D (informative) Analysis of gluphosinate ...................................................................................................................................16

Annex E (informative) Pre-treatment of hard water samples .................................................................................................20

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................22

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ISO 16308:2014(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers

to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 2, Physical,

chemical and biochemical methods.
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ISO 16308:2014(E)
Introduction

Glyphosate [N-(phosphonomethyl)glycine] is a non-selective broad-spectrum herbicide. The efficiency

of this compound makes it a top selling and one of the most widely used herbicides in the world since

it entered the market in 1974. Together with its main degradation product, aminomethylphosphonic

acid (AMPA), glyphosate is one of the most detected substances in water bodies in many developed

countries. Note also that AMPA can be released during sewage treatment, e.g. due to breakdown of

detergent formulations for textiles.

Glyphosate and AMPA belong to the aminophosphonate family and have specific physico-chemical

properties that require the development of complex analytical methods for analysis and detection. The

difficulty in analysis is mainly linked to the high solubility of glyphosate and AMPA and their chelating

nature. To solve these problems, their pre-column derivatization with 9-fluorenylmethylchloroformate

(FMOC-Cl) to form less polar derivatives allows a better separation using liquid chromatography.

Gluphosinate, another aminophosphonate, is less commonly subject to regulation and can be determined

simultaneously, provided it can be demonstrated that there is no interference with the sample under

analysis.

There is currently an International Standard for the determination by liquid chromatography and

fluorometric detection; however, the determination by HPLC–ESI–MS/MS can be much more specific

(unambiguous identification) and more sensitive (limits of quantification of approximately 30 ng/l for

both glyphosate and AMPA). This International Standard is based on this analytical technique and is

intended for laboratories involved in the regulatory control of the aquatic environment. Many such

laboratories are now equipped with this kind of apparatus.
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SIST ISO 16308:2018
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16308:2014(E)
Water quality — Determination of glyphosate and AMPA
— Method using high performance liquid chromatography
(HPLC) with tandem mass spectrometric detection

WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory

practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if

any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and

health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.

IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International

Standard be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope

This International Standard specifies a method for the determination of dissolved fraction of glyphosate

and its major metabolite, aminomethylphosphonic acid (AMPA), in drinking water, ground water, and

surface water at concentrations of 0,03 µg/l to 1,5 µg/l. It does not apply to marine or salty water. This

method can be applicable to other types of waters, provided the method is validated for each case.

2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated

references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods

ISO 5667-3, Water quality — Sampling — Part 3: Preservation and handling of water samples

ISO 8466-1, Water quality — Calibration and evaluation of analytical methods and estimation of performance

characteristics — Part 1: Statistical evaluation of the linear calibration function

3 Principle
Glyphosate and AMPA (dissolved fraction after filtration) are derivatized using

9-fluorenylmethylchloroformate (FMOC-Cl) (5.17) to lower their polarity and increase the retention

of compound in a separation on a reverse phase column (e.g. C18) as well as to improve the mass

spectrometric detection. If the mass spectrometer has sufficient detection capability, it is possible to

omit the solid phase extraction and to analyse the analytes by direct injection (see 8.2.1).

The derivatized sample is purified by liquid/liquid extraction and then concentrated by solid phase

extraction (SPE).

The analysis is performed by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass

spectrometry via an electrospray source (HPLC–ESI–MS/MS), using matrix-matched calibration.

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ISO 16308:2014(E)
Table 1 — Substances addressed
Molecular mass
Name Formula CAS-RN
g/mol
Glyphosate
C H NO P 169,1 1071–83–6
3 8 5
N-(phosphonomethyl)glycine
AMPA
CH NO P 111,0 1066–51–9
6 3
Aminomethylphosphonic acid
CAS-RN Chemical Abstracts Service Registry Number

NOTE Gluphosinate, belonging to the aminophosphonate family, can be determined simultaneously, provided

it can be demonstrated that there is no interference with the sample (matrix) subject to analysis.

4 Interferences

This method is validated for hard water containing up to 3,2 mmol/l of the sum of calcium and

magnesium. For waters with a higher calcium and magnesium content, it may be necessary to increase

the concentration of EDTA-Na (5.16) at the derivatization step (see Annex D).

It can prove necessary to include the acidification step described in Annex D even for some water types

below 3,2 mmol/l of the sum of calcium and magnesium. The laboratory shall check the necessity of this

procedure for its routine samples.

The presence of free chlorine, e.g. in treated waters, can cause losses of glyphosate by oxidation.

Consequently sodium thiosulfate shall be used (see Clause 7).
5 Reagents

Unless otherwise stated, all reagents and solvents shall be of sufficient purity, e.g. “for trace analysis”.

5.1 Deionized water.
5.2 Ultra-pure water, complying with grade 1 of ISO 3696.
5.3 Nitrogen, N , purity ≥ 99,996 % volume fraction.
5.4 Laboratory detergent, alkaline.
5.5 Sodium thiosulfate, Na S O .
2 2 3
5.6 Acetonitrile, C H N, HPLC grade.
2 3
5.7 Methanol, CH O, HPLC grade.
5.8 Ethanol, C H O, 95 %, HPLC grade mass fraction.
2 6
5.9 Ethyl acetate, C H O , HPLC grade.
4 8 2
5.10 Ammonium acetate, C H O N.
2 7 2
5.11 Triethylamine, C H N.
6 15
5.12 Ammonium hydroxide, NH OH 28 % mass fraction.
4 ,
2 © ISO 2014 – All rights reserved
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ISO 16308:2014(E)
5.13 Formic acid, CH O .
2 2
5.14 Hydrochloric acid, HCl, 300 g/l.
5.15 Glacial acetic acid, C H O .
2 4 2

5.16 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), disodium salt dihydrate, C H N O Na ·2H O, with a

10 14 2 8 2 2
minimum purity of 99 % mass fraction.

5.17 9-Fluorenylmethyl chloroformate,(FMOC-Cl), C H ClO , with a minimum purity of 97 % mass

15 11 2
fraction.

FMOC-Cl is used to prepare the derivatization reagent, FMOC-Cl solution, 50 mg/ml, in acetonitrile

(5.6). This solution can be stored at −18 °C ± 3 °C for 6 months.

For direct injection (8.2.1), use a FMOC-Cl solution of 0,5 mg/ml in acetonitrile.

5.18 Reference substances, according to Table 1.

5.18.1 Glyphosate, N-(phosphonomethyl)glycine, C H NO P, purity > 98 % mass fraction.

3 8 5
5.18.2 AMPA, aminomethylphosphonic acid, CH NO P, purity > 98 % mass fraction.
6 3
13 15

5.18.3 1,2- C , N-labelled glyphosate, surrogate standard, purity > 98 % mass fraction.

13 15
5.18.4 C, N-labelled AMPA, surrogate standard, purity > 98 % mass fraction.
5.19 Calibration solutions.

Individual stock solutions of glyphosate (5.18.1) and AMPA (5.18.2), 100 mg/l, prepared in ultra-pure

water (5.2). These solutions can be stored at 4 °C ± 3 °C for 1 month.
-13 15 13 15

Individual stock solutions of 1,2 C , N-labelled glyphosate (5.18.3) and C, N-labelled AMPA

(5.18.4) 100 mg/l, prepared in ultra-pure water (5.2). These solutions can be stored at 4 °C ± 3 °C for

1 month.
13 15 13 15

Multi-substance working solution of surrogates: 1,2- C , N-labelled glyphosate and C, N-labelled

AMPA, 20 µg/l, prepared in ultra-pure water (5.2). This solution can be stored at 4 °C ± 3 °C for 1 month.

NOTE Stock and calibration solutions can be stored longer, provided the adequate justifications are given

regarding stability.

5.20 Triethylammonium acetate buffer, 0,1 % triethylamine (5.11) solution adjusted to pH 9,5 with

glacial acetic acid (5.15) (mobile phase).
5.21 Sodium tetraborate, decahydrate, Na B O ·10H O.
2 4 7 2
5.22 Borate-Na buffer, 0,05 mol/l; pH = 9,2.

Dissolve 19 ± 0,1 g of sodium tetraborate (5.21), decahydrate in 1 l of water (5.1). This solution can be

stored for approximately 1 mo at 4 °C ± 3 °C.
2+ 2+

5.23 Mineral water, containing less than 3,2 mmol/l divalent cations (Mg and total Ca ), for preparing

matrix-matched calibration.
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ISO 16308:2014(E)
6 Apparatus

The material or any parts that are likely come into contact with the sample shall be free from any residue

that could cause unacceptable interference in the blanks.

Glass and plastics containers can be used for sampling and for all steps before derivatization. Glass vials

(6.10) and glass test tubes (6.11) shall be used after the derivatization step.
6.1 Usual laboratory glassware, or apparatus and in particular the following.

6.2 Glass, polyethene (PE) or polypropene (PP) bottles, minimum 50 ml, for sampling.

6.3 Glass, polyethene (PE) or polypropene (PP) syringe, 50 ml, for sample filtration.

6.4 Single use filter for syringe, diameter 25 mm, with a hydrophilic membrane, 0,45 µm, e.g. from

regenerated cellulose.

6.5 Glass, or single use PE or PP conical bottomed tubes, approximately 50 ml, for derivatization.

6.6 Micropipettes, adjustable from 100 µl to 500 µl.
6.7 pH-meter.
6.8 SPE cartridges, e.g. Oasis HLB Waters, 60 mg, 3 ml, or equivalent.
6.9 Centrifugation device, capable of 6 500 m .

6.10 Glass vials, suitable for autosampler, with caps and polytetrafluoroethene (PTFE) or silicon rubber

septa.
6.11 Glass test tube, 15 ml or smaller.
®1)

6.12 Reversed phase column, e.g. XBridge C18 column [Waters, 50 mm × 2,1 mm internal diameter

(i.d.) 2,5 µm, column] with guard column (Waters, 10 mm × 2,1 mm i.d. 2,5 µm).

A column whose stationary phase is alkali proof (pH 9 to pH 9,5) is highly recommended.

® 1)

NOTE A Gemini -NX column (Phenomenex) with similar dimensions is also suitable. Other columns can be

used, provided the separation conditions are adjusted.

6.13 High performance liquid chromatograph (HPLC), consisting of 6.13.1 to 6.13.5.

6.13.1 Injector, manual or automated.
6.13.2 Gradient pump.
6.13.3 Thermoregulation oven, for HPLC column.

6.13.4 Mass spectrometer, with triple quadrupole analyser and an electrospray source.

® ® ®

1) Oasis HLB , XBridge C18 and Gemini -NX are examples of suitable products available commercially. This

information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO

of these products.
4 © ISO 2014 – All rights reserved
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ISO 16308:2014(E)
6.13.5 Data acquisition and processing system.
7 Sampling

If the sampling bottles are not for single use, rinse the sample bottles (6.2) with deionized water (5.1),

then clean with a laboratory detergent (5.4). Rinse with water (5.1), then with ultra-pure water (5.2),

and finally with 95 % ethanol (5.8).

Perform the sampling in accordance with ISO 5667-3 in these bottles (6.2) (approximately 50 ml).

For samples suspected of containing free chlorine, add about 2 mg of sodium thiosulfate (5.5) or any

other chlorine reducing agent per 100 ml of sample.

Store the samples according to ISO 5667-3 at 3 °C ± 2 °C and pre-treat within 24 h.

8 Procedure
8.1 Pre-treatment (Suspended particular matter)
Place filter (6.4) on syringe (6.3). Rinse with 5 ml of ultra-pure water (5.2).

Filter the sample (approximately 50 ml), discard the first 5 ml. Collect the filtrate in a conical bottomed

tube (6.5).

Store the filtered samples at 4 °C ± 3 °C for one week maximum before the derivatization step.

8.2 Chelate break and derivatization
8.2.1 General

Adapt the derivatization step to the kind analytical step which follows derivatization:

— using a mass spectrometer with sufficient detection capability, no pre-concentration is needed and

the derivatized sample is injected directly after derivatization according to 8.2.2;

— otherwise, a pre-concentration step can be useful to reach the intended limit of quantification (LOQ)

performance, and derivatization shall be performed according to 8.2.3.
8.2.2 Chelate break and derivatization for direct injection

Place, e.g. 5 ml of the sample (different sample amounts requires the use of the equivalent amounts of

the following reagents) in a 25 ml Erlenmeyer flask with glass stopper, add the magnetic stir bar.

-13 15

Add 50 µl of a 20 µg/l multi-substances aqueous solution (5.19) of 1,2 C , N-labelled glyphosate

13 15

(5.18.3) and C, N-labelled AMPA (5.18.4) in ultra-pure water (5.2) as derivatization surrogate.

Add 100 µl EDTA-Na (5.16) [0,1 mol/l solution in ultra-pure water (5.2)], shake, and allow to stand for

10 min in the closed flask.

Add, e.g. 2 ml of the borate-Na buffer (5.22) 0,05 mol/l and stir for 30 min at 400 min to adjust to

pH 9,0 to pH 9,5.

Add 400 µl of FMOC-Cl solution (5.17 for direct injection); stir for 4 h with 400 min and wait for approx.

12 h (overnight).
Neutralize the solution with 30 % hydrochloric acid (5.14).
Filter and use for analysis (8.4).
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ISO 16308:2014(E)

The final volume of the pre-treated sample shall be considered when calculating the final result.

NOTE Valve switching of the eluate flow behind the column before and after passing of the analytes into the

waste is a good choice to protect the ion source of the MS/MS detector from contamination.

8.2.3 Chelate break and derivatization prior to pre-concentration

Use, e.g. a micropipette (6.6), PP or PE pipette, place 5 ml sample in, for example, a conical bottomed PP

tube (6.5).
-13 15

Add 50 µl of a 20 µg/l multi-substances aqueous solution of 1,2 C , N-labelled glyphosate (5.18.3)

13 15

and C, N-labelled AMPA (5.18.4) in ultra-pure water (5.2) as derivatization surrogate.

Add 325 µl of borate-Na buffer (5.22) and shake.

Add 200 µl EDTA-Na (5.16) [0,1 mol/l solution in ultra-pure water (5.2)], shake and allow to stand for

5 min. Addition of EDTA allows glyphosate and AMPA to be released from the complexes with divalent

2+ 2+
cations (e.g. Ca , Mg ).

Add 4,5 ml acetonitrile (5.6). Shake well for 1 min to homogenize (there shall be no phase separation

during this step of the procedure).
Add 0,6 ml of FMOC-Cl solution (5.17) and shake again.

Allow to stand for 30 min in the dark at room temperature (20 °C to 25 °C) for reaction.

After derivatization, excess FMOC-Cl and reaction byproducts (e.g. FMOC-OH) are removed during pre-

concentration (8.3).

If the water is hard, c(CaCO ) > 3 mmol/l, an additional sample pre-treatment is recommended (see

Annex E).
8.3 Pre-concentration
8.3.1 Liquid/liquid extraction of analytes derivates

Concentrate the analytical sample to approximately 5 ml under a nitrogen flow (20 ml/min to 40 ml/min)

at room temperature to remove acetonitrile. The evaporation of the acetonitrile shall be completed

and should not exceed 60 min. A FMOC-Cl (reagent excess) and FMOC-OH (byproduct) precipitate may

crystallize on the tube wall.

Transfer the solution from the plastic tube in a glass test tube (6.11). Rinse the plastic tube with

approximately 500 µl of ultra-pure water (5.2) and transfer into the glass tube.

Extract three times with 1,5 ml of ethyl acetate (5.9). If necessary, centrifuge for 20 s at 6 500 m after

each extraction to separate the two phases. Eliminate the supernatant with a Pasteur pipette (use a new

pipette for each extraction).

Then concentrate the aqueous phase under a nitrogen flow for 15 min to evaporate the remaining ethyl

acetate, shaking the tube every 5 min.
The final volume shall be approximately 6 ml.

The extract is then acidified to pH 3 with formic acid (5.13) to prevent any possible reaction with the

residual FMOC-Cl and to allow the further pre-concentration of the extracts with SPE (8.3.2). For this

purpose, add 100 µl of a 5 % volume fraction solution of formic acid (5.13) in ultra-pure water (5.2),

adjust the volume to 6 ml with ultra-pure water (5.2) if necessary, and then homogenize for 1 min.

6 © ISO 2014 – All rights reserved
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SIST ISO 16308:2018
ISO 16308:2014(E)
8.3.2 Solid phase extraction
8.3.2.1 General requirements

Use SPE cartridges (6.8) containing, e.g. 60 mg of 60 μm polystyrene-divinylbenzene polymeric solid

phase. The recovery shall be checked on a regular basis.
NOTE 1 Oasis HLB® (60 µm, 60 mg, 3 ml, Waters), or equivalent may be used.
NOTE 2 Online SPE purification and concentration is allowed.
8.3.2.2 Cartridges conditioning

Rinse with 2 × 500 µl of methanol (5.7) and with 2 × 500 µl aqueous solution of 0,1 % volume fraction

formic acid (5.13).
8.3.2.3 Purification

Pass 6 ml of acidified aqueous extract (pH 3) through the cartridge with an approximately 1 ml/min

flow rate.

Rinse the SPE tube with 1 ml of an aqueous 0,1 % volume fraction solution of formic acid (5.13), then

with 2 × 500 µl ultra-pure water (5.2).

Dry cartridge under vacuum or under a gentle stream of nitrogen during approximately 1 min to remove

the main part of the water.

Elute with 3 × 700 µl of methanol (5.7): 20 g/l ammonium hydroxide (5.12) in ultra-pure water (5.2)

(70:30 volume fraction).

Collect the eluate in a glass test tube (6.11) and reduce under a nitrogen flow until the methanol is

removed. Final volume shall be approximately 0,7 ml.

NOTE Residues of methanol can cause degradation in chromatographic conditions, resulting in split peaks.

Adjust to 1 ml with ultra-pure water (5.2). The purified extract can be stored for 48 h at 4 °C ± 3 °C

maximum prior to analysis due to the stability of the FMOC derivatives in water.
8.4 Chromatographic determination
8.4.1 General requirements
Use equipment in accordance with the instructions provided by the manufacturer.

Check the required system stability regularly. Adjust and optimize instrument parameter settings in

accordance with the manufacturer’s instructions.

Due to the use of a buffered mobile phase, it is recommended that the analytical column and the

chromatographic system be rinsed according to the manufacturer’s instructions on a regular basis.

8.4.2 Chromatographic conditions

Separate the glyphosate and AMPA derivatives by HPLC using a reversed phase column and appropriate

chromatographic conditions. The pH of the mobile phase shall be alkaline (pH 9 to pH 9,5) in order

to have better chromatographic performances (peak symmetry close to 1 and narrow peaks), which

implies the use of a particular column (hybrid stationary phase).
Examples of appropriate chromatographic conditions are shown in Annexes B to D.
© ISO 2014 – All rights reserved 7
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SIST ISO 16308:2018
ISO 16308:2014(E)
8.5 Identification and conf
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 16308
Première édition
2014-09-15
Qualité de l’eau — Détermination du
glyphosate et de l’AMPA — Méthode
par chromatographie en phase liquide
à haute performance (CLHP) avec
détection par spectrométrie de masse
en tandem
Water quality — Determination of glyphosate and AMPA — Method
using high performance liquid chromatography (HPLC) with tandem
mass spectrometric detection
Numéro de référence
ISO 16308:2014(F)
ISO 2014
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ISO 16308:2014(F)
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
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ISO 16308:2014(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 1

4 Interférences ............................................................................................................................................................................................................ 2

5 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 4

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 5

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 5

8.1 Prétraitement (matières en suspension) ......................................................................................................................... 5

8.2 Séparation et dérivation du chélate ...................................................................................................................................... 5

8.3 Préconcentration ................................................................................................................................................................................... 6

8.4 Dosage chromatographique ......................................................................................................................................................... 7

8.5 Identification et confirmation des analytes ................................................................................................................... 8

8.6 Contrôle des témoins à blanc ......... ............................................................................................................................................. 8

9 Étalonnage .................................................................................................................................................................................................................. 8

9.1 Gammes de concentration ............................................................................................................................................................ 8

9.2 Étalonnage en matrice ...................................................................................................................................................................... 9

9.3 Étalonnage avec étalon interne..............................................................................................................................................10

10 Expression des résultats............................................................................................................................................................................11

11 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................11

Annexe A (informative) Données de performance ..............................................................................................................................12

Annexe B (informative) Exemples de conditions chromatographiques .......................................................................15

Annexe C (informative) Exemples de chromatogrammes ...........................................................................................................16

Annexe D (informative) Analyse du glufosinate.....................................................................................................................................17

Annexe E (informative) Prétraitement d’échantillons d’eau dure .....................................................................................21

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................23

© ISO 2014 – Tous droits réservés iii
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ISO 16308:2014(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne

la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les

références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration

du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par

l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de

la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant

les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations

supplémentaires.

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité

SC 2, Méthodes physiques, chimiques et biochimiques.
iv © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO 16308:2014(F)
Introduction

Le glyphosate [N-(phosphonométhyl)glycine] est un herbicide à large spectre non sélectif. L’efficacité de

ce composé en fait l’herbicide le plus vendu et le plus utilisé au monde depuis son arrivée sur le marché

en 1974. Associé à son principal produit de dégradation, l’acide aminométhylphosphonique (AMPA), le

glyphosate est l’une des substances les plus fréquemment détectées dans les masses d’eau de la plupart

des pays développés. À noter toutefois que l’AMPA peut également provenir des rejets liées au traitement

des eaux usées (par exemple, en raison de la dégradation des formulations détergentes pour textiles).

Le glyphosate et l’AMPA appartiennent à la famille des aminophosphonates et possèdent des propriétés

physico-chimiques nécessitant la mise en œuvre de méthodes d’analyse complexes pour l’analyse et

la détection. La difficulté d’analyse est principalement liée à la haute solubilité du glyphosate et de

l’AMPA ainsi qu’à leur fonction chélatante. Pour résoudre ces problèmes, leur dérivation pré-colonne est

effectuée avec du 9-fluorénylméthylchloroformiate (FMOC-Cl) pour former des dérivés moins polaires,

ce qui permet une meilleure séparation par chromatographie en phase liquide.

Le glufosinate, un autre membre de la famille des aminophosphonates, est moins concerné par les

réglementations et peut être dosé simultanément, à condition de prouver l’absence d’interférence avec

l’échantillon soumis à l’analyse.

Il existe actuellement une Norme internationale dédiée au dosage par chromatographie en phase

liquide et par détection fluorimétrique; néanmoins, le dosage par CLHP-ESI-SM/SM peut être bien plus

spécifique (identification univoque) et plus sensible (limites de quantification d’environ 30 ng/l pour

le glyphosate et l’AMPA). La présente Norme internationale repose sur cette technique d’analyse et

s’adresse aux laboratoires impliqués dans le contrôle réglementaire du milieu aquatique. La majorité de

ces laboratoires est désormais équipée de ce type d’appareillage.
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NORME INTERNATIONALE ISO 16308:2014(F)
Qualité de l’eau — Détermination du glyphosate et
de l’AMPA — Méthode par chromatographie en phase
liquide à haute performance (CLHP) avec détection par
spectrométrie de masse en tandem

AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse

bien les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de

traiter de tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe

à l’utilisateur de la présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et

de sécurité et de s’assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.

IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon la présente Norme internationale

soient effectués par un personnel qualifié de manière adéquate.
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la fraction dissoute de

glyphosate et de son principal métabolite, l’acide aminométhylphosphonique (AMPA) dans l’eau potable,

l’eau souterraine et l’eau de surface à des concentrations de 0,03 µg/l à 1,5 µg/l. Elle ne s’applique pas à

l’eau de mer ou à l’eau salée. Cette méthode peut s’appliquer à d’autres types d’eaux à condition qu’elle

soit validée pour chaque cas.
2 Références normatives

Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à

l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai

ISO 5667-3, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 3: Conservation et manipulation des échantillons

d’eau

ISO 8466-1, Qualité de l’eau — Étalonnage et évaluation des méthodes d’analyse et estimation des caractères

de performance — Partie 1: Évaluation statistique de la fonction linéaire d’étalonnage

3 Principe

Le glyphosate et l’AMPA (fraction dissoute après filtration) sont dérivés en utilisant du

9-fluorénylméthylchloroformiate (FMOC-Cl) (5.17) pour réduire leur polarité et augmenter la rétention

des composés lors de leur séparation sur une colonne de chromatographie en phase inverse (par exemple,

C18) ainsi que pour l’amélioration de la détection par spectrométrie de masse. Si le spectromètre de

masse a une capacité de détection suffisante, il est possible d’omettre l’extraction en phase solide et

d’analyser des analytes par injection directe (voir 8.2.1).

L’échantillon dérivé est purifié par extraction liquide-liquide puis concentré par extraction en phase

solide (SPE).

L’analyse est effectuée en réalisant une chromatographie en phase liquide à haute performance couplée

à une spectrométrie de masse en tandem via une source électrospray (CLHP-ESI-SM/SM), en utilisant

l’étalonnage en matrice.
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ISO 16308:2014(F)
Tableau 1 — Substances concernées
Masse moléculaire
Nom Formule N° CAS
g/mol
Glyphosate
C H NO P 169,1 1071–83–6
3 8 5
N-(phosphonométhyl)glycine
AMPA
CH NO P 111,0 1066–51–9
6 3
Acide aminométhylphosphonique
CAS-RN Chemical Abstracts Service Registry Number

NOTE Le glufosinate, qui appartient à la famille des aminophosphonates, peut être dosé simultanément, à

condition de prouver l’absence d’interférence avec l’échantillon (matrice) soumis à l’analyse.

4 Interférences

Cette méthode est validée pour l’eau dure contenant jusqu’à 3,2 mmol/l de la somme du calcium et

du magnésium. Pour les eaux ayant une teneur plus élevée en calcium et en magnésium, il peut être

nécessaire d’augmenter la concentration en EDTA disodique (5.16) lors de l’étape de dérivation (voir

l’Annexe D).

Il peut s’avérer nécessaire d’inclure l’étape d’acidification décrite dans l’Annexe D même pour certains

types d’eaux inférieurs à 3,2 mmol/l de la somme du calcium et du magnésium. Le laboratoire doit

vérifier la nécessité de ce mode opératoire pour ses échantillons de routine.

La présence de chlore libre, par exemple dans les eaux traitées, peut provoquer des pertes de glyphosate

par oxydation. Par conséquent, du thiosulfate de sodium doit être utilisé (voir l’Article 7).

5 Réactifs

Sauf indication contraire, tous les réactifs et solvants doivent être de pureté suffisante, par exemple,

«pour l’analyse des traces».
5.1 Eau déionisée.
5.2 Eau ultra-pure, conforme au grade 1 de l’ISO 3696.
5.3 Azote, N , pureté ≥99,996 % en fraction volumique.
5.4 Détergent de laboratoire, alcalin.
5.5 Thiosulfate de sodium, Na S O .
2 2 3
5.6 Acétonitrile, C H N, qualité CLHP.
2 3
5.7 Méthanol, CH O, qualité CLHP.
5.8 Éthanol, C H O, 95 % en fraction massique, qualité CLHP.
2 6
5.9 Acétate d’éthyle, C H O , qualité CLHP.
4 8 2
5.10 Acétate d’ammonium, C H O N.
2 7 2
5.11 Triéthylamine, C H N.
6 15
2 © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO 16308:2014(F)
5.12 Hydroxyde d’ammonium, NH OH 28 % en fraction massique.
4 ,
5.13 Acide formique, CH O .
2 2
5.14 Acide chlorhydrique, HCl, 300 g/l.
5.15 Acide acétique glacial, C H O .
2 4 2

5.16 Acide éthylènediaminetétracétique (EDTA), sel disodique dihydraté, C H N O Na ·2H O,

10 14 2 8 2 2
pureté minimale de 99 % en fraction massique.

5.17 9-fluorénylméthylchloroformiate (FMOC-Cl), C H ClO , pureté minimale de 97 % en fraction

15 11 2
massique.

Le FMOC-Cl sert à préparer le réactif de dérivation, la solution FMOC-Cl, 50 mg/ml, dans de l’acétonitrile

(5.6). Cette solution peut être conservée pendant 6 mois à -18 ℃ ± 3 °C.

Pour l’injection directe (8.2.1), utiliser une solution FMOC-Cl de 0,5 mg/ml dans de l’acétonitrile.

5.18 Substances de référence, selon le Tableau 1.

5.18.1 Glyphosate, N-(phosphonométhyl)glycine, C H NO P, pureté >98 % en fraction massique.

3 8 5

5.18.2 AMPA, acide aminométhylphosphonique, CH NO P, pureté >98 % en fraction massique.

6 3
13 15

5.18.3 Étalon d’extraction de glyphosate marqué au 1,2- C , N, pureté >98 % en fraction massique.

13 15

5.18.4 Étalon d’extraction d’AMPA marqué au C, N, pureté >98 % en fraction massique.

5.19 Solutions d’étalonnage

Solutions mères individuelles de glyphosate (5.18.1) et d’AMPA (5.18.2), 100 mg/l, préparées dans de

l’eau ultra-pure (5.2). Ces solutions peuvent être conservées pendant 1 mois à 4 °C ± 3 °C.

13 15

Solutions mères individuelles de glyphosate marqué au 1,2- C , N (5.18.3) et d’AMPA marqué au

13 15

C, N (5.18.4), 100 mg/l, préparées dans de l’eau ultra-pure (5.2). Ces solutions peuvent être conservées

pendant 1 mois à 4 °C ± 3 °C.
13 15

Solution de travail multisubstances constituée d’étalons d’extraction: glyphosate marqué au 1,2- C , N

13 15

et AMPA marqué au C, N, 20 µg/l, préparées dans de l’eau ultra-pure (5.2). Cette solution peut être

conservée pendant 1 mois à 4 °C ± 3 °C.

NOTE Les solutions mères et les solutions d’étalonnage peuvent être conservées plus longtemps à condition

de fournir les justifications adéquates concernant la stabilité.

5.20 Tampon acétate de triéthylammonium, solution de triéthylamine à 0,1 % (5.11) ajustée à pH 9,5

avec de l’acide acétique glacial (5.15) (phase mobile).
5.21 Tétraborate de sodium, décahydraté, Na B O ·10H O.
2 4 7 2
5.22 Tampon borate de sodium, 0,05 mol/l; pH = 9,2.

Dissoudre 19 ± 0,1 g de tétraborate de sodium (5.21), décahydraté, dans 1 l d’eau (5.1). Cette solution

peut être conservée pendant environ 1 mois à 4 °C ± 3 °C.
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ISO 16308:2014(F)
2+ 2+

5.23 Eau minérale, contenant moins de 3,2 mmol/l de cations divalents (Mg et Ca total), pour

préparer l’étalonnage en matrice.
6 Appareillage

Le matériel ou l’une quelconque de ses parties, susceptible d’entrer en contact avec l’échantillon, doit

être exempt(e) de tout résidu susceptible de provoquer des interférences inacceptable dans les blancs.

Des récipients en verre et en plastique peuvent être utilisés pour l’échantillonnage et pour toutes les

étapes qui précèdent la dérivation. Des flacons en verre (6.10) et des tubes à essai en verre (6.11) doivent

être utilisés après l’étape de dérivation.

6.1 Verrerie courante de laboratoire, ou matériel courant de laboratoire, et en particulier ce qui suit.

6.2 Flacons en verre, en polyéthylène (PE) ou en polypropylène (PP), minimum 50 ml, pour

l’échantillonnage.

6.3 Seringue en verre, en polyéthylène (PE) ou en polypropylène (PP), minimum 50 ml, pour la

filtration des échantillons.

6.4 Filtre pour seringue à usage unique, 25 mm de diamètre, avec membrane hydrophile, 0,45 µm,

par exemple de cellulose régénérée,.

6.5 Tubes à fond conique en verre ou en PE ou PP à usage unique, environ 50 ml, pour la dérivation.

6.6 Micropipettes, réglables entre 100 µl et 500 µl.
6.7 pH-mètre.
6.8 Cartouches SPE, par exemple Oasis HLB® Waters 60 mg, 3 ml, ou équivalentes.

6.9 Dispositif de centrifugation, permettant d’obtenir une accélération de 6 500 g.

6.10 Fioles en verre, adaptées à l’échantillonneur automatique, équipées de bouchons et

polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou de septums en caoutchouc de silicone.
6.11 Tube à essai en verre, 15 ml ou moins.

6.12 Colonne en phase inverse, par exemple colonne XBridge C ® [Waters, 50 mm × 2,1 mm,

diamètre intérieur (D.I.) 2,5 µm) avec précolonne (Waters, 10 mm × 2,1 mm, D.I. 2,5 µm).

Il est hautement recommandé d’utiliser une colonne dont la phase stationnaire est résistante aux bases

(pH 9 à pH 9,5).

NOTE Une colonne Gemini NX® (Phenomenex) ayant des dimensions similaires convient également.

D’autres colonnes peuvent être utilisées, à condition d’ajuster les conditions de séparation.

6.13 Chromatographe en phase liquide à haute performance (CLHP), constituée des éléments 6.13.1

à 6.13.5.
6.13.1 Injecteur, manuel ou automatique.
® ® ®

1) Oasis HLB , XBridge C18 et Gemini -NX sont des exemples de produits appropriés disponibles dans le

commerce. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document

et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ces produits.
4 © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO 16308:2014(F)
6.13.2 Pompe à gradient.
6.13.3 Four thermorégulé, pour la colonne CLHP.

6.13.4 Spectromètre de masse, équipé d’un analyseur quadripôle et d’une source électrospray.

6.13.5 Système d’acquisition et de traitement des données.
7 Échantillonnage

Si les flacons de prélèvement ne sont pas à usage unique, rincer les flacons d’échantillons (6.2) avec de

l’eau déionisée (5.1) puis nettoyer avec un détergent de laboratoire (5.4). Rincer avec de l’eau (5.1) puis

avec de l’eau ultra-pure (5.2) et, pour finir, avec de l’éthanol à 95 % (5.8).

Effectuer l’échantillonnage conformément à l’ISO 5667-3 dans ces flacons (6.2) (environ 50 ml).

Pour les échantillons suspectés de contenir du chlore libre, ajouter environ 2 mg de thiosulfate de sodium

(5.5) ou de tout autre agent réducteur de chlore pour 100 ml d’échantillon.

Conserver les échantillons conformément à l’ISO 5667-3, à 4 °C ± 3 °C, et les prétraiter dans les 24 h.

8 Mode opératoire
8.1 Prétraitement (matières en suspension)

Placer le filtre (6.4) sur la seringue (6.3). Rincer avec 5 ml d’eau ultra-pure (5.2).

Filtrer l’échantillon (environ 50 ml) et jeter les 5 premiers millilitres. Collecter le filtrat dans un tube à

fond conique (6.5).

Conserver les échantillons filtrés à 4 °C ± 3 °C pendant une semaine maximum avant l’étape de dérivation.

8.2 Séparation et dérivation du chélate
8.2.1 Généralités
Adapter l’étape de dérivation au type d’étape analytique qui suit la dérivation:

— avec un spectromètre de masse ayant une capacité de détection suffisante, aucune préconcentration

n’est nécessaire et l’échantillon dérivé est directement injecté après la dérivation, conformément au

paragraphe 8.2.2;

— sinon, une étape de préconcentration peut être utile pour atteindre la limite de quantification (LOQ)

prévue et la dérivation doit être effectuée conformément au paragraphe 8.2.3.
8.2.2 Libération des chélates et dérivation pour l’injection directe

Placer, par exemple, 5 ml de l’échantillon (des quantités d’échantillons différentes requièrent l’utilisation

de quantités équivalentes des réactifs suivants) dans une fiole Erlenmeyer de 25 ml équipée d’un

bouchon en verre et ajouter le barreau magnétique.

Ajouter 50 µl d’une solution aqueuse multisubstances à 20 µg/l (5.19) constituée de glyphosate marqué

13 15 13 15

au 1,2- C , N (5.18.3) et d’AMPA marqué au C, N (5.18.4) dans de l’eau ultra-pure (5.2) comme

étalon de dérivation.

Ajouter 100 µl d’EDTA disodique (5.16) [solution à 0,1 mol/l dans de l’eau ultra-pure (5.2)], agiter et

laisser reposer pendant 10 min dans la fiole fermée.
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ISO 16308:2014(F)

Ajouter, par exemple, 2 ml du tampon borate de sodium (5.22) à 0,05 mol/l et agiter pendant 30 min à

400 g pour ajuster le pH entre 9,0 et 9,5.

Ajouter 400 µl de solution FMOC-Cl (5.17 pour l’injection directe), agiter pendant 4 h à 400 g et patienter

pendant environ 12 h (toute une nuit).
Neutraliser la solution avec de l’acide chlorhydrique à 30 % (5.14).
Filtrer et utiliser pour l’analyse (8.4).

Le volume final de l’échantillon prétraité doit être pris en compte lors du calcul du résultat final.

NOTE La commutation de vanne du débit d’éluat derrière la colonne avant et après le passage des analytes

vers le conteneur à déchets est un bon choix pour protéger la source d’ions du détecteur SM/SM contre la

contamination.
8.2.3 Séparation et dérivation du chélate avant la préconcentration

Utiliser, par exemple, une micropipette (6.6), une pipette en PP ou en PE, placer un échantillon de 5 ml

dans un tube à fond conique en PP (6.5), par exemple.

Ajouter 50 µl d’une solution aqueuse multisubstances à 20 µg/l constituée de glyphosate marqué au

13 15 13 15

1,2- C , N (5.18.3) et d’AMPA marqué au C, N (5.18.4) dans de l’eau ultra-pure (5.2) comme étalon

de dérivation.
Ajouter 325 µl de tampon borate de sodium (5.22) et agiter.

Ajouter 200 µl d’EDTA disodique (5.16) [solution à 0,1 mol/l dans de l’eau ultra-pure (5.2)], agiter et

laisser reposer pendant 5 min. L’ajout d’EDTA permet de libérer le glyphosate et l’AMPA des complexes

2+ 2+
avec les cations divalents (par exemple, Ca , Mg ).

Ajouter 4,5 ml d’acétonitrile (5.6). Bien agiter, pendant 1 min, pour homogénéiser (les phases ne doivent

pas se séparer pendant cette étape du mode opératoire).
Ajouter 0,6 ml de solution FMOC-Cl (5.17) et agiter à nouveau.

Laisser reposer pendant 30 min à l’abri de la lumière et à température ambiante (20 °C à 25 °C) pour la

réaction.

Après la dérivation, tout excédent de FMOC-Cl et tous les sous-produits de réaction (par exemple, le

FMOC-OH) sont éliminés pendant la préconcentration (8.3).

En cas d’eau dure, c(CaCO ) >3 mmol/l, il est recommandé d’effectuer un prétraitement supplémentaire

des échantillons (voir l’Annexe E).
8.3 Préconcentration
8.3.1 Extraction liquide-liquide des dérivés des analytes

Concentrer l’échantillon analytique à environ 5 ml sous un courant d’azote (20 ml/min à 40 ml/min) à

température ambiante pour éliminer l’acétonitrile. L’évaporation de l’acétonitrile doit être complète et il

convient qu’elle ne dure pas plus de 60 min. Un précipité de FMOC-Cl (excédent de réactif) et de FMOC-

OH (sous-produit) peut cristalliser la paroi du tube.

Transférer la solution du tube en plastique vers un tube à essai en verre (6.11). Rincer le tube en plastique

avec environ 500 µl d’eau ultra-pure (5.2) et transférer son contenu dans le tube en verre.

Extraire 3 fois avec 1,5 ml d’acétate d’éthyle (5.9). Si nécessaire, centrifuger pendant 20 s à 6 500 g

après chaque extraction pour séparer les deux phases. Éliminer le surnageant avec une pipette Pasteur

(utiliser une nouvelle pipette pour chaque extraction).
6 © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO 16308:2014(F)

Concentrer ensuite la phase liquide sous un courant d’azote pendant 15 min pour évaporer l’acétate

d’éthyle restant, en agitant le tube toutes les 5 min.
Le volume final doit être d’environ 6 ml.

L’extrait est ensuite acidifié à pH 3 avec de l’acide formique (5.13) pour prévenir toute éventuelle réaction

avec le FMOC-Cl résiduel et pour permettre de préconcentrer les extraits par SPE (8..3.2). Pour ce faire,

ajouter 100 µl d’une solution d’acide formique (5.13) ayant une fraction volumique de 5 % dans de l’eau

ultra-pure (5.2), ajuster le volume à 6 ml avec de l’eau ultra-pure (5.2) si nécessaire, puis homogénéiser

pendant 1 min.
8.3.2 Extraction en phase solide
8.3.2.1 Exigences générales

Utiliser des cartouches SPE (6.8) contenant, par exemple, 60 mg de phase solide polymère constituées

de polystyrène-divinylbenzène de 60 μm. Le taux de récupération doit être contrôlé régulièrement.

NOTE 1 Les cartouches Oasis HLB® (60 µm, 60 mg, 3 ml, Waters), ou des cartouches équivalentes peuvent

être utilisées.
NOTE 2 La purification et la concentration en ligne sur SPE sont autorisées.
8.3.2.2 Conditionnement des cartouches

Rincer avec 2 × 500 µl de méthanol (5.7) et avec 2 × 500 µl de solution aqueuse d’acide formique à 0,1 %

en fraction volumique (5.13).
8.3.2.3 Purification

Injecter 6 ml d’extrait aqueux acidifié (pH 3) dans la cartouche avec un débit d’environ 1 ml/min.

Rincer le tube SPE avec 1 ml d’une solution aqueuse d’acide formique (5.13) à 0,1 % en fraction volumique,

puis avec 2 × 500 µl d’eau ultra-pure (5.2).

Sécher la cartouche sous vide ou sous un courant modéré d’azote pendant environ 1 min pour éliminer

la majeure partie de l’eau.

Éluer avec 3 × 700 µl de méthanol (5.7)/ 20 g/l d’hydroxyde d’ammonium (5.12) dans de l’eau ultra-pure

(5.2) (70/30, fraction volumique).
Collecter l’éluat dans un tube à essai en v
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 16308
ISO/TC 147/SC 2 Secrétariat: DIN
Début de vote Vote clos le
2013-02-11 2013-05-11

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION • МЕЖДУНАРОДНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ • ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION

Qualité de l'eau — Détermination du glyphosate et de l'AMPA —
Méthode par chromatographie en phase liquide à haute
performance (CLHP) avec détection par spectrométrie de masse
en tandem

Water quality — Determination of glyphosate and AMPA — Method using high performance liquid

chromatography (HPLC) with tandem mass spectrometric detection
ICS 13.060.50

Pour accélérer la distribution, le présent document est distribué tel qu'il est parvenu du

secrétariat du comité. Le travail de rédaction et de composition de texte sera effectué au

Secrétariat central de l'ISO au stade de publication.

To expedite distribution, this document is circulated as received from the committee

secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text composition will be undertaken at

publication stage.

CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT

ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.

OUTRE LE FAIT D'ÊTRE EXAMINÉS POUR ÉTABLIR S'ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET

COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE

CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA

RÉGLEMENTATION NATIONALE.

LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-

PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE.

© Organisation Internationale de Normalisation, 2013
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ISO/DIS 16308
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Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous

quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur l’internet ou sur un

Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à l’adresse ci-après ou au

comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 16308
Sommaire Page

Avant-propos ..................................................................................................................................................... iv

Introduction ......................................................................................................................................................... v

1 Domaine d’application .......................................................................................................................... 1

2 Références normatives ......................................................................................................................... 1

3 Principe .................................................................................................................................................. 1

4 Interférences .......................................................................................................................................... 2

5 Réactifs ................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage ........................................................................................................................................... 4

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................... 5

8 Mode opératoire ..................................................................................................................................... 5

9 Étalonnage ............................................................................................................................................. 8

10 Expression des résultats .................................................................................................................... 11

11 Rapport d’essai .................................................................................................................................... 11

Annexe A (informative) Exemples de conditions chromatographiques ..................................................... 12

Annexe B (informative) Exemples de chromatogrammes ............................................................................ 13

Annexe C (informative) Analyse du glufosinate ............................................................................................ 14

Annexe D (informative) Prétraitement d’échantillons d’eau dure ................................................................ 18

Bibliographie ..................................................................................................................................................... 20

© ISO 2013 – Tous droits réservés iii
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ISO/DIS 16308
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée

aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du

comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 16308 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 2,

Méthodes physiques, chimiques et biochimiques.
iv © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 16308
Introduction

Le glyphosate [N-(phosphonométhyl)glycine] est un herbicide à large spectre non sélectif. L’efficacité de ce

composé en fait l’herbicide le plus vendu et le plus utilisé au monde depuis son arrivée sur le marché en

1974. Associé à son principal produit de dégradation, l’acide aminométhylphosphonique (AMPA), le

glyphosate est l’une des substances les mieux détectées dans les étendues d’eau de la plupart des pays

développés. À noter toutefois que l’AMPA peut également provenir des émanations liées au traitement des

eaux usées (par exemple, en raison de l’utilisation de formulations détergentes pour les textiles).

Le glyphosate et l’AMPA appartiennent à la famille des aminophosphonates et possèdent des propriétés

physico-chimiques nécessitant la mise en œuvre de méthodes d’analyse complexes pour l’analyse des

traces. La difficulté de leur analyse est principalement liée à la haute solubilité du glyphosate et de l’AMPA

ainsi qu’à leur fonction chélatante. Pour résoudre ces problèmes, leur dérivation pré-colonne est effectuée

avec du 9-fluorénylméthylchloroformiate (FMOC-Cl) pour former des dérivés moins polaires, ce qui permet

une meilleure séparation par chromatographie en phase liquide.

Bien que moins concerné par les réglementations, le glufosinate, qui appartient à la famille des

aminophosphonates, peut être dosé simultanément, à condition de prouver l'absence d'interférence avec

l'échantillon soumis à l'analyse.

Il s’agit de la norme actuelle en matière de dosage par chromatographie en phase liquide et par détection

fluorimétrique ; néanmoins, le dosage par CLHP-ESI-SM/SM peut être bien plus spécifique (identification

univoque) et plus sensible (limites de quantification d’environ 30 ng/l). La présente Norme internationale

repose sur cette technique d’analyse et répond au besoin croissant des laboratoires impliqués dans le

contrôle réglementaire du milieu aquatique qui est désormais couramment équipé de ce type d’appareillage.

© ISO 2013 – Tous droits réservés v
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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 16308
Qualité de l'eau — Détermination de la teneur en glyphosate et
en AMPA — Méthode par chromatographie en phase liquide à
haute performance (CLHP) avec détection par spectrométrie de
masse en tandem

AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien

les pratiques courantes de laboratoire. La présente norme n’a pas pour but de traiter de tous les

problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur de la

présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité et de s’assurer

de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.

IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon la présente Norme internationale

soient effectués par un personnel adéquatement qualifié.
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la fraction dissoute de

glyphosate et de son principal métabolite, l’acide aminométhylphosphonique (AMPA) dans l’eau potable, l’eau

souterraine et l’eau de surface à des concentrations de 0,03 µg/l à 1,5 µg/l. Elle ne s’applique pas à l’eau de

mer ou à l’eau salée. Cette méthode peut s’appliquer à d’autres types d’eaux à condition qu’elle soit validée

pour chaque cas.
2 Références normatives

Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à

l’application du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence (y compris les éventuels amendements)

s'applique.

ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai

ISO 5667-3, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 3 : Conservation et manipulation des échantillons

d'eau

ISO 8466-1, Qualité de l’eau — Étalonnage et évaluation des méthodes d’analyse et estimation des

caractères de performance — Partie 1 : Évaluation statistique de la fonction linéaire d'étalonnage

3 Principe

Le glyphosate et l’AMPA (fraction dissoute après filtration) sont dérivés en utilisant du 9-

fluorénylméthylchloroformiate (FMOC-Cl) (5.16.1) pour réduire leur polarité et augmenter la rétention des

composés par séparation sur une colonne de chromatographie en phase inverse (par exemple, C18).

L’échantillon dérivé est purifié par extraction liquide-liquide puis concentré par extraction en phase solide

(SPE).
© ISO 2013 – Tous droits réservés 1
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ISO/DIS 16308

L’analyse est effectuée en réalisant une chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à

une spectrométrie de masse en tandem via une source électrospray (CLHP-ESI-SM/SM), en utilisant

l’étalonnage avec adaptation matricielle.
Tableau 1 — Substances concernées
Masse moléculaire
Nom Formule N° CAS
(g/mol)
Glyphosate
C H NO P
169,1 1071-83-6
3 8 5
N-(phosphonométhyl)glycine
AMPA
CH NO P
111,0 1066-51-9
6 3
Acide
aminométhylphosphonique

NOTE Le glufosinate, qui appartient à la famille des aminophosphonates, peut être dosé simultanément, à condition

de prouver l'absence d'interférence avec l'échantillon soumis à l'analyse.
4 Interférences

Cette méthode est validée pour l’eau dure contenant jusqu’à 3,2 mmol/l de la somme du calcium et du

magnésium. Pour les eaux ayant une plus haute teneur en calcium et en magnésium, il peut être nécessaire

d'augmenter la concentration en EDTA sodique (5.15) lors de l’étape de dérivation (voir l’Annexe C).

NOTE Il peut être nécessaire d’inclure l’étape d’acidification décrite dans l’Annexe C même pour certains types

d’eaux inférieurs à 3,2 mmol/l de la somme du calcium et du magnésium. Le laboratoire doit vérifier la nécessité de ce

mode opératoire pour ses échantillons de routine.

La présence de chlore libre, par exemple dans les eaux traitées, peut provoquer des pertes de glyphosate par

oxydation. Par conséquent, du thiosulfate de sodium doit être utilisé (voir l’Article 7).

5 Réactifs

Sauf indication contraire, tous les réactifs et solvants doivent être de pureté suffisante, par exemple, « pour

l’analyse des traces ».
5.1 Eau déionisée
5.2 Eau ultra-pure, conforme au grade 1 de l’ISO 3696.
5.3 Azote, N , pureté ≥99,996 %.
5.4 Détergent de laboratoire, alcalin.
5.5 Thiosulfate de sodium, Na S O .
2 2 3
5.6 Acétonitrile, C H N, qualité CLHP.
2 3
5.7 Méthanol, CH O, qualité CLHP.
5.8 Éthanol, C H O, 95 %, qualité CLHP.
2 6
5.9 Acétate d’éthyle, C H O , qualité CLHP.
4 8 2
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 16308
5.10 Acétate d’ammonium, C H O N.
2 7 2
5.11 Triéthylamine, C H N.
6 15
5.12 Ammoniac, NH , 28 %.
5.13 Acide formique, CH O .
2 2
5.14 Acide chlorhydrique, HCl, 30 %.
5.15 Acide acétique glacial, C H O .
2 4 2

5.16 Acide éthylènediaminetétracétique (EDTA), sel disodique dihydraté, C H N Na O ·2H O, pureté

10 14 2 2 8 2

minimale de 99 %. 5.17 9-fluorénylméthylchloroformiate, FMOC-Cl, C H ClO , pureté minimale de

15 11 2
97 %.

Le FMOC-Cl sert à préparer le réactif de dérivation, la solution FMOC-Cl, 50 mg/ml, dans de l’acétonitrile

(5.6). Cette solution peut être conservée pendant 6 mois à -18 °C ± 3 °C.
5.18 Substances de référence, selon le Tableau 1.
⎯ Glyphosate, N-(phosphonométhyl)glycine, C H NO P, pureté >98 %.
3 8 5
⎯ AMPA, acide aminométhylphosphonique, CH NO P, pureté >98 %.
6 3
13 15
⎯ Étalon d’extraction de glyphosate marqué au 1,2 C , N, pureté >98 %.
13 15
⎯ Étalon d’extraction d’AMPA marqué au C, N, pureté >98 %.
5.19 Solutions d’étalonnage

Solutions mères individuelles de glyphosate et d’AMPA, 100 mg/l, préparées dans de l'eau ultra-pure (5.2).

Ces solutions peuvent être conservées pendant 1 mois à 4 °C ± 3 °C.
13 15 13 15

Solutions mères individuelles de glyphosate marqué (1,2 C , N) et d’AMPA marqué ( C, N), 100 mg/l,

préparées dans de l'eau ultra-pure (5.2). Ces solutions peuvent être conservées pendant 1 mois à

4 °C ± 3 °C.
13 15

Solution de travail multisubstances constituée d’étalons d’extraction : glyphosate marqué (1,2 C , N) et

13 15

AMPA marqué ( C, N), 20 µg/l, préparée dans de l'eau ultra-pure (5.2). Cette solution peut être conservée

pendant 1 mois à 4 °C ± 3 °C.

NOTE Les solutions mères et les solutions d’étalonnage peuvent être conservées plus longtemps à condition de

fournir les justifications adéquates.

5.20 Tampon acétate de triéthylammonium, solution de triéthylamine à 0,1 % (5.11) ajustée à pH 9,5 avec

de l’acide acétique glacial (5.15) (phase mobile).
5.21 Tétraborate de sodium, décahydraté, Na B O ·10H O.
2 4 7 2
5.22 Tampon borate de sodium, 0,05 mol/l ; pH = 9,2.

Dissoudre 19 ± 0,1 g de tétraborate de sodium (5.21), décahydraté, dans 1 l d’eau (5.1). Cette solution peut

être conservée pendant environ 1 mois à 4 °C ± 3 °C.
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ISO/DIS 16308
2+ 2+

5.23 Eau minérale, contenant moins de 3,2 mmol/l de cations divalents (Mg et Ca total), pour préparer

l’étalonnage avec adaptation matricielle.
6 Appareillage

Le matériel ou l’une de ses parties, qui risque d’entrer en contact avec l’échantillon, doit être exempt(e) de

tout résidu susceptible de provoquer des interférences inacceptable dans les blancs.

Des récipients en verre et en plastique peuvent être utilisés pour l’échantillonnage et pour toutes les étapes

qui précèdent la dérivation. Des flacons en verre (6.10) et des tubes à essai en verre (6.11) doivent être

utilisés après l’étape de dérivation.
6.1 Verrerie de laboratoire

6.2 Flacons en verre, en polyéthylène (PE) ou en polypropylène (PP), minimum 50 ml, pour

l’échantillonnage.

6.3 Seringue en verre, en polyéthylène (PE) ou en polypropylène (PP), minimum 50 ml, pour la filtration

des échantillons.

6.4 Filtre pour seringue à usage unique, ø 25 mm, avec membrane hydrophile en cellulose régénérée,

0,45 µm.

6.5 Tubes à fond conique en verre ou en PE ou PP à usage unique, environ 50 ml, pour la dérivation.

6.6 Micropipettes, réglables entre 100 µl et 500 µl.
6.7 pH-mètre
6.8 Cartouches SPE, par exemple Oasis HLB® Waters 60 mg, 3 ml, ou équivalentes.

6.9 Dispositif de centrifugation, permettant d’obtenir une accélération de 6 500 g.

6.10 Fioles en verre, adaptées à l’échantillonneur automatique, équipées de bouchons et de septums en

polytétrafluoroéthylène (PTFE).
6.11 Tube à essai en verre, 15 ml ou moins.

6.12 Colonne en phase inverse, par exemple colonne XBridge® C18 (Waters, 50 mm x 2,1 mm, D.I.

2,5 µm) avec précolonne (Waters, 10 mm x 2,1 mm, D.I. 2,5 µm).

NOTE Une colonne Gemini NX® (Phenomenex) ayant des dimensions similaires convient également. D’autres

types de colonnes peuvent être utilisés, à condition d’ajuster les conditions de séparation. Il est hautement recommandé

d’utiliser une colonne dont la phase stationnaire est résistante aux alcalis (pH = 9 à 9,5).

6.13 Chromatographe en phase liquide à haute performance (CLHP), constituée des éléments suivants :

⎯ un injecteur, manuel ou automatique ;
⎯ une pompe à gradient ;
⎯ un four thermorégulé, pour la colonne CLHP ;

OASIS HLB®, XBridge® et Gemini® sont des exemples de produits appropriés disponibles dans le commerce. Cette

information est donnée par souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer

un engagement de l'ISO à l’égard de ces produits.
4 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 16308

⎯ un spectromètre de masse, équipé d’un analyseur quadripôle et d’une source électrospray ;

⎯ un système d’acquisition et de traitement des données.
7 Échantillonnage

Si les flacons de prélèvement ne sont pas à usage unique, rincer les flacons d’échantillons (6.2) avec de l’eau

déionisée (5.1) puis nettoyer avec un détergent de laboratoire (5.4). Rincer avec de l’eau (5.1) puis avec de

l’eau ultra-pure (5.2) et, pour finir, avec de l’éthanol à 95 % (5.8).

Effectuer l’échantillonnage conformément à l’ISO 5667-3 dans ces flacons (6.2) (environ 50 ml).

Pour les échantillons suspectés de contenir du chlore libre, ajouter environ 2 mg de thiosulfate de sodium

(5.5) ou de tout autre agent réducteur de chlore pour 100 ml d'échantillon.
Conserver les échantillons à 4 °C ± 3 °C et les prétraiter dans les 24 h.
8 Mode opératoire
8.1 Prétraitement (SPM)

Adapter le filtre (6.4) sur la seringue (6.3). Rincer avec 5 ml d’eau ultra-pure (5.2).

Filtrer l’échantillon (environ 50 ml) et jeter les 5 premiers millilitres. Collecter le filtrat dans un tube à fond

conique (6.5).

Conserver les échantillons filtrés à 4 °C ± 3 °C pendant une semaine maximum avant l’étape de dérivation.

8.2 Séparation et dérivation du chélate

La condition de la dérivation doit être adaptée au type d’étape analytique qui suit la dérivation :

⎯ si une importante quantité d’analyte est suspectée, aucune préconcentration n’est nécessaire et

l’échantillon dérivé est directement injecté après la dérivation, conformément au paragraphe 8.2.1.

⎯ sinon, une étape de préconcentration peut être utile pour atteindre la performance LOQ prévue et la

dérivation doit être effectuée conformément au paragraphe 8.2.2.
8.2.1 Séparation et dérivation du chélate pour l’injection directe

Placer, par exemple, 5 ml de l’échantillon dans une fiole Erlenmeyer de 25 ml équipée d’un bouchon en verre

et ajouter le barreau magnétique.

Ajouter 50 µl d’une solution aqueuse multisubstances à 20 µg/l (5.19) constituée de glyphosate marqué (1,2

13 15 13 15

C , N) (5.18) et d’AMPA marqué ( C, N) (5.18) dans de l’eau ultra-pure (5.2) comme étalon d’extraction

de dérivation.

Ajouter 100 µl d’EDTA disodique (5.16) (solution à 0,1 mol/l dans de l’eau ultra-pure (5.2)), agiter et laisser

reposer pendant 10 min dans la fiole fermée.

Ajouter 2 ml du tampon borate de sodium (5.22) à 0,05 mol/l et agiter pendant 30 min à 400 g pour ajuster le

pH entre 9,0 et 9,5.

Ajouter 4 µl de solution de FMOC-Cl (4.17), agiter pendant 4 h à 400 g et patienter pendant environ 12 h

(toute une nuit).
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ISO/DIS 16308
Neutraliser la solution avec de l’acide chlorhydrique à 30 % (4.14).
Filtrer et utiliser pour l’analyser (8.4).

Le volume final de l’échantillon prétraité doit être pris en compte lors du calcul du résultat final.

NOTE La commutation de vanne du débit d’éluat derrière la colonne dans les déchets est un bon choix pour protéger

la source d’ions du détecteur SM/SM contre la contamination.
8.2.2 Séparation et dérivation du chélate avant la préconcentration

Utiliser, par exemple, une micropipette (6.6), une pipette en PP ou en PE, placer un échantillon de 5 ml dans

un tube à fond conique en PP (6.5), par exemple.

Ajouter 50 µl d’une solution aqueuse multisubstances à 20 µg/l constituée de glyphosate marqué (1,2 C ,

15 13 15

N) (5.18) et d’AMPA marqué ( C, N) (5.18) dans de l’eau ultra-pure (5.2) comme étalon d’extraction de

dérivation.
Ajouter 325 µl de tampon borate de sodium (5.22) et agiter.

Ajouter 200 µl d’EDTA disodique (5.15) (solution à 0,1 mol/l dans de l’eau ultra-pure (5.2)), agiter et laisser

reposer pendant 5 min. L’ajout d’EDTA permet de libérer les complexes de glyphosate et d’AMPA avec les

2+ 2+
cations divalents (par exemple, Ca , Mg ).

Ajouter 4,5 ml d’acétonitrile (5.6). Bien agiter, pendant 1 min, pour homogénéiser (les phases ne doivent pas

se séparer pendant cette étape du mode opératoire).
Ajouter 0,6 ml de solution FMOC-Cl (5.17) et agiter à nouveau.

Laisser reposer pendant 30 min à l’abri de la lumière et à température ambiante (20 °C à 25 °C) pour la

réaction.

Après la dérivation, tout excédent de FMOC-Cl et tous les sous-produits de réaction (par exemple, le

FMOC-OH) sont éliminés pendant la préconcentration (8.3).

NOTE En présence d’eau dure (c(CaCO ) > 3 mmol/l), il est recommandé d’effectuer un prétraitement

supplémentaire des échantillons (voir l’Annexe D).
8.3 Préconcentration
8.3.1 Extraction liquide-liquide des dérivés des analytes

Concentrer l’échantillon analytique à environ 5 ml sous un courant d’azote (20 ml/min à 40 ml/min) à

température ambiante pour éliminer l’acétonitrile. L’évaporation de l’acétonitrile doit être complète et il

convient qu’elle ne dure pas plus de 60 min. Un précipité de FMOC-Cl (excédent de réactif) et de FMOC-OH

(sous-produit) peut cristalliser la paroi du tube.

Transférer la solution du tube en plastique vers un tube à essai en verre (6.11). Rincer le tube en plastique

avec environ 500 µl d’eau ultra-pure (5.2) et transférer son contenu dans le tube en verre.

Extraire 3 fois avec 1,5 ml d’acétate d’éthyle (5.9). Si nécessaire, centrifuge pendant 20 s à 6 500 g après

chaque extraction pour séparer les deux phases. Éliminer le surnageant avec une pipette Pasteur (utiliser une

nouvelle pipette pour chaque extraction).

Concentrer ensuite la phase liquide sous un courant d’azote pendant 15 min pour évaporer l’acétate d’éthyle

restant, en agitant le tube toutes les 5 min.
Le volume final doit être d’environ 6 ml.
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L’extrait est ensuite acidifié à pH = 3 avec de l’acide formique (5.13) pour prévenir toute éventuelle réaction

avec le FMOC-Cl résiduel et pour permettre de préconcentrer les extraits par extraction en phase solide (8.4).

Pour ce faire, ajouter 100 µl d’une solution d’acide formique (5.13) ayant une fraction volumique de 5 % dans

de l’eau ultra-pure (5.2), ajuster le volume à 6 ml avec de l’eau ultra-pure (5.2) si nécessaire, puis

homogénéiser pendant 1 min.
8.3.2 Extraction en phase solide
8.3.2.1 Exigences générales

Utiliser des cartouches SPE contenant environ : 60 mg de cartouches d’extraction en phase solide (SPE)

polymère constituées de polystyrène-divinylbenzène de 60 µm. Le taux de récupération doit être contrôlé

régulièrement.

NOTE 1 Les cartouches Oasis HLB® (60 µm, 60 mg, 3 ml, Waters) ou des cartouches équivalentes peuvent être

utilisées.
NOTE 2 La purification et la concentration en ligne sur SPE sont autorisées.
8.3.2.2 Conditionnement des cartouches

Rincer avec 2 x 500 µl de méthanol (5.7) et avec 2 x 500 µl de solution aqueuse d’acide formique à 0,1 %

(5.13).
8.3.2.3 Purification

Injecter 6 ml d’extrait aqueux acidifié (pH = 3) dans la cartouche avec un débit d’environ 1 ml/min.

Rincer le tube SPE avec 1 ml d’une solution aqueuse d’acide formique (5.13) à 0,1 %, puis avec 2 x 500 µl

d’eau ultra-pure (5.2).Sécher la cartouche sous vide ou sous un courant modéré d’azote pendant environ

1 min pour éliminer la majeure partie de l’eau.

Éluer avec 3 x 700 µl de méthanol (5.7)/ 2 % d’ammoniac (5.12) dans de l’eau ultra-pure (5.2) (70/30, fraction

volumique).

Collecter l’éluat dans un tube à essai en verre (6.11) et réduire sous un courant d’azote jusqu’à ce que le

méthanol soit éliminé. Le volume final doit être d’environ 0,7 ml.

NOTE Les résidus de méthanol peuvent dégrader les conditions chromatographiques, avec une séparation

des pics.

Compléter à 1 ml avec de l’eau ultra-pure (5.2). L’extrait purifié peut être conservé pendant 48 h à 4 °C ± 3 °C

maximum avant analyse en raison de la stabilité des dérivés FMOC dans l’eau.
8.4 Dosage chromatographique
8.4.1 Exigences générales
Utiliser l’équipement conformément aux instructions du fabricant.

Vérifier régulièrement la stabilité du système. Ajuster et optimiser les paramètres des instruments

conformément aux instructions du fabricant.

En raison de l’utilisation de phases mobiles tamponnées, il est recommandé de rincer régulièrement la

colonne analytique et le système chromatographique conformément aux instructions du fabricant.

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8.4.2 Conditions chromatographiques

Séparer les dérivés de glyphosate et d’AMPA par CLHP en utilisant une colonne en phase inverse et des

conditions chromatographiques appropriées. Le pH de la phase mobile doit être alcalin (pH = 9 à 9,5) de

façon à obtenir les meilleures performances chromatographiques (symétrie des pics proche de 1 et pics

étroits), ce qui implique l’utilisation d’une colonne particulière (phase stationnaire hybride). Les Annexes A à C

illustrent des exemples de conditions chromatographiques appropriées.
8.5 Identification et confirmation des analytes

L’identification des composés cibles est effectuée en comparant leur temps de rétention à celui de la

substance de référence, ainsi que leur spectre de masse en mode d’ionisation négatif SRM (« single reaction

monitoring ») à celui des substances de référence. Le Tableau 2 donne les transitions caractéristiques

utilisées.
Tableau 2 —Détection ESI-SM/SM
Analytes Transition de quantification Transition de qualification
Glyphosate-FMOC 390>168 390>150
AMPA-FMOC
332>110 332>136
Glyphosate-FMOC marqué (1,2 393>171 393>153
13 15
C , N)
13 15
334>112 334>138
AMPA-FMOC marqué ( C, N)

Les rapports entre les transitions de quantification et de qualification dépendent des conditions SRM (c’est-à-

dire, l’énergie de collision et la pression gazeuse dans la cellule de collision). Ces rapports doivent être

déterminés en utilisant des substances de références et doivent représenter, pour les échantillons, ± 20 % de

la valeur observée pour la substance de référence, en utilisant la même optimisation de l’équipement.

Des exemples de chromatogrammes sont donnés dans l’Annexe B.
8.6 Contrôle des témoins à blanc

Les témoins à blanc sont obtenus en appliquant le mode opératoire sur une eau minérale (5.23)

13 15 13 15

supplémentée avec du glyphosate (1,2 C , N) et de l’AMPA ( C, N) uniquement. Les témoins à blanc

et les échantillons doivent être traités et analysés simultanément. Il convient que la teneur résiduelle en

glyphosate et en AMPA soit inférieure aux limites de quantification (LOQ).
9 Étalonnage
9.1 Gammes de concentration

Préparer un étalonnage en 5 points conformément à l’ISO 8466-1 couvrant le domaine de mesure de

13 15

0,03 µg/l à 1,5 µg/l pour le glyphosate et l’AMPA, ainsi que pour le glyphosate marqué (1,2 C , N) et

13 15
l’AMPA m
...

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