Soil quality — Inhibition of reproduction of the soil mite (Hypoaspis aculeifer) by soil contaminants

This document specifies a chronic test method for evaluating the habitat function of soils and determining effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Hypoaspis aculeifer by ? mainly ? alimentary uptake. This method is applicable to soils and soil materials of unknown quality, e.g. from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, industrial, agricultural or other sites under concern and waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed material, or manure, especially those for possible land disposal). The reproduction (= number of juveniles) is the measured parameter of the test. The test reflects the bioavailability of a mixture of contaminants in natural soils (contaminated site soils) to a species which represents a trophic level which is not covered by other ISO standards. This test is not intended to replace the earthworm (see ISO 11268-2) or Collembola (see ISO 11267) reproduction tests since this species belongs not only to a different trophic group but also a different taxonomic group (= mites; i.e. arachnids) than those used usually. Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For contaminated soils, the effects are determined in the soil to be tested and in a control soil. Depending on the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) are either an uncontaminated soil comparable to the soil to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g. artificial soil). This document provides information on how to use this method for testing samples (soils or substances) under temperate conditions. This document is not applicable to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than one, or to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa at 25 °C. NOTE The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.

Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de l'acarien prédateur (Hypoaspis aculeifer) par des contaminants du sol

Le présent document décrit une méthode d'essai chronique pour évaluer la fonction d'habitat des sols et déterminer les effets des contaminants du sol et des substances sur la reproduction de l'espèce Hypoaspis aculeifer par — principalement — absorption par voie alimentaire. Cette méthode est applicable aux sols et matériaux du sol de qualité inconnue, par exemple, provenant de sites contaminés, de sols amendés, de sols ayant fait l'objet d'une remédiation, de sites industriels, agricoles et autres, et aux déchets (par exemple, matériau de dragage, boue résiduaire des stations d'épuration des eaux usées, engrais ou fumier, notamment ceux pour épandage éventuel). La reproduction (= nombre de juvéniles) est le paramètre mesuré au cours de l'essai. L'essai reflète la biodisponibilité d'un mélange de contaminants dans les sols naturels (sols de sites contaminés) vis-à-vis d'une espèce qui représente un niveau trophique qui n'est pas couvert par les autres normes ISO. Il n'est pas prévu d'utiliser cet essai pour remplacer les essais de reproduction vis-à-vis des vers de terre (voir ISO 11268-2) ou des collemboles (voir ISO 11267) car cette espèce appartient non seulement à un autre groupe trophique, mais également à un autre groupe taxonomique (= acariens; c'est-à-dire, arachnides) que les autres espèces utilisées habituellement. Les effets des substances sont évalués en utilisant un sol standard, de préférence un substrat défini de sol artificiel. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol à analyser et dans un sol témoin. Selon l'objectif de l'étude, le substrat témoin et le substrat de dilution (séries de dilutions du sol contaminé) sont soit un sol non contaminé comparable au sol à analyser (sol de référence), soit un sol standard (par exemple, sol artificiel). Le présent document fournit des informations sur la façon d'utiliser cette méthode pour analyser des échantillons (sols ou substances) dans des conditions tempérées. Il n'est pas applicable aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/sol est supérieur à 1, ou aux substances dont la tension de vapeur dépasse 300 Pa à 25 °C. NOTE La stabilité de la substance d'essai ne peut pas être assurée tout au long de la période d'essai. La méthode d'essai ne prévoit pas de contrôler la persistance de la substance soumise à essai.

General Information

Status
Published
Publication Date
25-Apr-2019
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
26-Apr-2019
Completion Date
26-Apr-2019
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ISO 21285:2019 - Soil quality -- Inhibition of reproduction of the soil mite (Hypoaspis aculeifer) by soil contaminants
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ISO 21285:2019 - Qualité du sol -- Inhibition de la reproduction de l'acarien prédateur (Hypoaspis aculeifer) par des contaminants du sol
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21285
First edition
2019-04
Soil quality — Inhibition of
reproduction of the soil mite
(Hypoaspis aculeifer) by soil
contaminants
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de l'acarien prédateur
(Hypoaspis aculeifer) par des contaminants du sol
Reference number
ISO 21285:2019(E)
ISO 2019
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ISO 21285:2019(E)
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© ISO 2019

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Published in Switzerland
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ISO 21285:2019(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 2

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 3

5 Reagents and material .................................................................................................................................................................................... 4

5.1 Biological material ............................................................................................................................................................................... 4

5.2 Test mixtures ............................................................................................................................................................................................ 4

5.3 Reference substance ........................................................................................................................................................................... 5

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 6

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 6

7.1 Experimental design .......................................................................................................................................................................... 6

7.1.1 General...................................................................................................................................................................................... 6

7.1.2 Range-finding test (preliminary test) ............................................................................................................ 7

7.1.3 Definitive test ...................................................................................................................................................................... 7

7.1.4 Limit test ................................................................................................................................................................................. 7

7.2 Preparation of test mixtures ....................................................................................................................................................... 8

7.2.1 Testing contaminated soil ........................................................................................................................................ 8

7.2.2 Testing substances added to the test substrate .................................................................................... 8

7.2.3 Preparation of control containers ..................................................................................................................... 9

7.3 Addition of the biological material ........................................................................................................................................ 9

7.4 Test conditions and measurements ...................................................................................................................................... 9

7.5 Feeding of the mites............................................................................................................................................................................ 9

7.6 Determination of surviving predatory mites .............................................................................................................10

8 Calculation and expression of results ..........................................................................................................................................10

8.1 Calculation ...............................................................................................................................................................................................10

8.2 Expression of results .......................................................................................................................................................................10

9 Validity of the test .............................................................................................................................................................................................10

10 Statistical analysis ............................................................................................................................................................................................11

10.1 General ........................................................................................................................................................................................................11

10.2 Single-concentration tests ..........................................................................................................................................................11

10.3 Multi-concentration tests............................................................................................................................................................11

10.3.1 Range-finding test ........................................................................................................................................................11

10.3.2 Definitive test ...................................................................................................................................................................11

11 Test report ................................................................................................................................................................................................................12

Annex A (informative) Techniques for rearing and breeding of predatory mites .............................................14

Annex B (normative) Determination of water-holding capacity ..........................................................................................16

Annex C (informative) Guidance on adjustment of pH of artificial soil .........................................................................17

Annex D (informative) Extraction and counting of predatory mites ................................................................................18

Annex E (informative) Basic information on the biology of Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer .............19

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................20

© ISO 2019 – All rights reserved iii
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ISO 21285:2019(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso

.org/iso/foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,

Biological characterization.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21285:2019(E)
Introduction

Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in

soil and are proposed to complement conventional chemical analysis (see ISO 15799 and ISO 17616).

ISO 15799 includes a list and short characterization of recommended and standardized test systems

and ISO 17616 gives guidance on the choice and evaluation of the bioassays. Aquatic test systems with

soil eluate are applied to obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching

the groundwater by the water path (retention function of soils), whereas terrestrial test systems are

used to assess the habitat function of soils.

Mites (Acari) are a world-wide and diverse group of arthropods belonging to the class Arachnida with

over 40 000 species recorded, divided into two super-orders (Acariformes and Parasitiformes). Due to

their relative small size (a few µm to a few cm), they occupy specific ecological niches on plants as well

as in soils (see Reference [13]).

Among soil-inhabiting mites, the role of predation is ensured by, for example, Hypoaspis sp. (Laelapidae).

Because they are exposed to chemical contamination, mites are already considered in the environmental

risk assessment of pesticides, as non-target organisms (see Reference [10]). Indeed, among the data

required for active substances of pesticides, effects on predatory mites are assessed, i.e. for the plant-

inhabitant Typhlodromus pyri (Phytoseiidae) and the soil-inhabitant Hypoaspis aculeifer (Laelapidae)

(see Reference [6]).
[23][17]

The first authors introducing H. aculeifer as a test organism in ecotoxicological studies were later

proposed a two-species test system in the European project SECOFASE (Sublethal Effects of Chemicals

on Fauna in the Soil Ecosystem), including the collembolan Folsomia fimetaria as prey. In the context

of the development of an ecotoxicological test for the assessment of plant protection products on non-

target arthropods (see References [5][6]), a protocol on soil predatory mites using H. aculeifer was

further proposed. More recently, a standard test protocol for the assessment of chemicals was developed

for this species by OECD in 2008 and revised in 2016. The results of the associated international ring-

test were published in Reference [25].

Among mites, the predator Hypoaspis aculeifer is the most studied species in laboratory. The reproduction

end point was found in general to be more sensitive than mortality and avoidance. Compared to other

soil meso-fauna invertebrates, mites were found in general less sensitive than or as sensitive as other

test species, depending on the end points and chemicals studied. Considering semi-field studies,

H. aculeifer was used as a top predator whereas other soil invertebrates, mainly springtails, were

ranked in the grazer group. In these studies, mites showed to be quite tolerant towards anthropogenic

contamination. This statement was also corroborated by field surveys. However, the applicability of

laboratory test methods for the assessment of environmental samples (contaminated soils, wastes etc.)

with mites is emphasized, as to date a limited number of studies are available.

This document describes a method that is based on the determination of lethal and sublethal effects

of contaminated soils to adult predatory mites of the species Hypoaspis aculeifer. This species is

considered to be representative of predatory soil arthropods. Background information on the ecology

of these mites and their use in ecotoxicological testing is available in Reference [14].

© ISO 2019 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21285:2019(E)
Soil quality — Inhibition of reproduction of the soil mite
(Hypoaspis aculeifer) by soil contaminants
1 Scope

This document specifies a chronic test method for evaluating the habitat function of soils and

determining effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Hypoaspis aculeifer by

– mainly – alimentary uptake. This method is applicable to soils and soil materials of unknown quality,

e.g. from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, industrial, agricultural or other

sites under concern and waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater

treatment plant, composed material, or manure, especially those for possible land disposal). The

reproduction (= number of juveniles) is the measured parameter of the test. The test reflects the

bioavailability of a mixture of contaminants in natural soils (contaminated site soils) to a species which

represents a trophic level which is not covered by other ISO standards. This test is not intended to

replace the earthworm (see ISO 11268-2) or Collembola (see ISO 11267) reproduction tests since this

species belongs not only to a different trophic group but also a different taxonomic group (= mites; i.e.

arachnids) than those used usually.

Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For

contaminated soils, the effects are determined in the soil to be tested and in a control soil. Depending

on the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil)

are either an uncontaminated soil comparable to the soil to be tested (reference soil) or a standard soil

(e.g. artificial soil).

This document provides information on how to use this method for testing samples (soils or substances)

under temperate conditions.

This document is not applicable to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than

one, or to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa at 25 °C.

NOTE The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the

test method for monitoring the persistence of the substance under test.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 10390, Soil quality — Determination of pH

ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary

analysis)

ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level

using barium chloride solution

ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by

sieving and sedimentation

ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis —

Gravimetric method

ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic

conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory

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ISO 21285:2019(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.2
effect concentration for x % effect

concentration (mass fraction) of a test sample that causes x % of an effect on a given end point within a

given exposure period when compared with a control

EXAMPLE An EC is a concentration estimated to cause an effect on a test end point in 50 % of an exposed

population over a defined exposure period.

Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).

When substances are tested, the ECx is expressed as the mass of the test substance per dry mass of soil in

milligrams per kilogram.
3.3
effect rate

rate of a soil to be tested that causes an x % of an effect on a given end point within a given exposure

period when compared with a control
3.4
limit test

single concentration test consisting of at least four replicates each, the soil to be tested without any

dilution or the highest concentration of test substance mixed into the control soil and the control

3.5
lowest observed effect concentration
LOEC

lowest test substance concentration that has a statistically significant effect (probability p < 0,05)

Note 1 to entry: In this test, the LOEC is expressed as a mass of test substance per dry mass of the soil to be

tested. All test concentrations above the LOEC should usually show an effect that is statistically different from

the control.
3.6
lowest observed effect rate
LOER

lowest rate of a soil to be tested in a control soil at which a statistically significant effect is observed

3.7
no observed effect concentration
NOEC

highest test substance concentration immediately below the LOEC (3.5) at which no effect is observed

Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect

(probability p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control.

2 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21285:2019(E)
3.8
no observed effect rate
NOER

lowest rate of a soil to be tested immediately below the LOER (3.6) which when compared to the control

has no statistically significant effect (probability p < 0,05) within a given exposure period

3.9
reference soil

uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic

carbon content and texture) to the soil being studied
3.10
standard soil

field-collected soil or artificial soil whose main properties (pH, texture, organic matter content) are

within a known range
EXAMPLE Euro soils, artificial soil, LUFA standard soil type 2.2.

Note 1 to entry: The properties of standard soils can differ from the soil to be tested.

3.11
control soil

reference or standard soil used as a control and as medium for preparing dilution series with soils to be

tested or a reference substance, which fulfils the validity criteria

Note 1 to entry: In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving

the test validity criteria before using the soil in a definitive test.
3.12
test mixture

mixture of contaminated soil or the test substance (e.g. chemical, biosolid, waste) with control soil

3.13
test mixture ratio
ratio between the soil to be tested and the control soil in a test mixture
4 Principle

Adult females are exposed to the soil to be tested and the effects on reproduction measured are

compared to those observed for females exposed to a control soil. If appropriate, effects based on

exposure to a dilution range of contaminated soil and control soil or a range of concentrations of a test

substance mixed into control soil are determined. Test mixtures are prepared at the start of the test

and are not renewed within the test period. The test is started with 10 adult females per test vessel.

Males are not introduced in the test, because experience has shown that females mate immediately or

shortly after hatching from the deutonymph stage, if males are present. As the females are introduced

into the test about 7 d after they have reached the adult stage, the females can be considered as already

mated (Annex A and Annex E). The test runs until the first offspring have reached the deutonymph

stage. At 20 °C the exposure time ends at day 14 after introducing the females (day 0), followed by

two days of extraction. The number of surviving females and the number of juveniles per test vessel

are determined. The reproductive output of the mites exposed to the test mixtures is compared to

that of the controls in order to determine the concentrations which cause no effects on mortality and

reproduction (NOER/NOEC) and the concentration resulting in x % reduction of juveniles hatched from

eggs compared to the control (ER /EC ) respectively, depending on the experimental design (see 7.1.3).

x x

In case there is no prior knowledge of the dilution/concentration of the soil to be tested or the test

substance likely to have an effect, then it is useful to conduct the test in two steps:

— A range-finding test on reproduction is carried out, to give an indication of the effect dilution/

concentration, and the dilution/concentration giving no mortality (NOER/NOEC). Dilutions/

concentrations to be used in the definitive test can then be selected;
© ISO 2019 – All rights reserved 3
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ISO 21285:2019(E)

— the definitive test on reproduction to determine sublethal effects of (dilutions of) contaminated

soil or the concentration of a substance which, when evenly mixed into the standard soil, causes no

significant effects on numbers of offspring hatched from eggs compared with the control (NOER/

NOEC), and the lowest concentration causing effects (LOER/LOEC).

The use of a reference soil is an essential requirement to demonstrate the present status of the test

population, and to avoid misinterpretation of results.
5 Reagents and material
5.1 Biological material

In this test, Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer. adult female mites (7 d to 14 d after becoming adult; 28 d

to 35 d after the start of the egg laying in the synchronisation) are required to start the test. The mites

shall be selected from a synchronised cohort (see Annex E).
5.2 Test mixtures

5.2.1 Field-collected soil or waste. The field-collected soils used in the test shall be passed through

a sieve of 4 mm square mesh to remove coarse fragments and thoroughly mixed. If necessary, soil may

be air-dried without heating before sieving. Storage of soil to be tested should be as short as possible.

The soil shall be stored in accordance with ISO 18400-206 using containers that minimize losses of soil

contaminants sorption to the container walls. If soils or test mixtures have been stored, they should

be mixed a second time immediately before use. Soil pH should not be corrected as it can influence

bioavailability of soil contaminants.

For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled

from a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390;
b) texture (sand, loam or silt, clay) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) water-holding capacity according to Annex B;
e) cationic exchange capacity in accordance with ISO 11260;
f) organic carbon in accordance with ISO 10694;
g) percentage of material removed by the 4 mm sieve.

It is important to determine the water holding capacity of all mixtures used in the test.

5.2.2 Control soil, either a) reference soil or b) standard soil that allows the presence of predatory

mites. Control soil and soil used for dilution shall not differ in one test [either a) or b)].

a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should

be treated and characterized like the soils to be tested. If a toxic contamination or unusual soil

properties cannot be ruled out, standard control soils should be preferred.

b) For testing the effects of substances mixed into soil, standard soils (e.g. artificial soil, LUFA standard

soil type 2.2.) shall be used as test substrate. The properties of the field-collected standard soil

shall be reported.

The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:

4 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21285:2019(E)
Percentage expressed on dry mass
basis
— Sphagnum peat finely ground [a particle size of (2 ± 1) mm is 5 %
acceptable] and with no visible plant remains
— Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
— Industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 50 % 74 %
of particle size 0,05 mm to 0,2 mm)

Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverised, analytical grade) are necessary to

get a pH of 6,0 ± 0,5.

NOTE 1 Taking the properties of highly non-polar (log K > 2) or ionizing substances into account, 5 % of

peat have proven to be sufficient for maintaining the desired structure of the artificial soil.

NOTE 2 It has been demonstrated that Hypoaspis aculeifer can comply with the validity criteria even on

reproduction when tested in field soils with lower organic carbon content (e.g. 2,7 %), and there is experience

that this can be achieved in artificial soil with 5 % peat. Therefore, it is not necessary before using such a soil in a

definitive test to demonstrate the suitability of the artificial soil for allowing the test to comply with the validity

criteria unless the peat contents lowered more than specified above.

Prepare the artificial soil at least three days prior to start the test, by mixing the dry constituents listed

above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required is added

while mixing is continued. Allowance should be made for any water that is used for introducing the test

substance into the soil. The amount of calcium carbonate required can vary, depending on properties

of the individual batch of sphagnum peat and should be determined by measuring sub-samples

immediately before the test (see Annex C). Store the mixed artificial soil at room temperature for at

least two days to equilibrate acidity. To determine pH and the maximum water holding capacity, the

dry artificial soil is pre-moistened one or two days before starting the test by adding deionised water

to obtain approximately half of the required final water content of 40 % to 60 % of the maximum water

holding capacity.

The total water-holding capacity shall be determined in accordance with Annex B, the pH shall be

determined according to ISO 10390.
5.3 Reference substance
5.3.1 General. To
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21285
Première édition
2019-04
Qualité du sol — Inhibition de la
reproduction de l'acarien prédateur
(Hypoaspis aculeifer) par des
contaminants du sol
Soil quality — Inhibition of reproduction of the soil mite (Hypoaspis
aculeifer) by soil contaminants
Numéro de référence
ISO 21285:2019(F)
ISO 2019
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ISO 21285:2019(F)
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© ISO 2019

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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 21285:2019(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d'application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 2

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 3

5 Réactifs et matériel ............................................................................................................................................................................................ 4

5.1 Matériel biologique ............................................................................................................................................................................. 4

5.2 Mélanges d’essai .................................................................................................................................................................................... 4

5.3 Substance de référence .................................................................................................................................................................... 6

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 6

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 7

7.1 Plan d’expérience .................................................................................................................................................................................. 7

7.1.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 7

7.1.2 Essai préliminaire ........................................................................................................................................................... 7

7.1.3 Essai définitif ....................................................................................................................................................................... 7

7.1.4 Essai limite ............................................................................................................................................................................ 8

7.2 Préparation des mélanges d’essai .......................................................................................................................................... 8

7.2.1 Essai sur sol contaminé ........................................................................................................................................... ... 8

7.2.2 Essai sur substances ajoutées au substrat d’essai .............................................................................. 9

7.2.3 Préparation des récipients témoins ................................................................................................................ 9

7.3 Ajout du matériel biologique ...................................................................................................................................................10

7.4 Conditions d’essai et mesurages ...........................................................................................................................................10

7.5 Alimentation des acariens ..........................................................................................................................................................10

7.6 Détermination du nombre d’acariens prédateurs survivants .....................................................................11

8 Calcul et expression des résultats ...................................................................................................................................................11

8.1 Calcul ............................................................................................................................................................................................................11

8.2 Expression des résultats ..............................................................................................................................................................11

9 Validité de l’essai ...............................................................................................................................................................................................11

10 Analyse statistique ..........................................................................................................................................................................................11

10.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................11

10.2 Essais à une seule concentration ..........................................................................................................................................12

10.3 Essais à plusieurs concentrations........................................................................................................................................12

10.3.1 Essai préliminaire ........................................................................................................................................................12

10.3.2 Essai définitif ....................................................................................................................................................................12

11 Rapport d'essai ...................................................................................................................................................................................................13

Annexe A (informative) Techniques d’élevage des acariens prédateurs .....................................................................15

Annexe B (normative) Détermination de la capacité de rétention d’eau ....................................................................17

Annexe C (informative) Recommandations relatives à l’ajustement du pH d’un sol artificiel ..............19

Annexe D (informative) Extraction et comptage des acariens prédateurs ................................................................20

Annexe E (informative) Informations générales sur la biologie de Hypoaspis (Geolaelaps)

aculeifer ......................................................................................................................................................................................................................21

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................22

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ISO 21285:2019(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,

Caractérisation biologique.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
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ISO 21285:2019(F)
Introduction

Les systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les

effets des contaminants présents dans les sols et sont proposés pour compléter l’analyse chimique

conventionnelle (voir ISO 15799 et ISO 17616). L’ISO 15799 contient une liste et une brève caractérisation

des systèmes d’essai recommandés et normalisés et l’ISO 17616 donne des recommandations sur le

choix et l’évaluation des essais biologiques. Les systèmes d’essai aquatiques avec un éluat de sol sont mis

en œuvre pour obtenir des informations sur la fraction des contaminants susceptibles d’être entraînés

jusque dans les eaux souterraines par le cheminement de l’eau (fonction de rétention des sols), alors que

les systèmes d’essai terrestres sont utilisés pour évaluer la fonction d’habitat des sols.

Les acariens représentent un groupe divers d’arthropodes, présent dans le monde entier, appartenant

à la classe des Arachnides, avec plus de 40 000 espèces comptabilisées, divisé en deux super-ordres

(Acariformes et Parasitiformes). En raison de leur taille relativement petite (de quelques micromètres à

quelques centimètres), ils occupent des niches écologiques spécifiques sur les végétaux et dans les sols

(voir Référence [13]).

Chez les acariens terricoles, le rôle de prédation est assuré, par exemple, par Hypoaspis sp. (Laelapidae).

Étant donné qu’ils sont exposés à une contamination chimique, les acariens sont déjà pris en compte

dans l’évaluation des risques environnementaux des pesticides, au titre d’organismes non cibles (voir

Référence [10]). En effet, parmi les données requises pour les substances actives pesticides, les effets sur

les acariens prédateurs sont évalués, à savoir pour l’espèce planticole Typhlodromus pyri (Phytoseiidae)

et l’espèce terricole Hypoaspis aculeifer (Laelapidae) (voir Référence [6]).

Les premiers auteurs à avoir introduit l’espèce H. aculeifer comme organisme d’essai lors d’études

[23][17]

écotoxicologiques ont ensuite proposé un système d’essai à deux espèces dans le cadre du projet

européen SECOFASE (Sublethal Effects of Chemicals on Fauna in the Soil Ecosystem), avec le collembole

Folsomia fimetaria comme proie. Lors de l’élaboration d’un essai écotoxicologique pour l’évaluation

de produits phytopharmaceutiques sur des arthropodes non cibles (voir Références [5], [6]), un autre

protocole relatif aux acariens prédateurs du sol utilisant H. aculeifer a été proposé. Plus récemment, un

protocole d’essai standardisé pour l’évaluation des produits chimiques a été mis au point pour cette

espèce par l’OCDE en 2008 et a été révisé en 2016. Les résultats de l’essai interlaboratoires international

associé ont été publiés dans la Référence [25].

Chez les acariens, le prédateur Hypoaspis aculeifer est l’espèce la plus étudiée en laboratoire. En général,

le critère d’effet lié à la reproduction s’est révélé plus sensible que la mortalité et l’évitement. Comparés

à d’autres invertébrés de la mésofaune du sol, les acariens se sont généralement avérés moins ou aussi

sensibles que d’autres espèces d’essai, selon les critères d’effet et les produits chimiques étudiés.

D’après les études réalisées dans des conditions semi-naturelles, H. aculeifer a été utilisé comme

prédateur supérieur alors que les invertébrés du sol, notamment les collemboles, ont été classés dans

le groupe des herbivores. Dans ces études, les acariens se sont montrés relativement résistants à la

contamination anthropogénique. Cette observation a été corroborée par des études sur le terrain.

Cependant, l’applicabilité des méthodes d’essai de laboratoire relatives à l’évaluation d’échantillons

environnementaux (sols contaminés, déchets, etc.) avec des acariens est soulignée bien que, jusqu’à

présent, un faible nombre d’études soit disponible.

Le présent document décrit une méthode reposant sur la détermination des effets létaux et sublétaux

de sols contaminés sur des acariens prédateurs adultes de l’espèce Hypoaspis aculeifer. Cette espèce est

considérée comme étant représentative des arthropodes prédateurs du sol. Des informations générales

sur l’écologie de ces acariens et leur utilisation dans les essais écotoxicologiques sont disponibles dans

la Référence [14].
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NORME INTERNATIONALE ISO 21285:2019(F)
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de
l'acarien prédateur (Hypoaspis aculeifer) par des
contaminants du sol
1 Domaine d'application

Le présent document décrit une méthode d’essai chronique pour évaluer la fonction d’habitat des sols

et déterminer les effets des contaminants du sol et des substances sur la reproduction de l’espèce

Hypoaspis aculeifer par — principalement — absorption par voie alimentaire. Cette méthode est

applicable aux sols et matériaux du sol de qualité inconnue, par exemple, provenant de sites contaminés,

de sols amendés, de sols ayant fait l’objet d’une remédiation, de sites industriels, agricoles et autres,

et aux déchets (par exemple, matériau de dragage, boue résiduaire des stations d’épuration des eaux

usées, engrais ou fumier, notamment ceux pour épandage éventuel). La reproduction (= nombre de

juvéniles) est le paramètre mesuré au cours de l’essai. L’essai reflète la biodisponibilité d’un mélange

de contaminants dans les sols naturels (sols de sites contaminés) vis-à-vis d’une espèce qui représente

un niveau trophique qui n’est pas couvert par les autres normes ISO. Il n’est pas prévu d’utiliser cet

essai pour remplacer les essais de reproduction vis-à-vis des vers de terre (voir ISO 11268-2) ou des

collemboles (voir ISO 11267) car cette espèce appartient non seulement à un autre groupe trophique,

mais également à un autre groupe taxonomique (= acariens; c’est-à-dire, arachnides) que les autres

espèces utilisées habituellement.

Les effets des substances sont évalués en utilisant un sol standard, de préférence un substrat défini de

sol artificiel. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol à analyser et dans un sol

témoin. Selon l’objectif de l’étude, le substrat témoin et le substrat de dilution (séries de dilutions du sol

contaminé) sont soit un sol non contaminé comparable au sol à analyser (sol de référence), soit un sol

standard (par exemple, sol artificiel).

Le présent document fournit des informations sur la façon d’utiliser cette méthode pour analyser des

échantillons (sols ou substances) dans des conditions tempérées.

Il n’est pas applicable aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/sol est supérieur à 1,

ou aux substances dont la tension de vapeur dépasse 300 Pa à 25 °C.

NOTE La stabilité de la substance d’essai ne peut pas être assurée tout au long de la période d’essai. La

méthode d’essai ne prévoit pas de contrôler la persistance de la substance soumise à essai.

2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les

éventuels amendements).
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH

ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche

(analyse élémentaire)

ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d'échange cationique et du taux de saturation en

bases échangeables à l'aide d'une solution de chlorure de baryum

ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des

sols — Méthode par tamisage et sédimentation
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ISO 21285:2019(F)

ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode

gravimétrique

ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de

sols destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire

3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol du fait de l’activité humaine
3.2
concentration efficace à x %

concentration (fraction massique) d’un échantillon pour essai qui engendre un effet de x % sur un

critère d’effet donné durant une période d’exposition déterminée, par rapport au témoin

EXEMPLE Une CE est une concentration estimée produire un effet de 50 % d’une population exposée sur

un critère d’effet donné durant une période d’exposition déterminée.

Note 1 à l'article: La CEx est exprimée en pourcentage de sol soumis à essai (masse sèche) par mélange de sols

(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CEx est exprimée en masse de substance d’essai

par masse sèche de sol en milligrammes par kilogramme.
3.3
taux efficace

taux d’un sol soumis à essai qui engendre un effet de x % sur un critère d’effet donné durant une période

d’exposition déterminée, par rapport au témoin
3.4
essai limite

essai à une seule concentration comprenant au moins quatre réplicats chacun, le sol soumis à essai sans

dilution ou la concentration maximale de substance d’essai mélangée dans le sol témoin et le témoin

3.5
concentration minimale avec effet observé
CMEO

concentration minimale en substance d’essai ayant un effet statistiquement significatif (probabilité

p < 0,05)

Note 1 à l'article: Dans cet essai, la CMEO est exprimée en masse de substance d’essai par masse sèche de sol

soumis à essai. Il convient que toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO présentent généralement

un effet statistiquement différent du témoin.
3.6
taux minimal avec effet observé
RMEO

taux minimal d’un sol soumis à essai dans un sol témoin pour lequel un effet statistiquement significatif

est observé
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ISO 21285:2019(F)
3.7
concentration sans effet observé
CSEO

concentration maximale en substance d’essai, immédiatement inférieure à la CMEO (3.5), à laquelle

aucun effet n’est observé

Note 1 à l'article: Dans cet essai, la concentration correspondant à la CSEO ne présente aucun effet statistiquement

significatif (probabilité p < 0,05) durant une période d’exposition déterminée, en comparaison avec le témoin.

3.8
taux sans effet observé
RSEO

taux minimal d’un sol soumis à essai, immédiatement inférieur au RMEO (3.6), qui, en comparaison avec

le témoin, ne présente aucun effet statistiquement significatif (probabilité p < 0,05) durant une période

d’exposition déterminée
3.9
sol de référence

sol non contaminé avec des propriétés pédologiques (concentrations en éléments nutritifs, pH, teneur

en carbone organique et texture) comparables à celles du sol étudié
3.10
sol standard

sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les principales propriétés (pH, texture, teneur en matières

organiques) se situent dans une gamme connue
EXEMPLE Euro-sols, sol artificiel, sol LUFA standard de type 2.2.

Note 1 à l'article: Les propriétés des sols standards peuvent différer de celles du sol d’essai.

3.11
sol témoin

sol de référence ou sol standard utilisé comme témoin et comme milieu pour préparer une gamme de

dilution des sols soumis à essai ou d’une substance de référence, qui satisfait aux critères de validité

Note 1 à l'article: Dans le cas d’un sol naturel, il est recommandé de démontrer sa capacité à être utilisé pour un

essai et à remplir les critères de validité de l’essai avant de l’utiliser dans un essai définitif.

3.12
mélange d’essai

mélange d’un sol contaminé ou d’une substance d’essai (par exemple, substance chimique, biosolide,

déchet) avec un sol témoin
3.13
ratio de mélange d’essai
ratio entre le sol soumis à essai et le sol témoin dans un mélange d’essai
4 Principe

Des femelles adultes sont exposées au sol soumis à essai et les effets mesurés sur la reproduction sont

comparés à ceux observés pour des femelles exposées à un sol témoin. Si cela est approprié, les effets

observés sont déterminés sur la base de l’exposition à une gamme de dilutions de sol contaminé et de

sol témoin ou à une gamme de concentrations d’une substance d’essai mélangée dans le sol témoin.

Les mélanges d’essai sont préparés au début de l’essai et ne sont pas renouvelés au cours de la période

d’essai. L’essai commence avec 10 femelles adultes par récipient d’essai. Les mâles ne sont pas inclus

dans l’essai car l’expérience a montré que les femelles s’accouplent dès l’éclosion du stade deutonymphe

ou peu après, dès lors que des mâles sont présents. Étant donné que les femelles sont introduites

dans l’essai environ 7 jours après avoir atteint le stade adulte, on peut considérer qu’elles se sont déjà

accouplées (Annexe A et Annexe E). L’essai se déroule jusqu’à ce que la première larve ait atteint le

ème

stade deutonymphe. À 20 °C, la période d’exposition se termine le 14 jour, après avoir introduit

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les femelles (jour 0), et est suivie de deux jours d’extraction. Le nombre de femelles survivantes et le

nombre de juvéniles par récipient d’essai sont déterminés. Le taux de reproduction des acariens exposés

aux mélanges d’essai est comparé à celui des témoins, afin de déterminer les concentrations sans effet

observé sur la mortalité et la reproduction (RSEO/CSEO) et la concentration entraînant x % de réduction

des juvéniles éclos à partir des œufs en comparaison avec le témoin (RE /CE ), respectivement, selon le

x x
plan d’expérience (voir 7.1.3).

Dans le cas où il n'y a aucune connaissance préalable de la dilution/concentration du sol soumis à essai

ou de la substance d’essai susceptible d’avoir un effet, il est utile d’effectuer cet essai en deux étapes:

— un essai préliminaire sur la reproduction est réalisé pour obtenir une indication de la dilution/

concentration produisant un effet, et de la dilution/concentration ne provoquant pas de mortalité

(RSEO/CSEO). Les dilutions/concentrations à utiliser au cours de l’essai définitif peuvent ensuite

être choisies;

— l’essai définitif sur la reproduction pour déterminer les effets sublétaux de (dilutions de) sols

contaminés ou de la concentration d’une substance qui, lorsqu’elle est uniformément répartie dans

le sol standard, n’a pas d’effet significatif sur le nombre de larves écloses des œufs comparativement

au témoin (RSEO/CSEO), et la concentration minimale produisant un effet (RMEO/CMEO).

L’utilisation d’un sol de référence est une exigence essentielle pour démontrer l’état actuel de la

population d’essai et éviter une mauvaise interprétation des résultats.
5 Réactifs et matériel
5.1 Matériel biologique

Dans cet essai, des acariens femelles Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer adultes (7 jours à 14 jours après

avoir atteint le stade adulte; 28 jours à 35 jours après le début de la ponte lors de la synchronisation)

sont requis pour commencer l’essai. Les acariens doivent être choisis parmi une cohorte synchronisée

(voir Annexe E).
5.2 Mélanges d’essai

5.2.1 Sol ou déchets prélevé(s) sur le terrain Les sols prélevés sur le terrain et utilisés au cours de

l’essai doivent être tamisés à 4 mm (tamis à mailles carrées), pour éliminer les gros fragments, et être

soigneusement mélangés. Si nécessaire, le sol peut être séché à l’air, sans chauffage, avant le tamisage. Il

convient que la conservation du sol soumis à essai soit aussi courte que possible. Le sol doit être conservé

conformément à l’ISO 18400-206 en utilisant des récipients qui réduisent au minimum les pertes de

contaminants du sol par sorption sur les parois des récipients. Si des sols ou des mélanges d’essai ont été

conservés, il convient de les mélanger une nouvelle fois avant de les utiliser. Il convient de ne pas rectifier

le pH du sol car il peut avoir une incidence sur la biodisponibilité des contaminants du sol.

Pour l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées pour

chaque échantillon de sol prélevé sur site:
a) pH conformément à l’ISO 10390;
b) texture (sable, limon ou loam, argile) conformément à l’ISO 11277;
c) teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
d) capacité de rétention d’eau conformément à l’Annexe B;
e) capacité d'échange cationique conformément à l’ISO 11260;
f) carbone organique conformément à l’ISO 10694;
g) pourcentage de matériel éliminé par le tamis de 4 mm.
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Il est important de déterminer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai.

5.2.2 Sol témoin, soit a) un sol de référence soit b) un sol standard permettant la présence d’acariens

prédateurs. Le sol témoin et le sol utilisé pour la dilution ne doivent pas différer l’un de l’autre au cours

d’un essai [soit a) soit b)].

a) Si des sols de référence provenant de zones non contaminées voisines d’un site contaminé sont

disponibles, il convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les sols soumis à

...

Questions, Comments and Discussion

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