ISO 11063:2020
(Main)Soil quality — Direct extraction of soil DNA
Soil quality — Direct extraction of soil DNA
The present document specifies a method for direct extraction of DNA from soil samples to analyse the abundance and composition of microbial communities by various techniques of molecular biology including real-time quantitative PCR (qPCR). This method is mainly dedicated to agricultural and forest soils. This method can possibly not be suitable for soils rich in organic matter (e.g. peat soils) or soils heavily polluted with organic pollutants or heavy metals. The direct extraction of DNA from soil samples provides unique insight into the α- and β-diversity of microbial communities. Next-generation sequencing of amplicons obtained by PCR (polymerase chain reaction) amplification of soil DNA constitutes a promising domain which will in the near future contribute to the development of routine tools to monitor microbial communities in soil environments.
Qualité du sol — Extraction directe de l'ADN du sol
Le présent document spécifie une méthode pour l'extraction directe de l'ADN des échantillons de sol afin d'analyser l'abondance et la composition des communautés microbiennes au moyen de différentes techniques de biologie moléculaire, y compris la PCR quantitative en temps réel (qPCR). Cette méthode est principalement destinée aux sols agricoles et forestiers. Cette méthode peut ne pas être appropriée aux sols riches en matières organiques (par exemple sols de tourbières) ou aux sols très pollués par des polluants organiques ou des métaux lourds. L'extraction directe de l'ADN des échantillons de sol fournit des informations précieuses sur la diversité α et β des communautés microbiennes. Le séquençage de dernière génération des amplicons obtenus par amplification PCR (amplification en chaîne par polymérase) de l'ADN extrait du sol offre des perspectives prometteuses et pourra contribuer, dans un avenir proche, au développement d'outils de routine permettant de surveiller les communautés microbiennes des sols.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11063
Second edition
2020-09
Soil quality — Direct extraction of
soil DNA
Qualité du sol — Extraction directe de l'ADN du sol
Reference number
ISO 11063:2020(E)
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ISO 2020
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ISO 11063:2020(E)
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on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
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ISO 11063:2020(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Test materials . 2
5.1 Soil . 2
5.2 Chemicals . 2
5.3 Buffers and reagents . 3
6 Apparatus . 4
7 Procedures . 4
7.1 Preparation of soil samples . 4
7.2 Mechanical and chemical lyses . 4
7.3 Protein precipitation . 4
7.4 Nucleic acid precipitation and washing . 4
7.5 Nucleic acid storage . 5
8 Estimation of soil DNA quality and quantity . 5
8.1 Soil DNA quality and purity . 5
8.2 Soil DNA quantity . 5
9 Validation of the extraction procedure . 5
10 Test report . 6
Annex A (informative) Differences between ISO 11063:2012 and the revised document for
direct extraction of DNA from soil samples . 7
Annex B (informative) Possible methods to purify soil DNA extracts . 8
Bibliography . 9
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ISO 11063:2020(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: www .iso .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical committee ISO/TC 190/SC 4, Soil quality, Subcommittee SC 4
Biological characterization
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 11063:2012), which has been technically
revised. The main changes compared to the previous edition are as follows (see details in Annex A):
— the amount of soil used (1 g instead of 0,25 g dry mass equivalent);
— the nature and amount of beads (2,5 g of ceramic beads, 2 g of 0,1 mm silica beads and 4 glass beads
instead of 0,5 g of 106 µm glass beads and 2 glass beads);
— the duration of the mechanical lysis (90 s instead of 30 s);
— the salt used to precipitate the proteins (potassium acetate instead of sodium acetate).
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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ISO 11063:2020(E)
Introduction
DNA (deoxyribonucleic acid) is an essential component of any living organism coding for enzymes
responsible for any biological activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from
different matrices, by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that can
be used to sharply distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea and eucaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial soil quality indicators applicable to complex
environments, such as soil, were biased by the unculturability of many microorganisms and the lack of
[1]
sensitivity of traditional microbiological methods. The recent development of numerous molecular
biology methods based primarily on amplification of soil-extracted nucleic acids have provided a
pertinent alternative to classical culture-based microbiological methods, providing unique insight into
[2],[3],[4],[5],[6]
the composition, richness, and structure of microbial communities. DNA-based approaches
are now well-established in soil ecology and serve as genotypic (molecular genetic) markers for
determining microbial diversity.
The results of molecular analyses of soil microbial communities and/or populations rely on two main
parameters:
a) the extraction of DNA representative of the indigenous bacterial community composition;
b) PCR bias, such as the choice of primers, the concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or
[4],[7],[8],[9]
even the method chosen for analysis. Recently, numerous studies have investigated new
[10]
methods to improve extraction, purification, amplification, and quantification of DNA from soils .
The first edition (ISO 11063:2012) described the procedure used to extract DNA directly from soil
samples suitable for the study of the composition of microbial community by both quantitative (q-PCR)
[11]
and qualitative (A-RISA) approaches .
[12]
The aim of this document is to describe a new method recently reported derived from the first
edition procedure to analyse the diversity of soil microorganisms by next-generation sequencing of
ribosomal amplicons generated by polymerase chain reactions (PCR) using soil DNA as template. This
new method was shown to increase the DNA recovery and to better represents the abundance and the
[12]
structure of archaeal and fungal communities as compared to the original method .
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11063:2020(E)
Soil quality — Direct extraction of soil DNA
1 Scope
The present document specifies a method for direct extraction of DNA from soil samples to analyse
the abundance and composition of microbial communities by various techniques of molecular biology
including real-time quantitative PCR (qPCR). This method is mainly dedicated to agricultural and forest
soils. This method can possibly not be suitable for soils rich in organic matter (e.g. peat soils) or soils
heavily polluted with organic pollutants or heavy metals.
The direct extraction of DNA from soil samples provides unique insight into the α- and β-diversity
of microbial communities. Next-generation sequencing of amplicons obtained by PCR (polymerase
chain reaction) amplification of soil DNA constitutes a promising domain which will in the near future
contribute to the development of routine tools to monitor microbial communities in soil environments.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic
conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
soil DNA
DNA extracted from soil-living microorganisms and remaining DNA from dead microorganisms
4 Principle
DNA is directly extracted from 1 g soil samples (dry weight equivalent) using the following extraction
procedure. Soil samples added with an extraction buffer and glass beads are submitted to mechanical
and chemical lyses. The lysis step, e.g. by bead beating, is a crucial step to also extract DNA from
microbes that are difficult to lyse. Samples are then submitted to chemical lysis by incubation at 70 °C
for 30 min. After a brief centrifugation, soil debris are removed, and the supernatant is collected. Part
of it is added with potassium acetate to precipitate proteins. After centrifugation, the supernatant is
recovered, and nucleic acids are precipitated with ice-cold isopropanol. After centrifugation, the nucleic
acids pellet is washed with 70 % ethanol and suspended in sterile ultra-pure water or in TE buffer. DNA
quality is then checked by electrophoresis on an agarose gel and the DNA quantity is estimated using
a fluorometer. A schematic overview of the procedure is given in Figure 1. Differences between the
original (ISO 11063:2012) and this document are listed in a table in the Annex A.
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ISO 11063:2020(E)
Users of the method ought to be aware that although soil submitted to the DNA extraction procedure
is sieved thoroughly (2 mm mesh, procedure described in 5.1), plant residues can still remain in soil
samples and, as a result, traces of plant DNA can contaminate the soil DNA extract.
5 Test materials
5.1 Soil
Soil samples should be collected and sieved (2 mm mesh). If samples are not immediately processed,
they shall be stored for up to two years at −20 °C or up to 10 years at −80 °C or in liquid nitrogen
(−180 °C) as specified in ISO 18400-206. If soil samples are frozen, they may be thawed only once. Some
of these storage conditions are currently under testing.
Figure 1 — Schematic overview of soil DNA extraction procedure
5.2 Chemicals
5.2.1 Tris[hydroxymethyl]aminomethane, C H NO (CAS No. 77-86-1).
4 11 3
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ISO 11063:2
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11063
Deuxième édition
2020-09
Qualité du sol — Extraction directe de
l'ADN du sol
Soil quality — Direct extraction of soil DNA
Numéro de référence
ISO 11063:2020(F)
©
ISO 2020
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ISO 11063:2020(F)
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
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ISO 11063:2020(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Matériel d’essai . 2
5.1 Sol . 2
5.2 Substances chimiques . 3
5.3 Tampons et réactifs . 3
6 Appareillage . 4
7 Modes opératoires . 4
7.1 Préparation des échantillons de sol . 4
7.2 Lyse mécano-chimique . 4
7.3 Précipitation des protéines . 5
7.4 Précipitation et rinçage des acides nucléiques . 5
7.5 Conservation des acides nucléiques . 5
8 Estimation de la qualité et de la quantité d’ADN du sol . 5
8.1 Qualité et pureté de l’ADN du sol . 5
8.2 Quantité d’ADN du sol . 5
9 Validation du mode opératoire d’extraction . 6
10 Rapport d’essai . 6
Annexe A (informative) Différences entre l’ISO 11063:2012 et le document révisé relatif à
l’extraction directe de l’ADN d’échantillons de sol . 7
Annexe B (informative) Méthodes possibles de purification des extraits d’ADN du sol .8
Bibliographie . 9
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ISO 11063:2020(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant : www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190/SC 4, Qualité du sol,
sous-comité SC 4 Caractérisation biologique.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11063:2012), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes (voir l’Annexe A pour
plus de détails) :
— la quantité de sol utilisée (1 g au lieu de 0,25 g équivalent poids sec) ;
— la nature et la quantité de billes (2,5 g de billes de céramique, 2 g de billes de silice de 0,1 mm
et 4 billes de verre au lieu de 0,5 g de billes de verre de 106 µm et de 2 billes de verre) ;
— la durée de la lyse mécanique (90 s au lieu de 30 s) ;
— le sel utilisé pour précipiter les protéines (acétate de potassium au lieu d’acétate de sodium).
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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ISO 11063:2020(F)
Introduction
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est un composant essentiel des organismes vivants codant pour les
enzymes responsables de leurs activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extrait de différentes
matrices biologiques, à l’aide de nombreuses approches moléculaires, permet de fournir des marqueurs
moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents organismes
(bactéries, archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du
sol applicables à des milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de
nombreux micro-organismes et par le manque de sensibilité des méthodes microbiologiques classiques.
[1]
Le développement récent de nombreuses méthodes de biologie moléculaire reposant principalement
sur l’amplification des acides nucléiques extraits du sol a permis de proposer une alternative pertinente
à la microbiologie pasteurienne, pour fournir des informations précieuses sur la composition, la richesse
[2],[3],[4],[5],[6]
et la structure des communautés microbiennes. Les approches reposant sur l’analyse
de l’ADN sont désormais bien établies dans le domaine de l’écologie des sols et servent de marqueurs
génotypiques (marqueurs génétiques) pour la détermination de la diversité microbienne.
Les résultats d’analyses moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes du sol reposent
sur deux paramètres principaux :
a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition de la communauté bactérienne indigène ;
b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des amorces, la concentration en ADN
[4],[7],[8],[9]
amplifié, les erreurs de la PCR ou encore la méthode d’analyse choisie. Récemment, de
nombreuses études ont été menées sur de nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction,
[10]
la purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols.
La première édition (ISO 11063:2012) décrivait le mode opératoire utilisé pour extraire l’ADN
directement des échantillons de sol adaptés à l’étude de la composition de la communauté microbienne
[11]
à l’aide d’approches tant quantitatives (q-PCR) que qualitatives (A-RISA).
[12]
L’objectif du présent document est de décrire une nouvelle méthode récemment rapportée issue
du mode opératoire de la première édition pour analyser la diversité des micro-organismes du sol par
séquençage de dernière génération des amplicons ribosomiques générés par amplification en chaîne
par polymérase (PCR) en utilisant l’ADN du sol comme matrice. Il a été montré que cette nouvelle
méthode augmentait la récupération de l’ADN et représentait mieux l’abondance et la structure des
[12]
communautés fongiques et des archées que la méthode d’origine.
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NORME INTERNATIONALE ISO 11063:2020(F)
Qualité du sol — Extraction directe de l'ADN du sol
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode pour l’extraction directe de l’ADN des échantillons de sol
afin d’analyser l’abondance et la composition des communautés microbiennes au moyen de différentes
techniques de biologie moléculaire, y compris la PCR quantitative en temps réel (qPCR). Cette méthode
est principalement destinée aux sols agricoles et forestiers. Cette méthode peut ne pas être appropriée
aux sols riches en matières organiques (par exemple sols de tourbières) ou aux sols très pollués par des
polluants organiques ou des métaux lourds.
L’extraction directe de l’ADN des échantillons de sol fournit des informations précieuses sur la
diversité α et β des communautés microbiennes. Le séquençage de dernière génération des amplicons
obtenus par amplification PCR (amplification en chaîne par polymérase) de l’ADN extrait du sol offre
des perspectives prometteuses et pourra contribuer, dans un avenir proche, au développement d’outils
de routine permettant de surveiller les communautés microbiennes des sols.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206 : Collecte, manipulation et conservation de
sols destinés à l’évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes :
— ISO Online browsing platform : disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp ;
— IEC Electropedia : disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ .
3.1
ADN du sol
ADN extrait de micro-organismes vivant dans le sol et ADN de micro-organismes morts persistants
4 Principe
L’ADN est directement extrait d’échantillons de sol de 1 g (équivalent poids sec) en appliquant le mode
opératoire d’extraction suivant. Les échantillons de sol mélangés avec un tampon d’extraction et des
billes de verre sont soumis à une lyse mécano-chimique. L’étape de lyse, réalisée par exemple à l’aide d’un
broyeur à billes, est une étape cruciale pour extraire l’ADN, même de micro-organismes difficiles à lyser.
Les échantillons sont ensuite soumis à une lyse chimique par incubation à 70 °C pendant 30 min. Après
une brève centrifugation, les débris de sol sont éliminés et le surnageant est recueilli. Une partie est
mélangée à de l’acétate de potassium pour précipiter les protéines. Après centrifugation, le surnageant
est récupéré et les acides nucléiques sont précipités avec de l’isopropanol froid. Après centrifugation, le
culot d’acides nucléiques est rincé avec de l’éthanol à 70 % et est repris dans de l’eau stérile ultra-pure
ou dans un tampon TE. La qualité de l’ADN est ensuite contrôlée par électrophorèse sur gel d’agarose
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ISO 11063:2020(F)
et la quantité d’ADN est estimée à l’aide d’un fluorimètre. Une représentation schématique du mode
opératoire est donnée à la Figure 1. Les différences entre la version d’origine (ISO 11063:2012) et le
présent document sont répertoriées dans un tableau à l’Annexe A.
L’utilisateur de la méthode doit savoir que, même si le sol soumis au mode opératoire d’extraction de
l’ADN est soigneusement tamisé (mailles de 2 mm, mode opératoire décrit en 5.1), des résidus végétaux
peuvent demeurer dans les échantillons de sol et, de ce fait, l’extrait d’ADN du sol peut être contaminé
par des traces d’ADN végétal.
5 Matériel d’essai
5.1 Sol
Il convient de prélever des échantillons de sol et de les tamiser (mailles de 2 mm). Si les échantillons
ne sont pas immédiatement traités, ils doivent être conservés pendant deux ans maximum à –20 °C
ou pendant 10 ans maximum à –80 °C ou dans de l’azote liquide (–180 °C) comme spécifié dans
l’ISO 18400-206. Si les échantillons de sol sont congelés, ils ne peuvent être décongelés qu’une seule
fois. Certaines de ces conditions de stockage sont actuellement soumises à essai.
Figure 1 — Représentation schématique du mode opératoire d’extraction de l’ADN du sol
2 © ISO 2020 – Tous droits réservés
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ISO 11063:2020(F)
5.2 Substances chimiques
o
5.2.1 Tris[hydroxyméthyl]aminométhane, C H NO (n CAS 77-86-1).
4 11 3
5.2.2 Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), C H N
...
DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 11063
ISO/TC 190/SC 4 Secretariat: AFNOR
Voting begins on: Voting terminates on:
2019-09-03 2019-11-26
Soil quality — Direct extraction of soil DNA (revision of ISO
11063:2012)
Qualité du sol — Extraction directe de l'ADN du sol
ICS: 13.080.30
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This document is circulated as received from the committee secretariat.
FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS
THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
NOT BE REFERRED TO AS AN INTERNATIONAL
STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
USER PURPOSES, DRAFT INTERNATIONAL
STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO
BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
Reference number
NATIONAL REGULATIONS.
ISO/DIS 11063:2019(E)
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED
TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
NOTIFICATION OF ANY RELEVANT PATENT
RIGHTS OF WHICH THEY ARE AWARE AND TO
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PROVIDE SUPPORTING DOCUMENTATION. ISO 2019
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ISO/DIS 11063:2019(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Test materials . 2
5.1 Soil . 2
5.2 Chemicals . 2
5.3 Buffers and reagents . 3
6 Apparatus . 4
7 Procedures . 4
7.1 Preparation of soil samples . 4
7.2 Mechanical and chemical lyses . 4
7.3 Protein precipitation . 4
7.4 Nucleic acid precipitation and washing . 4
7.5 Nucleic acid storage . 5
8 Estimation of soil DNA quality and quantity . 5
8.1 Soil DNA quality and purity . 5
8.2 Soil DNA quantity . 5
9 Validation of the extraction procedure . 5
10 Test report . 6
Annex A (informative) Differences between ISO 11063:2012 and the revised document for
direct extraction of DNA from soil samples . 7
Annex B (informative) Possible methods to purify soil DNA extracts . 8
Bibliography . 9
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ISO/DIS 11063:2019(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: www .iso .org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical committee ISO/TC 190/SC 4, Soil quality, Subcommittee SC 4
Biological characterization
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 11063:2012), which has been technically
revised.
The main changes compared to the previous edition are as follows (see details in Annex A):
— the amount of soil used (1g instead of 0,25 g dry mass equivalent);
— the nature and amount of beads (2,5 g of ceramic beads, 2 g of 0,1 mm silica beads and 4 glass beads
instead of 0,5 g of 106 µm glass beads and 2 glass beads);
— the duration of the mechanical lysis (90 s instead of 30 s);
— the salt used to precipitate the proteins (potassium acetate instead of sodium acetate).
iv © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO/DIS 11063:2019(E)
Introduction
DNA (deoxyribonucleic acid) is an essential component of any living organism coding for enzymes
responsible for any biological activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from
different matrices, by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that can
be used to sharply distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea and eucaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial soil quality indicators applicable to complex
environments, such as soil, were biased by the unculturability of many microorganisms and the lack of
[1]
sensitivity of traditional microbiological methods. The recent development of numerous molecular
biology methods based primarily on amplification of soil-extracted nucleic acids have provided a
pertinent alternative to classical culture-based microbiological methods, providing unique insight into
[2] [3] [4] [5] [6]
the composition, richness, and structure of microbial communities. , , , , DNA-based approaches
are now well-established in soil ecology and serve as genotypic (molecular genetic) markers for
determining microbial diversity.
The results of molecular analyses of soil microbial communities and/or populations rely on two main
parameters:
a) the extraction of DNA representative of the indigenous bacterial community composition;
b) PCR bias, such as the choice of primers, the concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or
[4],[7],[8],[9]
even the method chosen for analysis. Recently, numerous studies have investigated new
[10]
methods to improve extraction, purification, amplification, and quantification of DNA from soils .
The first edition (ISO 11063:2012) described the procedure used to extract DNA directly from soil
samples suitable for the study of the composition of microbial community by both quantitative (q-PCR)
[11]
and qualitative (A-RISA) approaches .
[12]
The aim of the present document (ISO 11063:20XX) is to describe a new method recently reported
derived from the first edition procedure to analyse the diversity of soil microorganisms by
next-generation sequencing of ribosomal amplicons generated by polymerase chain reactions (PCR)
using soil DNA as template. This new method was shown to increase the DNA recovery and to better
represents the abundance and the structure of archaeal and fungal communities as compared to the
original method (Plassart et al., 2012).
© ISO 2019 – All rights reserved v
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DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 11063:2019(E)
Soil quality — Direct extraction of soil DNA (revision of ISO
11063:2012)
1 Scope
The present document specifies a method for direct extraction of DNA from soil samples to analyse
the abundance and composition of microbial communities by various techniques of molecular biology
including real-time quantitative PCR (qPCR). This method is mainly dedicated to agricultural and forest
soils. This method can possibly not be suitable for soils rich in organic matter (e.g. peat soils) or soils
heavily polluted with organic pollutants or heavy metals.
The direct extraction of DNA from soil samples provides unique insight into the α- and β-diversity
of microbial communities. Next-generation sequencing of amplicons obtained by PCR (polymerase
chain reaction) amplification of soil DNA constitutes a promising domain which will in the near future
contribute to the development of routine tools to monitor microbial communities in soil environments.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic
conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at http: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
soil DNA
DNA extracted from soil-living microorganisms and remaining DNA from dead microorganisms
4 Principle
DNA is directly extracted from 1 g soil samples (dry weight equivalent) using the following extraction
procedure. Soil samples added with an extraction buffer and glass beads are submitted to mechanical
and chemical lyses. The lysis step, e.g. by bead beating, is a crucial step to also extract DNA from
microbes that are difficult to lyse. Samples are then submitted to chemical lysis by incubation at 70 °C
for 30 min. After a brief centrifugation, soil debris are removed and the supernatant is collected. Part
of it is added with potassium acetate to precipitate proteins. After centrifugation, the supernatant
is recovered and nucleic acids are precipitated with ice-cold isopropanol. After centrifugation, the
nucleic acids pellet is washed with 70 % ethanol and suspended in sterile ultra-pure water or in 1 x
TE buffer. DNA quality is then checked by electrophoresis on an agarose gel and the DNA quantity is
estimated using a spectro-fluorimeter. A schematic overview of the procedure is given in Figure 1.
Differences betwee
...
PROJET DE NORME INTERNATIONALE
ISO/DIS 11063
ISO/TC 190/SC 4 Secrétariat: AFNOR
Début de vote: Vote clos le:
2019-09-03 2019-11-26
Qualité du sol — Extraction directe de l'ADN du sol
(révision de l’ISO 11063:2012)
Soil quality — Direct extraction of soil DNA (revision of ISO 11063:2012)
ICS: 13.080.30
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR
OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC
SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
Le présent document est distribué tel qu’il est parvenu du secrétariat du comité.
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE
AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES
FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR
POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES
POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
Numéro de référence
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
ISO/DIS 11063:2019(F)
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
©
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE. ISO 2019
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ISO/DIS 11063:2019(F)
ISO/DIS 11063:2019(F)
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction . v
1 Domaine d’application .1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions .1
4 Principe .2
5 Matériel d’essai.2
5.1 Sol .2
5.2 Substances chimiques .3
5.3 Tampons et réactifs .4
6 Appareillage .5
7 Modes opératoires.5
7.1 Préparation des échantillons de sol.5
7.2 Lyse mécano-chimique .5
7.3 Précipitation des protéines.5
7.4 Précipitation et rinçage des acides nucléiques .5
7.5 Conservation des acides nucléiques .5
8 Estimation de la qualité et de la quantité d’ADN du sol .6
8.1 Qualité et pureté de l’ADN du sol .6
8.2 Quantité d’ADN du sol .6
9 Validation du mode opératoire d’extraction .6
10 Rapport d’essai .7
Annexe A (informative) Différences entre l’ISO 11063:2012 et le document révisé relatif à
l’extraction directe de l’ADN d’échantillons de sol .8
Annexe B (informative) Méthodes possibles de purification des extraits d’ADN du sol .9
Bibliographie . 10
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2019
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en oeuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Tél.: +41 22 749 01 11
Fax: +41 22 749 09 47
E-mail: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
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iii
Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 11063:2019(F)
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction . v
1 Domaine d’application .1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions .1
4 Principe .2
5 Matériel d’essai.2
5.1 Sol .2
5.2 Substances chimiques .3
5.3 Tampons et réactifs .4
6 Appareillage .5
7 Modes opératoires.5
7.1 Préparation des échantillons de sol.5
7.2 Lyse mécano-chimique .5
7.3 Précipitation des protéines.5
7.4 Précipitation et rinçage des acides nucléiques .5
7.5 Conservation des acides nucléiques .5
8 Estimation de la qualité et de la quantité d’ADN du sol .6
8.1 Qualité et pureté de l’ADN du sol .6
8.2 Quantité d’ADN du sol .6
9 Validation du mode opératoire d’extraction .6
10 Rapport d’essai .7
Annexe A (informative) Différences entre l’ISO 11063:2012 et le document révisé relatif à
l’extraction directe de l’ADN d’échantillons de sol .8
Annexe B (informative) Méthodes possibles de purification des extraits d’ADN du sol .9
Bibliographie . 10
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ISO/DIS 11063:2019(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le
droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant : www.iso.org/iso/fr/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190/SC 4, Qualité du sol,
sous-comité SC 4, Caractérisation biologique.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11063:2012), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes (voir les détails à
l’Annexe A) :
— la quantité de sol utilisée (1 g au lieu de 0,25 g équivalent poids sec) ;
— la nature et la quantité de billes (2,5 g de billes de céramique, 2 g de billes de silice de 0,1 mm et
4 billes de verre au lieu de 0,5 g de billes de verre de 106 µm et de 2 billes de verre) ;
— la durée de la lyse mécanique (90 s au lieu de 30 s) ;
— le sel utilisé pour précipiter les protéines (acétate de potassium au lieu d’acétate de sodium).
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iv
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ISO/DIS 11063:2019(F)
Introduction
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est un composant essentiel des organismes vivants codant pour les
enzymes responsables de leurs activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extrait de différentes
matrices biologiques, à l’aide de nombreuses approches moléculaires, permet de fournir des marqueurs
moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents organismes
(bactéries, archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du
sol applicables à des milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de
nombreux micro-organismes et par le manque de sensibilité des méthodes microbiologiques
[1]
classiques. Le développement récent de nombreuses méthodes de biologie moléculaire reposant
principalement sur l’amplification des acides nucléiques extraits du sol a permis de proposer une
alternative pertinente à la microbiologie pasteurienne, pour fournir des informations précieuses sur la
[2] [3] [4] [5] [6]
composition, la richesse et la structure des communautés microbiennes , , , , Les approches
reposant sur l’analyse de l’ADN sont désormais bien établies dans le domaine de l’écologie des sols et
servent de marqueurs génotypiques (marqueurs génétiques) pour la détermination de la diversité
microbienne.
Les résultats d’analyses moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes du sol
reposent sur deux paramètres principaux :
a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition de la communauté bactérienne indigène ;
b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des amorces, la concentration en ADN amplifié,
[4],[7],[8],[9]
les erreurs de la PCR ou encore la méthode d’analyse choisie . Récemment, de nombreuses
études ont été menées sur de nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction, la
[10]
purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols .
La première édition (ISO 11063:2012) décrivait le mode opératoire utilisé pour extraire l’ADN
directement des échantillons de sol adaptés à l’étude de la composition de la communauté microbienne
[11]
à l’aide d’approches tant quantitatives (q-PCR) que qualitatives (A-RISA) .
L’objectif du présent document (ISO 11063:20XX) est de décrire une nouvelle méthode récemment
[12]
rapportée issue du mode opératoire de la première édition pour analyser la diversité des micro-
organismes du sol par séquençage de dernière génération des amplicons ribosomiques générés par
amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant l’ADN du sol comme matrice. Il a été montré
que cette nouvelle méthode augmentait la récupération de l’ADN et représentait mieux l’abondance et
la structure des communautés fongiques et des archées que la méthode d’origine (Plassart et al., 2012).
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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 11063:2019(F)
Qualité du sol — Extraction directe de l’ADN du sol
(révision de l’ISO 11063:2012)
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode pour l’extraction directe de l’ADN des échantillons de sol
afin d’analyser l’abondance et la composition des communautés microbiennes au moyen de différentes
techniques de biologie moléculaire, y compris la PCR quantitative en temps réel (qPCR). Cette méthode
est principalement destinée aux sols agricoles et forestiers. Cette méthode peut ne pas être appropriée
aux sols riches en matières organiques (par exemple sols de tourbières) ou aux sols très pollués par des
polluants organiques ou des métaux lourds.
L’extraction directe de l’ADN des échantillons de sol fournit des informations précieuses sur la diversité
α et β des communautés microbiennes. Le séquençage de dernière génération des amplicons obtenus
par amplification PCR (amplification en chaîne par polymérase) de l’ADN extrait du sol offre des
perspectives prometteuses et pourra contribuer, dans un avenir proche, au développement d’outils de
routine permettant de surveiller les communautés microbiennes des sols.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206 : Collecte, manipulation et conservation
de sols destinés à l’évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes :
— ISO Online browsing platform : disponible à l’adresse http://www.iso.org/obp ;
— IEC Electropedia : disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/.
3.1
ADN du sol
ADN extrait de micro-organismes vivant dans le sol et ADN de micro-organisme
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.