ISO/TR 6579-3:2014
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 3: Guidelines for serotyping of Salmonella spp.
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 3: Guidelines for serotyping of Salmonella spp.
ISO/TR 6579-3:2014 gives guidance on the procedure for serotyping Salmonella serovars and is applicable to the serotyping of pure cultures of Salmonella spp., independent of the source from which they are isolated.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche, le dénombrement et le sérotypage des Salmonella — Partie 3: Lignes directrices pour le sérotypage des Salmonella spp.
ISO/TR 6579-3:2014 donne des recommandations relatives au mode opératoire de sérotypage des Salmonella. Il s'applique aux cultures pures de Salmonella spp. indépendamment de l'origine de l'isolement.
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TECHNICAL ISO/TR
REPORT 6579-3
First edition
2014-07-15
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection,
enumeration and serotyping of
Salmonella —
Part 3:
Guidelines for serotyping of
Salmonella spp.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche, le dénombrement et la sérotypie des Salmonella —
Partie 3: Lignes directrices pour la sérotypie des Salmonella spp.
Reference number
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ISO 2014
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ISO/TR 6579-3:2014(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Culture media and sera . 2
5.1 General . 2
5.2 Culture media and reagents . 2
5.3 Antisera . 2
6 Apparatus . 2
7 Sample . 3
8 Taxonomy of Salmonella . 3
8.1 General . 3
8.2 Nomenclature. 3
8.3 Biochemical characteristics . 4
8.4 Antigenic characteristics . 5
9 Procedure for Salmonella serotyping . 7
9.1 General . 7
9.2 Example procedure for serotyping five public health-related Salmonella serovars . 7
10 Quality control .11
11 Reporting .11
Annex A (informative) Composition and preparation of culture media and reagents .13
Annex B (informative) Examples of procedures for serotyping an unknown Salmonella isolate .20
Annex C (informative) Biochemical tests .24
Annex D (informative) Schematic overview for serotyping five important public-health related
Salmonella serovars .26
Annex E (informative) Microtitre plate method for serotyping Salmonella spp.27
Annex F (informative) Examples of procedures for phase inversion .29
Bibliography .32
© ISO 2014 – All rights reserved iii
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ISO/TR 6579-3:2014(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any
patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on
the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
ISO 6579 consists of the following parts, under the general title Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella:
1)
— Part 1: Horizontal method for the detection of Salmonella spp.
2)
— Part 2: Enumeration by a miniaturized most probable number technique [Technical Specification]
— Part 3: Guidelines for serotyping of Salmonella spp. [Technical Report]
1) Under preparation. (Revision of ISO 6579:2002)
2) The main element of the series title has been changed since Part 2 was published. It is intended that upon
revision, the main element of the title will be aligned with Part 3.
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ISO/TR 6579-3:2014(E)
Introduction
This part of ISO 6579 gives information on the taxonomy of Salmonella spp. and it gives guidance on
serotyping of Salmonella serovars, based on the White–Kauffmann–Le Minor scheme (see Reference [9]).
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TECHNICAL REPORT ISO/TR 6579-3:2014(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method
for the detection, enumeration and serotyping of
Salmonella —
Part 3:
Guidelines for serotyping of Salmonella spp.
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
detecting and typing Salmonella, be undertaken only in properly equipped laboratories, under
the control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the disposal of all incubated
materials.
IMPORTANT — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety aspects, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
1 Scope
This part of ISO 6579 gives guidance on the procedure for serotyping Salmonella serovars and is
applicable to the serotyping of pure cultures of Salmonella spp., independent of the source from which
they are isolated.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6579-1, Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and
serotyping of Salmonella — Part 1: Horizontal method for the detection of Salmonella spp.
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and performance
testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Salmonella
gram-negative, oxidase-negative, facultatively anaerobic, non-spore-forming, rod-shaped bacteria which
generally form colonies of 2 mm to 4 mm in diameter on solid selective media and display biochemical
and serological characteristics described when tests are carried out in accordance with this part of
ISO 6579
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ISO/TR 6579-3:2014(E)
3.2
serotyping of Salmonella
determination of the presence or absence of specific O-antigens, H-antigens and Vi-antigens in an isolate
confirmed as Salmonella (3.1)
3.3
antigenic formula
combination of numbers and letters representing the O-, H-, and Vi-antigens of an isolate confirmed as
Salmonella (3.1)
4 Principle
For the serotyping of Salmonella spp. the following antigens are determined for isolates biochemically
confirmed as Salmonella spp.:
O-antigens, H-antigens and Vi-antigens.
NOTE Alternative procedures can be used to confirm the isolate being Salmonella spp. provided the suitability
of the alternative procedure is verified (see ISO 7218).
5 Culture media and sera
5.1 General
For current laboratory practice, apply ISO 7218.
For the performance testing of media, follow the recommendations of ISO 11133.
5.2 Culture media and reagents
See Annex A.
5.3 Antisera
O-antisera, H-antisera and Vi-antisera are available from various commercial suppliers. Information on
relevant polyvalent antisera and monovalent antisera can be found in Annex B.
6 Apparatus
Disposable supplies are an acceptable alternative to reusable glassware if they have similar specifications.
Usual microbiological laboratory equipment and, in particular, the following.
6.1 Incubator, to grow Salmonella isolates, capable of operating in the range 34 °C to 38 °C.
NOTE In this part of ISO 6579, the incubation temperature is not a differential parameter. Isolates are
cultured to obtain sufficient material to perform the tests on a pure culture. Therefore, culture step is performed
at an optimal growth temperature. For Salmonella this is generally a temperature between 34 °C and 38 °C.
6.2 Oven (for dry sterilization) or autoclave (for wet sterilization). See ISO 7218.
6.3 Refrigerator (for storage of prepared media), capable of operating at 5 °C ± 3 °C.
6.4 Glass slides.
6.5 Sterile inoculation instrument, e.g. needles, wires, wooden sticks, loops (e.g. of 1 µl).
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6.6 Sterile test tubes and flasks, of appropriate capacity. Flasks or bottles and test tubes with non-
toxic metallic or plastic (screw) caps may be used.
6.7 Sterile Petri dishes, with diameters of approximately 55 mm and 90 mm.
6.8 Water bath, capable of operating at 47-50 °C.
6.9 Water bath (or incubator), capable of operating at 50 °C ± 2 °C.
7 Sample
It is important that the laboratory works with a pure culture which has been biochemically confirmed
as Salmonella spp.
8 Taxonomy of Salmonella
8.1 General
Approximately every 7 years, the WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella
(Institut Pasteur, Paris) publishes an update of the “Antigenic formulae of the Salmonella serovars”,
which is the basis for assigning serovar names and formulas to isolates of Salmonella spp. At the time of
publication, the latest version of the White–Kauffmann–Le Minor scheme is that of 2007 (Reference [9]).
NOTE Supplements to the White-Kauffmann-Le Minor scheme are published in Research in Microbiology,
a publication of the Institut Pasteur (formerly called Annales de l’Institut Pasteur/Microbiologie). For instance,
supplement no. 47 was published in 2010 and characterises new serovars found between 2003 and 2007
(Reference [10]).
This part of ISO 6579 provides guidance on the serotyping of Salmonella serovars.
8.2 Nomenclature
Different nomenclatures have been used (or are still in use) for Salmonella strains:
— originally, Kauffmann (Reference [12]) considered each Salmonella serovar as a separate species;
— different type species have been used: S. enterica vs. S. choleraesuis, each having another type strain;
— some “important” Salmonella strains (like Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi) were
considered to be species and not being “only” serovars of a species.
The Judicial Commission of the International Committee on Systematics of Procaryotes indicated that
many synonyms can be used in Salmonella nomenclature (Reference [22]). In this part of ISO 6579,
the widely accepted current nomenclature is used, which is also approved by the WHO Collaborating
Centre for Reference and Research on Salmonella (Reference [9]), the American Society for Microbiology
(Reference [20]), the Centers for Disease Control and Prevention (Reference [3]) and Bergey’s manual
(Reference [17]). According to the current nomenclature, the genus Salmonella belongs to the family
of Enterobacteriaceae and consists of only two species: S. enterica and S. bongori. S. enterica is divided
into six subspecies: S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S.
enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, and S. enterica subsp. indica.
Salmonella serovars belonging to S. enterica subsp. enterica are isolated most frequently (more than
99,5 % of isolated Salmonella strains) and they are designated by a name, usually related to the
geographical place where the serovar was first isolated. Serovars belonging to other subspecies of
S. enterica and those of S. bongori are designated by their antigenic formula.
Due to combinations of subspecies and many serovars, the full names are long (e.g. Salmonella enterica
subsp. enterica serovar Typhimurium). It has therefore generally been accepted to use a shorter
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way to indicate the names of the serovars of subspecies enterica. The White–Kauffmann–Le Minor
scheme suggests the following shortened names: S. enterica serovar Typhimurium or Salmonella ser.
Typhimurium. According to Reference [3], at the first citation of a serovar in a text the genus name
should be given followed by the word “serovar” or the abbreviated term “ser”. and then the serovar
name. Subsequently, the name may be written with the genus followed directly by the serovar name (e.g.
Salmonella Typhimurium). This way of indicating Salmonella serovars is also accepted in the majority of
journals [e.g. journals of the American Society for Microbiology (ASM)] and is also used in this part of
ISO 6579.
In summary, the nomenclature of Salmonella:
family: Enterobacteriaceae (first letter capitalized, italicized)
genus: Salmonella (first letter capitalized, italicized)
species: enterica (not capitalized, italicized)
subspecies: enterica (not capitalized, italicized)
serovar (serotype or ser.): e.g. Typhimurium (first letter capitalized, not italicized)
subspecies: salamae
arizonae
diarizonae
houtenae
indica
species: bongori
In the 47th Supplement to the White–Kauffmann–Le Minor scheme (Reference [10]) more than 2600
Salmonella serovars are mentioned and the numbers increase regularly, as summarized in Table 1.
Table 1 — Number of Salmonella serovars through the years
Supplement
a b c
Species/subspecies 1998 2001 2007
Number of serovars
Salmonella enterica 2 443 2 502 2 587
subsp. enterica 1 454 1 492 1 547
subsp. salamae 489 500 513
subsp. arizonae 94 95 100
subsp. diarizonae 324 331 341
subsp. houtenae 70 71 73
subsp. indica 12 13 13
Salmonella bongori 20 21 23
Total no. of serovars (genus Salmonella) 2 463 2 523 2 610
a
Reference [18].
b
Reference [19].
c
Reference [10], covering 2003–2007.
8.3 Biochemical characteristics
The Salmonella species and subspecies are identified based on different biochemical tests. In Table 2, the
differential characteristics are listed. See Reference [9] and Annex C for further details.
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Table 2 — Biochemical characteristics of Salmonella species and subspecies (Reference [9])
Species S. enterica
S. bongori
Subspecies enterica salamae arizonae diarizonae houtenae indica
Dulcitol + + − − − d +
a
ONPG (2 h) − − + + − d +
Malonate − + + + − − −
Gelatinase − + + + + + −
Sorbitol + + + + + − +
b
Growth with KCN − − − − + − +
c
l(+)-tartrate + − − − − − −
Galacturonate − + − + + + +
e
γ-Glutamyltransferase + + − + + + +
β-Glucuronidase d d − + − d −
Mucate + + + − (70 %) − + +
Salicin − − − − + − −
Lactose − − − (75 %) + (75 %)+ − d −
Lysis by phage O1 + + − + − + d
+ = 90 % or more positive reaction
− = 90 % or more negative reaction
d = different reactions given by different serovars
a
o-Nitrophenyl-β-d-galactopyranoside (test for β-galactosidase).
b
Potassium cyanide.
c
= d-Tartrate, Paratyphi B: −, Paratyphi B biovar Java: +
e
= Typhimurium: d, Dublin: −.
8.4 Antigenic characteristics
8.4.1 General
The important antigenic characteristics of Salmonella for serological tests are divided into three main
types, being:
— the O-antigen, also called the somatic antigen;
— the H-antigen, also called the flagellar antigen;
— the Vi-antigen, also called the capsular antigen.
The antigenic formula of Salmonella spp. exists of these three types of antigens, reported in the following
way: O-antigens, Vi-antigen (if present): H-antigens of first phase: H-antigens of second phase. For
instance, the antigenic formula of Salmonella Paratyphi C is: 6,7,[Vi]:c:1,5; with O-antigens O:6 and O:7;
with the Vi-antigen, which can be present or absent (indicated by the square brackets); with H-antigen
H:c for the first phase; with H-antigens H:1 and H:5 for the second phase.
8.4.2 The O-antigen (somatic antigen)
This antigen consists of a cell wall component and the main substances are polysaccharide, protein,
and phospholipid. The O-antigen is very robust and can resist temperatures up to 100 °C for 150 min,
treatment with 95 % volume fraction ethanol or dilute acid (Reference [16]).
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ISO/TR 6579-3:2014(E)
The reaction of the O-antigen with antisera results in granular agglutination. Historically, the O-antigens
were classified in individual O-antigen groups in the Kauffmann–White scheme (Reference [9]). The
groups were named with Roman letters beginning with group A, which include antigen O:2, up to group
Z which contain antigen O:50. As there were more O-antigens than letters, the remaining antigens were
not given as group, but were named by the O-antigens O:51 to O:67. Nowadays it is preferred to designate
each O-group using the characteristic O-factor. The letters have been kept and are shown inside brackets,
e.g. O:4 (B) (Reference [9]). In Table 3, the old and new designations are summarized.
Table 3 — Salmonella serogroups (old designation) and relevant O-antigens (new designation)
Group O-antigen Group O-antigen Group O-antigen
A 2 G -G 13 Q 39
1 2
B 4 H 6,14 R 40
a
C (, C ) 6,7 I 16 S 41
1 4
C , C 8 J 17 T 42
2 3
D 9 K 18 U 43
1
D 9,46 L 21 V 44
2
D 9,46,27 M 28 W 45
3
b
E (, E , E ) 3,10 N 30 X 47
1 2 3
E 1,3,19 O 35 Y 48
4
F 11 P 38 Z 50
a
C has been merged into C
4 1.
b
E and E have been merged into E
2 3 1.
8.4.3 The H-antigen (flagellar antigen)
This antigen is located on the flagellum and the main component is protein. It is less robust than
O-antigens. It can easily be decomposed by alcohol, acid, and temperature above 60 °C, but it is resistant
to a formalin solution with a volume fraction of 0,5 % (Reference [16]).
The reaction of the H-antigen with antisera results in floccular agglutination. Many Salmonella spp.
possess two phases of the H-antigen, but monophasic and triphasic variants are also known. The first
phase is called the specific phase and the second phase is called the non-specific phase. The first phase
is indicated by a lower case letter, a to z. However, since the identification of the z-antigen, many new
H-antigens have been detected and are named z , z , z . z
1 2 3 91.
Examples of monophasic serovars are:
— Salmonella Paratyphi A: 1,2,12:a:[1,5]; with H:a for the first phase and where the square brackets
indicate that the second phase (H:1,5) can be present or absent;
— Salmonella Typhi: 9,12,[Vi]:d:-; with H:d for the first phase;
— Salmonella Derby: 1,4,[5],12:f,g:[1,2]; with H:f,g for the first phase and where the second phase
(H:1,2) can be present or absent;
— Salmonella Enteritidis: 1,9,12: g,m:-; with H:g,m for the first phase. In addition to factors H:g,m, some
strains may have factor H:p, or H:f, or H:t. Exceptional strains can have antigen H:1,7 as second
phase;
— Salmonella Dublin: 1,9,12,[Vi]:g,p:-; with H:g,p for the first phase.
NOTE 1 Underlined O-factors are determined by phage conversion. They are only present if the culture is
lysogenized by the corresponding converting phage (Reference [9]).
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NOTE 2 O- or H-factors indicated in square brackets can be present or absent, without relation to phage
conversion (Reference [9]).
NOTE 3 Diphasic strains of Salmonella Derby and Salmonella Enteritidis are very rare. It is possible that phase
inversion is required to detect these rare strains. However, this is only necessary for certain (special) cases (e.g.
in case of deviating sources and/or in the case of (special) travel-related cases).
8.4.4 Vi-antigen (capsular antigen)
This antigen is a surface (capsular) antigen and can mask the O-antigens so that the bacteria are not
agglutinated with O-antisera. The main component of the Vi-antigen is polysaccharide. The Salmonella
strains which possess a Vi-antigen are more virulent than the strains without Vi-antigen. The Vi-antigen
can be present in only three Salmonella serovars:
— Salmonella Typhi : 9,12,[Vi]:d:-;
— Salmonella Paratyphi C : 6,7,[Vi]:c:1,5;
— Salmonella Dublin: 1,9,12,[Vi]:g,p:-.
The square brackets indicate that the Vi-antigen can be present or absent.
NOTE The presence of Vi-antigens in Salmonella isolates from food or veterinary samples is very rare. If Vi is
present, it masks the detection of O-antigens. To detect the O-antigens, it can prove necessary to heat a suspension
of the isolate (e.g. in physiological saline solution) at 100 °C for 60 min, or at 120 °C for 15 min.
9 Procedure for Salmonella serotyping
9.1 General
Before starting the serotyping, it is important to confirm biochemically that the isolate belongs to
the genus Salmonella (as specified in ISO 6579-1). Although the H-antigens are specific for Salmonella,
several O-antigens are common in different genera of the Enterobacteriaceae (e.g. Salmonella, Citrobacter,
Hafnia).
NOTE Alternative procedures can be used to confirm that the isolate belongs to the genus Salmonella.
provided the suitability of the alternative procedure is verified (see ISO 7218).
Each supplier of antisera produces its own sets of antisera, with its own unique instructions for use. It
is therefore not possible to provide here one general set of instructions for serotyping, as it is always
important to follow the instructions of the supplier to obtain optimal results. Some manufacturers
supply pools of antisera (mixtures of several O-antisera or H-antisera), which are very useful at the
beginning of serotyping an unknown type. When the strain agglutinates with an antisera pool, it can be
further tested with group antisera and/or single factor antisera relevant to the positive pool. When the
focus is on typing only certain serovars and it is sufficient to indicate the other serovars as Salmonella
spp., the agglutination can immediately be performed with only the specific monofactor antisera of the
relevant serovars.
In Annex B, the general procedure is given for serotyping an unknown Salmonella isolate.
9.2 Example procedure for serotyping five public health-related Salmonella serovars
9.2.1 General
In the following example, the procedure is described for serotyping five important public health-related
Salmonella serovars (see Annex D). In Table 4 these strains are shown with their antigenic formula.
In the following sections, slide agglutination of Salmonella isolates is described, which is the procedure
most often performed. However, others also exist, such as the microtitre plate method (see Annex E).
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ISO/TR 6579-3:2014(E)
Table 4 — Antigenic formula of five important public health-related Salmonella serovars
H-antigens
b
Name O-antigens
phase I phase II
Salmonella Typhimurium 1,4,[5]12 i 1,2
a
Salmonella Enteritidis 1,9,12 g,m -
Salmonella Infantis 6,7,14 r 1,5
Salmonella Virchow 6,7,14 r 1,2
Salmonella Hadar 6,8 z e,n,x
10
a
In addition to factors H:g,m, some strains may have factor H:p or H:f or H:t. Exceptional strains can have antigen H:1,7 as
second phase (Reference [9]).
b
Underlined O factors are determined by phage conversion. They are present only if the culture is lysogenized by the
corresponding converting phage (Reference [9]).
9.2.2 Selection of a colony suspected for Salmonella
Culture a colony from a pure culture which is suspected to be Salmonella according to the biochemical
characterization. Use the culture media and methods as prescribed by the manufacturer of the antisera
used. If no information is given, a non-selective agar medium like nutrient agar (e.g. see A.2) can be used.
Incubate the in
...
RAPPORT ISO/TR
TECHNIQUE 6579-3
Première édition
2014-07-15
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche, le dénombrement
et le sérotypage des Salmonella —
Partie 3:
Lignes directrices pour le sérotypage
des Salmonella spp.
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection, enumeration and serotyping of Salmonella —
Part 3: Guidelines for serotyping of Salmonella spp.
Numéro de référence
ISO/TR 6579-3:2014(F)
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ISO 2014
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Milieux de culture et sérums . 2
5.1 Généralités . 2
5.2 Milieux de culture et réactifs . 2
5.3 Sérums . . 2
6 Appareillage . 2
7 Échantillon . 3
8 Taxonomie de Salmonella . 3
8.1 Généralités . 3
8.2 Nomenclature. 3
8.3 Caractéristiques biochimiques . 5
8.4 Caractéristiques antigéniques . 6
9 Mode opératoire pour le sérotypage des Salmonella . 8
9.1 Généralités . 8
9.2 Exemple de mode opératoire pour le sérotypage des cinq sérovars de Salmonella
d’importance en santé publique . 9
10 Contrôle de la qualité .12
11 Rapport d’essai .13
Annexe A (informative) Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs.14
Annexe B (informative) Exemples de modes opératoires pour le sérotypage d’un isolat de
Salmonella de sérovar inconnu .22
Annexe C (informative) Essais biochimiques .26
Annexe D (informative) Aperçu schématique pour le sérotypage des cinq sérovars de Salmonella
d’importance en santé publique .28
Annexe E (informative) Méthode des plaques de microtitrage pour le sérotypage de Salmonella
spp. .29
Annexe F (informative) Exemples de modes opératoires pour l’inversion de phase .31
Bibliographie .34
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ISO/TR 6579-3:2014(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie.
L’ISO 6579 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des aliments —
Méthode horizontale pour la recherche, le dénombrement et le sérotypage des Salmonella:
1)
— Partie 1: Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp.
— Partie 2: Dénombrement par une technique miniaturisée du nombre le plus probable [Spécification
2)
technique]
— Partie 3: Lignes directrices pour le sérotypage des Salmonella spp. [Rapport technique]
1) En cours d’élaboration. (Révision de l’ISO 6579:2002)
2) L’élément principal du titre de la série a été modifié depuis la publication de la Partie 2. Il est envisagé d’aligner
l’élément principal du titre avec la Partie 3 après révision.
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ISO/TR 6579-3:2014(F)
Introduction
La présente partie de l’ISO 6579 concerne la taxonomie des Salmonella spp. et donne des recommandations
pour le sérotypage des sérovars de Salmonella, d’après le schéma White–Kauffmann–Le Minor (voir
Référence [9]).
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RAPPORT TECHNIQUE ISO/TR 6579-3:2014(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche, le dénombrement et le
sérotypage des Salmonella —
Partie 3:
Lignes directrices pour le sérotypage des Salmonella spp.
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel
d’effectuer les essais de recherche de Salmonella uniquement dans des laboratoires correctement
équipés, sous la direction d’un microbiologiste compétent, et de faire très attention à l’élimination
de toutes les substances incubées.
IMPORTANT — Il convient que les personnes qui utilisent le présent document soient familiarisées
avec les bonnes pratiques de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous
les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur
d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité, et de s’assurer de leur
conformité à la réglementation nationale en vigueur.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 6579 donne des recommandations relatives au mode opératoire de sérotypage
des Salmonella. Il s’applique aux cultures pures de Salmonella spp. indépendamment de l’origine de
l’isolement.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6579-1, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche, le
dénombrement et la sérotypie des Salmonella spp. — Partie 1: Méthode horizontale pour la recherche des
Salmonella spp.
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
Salmonella
bactéries allongées Gram négative, oxydase négative, anaérobie facultatives non sporulées qui forment
généralement des colonies de 2 mm à 4 mm de diamètre sur des milieux sélectifs solides et possédant les
caractéristiques biochimiques et sérologiques décrites lorsque les tests sont réalisés selon la présente
partie de l’ISO 6579
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ISO/TR 6579-3:2014(F)
3.2
sérotypage de Salmonella
détermination de la présence ou de l’absence d’antigènes « O », d’antigènes « H » et d’antigènes « Vi »
spécifiques d’un isolat confirmé comme étant Salmonella (3.1)
3.3
formule antigénique
combinaison de chiffres et de lettres représentant les antigènes « O », « H » et « Vi » d’un isolat confirmé
comme étant Salmonella (3.1)
4 Principe
Pour le sérotypage de Salmonella spp., les antigènes suivants sont déterminés sur des isolats
biochimiquement confirmés comme étant Salmonella spp.:
Antigènes « O », antigènes « H » et antigènes « Vi ».
NOTE D’autres modes opératoires alternatifs peuvent être utilisés pour confirmer que l’isolat est Salmonella
spp., à condition de vérifier qu’ils sont adaptés (voir ISO 7218).
5 Milieux de culture et sérums
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoire, appliquer l’ISO 7218.
En ce qui concerne les essais de performance des milieux, suivre les recommandations de l’ISO 11133.
5.2 Milieux de culture et réactifs
Voir Annexe A.
5.3 Sérums
Les sérums anti- « O », « H » et « Vi » sont commercialement disponibles auprès de différents fournisseurs.
Des informations concernant les sérums polyvalents et monovalents pertinents figurent à l’Annexe B.
6 Appareillage
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si leurs spécifications
sont similaires.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Incubateur, pour cultiver des isolats de Salmonella, pouvant fonctionner à une température
comprise entre 34 °C et 38 °C.
NOTE Dans la présente partie de l’ISO 6579, la température d’incubation n’est pas un paramètre différentiel.
Les isolats sont mis en culture afin d’obtenir suffisamment de matériel pour effectuer les essais sur une culture
pure. La phase de culture est donc effectuée à une température de culture optimale. Pour les Salmonella, cette
température est généralement comprise entre 34 °C et 38 °C.
6.2 Four (pour la stérilisation en chaleur sèche) ou autoclave (pour la stérilisation en chaleur humide).
Voir ISO 7218.
6.3 Réfrigérateur (destiné à la conservation de milieux préparés), pouvant fonctionner à 5 °C ± 3 °C.
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ISO/TR 6579-3:2014(F)
6.4 Lames en verre.
6.5 Instrument d’ensemencement stérile, par exemple aiguilles, fils, bâtonnets en bois, anses (par
exemple de 1 µl).
6.6 Tubes à essai et flacons stériles, de capacité appropriée Des bouteilles ou flacons et des tubes à
essai à bouchons métalliques ou en matière plastique (à vis) non toxiques peuvent être utilisés.
6.7 Boîtes de Petri stériles, de diamètres d’environ 55 mm et 90 mm.
6.8 Bain-marie, pouvant fonctionner à 47-50 °C.
6.9 Bain-marie (ou incubateur), pouvant fonctionner à 50 °C ± 2 °C.
7 Échantillon
Il est important que le laboratoire travaille avec une culture pure, biochimiquement confirmée comme
étant Salmonella spp.
8 Taxonomie de Salmonella
8.1 Généralités
Environ tous les 7 ans, le Centre collaborateur OMS de référence et de recherche pour les Salmonella
(Institut Pasteur, Paris) publie une mise à jour de la « formule antigénique des sérovars de Salmonella »,
qui sert de base à l’attribution de noms de sérovars et de formules antigéniques aux isolats de Salmonella
spp. Au moment de cette publication, la dernière version du schéma White–Kauffmann–Le Minor est
celle de 2007 (Référence [9]).
NOTE Les suppléments au schéma White-Kauffmann-Le Minor sont publiés dans « Research in Microbiology »,
une publication de l’Institut Pasteur (anciennement intitulée « Annales de l’Institut Pasteur/Microbiologie »). Par
exemple, le supplément n°47 a été publié en 2010 et caractérise les nouveaux sérovars identifiés entre 2003 et
2007 (Référence [10]).
La présente partie de l’ISO 6579 donne des recommandations relatives au sérotypage des sérovars de
Salmonella.
8.2 Nomenclature
Différentes nomenclatures ont été (et sont toujours) utilisées pour les souches de Salmonella:
— à l’origine, Kauffmann (Référence [12]) considérait chaque sérovar de Salmonella comme une espèce
distincte,
— l’attribution à différentes espèces a été utilisée: S. enterica et S. choleraesuis, chacune des espèces
ayant une souche type,
— certaines souches « importantes » de Salmonella (par exemple, Salmonella Typhi et Salmonella
Paratyphi) étaient considérées comme étant des espèces et pas « uniquement » des sérovars d’une
espèce.
La « Judical Commission of the International Committee on Systematics of Procaryotes » (Commission
juridique du Comité international sur la systématique des procaryotes) indiquait que de nombreux
synonymes peuvent être utilisés dans la nomenclature des Salmonella (Référence [22]). Dans la présente
partie de l’ISO 6579, la nomenclature actuelle largement acceptée est utilisée, laquelle est également
validée par le Centre collaborateur OMS de référence et de recherche pour les Salmonella (Référence [9]),
l’American Society for Microbiology (Référence [20]), les Centres de contrôle et de prévention des
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ISO/TR 6579-3:2014(F)
maladies (Référence [3]) et le Manuel de Bergey (Référence [17]). D’après la nomenclature actuelle,
le genre Salmonella appartient à la famille des Enterobacteriaceae et est composé de deux espèces: S.
enterica et S. bongori. S. enterica se divise en six sous-espèces: S. enterica subsp. enterica, S. enterica
subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, et S.
enterica subsp. indica.
Les sérovars de Salmonella appartenant à la sous-espèce S. enterica subsp. enterica sont ceux qui sont
le plus fréquemment isolés (plus de 99,5 % des souches de Salmonella isolées). Ils sont désignés par
un nom, généralement lié au lieu géographique où ils ont été isolés pour la première fois. Les sérovars
appartenant aux sous-espèces S. enterica et S. bongori sont désignés par leur formule antigénique.
En raison des combinaisons des sous-espèces et de nombreux sérovars, les noms complets sont longs (par
exemple, Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Typhimurium). Il est donc généralement acceptable
de raccourcir les noms des sérovars de la sous-espèce enterica. Le schéma White–Kauffmann–Le Minor
suggère les noms raccourcis suivant: S. enterica sérovar Typhimurium ou Salmonella sér. Typhimurium.
Selon la Référence [3], à la première occurrence du nom d’un sérovar dans un texte, il convient de donner
le nom du genre suivi par le terme « sérovar » ou le terme abrégé « sér. » et ensuite, le nom du sérovar.
Par la suite, le nom peut être écrit avec le genre suivi directement du nom du sérovar (par exemple,
Salmonella Typhimurium). Cette façon de désigner les sérovars de Salmonella est également acceptée
dans la majorité des journaux (par exemple, les journaux de l’American Society for Microbiology —
ASM) et est également utilisée dans la présente partie de l’ISO 6579.
Pour résumer, la nomenclature des Salmonella:
famille: Enterobacteriaceae (première lettre en majuscule, italique)
genre: Salmonella (première lettre en majuscule, italique)
espèces: enterica (minuscule, italique)
sous-espèces: enterica (minuscule, italique)
sérovar (sérotype ou sér.): par exemple Typhimurium (première lettre en majuscule,
pas d’italique)
sous-espèces: salamae
arizonae
diarizonae
houtenae
indica
espèces: bongori
Dans le 47ème supplément du schéma White–Kauffmann–Le Minor (Référence [10]), plus de
2 600 sérovars de Salmonella sont mentionnés et ce nombre augmente régulièrement, tel que résumé
dans le Tableau 1.
4 © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO/TR 6579-3:2014(F)
Tableau 1 — Nombre de sérovars de Salmonella au cours des années
Supplément
a b c
Espèces/sous-espèces 1998 2001 2007
Nombre de sérovars
Salmonella enterica 2 443 2 502 2 587
subsp. enterica 1 454 1 492 1 547
subsp. salamae 489 500 513
subsp. arizonae 94 95 100
subsp. diarizonae 324 331 341
subsp. houtenae 70 71 73
subsp. indica 12 13 13
Salmonella bongori 20 21 23
Nb total de sérovars (genre Salmonella) 2 463 2 523 2 610
a
Référence [18]
b
Référence [19]
c
Référence [10], couvrant 2003–2007.
8.3 Caractéristiques biochimiques
Les espèces et sous-espèces de Salmonella sont identifiées d’après différents essais biochimiques. Le
Tableau 2 répertorie les caractéristiques différentielles. Voir Référence [9] et Annexe C pour plus de
détails.
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ISO/TR 6579-3:2014(F)
Tableau 2 — Caractéristiques biochimiques des espèces et sous-espèces de Salmonella
(Référence [9])
Espèces S. enterica
S. bongori
Sous-espèces enterica salamae arizonae diarizonae houtenae indica
Dulcitol + + − − − d +
a
ONPG (2 h) − − + + − d +
Malonate − + + + − − −
Gélatinase − + + + + + −
Sorbitol + + + + + − +
b
Culture avec KCN − − − − + − +
c
l(+)-tartrate + − − − − − −
Galacturonate − + − + + + +
e
γ-Glutamyltransférase + + − + + + +
β-Glucuronidase d d − + − d −
Mucate + + + − (70 %) − + +
Salicine − − − − + − −
Lactose − − − (75 %) + (75 %)+ − d −
Lyse par le phage O1 + + − + − + d
+ = réaction positive à 90 % ou plus
− = réaction négative à 90 % ou plus
d = différentes réactions données par différents sérovars
a
o-Nitrophényl-β-d-galactopyranoside (essai pour β-galactosidase).
b
Cyanure de potassium.
c
= d-Tartrate, Paratyphi B: −, Paratyphi B biovar Java: +
e
= Typhimurium: d, Dublin: −.
8.4 Caractéristiques antigéniques
8.4.1 Généralités
Les caractéristiques antigéniques importantes des Salmonella pour les essais sérologiques se divisent
en trois types principaux:
— l’antigène « O », également appelé antigène somatique,
— l’antigène « H », également appelé antigène flagellaire,
— l’antigène « Vi », également appelé antigène capsulaire.
La formule antigénique des Salmonella spp. est composée de ces trois types d’antigènes, présentés comme
suit: antigènes « O », antigène « Vi » (le cas échéant): antigènes « H » de première phase: antigènes « H »
de seconde phase. Par exemple, la formule antigénique du Salmonella Paratyphi C est: 6,7,[Vi]:c:1,5; avec
les antigènes « O » O:6 et O:7; avec l’antigène « Vi », qui peut être présent ou absent (indiqué par les
crochets); avec l’antigène « H » H:c pour la première phase; avec les antigènes « H » H:1 et H:5 pour la
seconde phase.
8.4.2 L’antigène « O » (antigène somatique)
Cet antigène provient de la paroi cellulaire et les principaux composants sont des polysaccharides, des
protéines et des phospholipides. L’antigène « O » est très robuste et peut résister à des températures
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ISO/TR 6579-3:2014(F)
pouvant atteindre 100 °C pendant 150 min, à un traitement avec de l’éthanol à 95 % (fraction volumique)
ou avec de l’acide dilué (Référence [16]).
La réaction de l’antigène « O » avec les immuns-sérums crée une agglutination granulaire. D’un point de
vue historique, les antigènes « O » ont été classés dans des groupes d’antigènes « O » individuels dans
le schéma White–Kauffmann–Le Minor (Référence [9]). Les groupes étaient nommés avec l’alphabet
latin, en commençant par le groupe A qui comprend l’antigène O:2, jusqu’au groupe Z qui comprend
l’antigène O:50. Comme il y avait plus d’antigènes « O » que de lettres, les antigènes restants n’étaient
pas classifiés sous forme de groupe, mais étaient dénommés antigènes « O » O:51 à O:67. Aujourd’hui,
il est préférable de désigner chaque groupe « O » selon le facteur « O » caractéristique. Les lettres ont
été conservées et sont indiquées entre parenthèses, par exemple, O:4 (B) (Référence [9]). Le Tableau 3
résume les nomenclatures anciennes et nouvelles.
Tableau 3 — Sérogroupes de Salmonella (ancienne désignation) et antigènes « O »
correspondants (nouvelle désignation)
Groupe Antigène « O » Groupe Antigène « O » Groupe Antigène « O »
A 2 G -G 13 Q 39
1 2
B 4 H 6,14 R 40
a
C (, C ) 6,7 I 16 S 41
1 4
C , C 8 J 17 T 42
2 3
D 9 K 18 U 43
1
D 9,46 L 21 V 44
2
D 9,46,27 M 28 W 45
3
b
E (, E , E ) 3,10 N 30 X 47
1 2 3
E 1,3,19 O 35 Y 48
4
F 11 P 38 Z 50
a
C est désormais inclus dans C
4 1.
b
E et E sont désormais inclus dans E
2 3 1.
8.4.3 L’antigène « H » (antigène flagellaire)
Cet antigène se situe sur le flagelle et se compose principalement de protéines. Il est moins robuste que
les antigènes « O ». Il peut facilement être décomposé par de l’alcool, de l’acide et à une température
supérieure à 60 °C, mais il résiste à une solution de formol de fraction volumique de 0,5 % (Référence [16]).
La réaction de l’antigène « H » avec les immuns-sérums crée une agglutination floconneuse. De nombreuses
espèces de Salmonella possèdent deux phases d’antigène « H », mais des variantes monophasiques et
triphasiques sont également connues. La première phase s’appelle la phase spécifique et la seconde
phase s’appelle la phase non spécifique. La première phase est indiquée par une lettre minuscule, allant
de a à z. Toutefois, depuis l’identification de l’antigène z, de nombreux nouveaux antigènes « H » ont été
identifiés et nommés z , z , z . z
1 2 3 91.
Voici quelques exemples de sérovars monophasiques:
— Salmonella Paratyphi A: 1,2,12:a[1,5]; avec H:a pour la première phase et où les crochets indiquent
que la seconde phase (H:1,5) peut être présente ou absente;
— Salmonella Typhi: 9,12,[Vi]:d:-; avec H:d pour la première phase;
— Salmonella Derby: 1,4,[5]12:f,g[1,2]; avec H:f,g pour la première phase et où la seconde phase (H:1,2)
peut être présente ou absente;
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ISO/TR 6579-3:2014(F)
— Salmonella Enteritidis: 1,9,12: g,m:-; avec H:g,m pour la première phase. Outre les facteurs H:g,m,
certaines souches peuvent avoir le facteur H:p, H:f ou H:t. Des souches exceptionnelles peuvent avoir
l’antigène H:1,7 comme seconde phase;
— Salmonella Dublin: 1,9,12,[Vi]:g,p:-; avec H:g,p pour la première phase.
NOTE 1 Les facteurs « O » soulignés sont déterminés par conversion phagique. Ils sont présents uniquement si
la culture est lysogénisée par le phage de conversion correspondant (Référence [9]).
NOTE 2 Les facteurs « O » ou « H » indiqués entre crochets peuvent être présents ou absents, indépendamment
de la conversion phagique (Référence [9]).
NOTE 3 Les souches diphasiques de Salmonella Derby et Salmonella Enteritidis sont très rares. Il est possible
qu’une inversion de phase soit nécessaire pour détecter ces souches rares. Toutefois, cela n’est nécessaire que
pour certains cas (spéciaux) (par exemple, dans le cas de sources déviantes et/ou de cas associés à des voyages
[spéciaux]).
8.4.4 L’antigène « Vi » (antigène capsulaire)
Cet antigène est un antigène (capsulaire) de surface et peut masquer les antigènes « O » de façon à ce que
les bactéries ne s’agglutinent pas avec les sérums anti- « O ». L’antigène « Vi » se compose essentiellement
de polysaccharides. Les souches de Salmonella qui possèdent un antigène « Vi » sont plus virulentes
que les souches qui ne l’ont pas. L’antigène « Vi » peut être présent dans seulement trois sérovars de
Salmonella:
— Salmonella Typhi: 9,12,[Vi]:d:-;
— Salmonella Paratyphi C: 6,7,[Vi]:c:1,5;
— Salmonella Dublin: 1,9,12,[Vi]:g,p:-.
Les crochets indiquent que l’antigène « Vi » peut être présent ou absent.
NOTE La présence d’antigènes « Vi » dans les isolats de Salmonella issus d’échantillons alimentaires ou
vétérinaires est très rare. Si l’antigène « Vi » est présent, il masque la détection d’antigènes « O ». Pour détecter les
antigènes « O », il peut s’avérer nécessaire de chauffer une suspension de l’isolat (par exemple, dans une solution
saline physiologique) à 100 °C pendant 60 min, ou à 120 °C pendant 15 min.
9 Mode opératoire pour le sérotypage des Salmonella
9.1 Généralités
Avant de commencer le sérotypage, il est important de confirmer biochimiquement que l’isolat appartient
au genre Salmonella (comme spécifié dans l’ISO 6579-1). Même si les antigènes « H » sont propres aux
Salmonella, plusieurs antigènes « O » sont communs à différents genres d’Enterobacteriaceae (par
exemple, Salmonella, Citrobacter, Hafnia).
NOTE D’autres modes opératoires alternatifs peuvent être utilisés pour confirmer que l’isolat appartient au
...
Questions, Comments and Discussion
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