ISO 7346-1:1996

Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Part 1: Static method

Specifies a static method for the determination of the acute lethal toxicity of stable, non-volatile, single substances, soluble in water under specified conditions, to a freshwater fish (Brachydanio rerio - zebra fish). Replaces the first edition.

Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis d'un poisson d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae)] — Partie 1: Méthode statique

La présente partie de l'ISO 7346 prescrit une méthode statique pour la détermination de la toxicité aiguë létale de substances simples, stables, non volatiles, solubles dans l'eau dans les conditions prescrites, vis-à-vis d'un poisson d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae) -- nom commun, poisson-zèbre], dans une eau de qualité donnée. La méthode est applicable pour chaque substance à expérimenter, pour donner une idée globale de la toxicité aiguë létale vis-à-vis du Brachydanio rerio, dans les conditions de l'essai. Les résultats sont en eux-mêmes insuffisants pour définir des normes de qualité de l'eau en vue de la protection de l'environnement. La méthode est également applicable à certaines autres espèces de poissons d'eau douce comme organismes pour essais1). La méthode peut être adaptée pour d'autres poissons d'eaux douce, marine ou saumâtre avec des modifications appropriées des conditions d'essai, concernant notamment la quantité et la qualité de l'eau de dilution et la température.

Kakovost vode - Ugotavljanje akutne smrtne strupenosti snovi s sladkovodnimi ribami (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)) - 1. del: Statična metoda

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 12-Jun-1996
• ICS: 13.060.70 - Examination of biological properties of water
• Technical Committee: ISO/TC 147/SC 5 - Biological methods
• Drafting Committee: ISO/TC 147/SC 5 - Biological methods
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 05-Aug-2021
• Ref Project: SIST ISO 7346-1:1997 - Water quality -- Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] -- Part 1: Static method

Relations

• Revises: ISO 7346-1:1984 - Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish (Brachydanio rerio, Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)) — Part 1: Static method
• Effective Date: 15-Apr-2008

Standards Content (Sample)

IS0 7346-l :1996(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be ’
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard IS0 7346-l was prepared by Technical Committee
lSO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition
(IS0 7346-l : 1984), which has been technically revised.
IS0 7346 consists of the following parts, under the general title Water
quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a
freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae) ‘J:
- Part 1: Static method
- Part 2: Semi-static method
- Part 3: Flow-through method
Annexes A, B and C of this part of IS0 7346 are for information only.
0 IS0 1996
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-1211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii

---------------------- Page: 1 ----------------------
0 IS0
IS0 7346-l :1996(E)
Introduction
The three parts of IS0 7346 describe methods of determining the acute
lethal toxicity of substances to the zebra fish (Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan) but it must be emphasized that the recommended
use of the zebra fish does not preclude the use of other species. The
methodologies presented here ‘may also be used for other species of
freshwater, marine or brackish water fish, with appropriate modifications
of, for example, dilution water quality and the temperature conditions of
the test.
Within the three parts of IS0 7346, a choice can be made between static,
semi-static and flow-through methods. The static test, described in this
part of IS0 7346, in which the solution is not renewed, has the advantage
of requiring simple apparatus, although the substances in the test vessel
may become depleted during the course of the test and the general quality
of the water may deteriorate. The flow-through method, described in
IS0 7346-3, in which the test solution is replenished continuously, over-
comes such problems but requires the use of more complex apparatus.
In the semi-static procedure, described in IS0 7346-2, the test solutions
are renewed every 24 h or 48 h, this method being a compromise be-
tween the other two.
The flow-through method can be used for most types of substances, in-
cluding those unstable in water, but the concentrations of the test sub-
stance are determined wherever possible. The static method is limited to
the study of substances whose tested concentrations remain relatively
constant during the test period. The semi-static method can be used for
testing those substances whose concentrations can be maintained satis-
factorily throughout the test by renewal of the solutions every 24 h or
48 h. Special arrangements may be necessary for substances which are
highly volatile.
To assist in the preparation and maintenance of concentrations of sub-
stances which may be lethal at concentrations close to that of their
aqueous solubility, a small volume of solvent may be used, as specified in
the methods.

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This page intentionally left blank

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INTERNATIONAL STANDARD 0 ISO IS0 7346-l :1996(E)
Water quality - Determination of the acute lethal
toxicity of substances to a freshwater fish [B~&ydanio
rer;o Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] -
Part 1:
Static method
with appropriate modification of the test conditions,
1 Scope
particularly with respect to the quantity and quality of
the dilution water and the temperature.
This part of IS0 7346 specifies a static method for the
determination of the acute lethal toxicity of stable,
non-volatile, single substances, soluble in water under
2 Principle
specified conditions, to a freshwater fish
[ Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Determination, under specified conditions, of the
common name, zebra fish] in water of
Cyprinidae) -
concentrations at which a substance is lethal to
a specified quality.
50 % of a test population of Brachydanio rerio after
exposure periods of 24 h, 48 h, 72 h and 96 h to that
The method is applicable for assigning, for each test
substance in the ambient water. These median lethal
substance, broad categories of acute lethal toxicity to
concentrations are designated the 24 h - LC50,
Brachydanio rerio under the test conditions.
48 h - LC50, 72 h - LC50 and 96 h - LC50.
The results are insufficient by themselves to define
The test is carried out in two stages:
water quality standards for environmental protection.
a) a preliminary test which gives an approximate in-
The method is also applicable when using certain
dication of the acute median lethal concentrations
other species of freshwater fish as the test and serves to determine the range of concen-
OrganismI).
trations for the final test;
The method may be adapted for use with other b) a final test, the results of which alone are re-
freshwater fish and marine and brackish water fish ported.
1) The following species of freshwater fish can be used, in addition to Brachydanio rerio, without modification to this part of
IS0 7346.
- Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)
- Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)
- Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)
- Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)

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IS0 7346=1:1996(E) 0 IS0
Where evidence is available to show that test con-
3.2 Standard dilution water
centrations remain relatively constant (i.e. within
about 20 % of the nominal values) throughout the
The freshly prepared standard dilution water shall
test, then either measured or nominal concentrations
have a pH of 7,8 + 0,2, and a calcium hardness of
-
are used in the estimation of the LC50. Where such
approximately 250 mg/l, expressed as calcium
analyses show that the concentrations present remain
carbonate, and shall contain the following concen-
relatively constant but are less than about 80 %, or
trations of salts dissolved in distilled or deionized
greater than 120 %, of the nominal values, then the
water:
analytical values are used in estimating the LC50.
Where evidence is not available to show that the test 294,0 mg/l CaCI,.2H,O
concentrations remained at an acceptable level
123,3 mg/l MgSOJH,O
throughout the test period, or where it is known (or
suspected) that the concentrations of the test chemi-
63,0 mg/l NaHCO,
cal have declined significantly at any stage during the
test, then, irrespective of whether or not chemical
5,5 mg/l KCI
analytical data are available, the LC50 cannot be de-
fined using this test method. In these cases, the test
Aerate the dilution water until the concentration of
is not necessarily invalidated but it can only be stated
dissolved oxygen reaches at least 90 % of its air
that the LC50 of the substance is < x mg/l, the value,
saturation value (ASV) and the pH is constant at
X, being estimated from the nominal concentrations
7,8 + 0,2. If necessary, adjust the pH of the solution
used.
by adding sodium hydroxide solution or hydrochloric
acid. The dilution water thus prepared shall receive
no further forced aeration before use in the tests.
3 Test organism and reagents
The reagents shall be of recognized analytical grade.
3.3 Stock solutions of test substances
The water used for the preparation of solutions shall
be glass-distilled water or deionized water of at least
A stock solution of the test substance should be pre-
equivalent purity.
pared by dissolving a known amount of test sub-
stance in a defined volume of dilution water,
deionized water or glass-distilled water. To enable
stock solutions to be prepared and to assist in their
3.1 Test organism
transfer to the test vessels, substances of low
aqueous solubility may be dissolved or dispersed by
The test species shall be Brachydanio rerio Hamilton-
suitable means, including ultrasonic devices and or-
Buchanan (Teleostei, Cyprinidae), commonly known
ganic solvents of low toxicity to fish. If any such or-
as the zebra fish. Each test fish shall have a total
ganic solvent is used, its concentration in the test
length of 30 mm + 5 mm, which, in principle, corre-
-
solution shall not exceed 0,l ml/l, or the volume con-
sponds to a mass of 0,3 g + 0,l g. They shall be se-
taining 0,l g/l, whichever is the greater. Where a sol-
lected from a population of a single stock. This stock
vent is used, two sets of controls, one containing
should have been acclimatized and, in any case,
solvent at the maximum concentration used in any
maintained for at least 7 d prior to the test in dilution
test vessel and one without solvent or test substance,
water, continuously aerated using bubbled air (see
shall be included.
3.2), under conditions of water quality and illumination
similar to those used in the test. They shall be fed as
normal up to the 24 h period immediately preceding
the test.
3.4 Test solutions
Test fish shall be free of overt disease or visible
Test solutions are prepared by adding apbropriate
malformation. They shall not receive treatment for
amounts of the stock solution of the test substance
disease during the test or in the 2 weeks preceding
to the dilution water to give the required concen-
the test. Subsequent to the test, fish remaining alive
trations. It is recommended that, when a stock sol-
should be suitably disposed of.
ution is prepared in distilled or deionized water, no
maintenance and more than 100 ml of stock solution should be added
Enviro nmental conditions for the
per 10 litres of dilution water.
breedi ng of ze bra fish are given in annex A.
2

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0 IS0
IS0 7346=1:1996(E)
Maintain the temperature of the water in the stock
4 Apparatus
tanks at 23 “C + 1 “C (4.2).
All materials which may come into contact with any
liquid into which the fish are to be placed, or with
6.2 Limit test
which they may come into contact, shall be inert and
should not absorb the test substance significantly.
Using the procedures described in this part of
IS0 7346, a limit test may be performed at the limit
Usual laboratory equipment and the following.
of aqueous solubility under the conditions of the test
or at 100 mg/l, whichever is the lower, in order to
4.1 Test vessels, of sufficient capacity (which may
demonstrate that the 96 h - LC50 is greater than this
need to be greater than 10 litres), with a large area
concentration. If no fish die in the limit test, no further
of interface between the air and the test medium (of
testing is required.
about 800 cm* for 10 litres of medium) and equipped
with a securely fixed and close-fitting cover. The vol-
Perform the limit test using 10 fish, with the same
ume of the test vessels should be sufficient that a
number in the control(s).
loading rate of 1 g of fish per litre of water should not
NOTE 1 Binominal theory dictates that, when 10 fish are
be exceeded at any time during the test.
used, with zero mortality there is a 99,9 % confidence that
Before use, the test vessels shall be cleaned the 96 h - LC50 is greater than the limit-test concentration.
If mortalities occur, a complete study (see 6.3 and 6.4) may
thoroughly, for example with a non-ionic detergent
need to be considered. If sub-lethal effects are observed,
(followed by acid and solvent washes for substances
these should be recorded.
expected to adsorb strongly to the vessel).
4.2 Temperature control equipment, to regulate 6.3 Preliminary test
the temperature of the test solutions and the water
Add at least 2,5 litres, preferably 5 litres, of standard
in the stock tanks to 23 “C + 1 “C by a suitable
-
dilution water (3.2) to each of six test vessels (4.1)
method.
and aerate if necessary to restore the concentration
of dissolved oxygen to at least 90 % of its air satu-
4.3 Dip-net, made of nylon or of another chemically
ration value.
inert material, for the control vessels and another for
all the test vessels (4.1).
Prepare test solutions by adding appropriate amounts
of stock solution of the test substance (3.3) to five of
5 Test environment
the vessels in order to obtain an adequate geometric
range of concentrations, for example 1 000 mg/l;
The preparation and storage of solutions, the holding
100 mg/l; 10 mg/l; 1 mg/l and 0,l mg/l. Nothing is
of fish, and all the manipulations and tests shall be
added to the sixth vessel, which serves as a control.
carried out in premises with an atmosphere free from
The solutions shall be adjusted to and maintained at
harmful concentrations of airborne contaminants.
23 “C + 1 “C (4.2) and shall not be forcibly aerated
during the test.
Take care to avoid any unwanted disturbance that
may change the behaviour of the fish. Carry out all
Place three fish in each vessel.
tests under normal laboratory illumination with a daily
photoperiod of 12 h to 16 h.
At least twice a day, note the number of dead fish and
the dissolved oxygen concentration in each vessel.
Remove the dead fish.
6 Procedure
If there are insufficient data for establishing the range
6.1 Condition of the fish
of concentrations required for the final test, repeat
this preliminary test with alternative ranges of con-
Whenever there is a change of stock population, carry
centrations.
out a toxicity test using the method specified in this
part of IS0 7346 using a suitable reference chemical
6.4 Final test
[e.g. potassium dichromate (K,Cr,O,)]. The results of
such tests shall be in reasonable agreement with re-
Select at least five concentrations, forming an ap-
sults obtained previously in the same labo
...

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 7346-1:1997
01-januar-1997
.DNRYRVWYRGH8JRWDYOMDQMHDNXWQHVPUWQHVWUXSHQRVWLVQRYLVVODGNRYRGQLPL
ULEDPL%UDFK\GDQLRUHULR+DPLOWRQ%XFKDQDQ7HOHRVWHL&\SULQLGDHGHO
6WDWLþQDPHWRGD
Water quality -- Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater
fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] -- Part 1: Static
method
Qualité de l'eau -- Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis d'un
poisson d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae)] --
Partie 1: Méthode statique
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 7346-1:1996
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 7346-1:1997 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 7346-1:1997

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IS0 7346-l :1996(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be ’
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard IS0 7346-l was prepared by Technical Committee
lSO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition
(IS0 7346-l : 1984), which has been technically revised.
IS0 7346 consists of the following parts, under the general title Water
quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a
freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae) ‘J:
- Part 1: Static method
- Part 2: Semi-static method
- Part 3: Flow-through method
Annexes A, B and C of this part of IS0 7346 are for information only.
0 IS0 1996
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
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IS0 7346-l :1996(E)
Introduction
The three parts of IS0 7346 describe methods of determining the acute
lethal toxicity of substances to the zebra fish (Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan) but it must be emphasized that the recommended
use of the zebra fish does not preclude the use of other species. The
methodologies presented here ‘may also be used for other species of
freshwater, marine or brackish water fish, with appropriate modifications
of, for example, dilution water quality and the temperature conditions of
the test.
Within the three parts of IS0 7346, a choice can be made between static,
semi-static and flow-through methods. The static test, described in this
part of IS0 7346, in which the solution is not renewed, has the advantage
of requiring simple apparatus, although the substances in the test vessel
may become depleted during the course of the test and the general quality
of the water may deteriorate. The flow-through method, described in
IS0 7346-3, in which the test solution is replenished continuously, over-
comes such problems but requires the use of more complex apparatus.
In the semi-static procedure, described in IS0 7346-2, the test solutions
are renewed every 24 h or 48 h, this method being a compromise be-
tween the other two.
The flow-through method can be used for most types of substances, in-
cluding those unstable in water, but the concentrations of the test sub-
stance are determined wherever possible. The static method is limited to
the study of substances whose tested concentrations remain relatively
constant during the test period. The semi-static method can be used for
testing those substances whose concentrations can be maintained satis-
factorily throughout the test by renewal of the solutions every 24 h or
48 h. Special arrangements may be necessary for substances which are
highly volatile.
To assist in the preparation and maintenance of concentrations of sub-
stances which may be lethal at concentrations close to that of their
aqueous solubility, a small volume of solvent may be used, as specified in
the methods.

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SIST ISO 7346-1:1997
INTERNATIONAL STANDARD 0 ISO IS0 7346-l :1996(E)
Water quality - Determination of the acute lethal
toxicity of substances to a freshwater fish [B~&ydanio
rer;o Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] -
Part 1:
Static method
with appropriate modification of the test conditions,
1 Scope
particularly with respect to the quantity and quality of
the dilution water and the temperature.
This part of IS0 7346 specifies a static method for the
determination of the acute lethal toxicity of stable,
non-volatile, single substances, soluble in water under
2 Principle
specified conditions, to a freshwater fish
[ Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Determination, under specified conditions, of the
common name, zebra fish] in water of
Cyprinidae) -
concentrations at which a substance is lethal to
a specified quality.
50 % of a test population of Brachydanio rerio after
exposure periods of 24 h, 48 h, 72 h and 96 h to that
The method is applicable for assigning, for each test
substance in the ambient water. These median lethal
substance, broad categories of acute lethal toxicity to
concentrations are designated the 24 h - LC50,
Brachydanio rerio under the test conditions.
48 h - LC50, 72 h - LC50 and 96 h - LC50.
The results are insufficient by themselves to define
The test is carried out in two stages:
water quality standards for environmental protection.
a) a preliminary test which gives an approximate in-
The method is also applicable when using certain
dication of the acute median lethal concentrations
other species of freshwater fish as the test and serves to determine the range of concen-
OrganismI).
trations for the final test;
The method may be adapted for use with other b) a final test, the results of which alone are re-
freshwater fish and marine and brackish water fish ported.
1) The following species of freshwater fish can be used, in addition to Brachydanio rerio, without modification to this part of
IS0 7346.
- Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)
- Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)
- Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)
- Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)

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IS0 7346=1:1996(E) 0 IS0
Where evidence is available to show that test con-
3.2 Standard dilution water
centrations remain relatively constant (i.e. within
about 20 % of the nominal values) throughout the
The freshly prepared standard dilution water shall
test, then either measured or nominal concentrations
have a pH of 7,8 + 0,2, and a calcium hardness of
-
are used in the estimation of the LC50. Where such
approximately 250 mg/l, expressed as calcium
analyses show that the concentrations present remain
carbonate, and shall contain the following concen-
relatively constant but are less than about 80 %, or
trations of salts dissolved in distilled or deionized
greater than 120 %, of the nominal values, then the
water:
analytical values are used in estimating the LC50.
Where evidence is not available to show that the test 294,0 mg/l CaCI,.2H,O
concentrations remained at an acceptable level
123,3 mg/l MgSOJH,O
throughout the test period, or where it is known (or
suspected) that the concentrations of the test chemi-
63,0 mg/l NaHCO,
cal have declined significantly at any stage during the
test, then, irrespective of whether or not chemical
5,5 mg/l KCI
analytical data are available, the LC50 cannot be de-
fined using this test method. In these cases, the test
Aerate the dilution water until the concentration of
is not necessarily invalidated but it can only be stated
dissolved oxygen reaches at least 90 % of its air
that the LC50 of the substance is < x mg/l, the value,
saturation value (ASV) and the pH is constant at
X, being estimated from the nominal concentrations
7,8 + 0,2. If necessary, adjust the pH of the solution
used.
by adding sodium hydroxide solution or hydrochloric
acid. The dilution water thus prepared shall receive
no further forced aeration before use in the tests.
3 Test organism and reagents
The reagents shall be of recognized analytical grade.
3.3 Stock solutions of test substances
The water used for the preparation of solutions shall
be glass-distilled water or deionized water of at least
A stock solution of the test substance should be pre-
equivalent purity.
pared by dissolving a known amount of test sub-
stance in a defined volume of dilution water,
deionized water or glass-distilled water. To enable
stock solutions to be prepared and to assist in their
3.1 Test organism
transfer to the test vessels, substances of low
aqueous solubility may be dissolved or dispersed by
The test species shall be Brachydanio rerio Hamilton-
suitable means, including ultrasonic devices and or-
Buchanan (Teleostei, Cyprinidae), commonly known
ganic solvents of low toxicity to fish. If any such or-
as the zebra fish. Each test fish shall have a total
ganic solvent is used, its concentration in the test
length of 30 mm + 5 mm, which, in principle, corre-
-
solution shall not exceed 0,l ml/l, or the volume con-
sponds to a mass of 0,3 g + 0,l g. They shall be se-
taining 0,l g/l, whichever is the greater. Where a sol-
lected from a population of a single stock. This stock
vent is used, two sets of controls, one containing
should have been acclimatized and, in any case,
solvent at the maximum concentration used in any
maintained for at least 7 d prior to the test in dilution
test vessel and one without solvent or test substance,
water, continuously aerated using bubbled air (see
shall be included.
3.2), under conditions of water quality and illumination
similar to those used in the test. They shall be fed as
normal up to the 24 h period immediately preceding
the test.
3.4 Test solutions
Test fish shall be free of overt disease or visible
Test solutions are prepared by adding apbropriate
malformation. They shall not receive treatment for
amounts of the stock solution of the test substance
disease during the test or in the 2 weeks preceding
to the dilution water to give the required concen-
the test. Subsequent to the test, fish remaining alive
trations. It is recommended that, when a stock sol-
should be suitably disposed of.
ution is prepared in distilled or deionized water, no
maintenance and more than 100 ml of stock solution should be added
Enviro nmental conditions for the
per 10 litres of dilution water.
breedi ng of ze bra fish are given in annex A.
2

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SIST ISO 7346-1:1997
0 IS0
IS0 7346=1:1996(E)
Maintain the temperature of the water in the stock
4 Apparatus
tanks at 23 “C + 1 “C (4.2).
All materials which may come into contact with any
liquid into which the fish are to be placed, or with
6.2 Limit test
which they may come into contact, shall be inert and
should not absorb the test substance significantly.
Using the procedures described in this part of
IS0 7346, a limit test may be performed at the limit
Usual laboratory equipment and the following.
of aqueous solubility under the conditions of the test
or at 100 mg/l, whichever is the lower, in order to
4.1 Test vessels, of sufficient capacity (which may
demonstrate that the 96 h - LC50 is greater than this
need to be greater than 10 litres), with a large area
concentration. If no fish die in the limit test, no further
of interface between the air and the test medium (of
testing is required.
about 800 cm* for 10 litres of medium) and equipped
with a securely fixed and close-fitting cover. The vol-
Perform the limit test using 10 fish, with the same
ume of the test vessels should be sufficient that a
number in the control(s).
loading rate of 1 g of fish per litre of water should not
NOTE 1 Binominal theory dictates that, when 10 fish are
be exceeded at any time during the test.
used, with zero mortality there is a 99,9 % confidence that
Before use, the test vessels shall be cleaned the 96 h - LC50 is greater than the limit-test concentration.
If mortalities occur, a complete study (see 6.3 and 6.4) may
thoroughly, for example with a non-ionic detergent
need to be considered. If sub-lethal effects are observed,
(followed by acid and solvent washes for substances
these should be recorded.
expected to adsorb strongly to the vessel).
4.2 Temperature control equipment, to regulate 6.3 Preliminary test
the temperature of the test solutions and the water
Add at least 2,5 litres, preferably 5 litres, of standard
in the stock tanks to 23 “C + 1 “C by a suitable
-
dilution water (3.2) to each of six test vessels (4.1)
method.
and aerate if necessary to restore the concentration
of dissolved oxygen to at least 90 % of its air satu-
4.3 Dip-net, made of nylon or of another chemically
ration value.
inert material, for the control vessels and another for
all the test vessels (4.1).
Prepare test solutions by adding appropriate amounts
of stock solution of the test substance (3.3) to five of
5 Test environment
the vessels in order to obtain an adequate geometric
range of concentrations, for example 1 000 mg/l;
The preparation and storage of solutions, the holding
100 mg/l; 10 mg/l; 1 mg/l and 0,l mg/l. Nothing is
of fish, and all the manipulations and tests shall be
added to the sixth vessel, which serves as a control.
carried out in premises with an atmosphere free from
The solutions shall be adjusted to and maintained at
harmful concentrations of airborne contaminants.
23 “C + 1 “C (4.2) and shall not be forcibly aerated
during the test.
Take care to avoid any unwanted disturbance that
may change the behaviour of the fish. Carry out all
Place three fish in each vessel.
tests under normal laboratory illumination with a daily
photoperiod of 12 h to 16 h.
At least twice a day, note the number of dead fish and
the dissolved oxygen concentratio
...

ISO
NORME
7346-l
INTERNATIONALE
Deuxième édition
1996-06-15
- Détermination de la
Qualité de l’eau
toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis
d’un poisson d’eau douce [Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan (Téléostei,
Cyprinidae)] -
Partie 1:
Méthode statique
Determination of the acute lethal toxicity of substances
Water quality -
to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae)] -
Part 1: Static method
Numéro de référence
ISO 7346-1:1996(F)

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 7346-I : 1996(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 7346-l a été élaborée par le comité techni-
que lSO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5, Méthodes biologi-
ques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 7346-l :1984), dont elle constitue une révision technique.
L’ISO 7346 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre gé-
néral Qualité de l’eau - Détermination de la toxicité aiguë lé tale de
substances vis-à-vis d’un poisson d’eau douce [Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidaefl:
- Partie 1: Méthode statique
- Partie 2: Méthode semi-sta tique
- Partie 3: Méthode avec renouvellement continu
Les annexes A, B et C de la présente partie de I’ISO 7346 sont données
uniquement à titre d’information.
0 60 1996
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii

---------------------- Page: 2 ----------------------
0 ISO
ISO 7346-1: 1996(F)
Introduction
Les trois parties de I’ISO 7346 décrivent des procédures d’essai pour dé-
terminer la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis du poisson-zèbre
(Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan), mais il faut souligner que l’emploi
recommandé du poisson-zèbre n’exclut pas l’utilisation d’autres espèces.
Les méthodologies présentées ici peuvent aussi être utilisées pour d’au-
tres espèces de poissons d’eau douce, d’eau de mer ou d’eau saumâtre,
avec les modifications appropriées de, par exemple, la qualité de l’eau de
dilution ou des conditions de température de l’essai.
Parmi les trois parties de I’ISO 7346, un choix peut être fait entre les
méthodes statique, semi-statique et avec renouvellement continu. L’essai
statique décrit dans la présente partie de I’ISO 7346, dans lequel la solu-
tion n’est pas renouvelée, a l’avantage de ne nécessiter qu’un appareillage
simple, bien que la substance puisse s’épuiser dans le récipient d’essais
au cours de l’essai et la qualité globale de l’eau se détériorer. La méthode
avec renouvellement continu, décrite dans I’ISO 7346-3, dans laquelle la
solution d’essai est renouvelée de façon continue, évite de tels problè-
mes, mais nécessite l’emploi d’un appareillage plus complexe. Dans la
méthode semi-statique, décrite dans I’ISO 7346-2, les solutions d’essai
sont renouvelées toutes les 24 h ou 48 h, offrant ainsi un compromis en-
tre les deux.
La méthode avec renouvellement continu peut être utilisée pour la plupart
des types de substances, y compris celles qui sont instables dans l’eau,
mais les concentrations de la substance à expérimenter sont déterminées
chaque fois que c’est possible. La méthode statique est limitée à l’étude
des substances dont les concentrations expérimentales restent rela-
tivement constantes pendant la durée de l’essai. La méthode semi-
statique peut être utilisée pour expérimenter des substances dont les
concentrations peuvent être maintenues constantes, de façon satisfai-
sante, tout au long de l’essai par le renouvellement des solutions toutes
les 24 h ou 48 h. Des adaptations peuvent être nécessaires pour les
substances hautement volatiles.
Pour faciliter la préparation et le maintien de concentrations de substances
qui peuvent être létales lorsqu’elles sont proches de la solubilité aqueuse,
il est possible d’utiliser un faible volume de solvant, comme prescrit dans
les méthodes.

---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche

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NORME INTERNATIONALE 0 ISO
ISO 7346-l :1996(F)
Qualité de l’eau - Détermination de la toxicité aiguë
létale de substances vis-à-vis d’un poisson d’eau douce
[ Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei,
Cyprinidae)] -
Partie 1:
Méthode statique
La méthode est également applicable à certaines au-
1 Domaine d’application
tres espèces de poissons d’eau douce comme orga-
nismes pour essais?
La présente partie de I’ISO 7346 prescrit une mé-
La méthode peut être adaptée pour d’autres poissons
thode statique pour la détermination de la toxicité ai-
d’eaux douce, marine ou saumâtre avec des modifi-
guë létale de substances simples, stables, non
cations appropriées des conditions d’essai, concer-
volatiles, solubles dans l’eau dans les conditions
nant notamment la quantité et la qualité de l’eau de
vis-à-vis d’un poisson
prescrites, d’eau douce
dilution et la température.
[ Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei,
Cyprinidae) - nom commun, poisson-zèbre], dans
une eau de qualité donnée.
2 Principe
La méthode est applicable pour chaque substance à Détermination, dans des conditions définies, des
expérimenter, pour donner une idée globale de la concentrations auxquelles une substance est létale
pour 50 % d’une population d’essai de Brachydanio
toxicité aiguë létale vis-à-vis du Brachydanio rerio,
rerio, après des périodes d’exposition à cette subs-
dans les conditions de l’essai.
tance de 24 h, 48h, 72 h et 96 h dans l’eau ambiante.
Les résultats sont en eux-mêmes insuffisants pour Ces concentrations moyennes létales sont désignées
définir des normes de qualité de l’eau en vue de la par CL50 - 24 h, CL50 - 48 h, CL50 - 72 h et CL50 -
protection de l’environnement. 96 h.
1) Les espèces suivantes de poissons d’eau douce peuvent être utilisées, en sus de Brachydanio rerio, sans modification de
la présente partie de NS0 7346:
- Lepomis macrochirus (Téléostei, Centrarchidae)
- Oryzias latipes (Téléostei, Poeciliidae)
- Pimephales promelas (Téléostei, Cyprinidae)
- Poecilia reticulata (Téléostei, Poeciliidae)
1

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ISO 7346-1: 1996(F)
L’essai est réalisé en deux étapes: Les poissons pour essai doivent être exempts de
maladies ou de malformations visibles. Ils ne doivent
a) un essai préliminaire qui donne une indication ap-
subir aucun traitement pendant l’essai ou pendant les
proximative des concentrations moyennes aiguës
2 semaines précédant l’essai. À l’issue de l’essai, il
létales et qui sert à déterminer la gamme des
convient d’éliminer de façon convenable les poissons
concentrations pour l’essai définitif;
restant en vie.
b) un essai définitif dont seuls les résultats sont re- Les conditions d’environnement pour la maintenance
portés. et l’élevage du poisson-zèbre sont données dans
l’annexe A.
S’il est manifeste que les concentrations restent rela-
tivement constantes (par exemple s’écartant au plus
de 20 % de la valeur nominale) pendant l’essai, les
3.2 Eau de dilution norma I
concentrations nominales ou mesurées sont utilisées
pour l’estimation de la CL50. Si des analyses mon-
L’eau de dilution normalisée fraîchement préparée
trent que les concentrations réelles restent rela-
doit avoir un pH de 7,8 + 0,2, une dureté calcique
tivement constantes, mais inférieures à 80 % ou
d’environ 250 mg/l, exprimée en carbonate de cal-
supérieures à 120 % des valeurs nominales, les va-
cium, et doit contenir les concentrations suivantes de
leurs analytiques sont utilisées pour l’estimation de la
sels dissous dans l’eau distillée ou déionisée:
CL50. S’il n’est pas manifeste que les concentrations
d’essai restent à un niveau acceptable pendant la du-
2940 mg/1 CaCl,,2H,O
rée de l’essai ou s’il est connu (ou suspecté) que les
concentrations de la substance d’essai ont décru si- 123,3 mg/1 MgSOJH,O
gnificativement à un certain stade de l’essai, alors,
ô3,0 mg/1 NaHCO,
sans tenir compte des données analytiques disponi-
bles ou non, la CL50 ne peut être déterminée en uti-
5,5 mg/1 KCI
lisant la présente méthode d’essai. Dans ce cas,
l’essai n’est pas nécessairement invalidé, mais il peut
Aérer l’eau de dilution jusqu’à ce que la concentration
seulement être établi que la CL50 de la substance est
en oxygène dissous atteigne au moins 90 % de la
< x mg/l, la valeur, X, étant estimée à partir des
valeur de saturation dans l’air et jusqu’à stabilisation
concentrations nominales utilisées.
du pH à 7,8 + 0,2. Si nécessaire, ajuster le pH de la
-
solution en ajoutant une solution d’hydroxyde de so-
3 Organismes pour essai et réactifs
dium ou de l’acide chlorhydrique. L’eau de dilution
ainsi préparée ne doit recevoir aucune aération sup-
Les réactifs chimiques doivent être de qualité analyti-
plémentaire avant emploi dans les essais.
que reconnue. L’eau utilisée pour la préparation des
solutions de réactif doit être distillée dans un appareil
en verre ou déionisée d’une pureté au moins équiva-
3.3 Solutions mères des substances à
expérimenter
II convient de préparer une solution mère de la subs-
31 . Organismes pour essai
tance à expérimenter par dissolution d’une quantité
L’espèce utilisée pour l’essai doit être le Brachydanio connue de la substance dans un volume défini d’eau
rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae), ap- de dilution, d’eau déionisée ou d’eau distillée dans un
pelée communément ((poisson-zèbre)). Chaque pois- appareil en verre. Afin de permettre la préparation des
son pour essai doit avoir une longueur totale de solutions mères et d’aider à leur transfert dans les
30 mm + 5 mm ce qui, en principe, correspond à une récipients d’essais, les substances de faible solubilité
-
masse de 0,3 g + 0,l g. Ils doivent être sélectionnés aqueuse peuvent être solubilisées ou dispersées par
à partir d’une population mère unique. II convient que des moyens adéquats, tels que des dispositifs à ul-
cette population mère ait été acclimatée et, dans tous trasons et des solvants organiques de faible toxicité
vis-à-vis du poisson. Lorsqu’un solvant organique est
les cas, maintenue au moins 7 jours avant l’essai dans
employé, sa concentration dans la solution d’essai ne
l’eau de dilution, aérée de manière continue par
barbotage d’air (voir 3.2), dans des conditions de doit pas excéder 0,l ml/l ou un volume contenant
qualité de l’eau et d’éclairement semblables à celles 0,l g/l (prendre en compte la valeur la plus élevée).
utilisées pour l’essai. Ils doivent être nourris nor- Lorsqu’un solvant est utilisé, deux jeux d’essais té-
moins, l’un contenant le solvant à la concentration
malement jusqu’aux 24 h précédant immédiatement
maximale utilisée dans les récipients d’essais et I’au-
l’essai.
2

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0 ISO ISO 7346~1:1996( F)
Ivant ni substance à expérimen ter, doivent Éviter soigneusement toute perturbation indésirable
tre sans so
susceptible de modifier le comportement des pois-
être inclus.
sons. Réaliser les essais sous un éclairement normal
de laboratoire d’une photopériode quotidienne de
3.4 Solutions d’essai
12 h à 16 h.
Les solutions d’essai sont préparées par ajout des
quantités appropriées de la solution mère de la subs- 6 Mode opératoire
tance à expérimenter à l’eau de dilution pour obtenir
les concentrations nécessaires. II est recommandé,
6.1 État des poissons
lorsqu’une solution mère est préparée dans de l’eau
déionisée ou de l’eau distillée, de ne pas ajouter plus
En cas de changement de la population mère, effec-
de 100 ml de la solution mère pour 10 litres d’eau de
tuer un essai de toxicité selon la méthode définie
dilution.
dans la présente partie de I’ISO 7346 en utilisant un
produit chimique de référence approprié [par exemple
le dichromate de potassium (K,Cr,O,)]. Les résultats
4 Appareillage
de tels essais doivent être en accord raisonnable avec
les résultats obtenus précédemment par le même la-
Tout matériau qui est susceptible d’entrer en contact
boratoire.
avec tout liquide dans lequel les poissons sont placés
ou avec lequel ils sont mis en contact doit être inerte
soumis à 1’ oivent pas avoir été
Les poissons essai ne d
et ne doit pas adsorber significativement la substance
utilisés dans des essais antérieurs
à expérimenter.
Maintenir la température de l’eau dans les récipients
Matériel courant de laboratoire et ce qui suit.
de stockage à 23 “C + 1 “C (4.2).
4.1 Récipients d’essais, de capacité suffisante (une
6.2 Essai de limite
capacité supérieure à 10 litres peut être nécessaire),
avec une grande aire d’interface entre l’air et le milieu
En utilisant les modes opératoires décrits dans la
d’essai (d’environ 800 cm* pour 10 litres de milieu)
présente partie de I’ISO 7346, un essai de limite peut
et équipés d’un couvercle sûrement fixé. II convient
être réalisé à la limite de solubilité aqueuse dans les
que la capacité des récipients d’essais soit suffisante
conditions de l’essai ou à 100 mg/1 (prendre en
afin de ne pas dépasser, à aucun moment de l’essai,
compte la valeur la plus faible), afin de démontrer que
un rapport massique de 1 g de poisson par litre d’eau.
la CL50 - 96 h est plus élevée que cette concen-
tration. Si aucun poisson ne meurt lors de l’essai de
Avant emploi, les récipients d’essais doivent être soi-
limite, aucun essai supplémentaire n’est requis.
gneusement nettoyés, par exemple à l’aide d’un dé-
tergent non ionique (suivi par des lavages à l’aide
Réaliser l’essai de limite à partir de 10 poiss ons, avec
d’acide et de solvant pour les substances suscepti-
un nombre identique dans le(s) témoin(s).
bles de s’adsorber dans le récipient d’essais).
NOTE 1 La théorie binomiale impose que lorsque 10
poissons sont utilisés, avec une mortalité nulle, il est sûr à
4.2 Dispositif de contrôle de la température, pour
99,9 % que la CL50 - 96 h est plus élevée que la concen-
réguler la température des solutions d’essai et de
tration de l’essai de limite. En cas de mortalité, il peut être
l’eau dans les récipients de stockage, à 23 “C & 1 “C
nécessaire d’envisager une étude plus approfondie (voir 6.3
à l’aide d’une méthode appropriée.
et 6.4). Si des effets sublétaux sont observés, il convient
de les consigner.
4.3 Filet, en nylon ou en un autre matériau chimi-
6.3 Essai préliminaire
quement inerte, pour les récipients de contrôle et un
autre pour tous les récipients d’essais (4.1).
Placer au moins 2,5 litres, de préférence 5 litres,
d’eau de dilution normalisée (3.2) dans six récipients
5 Environnement de l’essai
d’essais (4.1) et les aérer si nécessaire pour restituer
la concentration en oxygène dissous à au moins
La préparation et la conservation des solutions, la
90 % de sa valeur de saturation dans l’air.
conservation des poissons et l’ensemble des mani-
Préparer les solutions d’essai par addition des quanti-
pulations et des essais doivent être réalisés dans des
locaux dont l’atmosphère est exempte de contami- tés appropriées de la solution mère de la substance
nants de l’air à des concentrations nocives. à expérimenter (3.3) à cinq des récipients afin d’obte-
3

---------------------- Page: 7 ----------------------
*
0 ISO
ISO 7346~1:1996( F)
nir une gamme adéquate de concentrations en pro- sais, sans délai, à l’aide d’un filet à petites mailles
gression géométrique, par exemple 1 000 mg/l, constitué d’un matériau doux inerte (4.3). Écarter tout
1
...

ISO
NORME
7346-l
INTERNATIONALE
Deuxième édition
1996-06-15
- Détermination de la
Qualité de l’eau
toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis
d’un poisson d’eau douce [Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan (Téléostei,
Cyprinidae)] -
Partie 1:
Méthode statique
Determination of the acute lethal toxicity of substances
Water quality -
to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae)] -
Part 1: Static method
Numéro de référence
ISO 7346-1:1996(F)

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ISO 7346-I : 1996(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 7346-l a été élaborée par le comité techni-
que lSO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5, Méthodes biologi-
ques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 7346-l :1984), dont elle constitue une révision technique.
L’ISO 7346 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre gé-
néral Qualité de l’eau - Détermination de la toxicité aiguë lé tale de
substances vis-à-vis d’un poisson d’eau douce [Brachydanio rerio
Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidaefl:
- Partie 1: Méthode statique
- Partie 2: Méthode semi-sta tique
- Partie 3: Méthode avec renouvellement continu
Les annexes A, B et C de la présente partie de I’ISO 7346 sont données
uniquement à titre d’information.
0 60 1996
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii

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Introduction
Les trois parties de I’ISO 7346 décrivent des procédures d’essai pour dé-
terminer la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis du poisson-zèbre
(Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan), mais il faut souligner que l’emploi
recommandé du poisson-zèbre n’exclut pas l’utilisation d’autres espèces.
Les méthodologies présentées ici peuvent aussi être utilisées pour d’au-
tres espèces de poissons d’eau douce, d’eau de mer ou d’eau saumâtre,
avec les modifications appropriées de, par exemple, la qualité de l’eau de
dilution ou des conditions de température de l’essai.
Parmi les trois parties de I’ISO 7346, un choix peut être fait entre les
méthodes statique, semi-statique et avec renouvellement continu. L’essai
statique décrit dans la présente partie de I’ISO 7346, dans lequel la solu-
tion n’est pas renouvelée, a l’avantage de ne nécessiter qu’un appareillage
simple, bien que la substance puisse s’épuiser dans le récipient d’essais
au cours de l’essai et la qualité globale de l’eau se détériorer. La méthode
avec renouvellement continu, décrite dans I’ISO 7346-3, dans laquelle la
solution d’essai est renouvelée de façon continue, évite de tels problè-
mes, mais nécessite l’emploi d’un appareillage plus complexe. Dans la
méthode semi-statique, décrite dans I’ISO 7346-2, les solutions d’essai
sont renouvelées toutes les 24 h ou 48 h, offrant ainsi un compromis en-
tre les deux.
La méthode avec renouvellement continu peut être utilisée pour la plupart
des types de substances, y compris celles qui sont instables dans l’eau,
mais les concentrations de la substance à expérimenter sont déterminées
chaque fois que c’est possible. La méthode statique est limitée à l’étude
des substances dont les concentrations expérimentales restent rela-
tivement constantes pendant la durée de l’essai. La méthode semi-
statique peut être utilisée pour expérimenter des substances dont les
concentrations peuvent être maintenues constantes, de façon satisfai-
sante, tout au long de l’essai par le renouvellement des solutions toutes
les 24 h ou 48 h. Des adaptations peuvent être nécessaires pour les
substances hautement volatiles.
Pour faciliter la préparation et le maintien de concentrations de substances
qui peuvent être létales lorsqu’elles sont proches de la solubilité aqueuse,
il est possible d’utiliser un faible volume de solvant, comme prescrit dans
les méthodes.

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Qualité de l’eau - Détermination de la toxicité aiguë
létale de substances vis-à-vis d’un poisson d’eau douce
[ Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei,
Cyprinidae)] -
Partie 1:
Méthode statique
La méthode est également applicable à certaines au-
1 Domaine d’application
tres espèces de poissons d’eau douce comme orga-
nismes pour essais?
La présente partie de I’ISO 7346 prescrit une mé-
La méthode peut être adaptée pour d’autres poissons
thode statique pour la détermination de la toxicité ai-
d’eaux douce, marine ou saumâtre avec des modifi-
guë létale de substances simples, stables, non
cations appropriées des conditions d’essai, concer-
volatiles, solubles dans l’eau dans les conditions
nant notamment la quantité et la qualité de l’eau de
vis-à-vis d’un poisson
prescrites, d’eau douce
dilution et la température.
[ Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei,
Cyprinidae) - nom commun, poisson-zèbre], dans
une eau de qualité donnée.
2 Principe
La méthode est applicable pour chaque substance à Détermination, dans des conditions définies, des
expérimenter, pour donner une idée globale de la concentrations auxquelles une substance est létale
pour 50 % d’une population d’essai de Brachydanio
toxicité aiguë létale vis-à-vis du Brachydanio rerio,
rerio, après des périodes d’exposition à cette subs-
dans les conditions de l’essai.
tance de 24 h, 48h, 72 h et 96 h dans l’eau ambiante.
Les résultats sont en eux-mêmes insuffisants pour Ces concentrations moyennes létales sont désignées
définir des normes de qualité de l’eau en vue de la par CL50 - 24 h, CL50 - 48 h, CL50 - 72 h et CL50 -
protection de l’environnement. 96 h.
1) Les espèces suivantes de poissons d’eau douce peuvent être utilisées, en sus de Brachydanio rerio, sans modification de
la présente partie de NS0 7346:
- Lepomis macrochirus (Téléostei, Centrarchidae)
- Oryzias latipes (Téléostei, Poeciliidae)
- Pimephales promelas (Téléostei, Cyprinidae)
- Poecilia reticulata (Téléostei, Poeciliidae)
1

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ISO 7346-1: 1996(F)
L’essai est réalisé en deux étapes: Les poissons pour essai doivent être exempts de
maladies ou de malformations visibles. Ils ne doivent
a) un essai préliminaire qui donne une indication ap-
subir aucun traitement pendant l’essai ou pendant les
proximative des concentrations moyennes aiguës
2 semaines précédant l’essai. À l’issue de l’essai, il
létales et qui sert à déterminer la gamme des
convient d’éliminer de façon convenable les poissons
concentrations pour l’essai définitif;
restant en vie.
b) un essai définitif dont seuls les résultats sont re- Les conditions d’environnement pour la maintenance
portés. et l’élevage du poisson-zèbre sont données dans
l’annexe A.
S’il est manifeste que les concentrations restent rela-
tivement constantes (par exemple s’écartant au plus
de 20 % de la valeur nominale) pendant l’essai, les
3.2 Eau de dilution norma I
concentrations nominales ou mesurées sont utilisées
pour l’estimation de la CL50. Si des analyses mon-
L’eau de dilution normalisée fraîchement préparée
trent que les concentrations réelles restent rela-
doit avoir un pH de 7,8 + 0,2, une dureté calcique
tivement constantes, mais inférieures à 80 % ou
d’environ 250 mg/l, exprimée en carbonate de cal-
supérieures à 120 % des valeurs nominales, les va-
cium, et doit contenir les concentrations suivantes de
leurs analytiques sont utilisées pour l’estimation de la
sels dissous dans l’eau distillée ou déionisée:
CL50. S’il n’est pas manifeste que les concentrations
d’essai restent à un niveau acceptable pendant la du-
2940 mg/1 CaCl,,2H,O
rée de l’essai ou s’il est connu (ou suspecté) que les
concentrations de la substance d’essai ont décru si- 123,3 mg/1 MgSOJH,O
gnificativement à un certain stade de l’essai, alors,
ô3,0 mg/1 NaHCO,
sans tenir compte des données analytiques disponi-
bles ou non, la CL50 ne peut être déterminée en uti-
5,5 mg/1 KCI
lisant la présente méthode d’essai. Dans ce cas,
l’essai n’est pas nécessairement invalidé, mais il peut
Aérer l’eau de dilution jusqu’à ce que la concentration
seulement être établi que la CL50 de la substance est
en oxygène dissous atteigne au moins 90 % de la
< x mg/l, la valeur, X, étant estimée à partir des
valeur de saturation dans l’air et jusqu’à stabilisation
concentrations nominales utilisées.
du pH à 7,8 + 0,2. Si nécessaire, ajuster le pH de la
-
solution en ajoutant une solution d’hydroxyde de so-
3 Organismes pour essai et réactifs
dium ou de l’acide chlorhydrique. L’eau de dilution
ainsi préparée ne doit recevoir aucune aération sup-
Les réactifs chimiques doivent être de qualité analyti-
plémentaire avant emploi dans les essais.
que reconnue. L’eau utilisée pour la préparation des
solutions de réactif doit être distillée dans un appareil
en verre ou déionisée d’une pureté au moins équiva-
3.3 Solutions mères des substances à
expérimenter
II convient de préparer une solution mère de la subs-
31 . Organismes pour essai
tance à expérimenter par dissolution d’une quantité
L’espèce utilisée pour l’essai doit être le Brachydanio connue de la substance dans un volume défini d’eau
rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae), ap- de dilution, d’eau déionisée ou d’eau distillée dans un
pelée communément ((poisson-zèbre)). Chaque pois- appareil en verre. Afin de permettre la préparation des
son pour essai doit avoir une longueur totale de solutions mères et d’aider à leur transfert dans les
30 mm + 5 mm ce qui, en principe, correspond à une récipients d’essais, les substances de faible solubilité
-
masse de 0,3 g + 0,l g. Ils doivent être sélectionnés aqueuse peuvent être solubilisées ou dispersées par
à partir d’une population mère unique. II convient que des moyens adéquats, tels que des dispositifs à ul-
cette population mère ait été acclimatée et, dans tous trasons et des solvants organiques de faible toxicité
vis-à-vis du poisson. Lorsqu’un solvant organique est
les cas, maintenue au moins 7 jours avant l’essai dans
employé, sa concentration dans la solution d’essai ne
l’eau de dilution, aérée de manière continue par
barbotage d’air (voir 3.2), dans des conditions de doit pas excéder 0,l ml/l ou un volume contenant
qualité de l’eau et d’éclairement semblables à celles 0,l g/l (prendre en compte la valeur la plus élevée).
utilisées pour l’essai. Ils doivent être nourris nor- Lorsqu’un solvant est utilisé, deux jeux d’essais té-
moins, l’un contenant le solvant à la concentration
malement jusqu’aux 24 h précédant immédiatement
maximale utilisée dans les récipients d’essais et I’au-
l’essai.
2

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0 ISO ISO 7346~1:1996( F)
Ivant ni substance à expérimen ter, doivent Éviter soigneusement toute perturbation indésirable
tre sans so
susceptible de modifier le comportement des pois-
être inclus.
sons. Réaliser les essais sous un éclairement normal
de laboratoire d’une photopériode quotidienne de
3.4 Solutions d’essai
12 h à 16 h.
Les solutions d’essai sont préparées par ajout des
quantités appropriées de la solution mère de la subs- 6 Mode opératoire
tance à expérimenter à l’eau de dilution pour obtenir
les concentrations nécessaires. II est recommandé,
6.1 État des poissons
lorsqu’une solution mère est préparée dans de l’eau
déionisée ou de l’eau distillée, de ne pas ajouter plus
En cas de changement de la population mère, effec-
de 100 ml de la solution mère pour 10 litres d’eau de
tuer un essai de toxicité selon la méthode définie
dilution.
dans la présente partie de I’ISO 7346 en utilisant un
produit chimique de référence approprié [par exemple
le dichromate de potassium (K,Cr,O,)]. Les résultats
4 Appareillage
de tels essais doivent être en accord raisonnable avec
les résultats obtenus précédemment par le même la-
Tout matériau qui est susceptible d’entrer en contact
boratoire.
avec tout liquide dans lequel les poissons sont placés
ou avec lequel ils sont mis en contact doit être inerte
soumis à 1’ oivent pas avoir été
Les poissons essai ne d
et ne doit pas adsorber significativement la substance
utilisés dans des essais antérieurs
à expérimenter.
Maintenir la température de l’eau dans les récipients
Matériel courant de laboratoire et ce qui suit.
de stockage à 23 “C + 1 “C (4.2).
4.1 Récipients d’essais, de capacité suffisante (une
6.2 Essai de limite
capacité supérieure à 10 litres peut être nécessaire),
avec une grande aire d’interface entre l’air et le milieu
En utilisant les modes opératoires décrits dans la
d’essai (d’environ 800 cm* pour 10 litres de milieu)
présente partie de I’ISO 7346, un essai de limite peut
et équipés d’un couvercle sûrement fixé. II convient
être réalisé à la limite de solubilité aqueuse dans les
que la capacité des récipients d’essais soit suffisante
conditions de l’essai ou à 100 mg/1 (prendre en
afin de ne pas dépasser, à aucun moment de l’essai,
compte la valeur la plus faible), afin de démontrer que
un rapport massique de 1 g de poisson par litre d’eau.
la CL50 - 96 h est plus élevée que cette concen-
tration. Si aucun poisson ne meurt lors de l’essai de
Avant emploi, les récipients d’essais doivent être soi-
limite, aucun essai supplémentaire n’est requis.
gneusement nettoyés, par exemple à l’aide d’un dé-
tergent non ionique (suivi par des lavages à l’aide
Réaliser l’essai de limite à partir de 10 poiss ons, avec
d’acide et de solvant pour les substances suscepti-
un nombre identique dans le(s) témoin(s).
bles de s’adsorber dans le récipient d’essais).
NOTE 1 La théorie binomiale impose que lorsque 10
poissons sont utilisés, avec une mortalité nulle, il est sûr à
4.2 Dispositif de contrôle de la température, pour
99,9 % que la CL50 - 96 h est plus élevée que la concen-
réguler la température des solutions d’essai et de
tration de l’essai de limite. En cas de mortalité, il peut être
l’eau dans les récipients de stockage, à 23 “C & 1 “C
nécessaire d’envisager une étude plus approfondie (voir 6.3
à l’aide d’une méthode appropriée.
et 6.4). Si des effets sublétaux sont observés, il convient
de les consigner.
4.3 Filet, en nylon ou en un autre matériau chimi-
6.3 Essai préliminaire
quement inerte, pour les récipients de contrôle et un
autre pour tous les récipients d’essais (4.1).
Placer au moins 2,5 litres, de préférence 5 litres,
d’eau de dilution normalisée (3.2) dans six récipients
5 Environnement de l’essai
d’essais (4.1) et les aérer si nécessaire pour restituer
la concentration en oxygène dissous à au moins
La préparation et la conservation des solutions, la
90 % de sa valeur de saturation dans l’air.
conservation des poissons et l’ensemble des mani-
Préparer les solutions d’essai par addition des quanti-
pulations et des essais doivent être réalisés dans des
locaux dont l’atmosphère est exempte de contami- tés appropriées de la solution mère de la substance
nants de l’air à des concentrations nocives. à expérimenter (3.3) à cinq des récipients afin d’obte-
3

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*
0 ISO
ISO 7346~1:1996( F)
nir une gamme adéquate de concentrations en pro- sais, sans délai, à l’aide d’un filet à petites mailles
gression géométrique, par exemple 1 000 mg/l, constitué d’un matériau doux inerte (4.3). Écarter tout
1
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