ISO 21872-1:2017

Microbiology of the food chain - Horizontal method for the determination of Vibrio spp. - Part 1: Detection of potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus

ISO 21872-1:2017 specifies a horizontal method for the detection of enteropathogenic Vibrio spp., which causes human illness in or via the intestinal tract. The species detectable by the methods specified include Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus. ISO 21872-1:2017 is applicable to the following: - products intended for human consumption and the feeding of animals; - environmental samples in the area of food production and food handling.

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la détermination des Vibrio spp. — Partie 1: Recherche des espèces de Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae et Vibrio vulnificus potentiellement entéropathogènes

ISO 21872-1:2017 spécifie une méthode horizontale pour la recherche des espèces entéropathogènes de Vibrio provoquant des maladies dans ou via le tractus intestinal chez l'homme. Les espèces détectables par les méthodes spécifiées incluent Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae et Vibrio vulnificus. ISO 21872-1:2017 s'applique: - aux produits destinés à la consommation humaine et à l'alimentation animale; - aux échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de denrées alimentaires.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 09-Jul-2017
• ICS: 07.100.30 - Food microbiology
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 9 - Microbiology
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 9/WG 27 - Vibrios
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Start Date: 21-Feb-2023
• Completion Date: 13-Dec-2025

Relations

• Amended By: ISO 21872-1:2017/Amd 1:2023 - Microbiology of the food chain - Horizontal method for the determination of Vibrio spp. - Part 1: Detection of potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus - Amendment 1: Inclusion of performance testing of culture media and reagents
• Effective Date: 08-Jan-2022
• Revises: ISO/TS 21872-2:2007 - Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. - Part 2: Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae
• Effective Date: 19-Aug-2017
• Revises: ISO/TS 21872-1:2007 - Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. - Part 1: Detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae
• Effective Date: 08-Jul-2017

Overview

ISO 21872-1:2017 - Microbiology of the food chain - Horizontal method for the determination of Vibrio spp. - Part 1 - specifies a horizontal detection method for potentially enteropathogenic Vibrio species, including Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus. The standard is applicable to food and feed products and to environmental samples in food production and handling areas. It includes both traditional culture-based workflows and optional molecular identification methods for major food‑borne Vibrio spp.

Key topics and technical requirements

• Scope and applicability: Designed for products intended for human consumption, animal feed and environmental monitoring around food production and handling.
• Method principle: A staged approach including primary and secondary selective enrichment, isolation on selective solid media, and confirmation by biochemical and/or molecular methods.
• Culture media and reagents: Specifies enrichment medium (alkaline saline peptone water, ASPW), selective isolation media (e.g., TCBS agar), saline nutrient agar and reagents for oxidase and biochemical assays (L‑lysine decarboxylase, arginine dihydrolase, indole, β‑galactosidase).
• Molecular options: Incorporates optional PCR and real‑time PCR procedures for species and virulence gene detection (see Annexes C and D).
• Quality/performance: Includes performance characteristics, interlaboratory study results and limits of detection (Annex E and Clause 11).
• Safety: Emphasizes that testing (particularly for toxigenic V. cholerae) must be conducted in suitably equipped laboratories under experienced supervision and with careful disposal of contaminated materials.

Practical applications and users

ISO 21872-1:2017 is used by:

• Food testing laboratories and microbiology analysts validating presence/absence of Vibrio spp.
• Public health and regulatory agencies conducting surveillance of seafood and other foodborne Vibrio risks.
• Seafood processors, aquaculture and food safety teams implementing incoming raw material and environmental monitoring programs.
• Research and reference laboratories applying molecular confirmation for virulence genes and species identification.

Benefits:

• Provides a harmonized, validated framework for detection of major foodborne Vibrio species.
• Supports compliance, risk assessment and outbreak investigation in the food chain.

Related standards

Normative references and related ISO documents cited include:

• ISO 6887‑1:2017 and ISO 6887‑3 (sample preparation)
• ISO 7218 (general requirements for microbiological examinations)
• ISO 11133 (culture media production and testing)
• ISO 22118 (molecular methods guidance)

Keywords: ISO 21872-1:2017, Vibrio spp., Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, horizontal method, food safety, TCBS, ASPW, PCR, microbiology of the food chain.

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21872-1
First edition
2017-06
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the
determination of Vibrio spp. —
Part 1:
Detection of potentially
enteropathogenic Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio cholerae and
Vibrio vulnificus
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la détermination des Vibrio spp. —
Partie 1: Recherche des espèces de Vibrio parahaemolyticus, Vibrio
cholerae et Vibrio vulnificus potentiellement entéropathogènes
Reference number
©
ISO 2017
© ISO 2017, Published in Switzerland
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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
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Fax [phone]
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Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Primary enrichment in a liquid selective medium . 2
4.3 Secondary enrichment in a liquid selective medium . 3
4.4 Isolation and identification . 3
4.5 Confirmation . 3
5 Culture media and reagents . 3
5.1 Enrichment medium: alkaline saline peptone water (ASPW). 4
5.2 Solid selective isolation media . 4
5.2.1 First medium: thiosulphate, citrate, bile and sucrose agar medium (TCBS) . 4
5.2.2 Second medium. 4
5.3 Saline nutrient agar (SNA) . 4
5.4 Reagent for detection of oxidase . 4
5.5 Biochemical tests . 4
5.5.1 L-lysine decarboxylase saline medium (LDC) . 4
5.5.2 Arginine dihydrolase saline medium (ADH) . 4
5.5.3 Reagent for detection of β-galactosidase . 5
5.5.4 Saline medium for detection of indole . 5
5.5.5 Saline peptone waters . 5
5.5.6 Sodium chloride solution . 5
5.6 PCR . 5
5.6.1 Tris acetate EDTA buffer (TAE) (or a buffer allowing similar performance
for the purpose) . 5
5.6.2 Mastermix . 5
5.6.3 Primers and probes . 5
5.6.4 Positive control material . 5
5.6.5 Negative extraction control . 6
6 Equipment and consumables . 6
7 Sampling . 6
8 Preparation of the test sample . 6
9 Procedure (See Figure A.1) . 7
9.1 Test portion and initial suspension . 7
9.2 Primary selective enrichment . 7
9.3 Secondary selective enrichment . 7
9.4 Isolation and identification . 8
9.5 Confirmation . 8
9.5.1 General. 8
9.5.2 Selection of colonies for confirmation and preparation of pure cultures . 9
9.5.3 Tests for presumptive identification . 9
9.5.4 Biochemical confirmation .10
9.5.5 PCR confirmation .12
9.5.6 DNA extraction .12
9.5.7 Conventional PCR .12
9.5.8 Real-time PCR .13
10 Expression of results .13
11 Performance characteristics of the method .13
11.1 Interlaboratory study .13
11.2 Sensitivity .14
11.3 Specificity .14
11.4 LOD .14
12 Test report .14
Annex A (normative) Diagram of procedure .15
Annex B (normative) Composition and preparation of the culture media and reagents .17
Annex C (informative) Conventional PCR for the detection of Vibrio parahaemolyticus,
thermostable direct haemolysin (tdh) and thermostable direct related haemolysin
(trh) genes, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus .23
Annex D (informative) Real-time PCR for the detection of Vibrio parahaemolyticus,
thermostable direct haemolysin gene (tdh) and Vibrio vulnificus .27
Annex E (informative) Results of an interlaboratory study .29
Bibliography .32
iv © ISO 2017 – All rights reserved

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,
as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the
Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www . i so .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the agreement
on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This first edition cancels and replaces ISO/TS 21872-1:2007, which has been technically revised. It also
incorporates ISO/TS 21872-1:2007/Cor.1:2008.
The main changes are as follows:
— introduction of optional molecular identification methods for major food borne Vibrio spp.
(V. parahaemolyticus, including potentially enteropathogenic strains, V. vulnificus and V. cholerae);
— performance characteristics of the method have been added in Annex E.
A list of all parts in the ISO 21872 series can be found on the ISO website.
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, the horizontal method described in this
document may not be appropriate in every detail for certain products. In this case, different methods,
which are specific to these products may be used if absolutely necessary for justified technical reasons.
Nevertheless, every attempt will be made to apply this horizontal method as far as possible.
The main changes, listed in the foreword, introduced in this document compared to ISO/TS 21872-
1:2007 are considered as major (see ISO 17468).
When this document is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from this
method in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain groups of products,
International Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this
horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply
with this document so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will
be those necessary for well-established technical reasons.
vi © ISO 2017 – All rights reserved

INTERNATIONAL STANDARD ISO 21872-1:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the determination of Vibrio spp. —
Part 1:
Detection of potentially enteropathogenic Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that
tests for detection of Vibrio spp., and particularly toxigenic Vibrio cholerae, be conducted
only in laboratories equipped for this purpose and under the supervision of an experienced
microbiologist, and that great care is exercised in the disposal of contaminated material.
1 Scope
This document specifies a horizontal method for the detection of enteropathogenic Vibrio spp., which
causes human illness in or via the intestinal tract. The species detectable by the methods specified
include Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus.
It is applicable to the following:
— products intended for human consumption and the feeding of animals;
— environmental samples in the area of food production and food handling.
NOTE 1 This method may not be appropriate in every detail for certain products (see Introduction).
NOTE 2 The World Health Organization (WHO) has identified that V. parahaemolyticus, V. cholerae and V.
vulnificus are the major food-borne Vibrio spp. However, the method in this document can also be appropriate for
[1]
the identification of other Vibrio spp. causing illness in humans.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887-1:2017, Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions
ISO 6887-3, Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and decimal
dilutions for microbiological examination — Part 3: Specific rules for the preparation of fish and fishery
products
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
ISO 22118, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection and quantification of food-borne pathogens — Performance characteristics
ISO 22119, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Real-time polymerase chain reaction (PCR) for
the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
potentially enteropathogenic Vibrio spp.
microorganism which forms typical colonies on solid selective media and which possesses the described
biochemical or molecular characteristics when the test is performed in accordance with this document
Note 1 to entry: This document describes specific procedures for V. parahaemolyticus, V. cholerae and V. vulnificus.
3.2
detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp.
determination of the presence or absence of potentially enteropathogenic Vibrio spp. (3.1)
(V. parahaemolyticus, V. cholerae and V. vulnificus) in a determined quantity of product, when the test is
performed in accordance with this document
4 Principle
4.1 General
The detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. (V. parahaemolyticus, V. cholerae and
V. vulnificus) requires four successive phases, as shown in the procedure diagram in Annex A.
Recovery of certain Vibrio spp. from foodstuffs may be improved by the use of different incubation
temperatures depending upon the target species or state of the food matrix. For example, recovery of
V. parahaemolyticus and V. cholerae in fresh products is enhanced by enrichment at 41,5 °C whereas
[2]
for V. vulnificus, and for V. parahaemolyticus and V. cholerae in deep frozen (<−18 °C), dried or salted
products, recovery is enhanced by enrichment at 37 °C. If detection of V. parahaemolyticus, V. cholerae
and V. vulnificus is required, all specified incubation temperatures should be used. If detection of
V. parahaemolyticus, V. cholerae and V. vulnificus together is not required, the specific procedure(s) may
be selected according to the species being sought. Such a selection should be clearly specified in the
test report.
NOTE V. parahaemolyticus, V. cholerae and V. vulnificus may be present in small numbers and are often
accompanied by a much larger number of other microorganisms belonging to the Vibrionaceae family or to other
families.
4.2 Primary enrichment in a liquid selective medium
Inoculation of the test portion in the primary enrichment medium alkaline saline peptone water
(ASPW) (5.1) at ambient temperature, followed by incubation at 41,5 °C for 6 h and/or 37 °C for 6 h.
The incubation conditions are determined by the target species and food product state.
For detection of all target species in deep frozen, dried or salted products, primary enrichment should
be at 37 °C.
2 © ISO 2017 – All rights reserved

For detection of V. vulnificus in all products, primary enrichment should be at 37 °C.
For detection of V. parahaemolyticus and/or V. cholerae only, in fresh products, primary enrichment
should be at 41,5 °C.
4.3 Secondary enrichment in a liquid selective medium
Inoculation of the second enrichment medium (ASPW) with the cultures obtained in 4.2.
Incubation of inoculated enrichment medium at 41,5 °C for 18 h and/or 37 °C for 18 h.
For detection of V. vulnificus in all products, secondary enrichment should be at 37 °C.
For detection of V. parahaemolyticus and/or V. cholerae only, in all products, secondary enrichment
should be at 41,5 °C.
4.4 Isolation and identification
From the cultures obtained in 4.2 and in 4.3, inoculation of two solid selective media:
— thiosulfate citrate bile and sucrose agar (TCBS) medium (5.2.1);
— another appropriate solid selective medium (left to the choice of the laboratory), such as chromogenic
agar, complementary to the TCBS medium (5.2.2).
Incubation of the TCBS medium at 37 °C, then examination after 24 h. Incubation of the second selective
medium according to the manufacturer’s recommendations.
4.5 Confirmation
Presumptive colonies of V. parahaemolyticus, V. cholerae and V. vulnificus isolated in 4.4 are subcultured
and confirmed by means of appropriate biochemical and/or polymerase chain reaction (PCR) tests.
Biochemical and/or PCR confirmation of isolates may be used for species identification, however,
reliable detection of enteropathogenic V. parahaemolyticus as determined by presence of the direct
thermostable haemolysin (tdh) and/or direct related haemolysin (trh) genes can only be carried out
using PCR tests.
It has been demonstrated that by screening ASPW broths using conventional PCR, the absence of
[3]
amplification of Vp-toxR can indicate no detection of V. parahaemolyticus. To reduce the amount
of downstream testing and, if shown to be reliable by the user laboratory, screening of incubated
enrichment broths may be used. This approach is only recommended after secondary enrichment and
does not apply to molecular targets for other Vibrio spp.
NOTE 1 Validation data generated in the preparation of this document demonstrated that PCR based
identification can be achieved by conventional PCR for V. parahaemolyticus, V. vulnificus and V. cholerae or real-
time PCR for V. parahaemolyticus and V. vulnificus. The PCR methods used in the development of this document
are given in Annexes C and D.
NOTE 2 Validation data for screening of secondary enrichment broths for amplification of Vp-toxR were not
generated in the preparation of this document.
5 Culture media and reagents
For general laboratory practice, refer to ISO 7218.
For clarity of the text, details of the composition of culture media and reagents and their preparation
are described in Annex B.
For performance testing of culture media, refer to ISO 11133.
NOTE Primers, probes and PCR running conditions used in the development of this document are given in
Annexes C and D.
5.1 Enrichment medium: alkaline saline peptone water (ASPW)
As specified in B.1.
5.2 Solid selective isolation media
5.2.1 First medium: thiosulphate, citrate, bile and sucrose agar medium (TCBS)
As specified in B.2. See Table 1 for performance testing data.
Table 1 — Performance testing of thiosulphate, citrate, bile and sucrose agar medium (TCBS)
a e
Function Incubation Control strains WDCM Method of Criteria Characteristic
control reactions
b
Productivity 37 °C ± 1 °C for Vibrio parahaemolyticus 00185 Qualitative Good Green colonies
24 h ± 3 h growth (2) (sucrose negative)
b
37 °C ± 1 °C for Vibrio furnissii 00186 Qualitative Good Yellow colonies
24 h ± 3 h growth (2) (sucrose positive)
c d
Selectivity 37 °C ± 1 °C for Escherichia coli 00012, Qualitative Total
24 h ± 3 h 00013 or inhibition —
00090 (0)
a
World Data Centre for Microorganisms (WDCM) strain catalogue available at http:// refs .wdcm .org
b
Strain to be used as a minimum (see ISO 11133).
c
Some national restrictions and directions may require the use of a different E. coli serovar. Make reference to national
requirements relating to the choice of E. coli serovars.
d
Strain free of choice; one of the strains shall be used as a minimum (see ISO 11133).
e
Growth is categorized as 0: no growth, 1: weak growth (partial inhibition), and 2: good growth (see ISO 11133).
5.2.2 Second medium
The selection of the second medium is left to the choice of the test laboratory. Preparation of the medium
should be strictly according to the manufacturer’s instructions.
5.3 Saline nutrient agar (SNA)
As specified in B.3.
5.4 Reagent for detection of oxidase
As specified in B.4.
5.5 Biochemical tests
5.5.1 L-lysine decarboxylase saline medium (LDC)
As specified in B.5.
5.5.2 Arginine dihydrolase saline medium (ADH)
As specified in B.6.
4 © ISO 2017 – All rights reserved

5.5.3 Reagent for detection of β-galactosidase
As specified in B.7.
5.5.4 Saline medium for detection of indole
As specified in B.8.
5.5.5 Saline peptone waters
As specified in B.9.
5.5.6 Sodium chloride solution
As specified in B.10.
5.6 PCR
5.6.1 Tris acetate EDTA buffer (TAE) (or a buffer allowing similar performance for the
purpose)
As specified in B.11.
5.6.2 Mastermix
Reagents shall be added in quantities as specified by the manufacturer’s instructions. See Annexes C
and D for example details of master mixes used in the development of this document.
5.6.3 Primers and probes
Primer (and hydrolysis probe) sequences if required shall be published in a peer-reviewed journal and
be verified for use against a broad range of target Vibrio spp. and non-target strains. With advances
in whole genome sequencing of bacterial strains, more appropriate species-specific markers may be
identified in the future.
For V. parahaemolyticus the target region should be toxR.
For determination of pathogenic strains of V. parahaemolyticus genes encoding the thermostable direct
(TDH) and the thermostable direct related (TRH) haemolysins should be targeted.
For V. cholerae the target region for conventional PCR should be the 16S-23S rRNA intergenic spacer
region prVC.
For V. vulnificus the target region should be the V. vulnificus haemolysin region (vvha).
Target regions other than those specified above for the identification of V. parahaemolyticus, V. vulnificus
and V. cholerae can be used if they have been shown to demonstrate equivalent performance to those
used in the development of this document and described in Annexes C or D, are published in a peer-
reviewed journal and are verified against a broad range of target Vibrio spp. and non-target strains.
See Annex C for example details of primers used for conventional PCR and Annex D for primers and
hydrolysis probes for real-time PCR used in the development of this document.
5.6.4 Positive control material
Separate control material shall be used for each target Vibrio spp. See Annexes C and D for example
details of control strains used in the development of this document.
5.6.5 Negative extraction control
Nuclease free water or sterile NaCl 0,85 % extracted according to 9.5.6.
6 Equipment and consumables
Disposable equipment is acceptable in the same way as reusable glassware, if the specifications are
similar.
Ordinary microbiology laboratory equipment as specified in ISO 7218, and in particular the following.
6.1 Refrigerator, adjustable to 5 °C ± 3,0 °C.
6.2 Incubator, adjustable to 37 °C ± 1,0 °C.
6.3 Incubator, adjustable to 41,5 °C ± 1,0 °C.
6.4 Freezer, adjustable to <−15 °C.
6.5 Micro-centrifuge tubes, with a capacity of 1,5 ml and 2,0 ml.
6.6 Micro-centrifuge, for reaction tubes with a capacity of 1,5 ml and 2,0 ml and capable of running at
10 000g.
6.7 Heating block capable of operating at 95 °C ± 2,0 °C or equivalent.
6.8 Vortex.
6.9 Graduated pipettes and pipette filter tips, for volumes between 1 µl and 1 000 µl.
6.10 Associated consumables for conventional or real-time PCR, e.g. optical plates and caps, optical
plate holder, suitable for use with the selected PCR machine.
6.11 Conventional or real-time PCR machine, gel electrophoresis and UV visualization equipment as
appropriate.
7 Sampling
It is important that the laboratory receives a truly representative sample which has not been damaged
or modified during transport and storage.
Sampling does not form part of the method specified in this document. See the International Standard
specific to the relevant product. If a specific document does not exist, it is recommended that the
relevant parties reach agreement on this subject.
8 Preparation of the test sample
Prepare the test sample in accordance with ISO 6887-1 and ISO 6887-3 and/or the document concerning
the product to be examined. If a specific document does not exist, it is recommended that the relevant
parties reach agreement on this subject.
6 © ISO 2017 – All rights reserved

9 Procedure (See Figure A.1)
9.1 Test portion and initial suspension
This document has been validated for test portions of up to 25 g or 25 ml. A smaller test portion may be
used without the need for additional validation/verification provided that the same ratio between (pre-)
enrichment broth and test portion is maintained. A larger test portion than that initially validated may
be used if a validation/verification study has shown that there are no adverse effects on the detection
of Vibrio spp.
NOTE Validation can be conducted in accordance with the appropriate document of ISO 16140 (all parts).
Verification for pooling samples can be conducted in accordance with the protocol described in ISO 6887-1:2017,
Annex D.
For the preparation of the initial suspensions, use the first enrichment medium (ASPW) specified in 5.1.
Take test portions (25 g or 25 ml) and homogenize in 225 ml of enrichment medium.
In the case of large quantities (greater than 25 g or 25 ml), the ASPW should be warmed to 37 °C ± 1 °C
and/or 41,5 °C ± 1 °C (4.2) before inoculation with the test portion.
In order to reduce the amount of examination work, where more than one 25 g or 25 ml test portion
stemming from a determined batch of food is to be examined, and where proof is available indicating
that a mixture (gathering together the test portions) does not modify the results concerning this
product in particular, the test portions may be mixed. For example, if 10 test portions of 25 g or 25 ml
are to be examined, it is possible to combine these 10 units in order to obtain a composite sample of
250 g or 250 ml and to add 2,25 l of enrichment medium.
Cell counts of Vibrio spp. potentially decline significantly on storage at refrigeration temperatures.
Storage of samples and, to a lesser extent, of suspensions at such temperatures should be avoided where
possible and should otherwise be kept to a minimum.
9.2 Primary selective enrichment
Incubate the initial suspensions (9.1) at 41,5 °C ± 1 °C and/or 37 °C ± 1 °C for 6 h ± 1 h according to
Table 2.
Table 2 — Primary incubation and target species/product state
Target Vibrio spp. in fresh product
Vibrio
a
Incubation temperature Vibrio cholerae Vibrio vulnificus
parahaemolyticus
41,5 °C ± 1 °C  
37 °C ± 1 °C 
Target Vibrio spp. in deep frozen, dried or salted product (such as bacalhau, stockfish, boknafisk, katsuo-
bushi, obambo)
Vibrio
a
Incubation temperature Vibrio cholerae Vibrio vulnificus
parahaemolyticus
41,5 °C ± 1 °C
37 °C ± 1 °C   
a
Vibrio spp. other than those listed in Reference [1], such as V. alginolyticus, may be recovered at these incubation
temperatures.
9.3 Secondary selective enrichment
Transfer 1 ml of the culture obtained in 9.2 taken from the surface into a tube containing 10 ml of ASPW
(5.1). It is recommended that the sample is not agitated before taking the aliquot.
Incubate the ASPW at 41,5 °C ± 1 °C and/or 37 °C ± 1 °C for 18 h ± 1 h according to Table 3.
NOTE Cultures and/or boiled broths obtained in 9.3 can be screened using PCR
Table 3 — Secondary incubation and target species/product state
Target Vibrio spp. in all product states
a
Incubation temperature Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae Vibrio vulnificus
 
41,5 °C ± 1 °C
37 °C ± 1 °C 
a
Vibrio spp. other than those listed in Reference [1], such as V. alginolyticus, may be recovered at these incubation
temperatures.
9.4 Isolation and identification
From the cultures obtained in the ASPW (9.2 and 9.3), inoculate with a 1 μl sampling loop the surface of
a TCBS agar plate (5.2.1), so as to permit the development of well-isolated colonies.
Proceed likewise with the chosen second selective isolation medium (5.2.2) using a fresh sampling loop.
Invert the agar plates:
— for TCBS agar plates, incubate at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h;
— for the second isolation medium, incubate according to the manufacturer’s instructions.
After incubation, examine the TCBS and second selective medium for the presence of typical colonies of
presumptive pathogenic Vibrio spp. Mark their position on the bottom of the plates.
On TCBS agar V. parahaemolyticus, V. vulnificus, and V. cholerae exhibit different typical colony
morphologies:
— typical colonies of V. parahaemolyticus and V. vulnificus are smooth, green (negative sucrose) and of
2 mm to 3 mm in diameter;
— typical colonies of V. cholerae are smooth, yellow (positive sucrose) and of 1 mm to 2 mm in diameter.
For the second selective medium, examine for the presence of colonies, which, according to their
characteristics, may be considered as possible isolates of V. parahaemolyticus, V. vulnificus, and/or V.
cholerae.
NOTE 1 Vibrio spp. other than those listed in Reference [1], such as V. alginolyticus, can be recovered on TCBS
and the second selective medium.
NOTE 2 Recognition of colonies of Vibrio spp. is largely a question of experience and their appearance can
sometimes vary, not only from one species to another, but also from one batch of culture medium to another.
NOTE 3 For enhanced recovery of V. vulnificus, medium containing derivatives of cellobiose-polymyxin
[4]
B-colistin and cellobiose-colistin has been shown to be effective.
9.5 Confirmation
9.5.1 General
Using this document, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, and V. cholerae can be confirmed by molecular
PCR and/or biochemical approaches. Confirmation may be carried out at the end user laboratory or by a
specialist reference laboratory. Other Vibrio spp. may be isolated using this document.
Not all V. parahaemolyticus possess pathogenicity traits. In order to confirm the pathogenic character
of the strains, it is preferable to detect the presence of thermostable direct haemolysin (tdh) or TDH-
8 © ISO 2017 – All rights reserved

related haemolysin (trh) genes. This should be carried out using PCR tests. PCR based confirmation
also may reduce the subjective interpretation of biochemical identification tests and accelerate the
identification process.
If shown to be reliable, commercially available biochemical test kits may be used to identify Vibrio to
the species level provided they are inoculated with a suspension of the bacteria to be identified in a
sufficiently saline medium or dilution fluid, and as long as the database or identification table for the
product has been based on reactions obtained using similar media to those described in this document.
These kits shall be used in accordance with the manufacturer’s instructions.
If shown to be reliable, commercially available molecular detection kits may be used to identify Vibrio
to the species level. These kits shall be used in accordance with the manufacturer’s instructions.
9.5.2 Selection of colonies for confirmation and preparation of pure cultures
For confirmation, subculture from each selective medium (9.4) at least one well isolated colony
considered to be typical or similar to each of the potentially pathogenic Vibrio spp. sought. If the result
of the first isolated colony tested is negative, a further four well isolated colonies should be tested.
In samples where it is considered important to optimize the detection of potentially pathogenic V.
parahaemolyticus based upon the presence of thermostable direct and thermostable direct related
haemolysins, it is recommended that at least five and, where possible, all colonies exhibiting typical V.
parahaemolyticus colony morphology are sub-cultured for downstream testing.
Inoculate the colonies selected onto the surface of plates of saline nutrient agar (SNA) (5.3) or suitable
medium of the laboratory’s choice to obtain isolated colonies. Incubate at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h.
NOTE 1 Food, especially seafood, may contain large numbers of bacteria, including non-pathogenic Vibrio spp.
which may grow through the selective culture process. Subculture of small numbers of colonies may result in
potentially pathogenic species being missed. This is particularly critical with the use of TCBS on which non Vibrio
spp. or non-enteropathogenic Vibrio spp. colonies may be morphologically similar to enteropathogenic species.
NOTE 2 The proportion of pathogenic strains in environmental and food samples is usually low (for V.
parahaemolyticus they usually represent less than 5 % of the total V. parahaemolyticus present in a sample) and
thus the likelihood of detecting pathogenic strains by sub-culturing a small number of colonies for identification
and confirmation is very low. Confirmation of as many colonies as possible and preferably all colonies increases
the likelihood of detecting pathogenic strains.
9.5.3 Tests for presumptive identification
9.5.3.1 Oxidase test
Using a sampling loop, platinum iridium straight wire or glass rod, take a portion of the pure culture
from the saline nutrient agar (9.5.2) and streak onto the filter paper moistened with oxidase reagent
(5.4) or use a commercially available test, following the manufacturer’s instructions. Neither a nickel-
chromium sampling loop nor a metallic wire shall be used. Nickel or chrome wire sampling loops may
give false-positive results, and should be avoided.
9.5.3.2 Microscopic examination (optional)
For each pure culture obtained in 9.4, test according to a) and b).
a) Prepare a film for Gram staining; see ISO 7218. After staining, examine for morphology and the
Gram reaction using a microscope and record the results.
b) Inoculate a tube of ASPW (5.1). Incubate at 37 °C ± 1 °C for 1 h to 6 h. Deposit a drop of the culture
onto a clean slide, cover with a cover slip and examine for the motility under the microscope. Note
the cultures showing a positive result for motility.
9.5.3.3 Selection of the cultures
For confirmation, retain the oxidase-positive colonies.
For confirmation, also retain Gram-negative colonies which give a positive result in the motility test
(if examined).
9.5.4 Biochemical confirmation
9.5.4.1 General
Using an inoculation loop, inoculate the media indicated in 9.5.4.2 to 9.5.4.6 with each of the cultures
obtained from the colonies retained in 9.5.2.
9.5.4.2 L-lysine decarboxylase saline medium (5.5.1)
Inoculate the liquid medium just below the surface. Add about 1 ml of sterile mineral oil on the top of
the medium.
Incubate at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h.
Turbidity and a violet colour after incubation indicate a positive reaction (bacterial growth and
decarboxylation of the L-lysine). A yellow colour indicates a negative reaction.
9.5.4.3 Arginine dihydrolase saline medium (5.5.2)
Inoculate the liquid medium just below the surface. Add about 1 ml of sterile mineral oil on the top of
the medium.
Incubate at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h.
Turbidity and a violet colour after incubation indicate a positive reaction (bacterial growth and
dihydrolation of arginine). A yellow colour indicates a negative reaction.
9.5.4.4 Detection of β-galactosidase (5.5.3)
Inoculate the presumptive colony into a tube containing 0,25 ml of sodium chloride solution (5.5.6).
Add one drop of toluene and shake the tube.
Place the tube in the incubator (6.2) set at 37 °C ± 1 °C and leave to stand for approximately 5 min.
Add 0,25 ml of the reagent for the detection of β-galactosidase and mix.
Replace the tube in the water bath set at 37 °C ± 1 °C, leave to stand for 24 h ± 3 h, examining it from
time to time.
A yellow colour indicates a positive reaction (presence of β-galactosidase). The reaction is often visible
after 20 min. Absence of colouring after 24 h indicates a negative reaction.
If ready-to-use paper disks (5.5.3) are used, follow the manufacturer’s instructions.
9.5.4.5 Detection of indole (5.5.4)
Inoculate a tube containing 5 ml of the tryptophan saline medium with the presumptive colony.
Incubate at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h. After incubation, add 1 ml of Kovacs reagent (5.5.4).
The formation of a red ring indicates a positive reaction (
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21872-1
Première édition
2017-06
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la détermination des Vibrio
spp. —
Partie 1:
Recherche des espèces de Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio cholerae
et Vibrio vulnificus potentiellement
entéropathogènes
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
determination of Vibrio spp. —
Part 1: Detection of potentially enteropathogenic Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus
Numéro de référence
©
ISO 2017
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Fax [phone]
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Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principes . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Premier enrichissement en milieu sélectif liquide . 3
4.3 Second enrichissement en milieu sélectif liquide . 3
4.4 Isolement et identification . 3
4.5 Confirmation . 3
5 Milieux de culture et réactifs . 4
5.1 Milieu d’enrichissement: eau peptonée alcaline salée (EPAS) . . 4
5.2 Milieux d’isolement sélectifs solides . 4
5.2.1 Premier milieu: milieu gélosé au thiosulfate, citrate, bile et saccharose (TCBS) . 4
5.2.2 Second milieu. 5
5.3 Gélose nutritive salée (GNS) . 5
5.4 Réactif pour la recherche de l’oxydase . 5
5.5 Essais biochimiques . 5
5.5.1 Milieu salé pour la détection de la L-lysine décarboxylase (LDC) . 5
5.5.2 Milieu salé pour la détection de l’arginine dihydrolase (ADH) . 5
5.5.3 Réactif pour la recherche de β-galactosidase . . 5
5.5.4 Milieu salé pour la recherche de l’indole . 5
5.5.5 Eaux peptonées salées . 5
5.5.6 Solution de chlorure de sodium . 5
5.6 PCR . 5
5.6.1 Tampon Tris Acétate EDTA (TAE) (ou un tampon permettant d’obtenir
des performances similaires) . 5
5.6.2 Mélange réactionnel . . 5
5.6.3 Amorces et sondes. 5
5.6.4 Témoin positif . 6
5.6.5 Témoin d’extraction négatif . 6
6 Matériel et consommables . 6
7 Échantillonnage . 7
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 7
9 Mode opératoire (voir Figure A.1) . 7
9.1 Prise d’essai et suspension mère. 7
9.2 Premier enrichissement sélectif . 8
9.3 Second enrichissement sélectif. 8
9.4 Isolement et identification . 8
9.5 Confirmation . 9
9.5.1 Généralités . 9
9.5.2 Choix des colonies pour la confirmation et la préparation de cultures pures . 9
9.5.3 Essais d’identification présomptive .10
9.5.4 Confirmation biochimique .10
9.5.5 Confirmation par PCR . .12
9.5.6 Extraction d’ADN .13
9.5.7 PCR classique .13
9.5.8 PCR en temps réel .14
10 Expression des résultats.14
11 Caractéristiques de performance de la méthode .14
11.1 Étude interlaboratoires .14
11.2 Sensibilité .15
11.3 Spécificité .15
11.4 LD .15
12 Rapport d’essai .15
Annexe A (normative) Schéma du mode opératoire .16
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs .18
Annexe C (informative) PCR classique pour la recherche de Vibrio parahaemolyticus,
des gènes de l’hémolysine thermostable directe, TDH (tdh), et de l’hémolysine
apparentée à la TDH (trh), de Vibrio cholerae et de Vibrio vulnificus .24
Annexe D (informative) PCR en temps réel pour la recherche de Vibrio parahaemolyticus,
du gène de l’hémolysine thermostable directe, TDH (tdh), et de Vibrio vulnificus .29
Annexe E (informative) Résultats d’une étude interlaboratoires .32
Bibliographie .36
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits
alimentaires — Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette première édition annule et remplace l’ISO/TS 21872-1:2007, qui ont fait l’objet d’une révision
technique. Elle intègre également l’ISO/TS 21872-1:2007/Cor.1:2008.
Les principales modifications sont les suivantes:
— introduction de méthodes d’identification moléculaire facultatives pour les principales espèces
de Vibrio d’origine alimentaire (V. parahaemolyticus, y compris les souches potentiellement
entéropathogènes, V. vulnificus et V. cholerae);
— ajout des caractéristiques de performance de la méthode dans l’Annexe E.
Une liste de toutes les parties de la norme ISO 21872 se trouve sur le site web de l’ISO.
Introduction
En raison de la grande diversité des produits alimentaires et des produits destinés à l’alimentation
animale, la méthode horizontale décrite dans le présent document peut ne pas convenir exactement,
dans tous ses détails, à certains d’entre eux. Dans ce cas, des méthodes différentes, spécifiques à ces
produits, peuvent être utilisées si cela s’avère absolument nécessaire pour des raisons techniques
justifiées. Néanmoins, tous les efforts seront déployés pour appliquer cette méthode horizontale chaque
fois que cela est possible.
Les principales modifications, listées dans l’avant-propos, qui ont été introduites dans le présent
document par comparaison à l’ISO/TS 21872-1:2007 sont considérées comme majeures (voir
l’ISO 17468).
À la prochaine révision du présent document, il sera tenu compte de toutes les informations collectées
depuis sa publication, indiquant dans quelle mesure la présente méthode horizontale aura été suivie et
les raisons pour lesquelles on y aura dérogé dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être réalisée de façon immédiate et, de ce fait, il peut
déjà exister, pour certains groupes de produits, des normes internationales et/ou nationales qui ne
concordent pas avec cette méthode horizontale. Lorsque de telles normes feront l’objet d’une révision, il
serait souhaitable qu’elles soient conformes au présent document de sorte que les seuls écarts restants
de cette méthode horizontale soient ceux qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien établies.
vi © ISO 2017 – Tous droits réservés

NORME INTERNATIONALE ISO 21872-1:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la détermination des Vibrio spp. —
Partie 1:
Recherche des espèces de Vibrio parahaemolyticus,
Vibrio cholerae et Vibrio vulnificus potentiellement
entéropathogènes
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que
les essais pour la recherche des espèces de Vibrio, et en particulier des V. cholerae toxinogènes,
ne soient réalisés que dans des laboratoires équipés à cet effet et sous la surveillance d’un
microbiologiste expérimenté, et qu’un grand soin soit pris lors de l’élimination des éléments
contaminés.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour la recherche des espèces entéropathogènes
de Vibrio provoquant des maladies dans ou via le tractus intestinal chez l’homme. Les espèces
détectables par les méthodes spécifiées incluent Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae et Vibrio
vulnificus.
Le présent document s’applique:
— aux produits destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale;
— aux échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de
denrées alimentaires.
NOTE 1 Cette méthode peut ne pas être appropriée dans les moindres détails pour certains produits (voir
l’Introduction).
NOTE 2 L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a identifié V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus
comme les principales espèces de Vibrio d’origine alimentaire. Cependant, le présent document peut également
[1]
convenir pour l’identification des autres espèces de Vibrio provoquant des maladies chez l’homme.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887-1:2017, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la
préparation de la suspension mère et des dilutions décimales
ISO 6887-3, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 3: Règles spécifiques pour la
préparation des produits de la pêche
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 22118, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection et
la quantification des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Caractéristiques de performance
ISO 22119, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour la
détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp
3.1
espèces de Vibrio potentiellement entéropathogènes
micro-organismes formant des colonies caractéristiques sur des milieux sélectifs solides et possédant
les caractéristiques biochimiques ou moléculaires décrites, lorsque l’essai est réalisé conformément au
présent document
Note 1 à l’article: Le présent document décrit des modes opératoires spécifiques pour V. parahaemolyticus,
V. cholerae et V. vulnificus.
3.2
recherche des espèces de Vibrio potentiellement entéropathogènes
détermination de la présence ou de l’absence d’espèces de Vibrio potentiellement entéropathogènes (3.1)
(V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus) dans une quantité spécifiée de produit, lorsque l’essai
est réalisé conformément au présent document
4 Principes
4.1 Généralités
La recherche d’espèces de Vibrio potentiellement entéropathogènes (V. parahaemolyticus, V. cholerae
et V. vulnificus) exige quatre phases successives, comme indiqué dans le schéma du mode opératoire
figurant dans l’Annexe A.
La récupération de certaines espèces de Vibrio dans les aliments peut être améliorée en utilisant
différentes températures d’incubation en fonction de l’espèce ciblée ou de l’état de la matrice
alimentaire. Par exemple, la récupération de V. parahaemolyticus et V. cholerae dans les produits frais
est améliorée par enrichissement à 41,5 °C, alors que pour V. vulnificus, et pour V. parahaemolyticus et
[2]
V. cholerae dans les produits congelés (< −18 °C) , séchés ou salés, la récupération est améliorée par
enrichissement à 37 °C. Si la recherche de V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus est exigée,
il convient d’utiliser toutes les températures d’incubation spécifiées. Si la recherche simultanée de
V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus n’est pas exigée, le ou les modes opératoires spécifiques
2 © ISO 2017 – Tous droits réservés

peuvent être sélectionnés en fonction des espèces à rechercher. Il convient de spécifier clairement cette
sélection dans le rapport d’essai.
NOTE V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus peuvent être présents en petit nombre et sont souvent
accompagnés d’un nombre beaucoup plus grand d’autres micro-organismes appartenant à la famille des
Vibrionaceae ou à d’autres familles.
4.2 Premier enrichissement en milieu sélectif liquide
Ensemencement de la prise d’essai dans le premier milieu d’enrichissement à base d’eau peptonée
alcaline salée (EPAS) (5.1) à température ambiante, puis incubation à 41,5 °C pendant 6 h et/ou à 37 °C
pendant 6 h.
Les conditions d’incubation sont déterminées par les espèces ciblées et l’état du produit alimentaire.
Pour la recherche de toutes les espèces ciblées dans les produits congelés, séchés ou salés, il convient
d’effectuer le premier enrichissement à 37 °C.
Pour la recherche de V. vulnificus dans tous les produits, il convient de procéder au premier
enrichissement à 37 °C.
Pour la recherche de V. parahaemolyticus et/ou V. cholerae uniquement, dans les produits frais, il
convient de procéder au premier enrichissement à 41,5 °C.
4.3 Second enrichissement en milieu sélectif liquide
Ensemencement du second milieu d’enrichissement (EPAS) avec les cultures obtenues en 4.2.
Incubation du milieu d’enrichissement ensemencé à 41,5 °C pendant 18 h et/ou à 37 °C pendant 18 h.
Pour la recherche de V. vulnificus dans tous les produits, il convient de procéder au second enrichissement
à 37 °C.
Pour la recherche de V. parahaemolyticus et/ou V. cholerae uniquement, dans tous les produits, il
convient de procéder au second enrichissement à 41,5 °C.
4.4 Isolement et identification
À partir des cultures obtenues en 4.2 et en 4.3, ensemencement de deux milieux sélectifs solides:
— milieu gélosé au thiosulfate, citrate, bile et saccharose (TCBS) (5.2.1);
— un autre milieu sélectif solide approprié (dont le choix est laissé au laboratoire), tel que la gélose
chromogène, en complément du milieu TCBS (5.2.2).
Incubation du milieu TCBS à 37 °C, puis examen après 24 h. Incubation du second milieu sélectif selon
les recommandations du fabricant.
4.5 Confirmation
Les colonies présumées V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus isolées en 4.4 sont repiquées et
confirmées au moyen d’essais biochimiques appropriés et/ou d’essais de réaction de polymérisation en
chaîne (PCR).
La confirmation biochimique et/ou par PCR d’isolats peut être utilisée pour l’identification d’espèces;
toutefois, la recherche fiable de V. parahaemolyticus entéropathogènes, tels que déterminés par la
présence de gènes de l’hémolysine thermostable directe, TDH (tdh), et/ou de l’hémolysine apparentée à
la TDH (trh), ne peut être effectuée que par des essais de PCR.
Il a été démontré qu’en procédant à un criblage de bouillons d’EPAS par PCR classique, l’absence
[3]
d’amplification de Vp-toxR peut indiquer l’absence de détection de V. parahaemolyticus. Afin de réduire
le nombre d’essais en aval et si sa fiabilité a été démontrée par le laboratoire utilisateur, le criblage
de bouillons d’enrichissement incubés peut être utilisé. Cette approche est uniquement recommandée
après le second enrichissement et ne s’applique pas aux autres cibles moléculaires des espèces de Vibrio.
NOTE 1 Des données de validation générées lors de la préparation du présent document ont démontré que
l’identification par PCR peut être effectuée par une PCR classique pour V. parahaemolyticus, V. vulnificus et
V. cholerae, ou par une PCR en temps réel pour V. parahaemolyticus et V. vulnificus. Les méthodes PCR utilisées
pour l’élaboration du présent document sont décrites dans les Annexes C et D.
NOTE 2 Les données de validation pour le criblage de bouillons du second enrichissement en vue de
l’amplification de Vp-toxR n’ont pas été générées lors de la préparation du présent document.
5 Milieux de culture et réactifs
Pour les pratiques générales de laboratoire, se reporter à l’ISO 7218.
Pour la clarté du texte, les détails de la composition et de la préparation des milieux de culture et des
réactifs sont décrits dans l’Annexe B.
Pour les essais de performance des milieux de culture, se reporter à l’ISO 11133.
NOTE Les amorces, les sondes et les conditions de la PCR utilisées pour l’élaboration du présent document
sont décrites dans les Annexes C et D.
5.1 Milieu d’enrichissement: eau peptonée alcaline salée (EPAS)
Tel que spécifié en B.1.
5.2 Milieux d’isolement sélectifs solides
5.2.1 Premier milieu: milieu gélosé au thiosulfate, citrate, bile et saccharose (TCBS)
Tel que spécifié en B.2. Voir le Tableau 1 pour les données d’essai de performance.
Tableau 1 — Essais de performance du milieu gélosé au thiosulfate, citrate, bile et
saccharose (TCBS)
Méthode de Réactions
a e
Fonction Incubation Souches de contrôle WDCM Critères
contrôle caractéristiques
b
Productivité 37 °C ± 1 °C Vibrio parahaemoly- 00185 Qualitative Bonne Colonies vertes
pendant ticus croissance (saccharose négatif)
24 h ± 3 h (2)
b
37 °C ± 1 °C Vibrio furnissii 00186 Qualitative Bonne Colonies jaunes
pendant croissance (saccharose positif)
24 h ± 3 h (2)
c d
Sélectivité 37 °C ± 1 °C Escherichia coli 00012, Qualitative Inhibition
pendant 00013 ou totale (0) —
24 h ± 3 h 00090
a
Catalogue de souches du World Data Centre for Microorganisms (WDCM) disponible à l’adresse: http:// refs .wdcm .org.
b
Souches à utiliser au minimum (voir ISO 11133).
c
Certaines restrictions nationales et directives peuvent nécessiter l’utilisation d’un sérovar d’E. coli différent. Se référer
aux exigences nationales relatives au choix des sérovars d’E. coli.
d
Souches au choix; au moins l’une des souches doit être utilisée (voir ISO 11133).
e
La croissance est classée en: 0 : croissance nulle, 1 : croissance faible (inhibition partielle), et 2 : croissance marquée
(voir ISO 11133).
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5.2.2 Second milieu
Le choix du second milieu est laissé au laboratoire d’essai. Il convient de suivre scrupuleusement les
instructions du fabricant relatives à sa préparation.
5.3 Gélose nutritive salée (GNS)
Telle que spécifiée en B.3.
5.4 Réactif pour la recherche de l’oxydase
Tel que spécifié en B.4.
5.5 Essais biochimiques
5.5.1 Milieu salé pour la détection de la L-lysine décarboxylase (LDC)
Tel que spécifié en B.5.
5.5.2 Milieu salé pour la détection de l’arginine dihydrolase (ADH)
Tel que spécifié en B.6.
5.5.3 Réactif pour la recherche de β-galactosidase
Tel que spécifié en B.7.
5.5.4 Milieu salé pour la recherche de l’indole
Tel que spécifié en B.8.
5.5.5 Eaux peptonées salées
Telles que spécifiées en B.9.
5.5.6 Solution de chlorure de sodium
Telle que spécifiée en B.10.
5.6 PCR
5.6.1 Tampon Tris Acétate EDTA (TAE) (ou un tampon permettant d’obtenir des performances
similaires)
Tel que spécifié en B.11.
5.6.2 Mélange réactionnel
Les réactifs doivent être ajoutés dans les quantités spécifiées dans les instructions du fabricant. Voir les
Annexes C et D (informatives) pour obtenir des exemples de compositions des mélanges réactionnels
utilisés pour l’élaboration du présent document.
5.6.3 Amorces et sondes
Les séquences d’amorce (et de sonde d’hydrolyse), si elles sont exigées, doivent être publiées dans une
revue révisée par des pairs et leur spécificité vérifiée sur un large éventail de souches de l’espèce Vibrio
cible et de souches non cibles. Grâce aux progrès réalisés dans le séquençage du génome complet de
souches bactériennes, des marqueurs spécifiques aux espèces plus appropriés pourraient être identifiés
dans le futur.
Pour V. parahaemolyticus, il convient que la région cible soit toxR.
Pour la recherche de souches pathogènes de V. parahaemolyticus, il convient de cibler les gènes codant
l’hémolysine thermostable directe (TDH) et l’hémolysine apparentée à la TDH (TRH).
Pour V. cholerae, il convient de cibler la région prVC de l’espace intergénique de l’ARNr 16S-23S pour une
PCR classique.
Pour V. vulnificus, il convient que la région cible soit la région de l’hémolysine de V. vulnificus (vvha).
Des régions cibles autres que celles spécifiées ci-dessus pour l’identification de V. parahaemolyticus,
V. vulnificus et V. cholerae peuvent être utilisées s’il a été démontré qu’elles donnaient lieu à des
performances équivalentes à celles utilisées pour l’élaboration du présent document et décrites dans les
Annexes C et D, si elles sont publiées dans une revue révisée par des pairs et si leur spécificité a été
vérifiée par utilisation sur un large éventail de souches de l’espèce de Vibrio cible et de souches non cibles.
Voir l’Annexe C pour obtenir des exemples détaillés d’amorces utilisées pour une PCR classique,
et l’Annexe D pour les amorces et les sondes d’hydrolyse pour la PCR en temps réel utilisées pour
l’élaboration du présent document.
5.6.4 Témoin positif
Un témoin séparé doit être utilisé pour chaque espèce de Vibrio ciblée. Voir les Annexes C et D pour
obtenir des exemples détaillés des souches de contrôle utilisées pour l’élaboration du présent document.
5.6.5 Témoin d’extraction négatif
De l’eau sans nucléase ou de l’eau stérile à 0,85 % NaCl extraite conformément à 9.5.6.
6 Matériel et consommables
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications
sont similaires.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie tel que spécifié dans l’ISO 7218, et en particulier le
matériel suivant.
6.1 Réfrigérateur, réglable à 5 °C ± 3,0 °C.
6.2 Incubateur, réglable à 37 °C ± 1,0 °C.
6.3 Incubateur, réglable à 41,5 °C ± 1,0 °C.
6.4 Congélateur, réglable à < −15 °C.
6.5 Tubes de micro-centrifugeuse, de 1,5 ml et 2,0 ml de capacité.
6.6 Micro-centrifugeuse, pour tubes de réaction de 1,5 ml et 2,0 ml et capable de fonctionner à
10 000 g.
6.7 Bloc chauffant capable de fonctionner à 95 °C ± 2,0 °C, ou équivalent.
6.8 Agitateur vortex.
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6.9 Pipettes graduées et pointes à filtre, pour volumes entre 1 µl et 1 000 µl.
6.10 Consommables associés à la technique de PCR classique ou en temps réel, par exemple
des plaques optiques et des bouchons, un support de plaques optiques, appropriés à l’utilisation avec
l’appareil de PCR sélectionné.
6.11 Appareil de PCR classique ou en temps réel, électrophorèse sur gel et matériel de visualisation
des UV le cas échéant.
7 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif qui n’a pas été
endommagé ou modifié pendant le transport et le stockage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Se reporter à
la Norme internationale spécifique au produit concerné. S’il n’existe pas de document spécifique, il est
recommandé que les parties concernées s’accordent sur ce sujet.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à l’ISO 6887-1 et à l’ISO 6887-3 et/ou au document
concernant le produit à examiner. S’il n’existe pas de document spécifique, il est recommandé que les
parties concernées s’accordent sur ce sujet.
9 Mode opératoire (voir Figure A.1)
9.1 Prise d’essai et suspension mère
Le présent document a été validé pour des prises d’essai allant jusqu’à 25 g ou 25 ml. Une prise d’essai
plus petite peut être utilisée sans validation ou vérification supplémentaire, dans la mesure où le rapport
entre le bouillon de (pré-)enrichissement et la prise d’essai demeure le même. Il est admis d’utiliser
une prise d’essai plus importante que celle validée à l’origine si une étude de validation/vérification a
démontré l’absence d’effets néfastes sur la recherche des espèces de Vibrio.
NOTE Une validation peut être effectuée conformément au document approprié de l’ISO 16140 (toutes les
parties). La vérification du regroupement des échantillons peut être réalisée conformément au protocole décrit
dans l’ISO 6887-1:2017, Annexe D.
Pour la préparation des suspensions mères, utiliser le premier milieu d’enrichissement (EPAS)
spécifié en 5.1.
Utiliser des prises d’essai (25 g ou 25 ml) et homogénéiser dans 225 ml de milieu d’enrichissement.
En cas de grandes quantités (supérieures à 25 g ou 25 ml), il convient de chauffer l’EPAS à 37 °C ± 1 °C
et/ou 41,5 °C ± 1 °C (4.2) avant ensemencement avec la prise d’essai.
Afin de réduire la somme de travail, lorsque plusieurs prises d’essai de 25 g ou 25 ml issues d’un lot
déterminé de produit alimentaire sont à examiner et lorsqu’il est prouvé qu’un mélange (réunissant
les prises d’essai) ne modifie pas les résultats en ce qui concerne ce produit en particulier, les prises
d’essai peuvent être mélangées. Par exemple, si 10 prises d’essai de 25 g ou 25 ml sont à examiner, il
est possible de combiner ces 10 unités afin d’obtenir un échantillon composite de 250 g ou 250 ml et
d’ajouter 2,25 l de milieu d’enrichissement.
Le nombre de cellules d’espèces de Vibrio potentiellement entéropathogènes diminue sensiblement lors
du stockage à des températures de réfrigération. Il convient donc d’éviter, dans la mesure du possible,
de stocker les échantillons et, dans une moindre mesure, les suspensions à ces températures et sinon de
les y maintenir un minimum de temps.
9.2 Premier enrichissement sélectif
Incuber les suspensions mères (9.1) à 41,5 °C ± 1 °C et/ou 37 °C ± 1 °C pendant 6 h ± 1 h conformément
au Tableau 2.
Tableau 2 — Première incubation et espèces ciblées/état du produit
Espèce ciblée de Vibrio dans un produit frais
Vibrio Vibrio Vibrio
a
Température d’incubation
parahaemolyticus cholerae vulnificus
 
41,5 °C ± 1 °C

37 °C ± 1 °C
Espèce ciblée de Vibrio dans un produit congelé, séché ou salé (tel que bacalhau, stockfish, boknafisk,
katsuobushi, obambo)
Vibrio Vibrio Vibrio
a
Température d’incubation
parahaemolyticus cholerae vulnificus
41,5 °C ± 1 °C
37 °C ± 1 °C   
a
D’autres espèces de Vibrio que celles énumérées dans la Référence [1], tel que V. alginolyticus, peuvent être récupérées à
ces températures d’incubation.
9.3 Second enrichissement sélectif
Transférer 1 ml de la culture, obtenue en 9.2 et prélevée en surface, dans un tube contenant 10 ml
d’EPAS (5.1). Il est recommandé de ne pas agiter l’échantillon avant de prélever l’aliquote.
Incuber l’EPAS conformément à 41,5 °C ± 1 °C et/ou 37 °C ± 1 °C pendant 18 h ± 1 h conformément au
Tableau 3.
NOTE Les cultures et/ou les bouillions obtenues en 9.3 peuvent être criblées par PCR.
Tableau 3 — Seconde incubation et espèces ciblées/état du produit
Espèce ciblée de Vibrio dans tous les états de produit
Vibrio Vibrio Vibrio
a
Température d’incubation
parahaemolyticus cholerae vulnificus
 
41,5 °C ± 1 °C
37 °C ± 1 °C 
a
D’autres espèces de Vibrio que celles énumérées dans la Référence [1], tel que V. alginolyticus, peuvent être récupérées à
ces températures d’incubation.
9.4 Isolement et identification
À partir des cultures obtenues dans l’EPAS (9.2 et 9.3), ensemencer la surface d’une boîte de gélose
TCBS (5.2.1) avec une anse bouclée de 1 μl, de façon à permettre le développement de colonies bien
isolées.
Procéder de la même façon avec le second milieu d’isolement sélectif (5.2.2) en utilisant une nouvelle anse.
Retourner les boîtes de gélose:
— pour les boîtes de gélose TCBS, incuber à 37 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 3 h;
— pour le second milieu d’isolement, incuber suivant les instructions du fabricant.
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Après l’incubation, examiner la gélose TCBS et le second milieu sélectif afin de rechercher la présence
de colonies caractéristiques d’espèces de Vibrio présumées pathogènes. Marquer leur position sur le
dessous des boîtes.
Sur la gélose TCBS, V. parahaemolyticus, V. vulnificus et V. cholerae présentent différentes morphologies
caractéristiques des colonies:
— les colonies caractéristiques de V. parahaemolyticus et V. vulnificus sont lisses, vertes (saccharose
négatif) et d’un diamètre de 2 mm à 3 mm;
— les colonies caractéristiques de V. cholerae sont lisses, jaunes (saccharose positif) et d’un diamètre
de 1 mm à 2 mm.
Examiner le second milieu sélectif afin de rechercher la présence de colonies qui, d’après leurs
caractéristiques, peuvent être considérées comme des isolats potentiels V. parahaemolyticus,
V. vulnificus, et/ou V. cholerae.
NOTE 1 Les espèces de Vibrio autres que celles énumérées dans la Référence [1], tel que V. alginolyticus,
peuvent être récupérées sur la gélose TCBS et le second milieu sélectif.
NOTE 2 La reconnaissance de colonies d’espèces de Vibrio est en grande partie une question d’expérience et
leur aspect peut quelquefois varier non seulement d’une espèce à une autre, mais également d’un lot de milieu de
culture à un autre.
NOTE 3 Pour améliorer la récupération de V. vulnificus, il a été montré que l’utilisation d’un milieu contenant
[4]
des dérivés de cellobiose-polymyxine B-colistine et de cellobiose-colistine était efficace.
9.5 Confirmation
9.5.1 Généralités
L’utilisation du présent document permet de confirmer la présence de V. parahaemolyticus, V. vulnificus
et V. cholerae par des approches moléculaires (PCR) et/ou biochimiques. La confirmation peut être
apportée par le laboratoire utilisateur final ou par un laboratoire de référence spécialisé. D’autres
espèces de Vibrio peuvent être isolées en utilisant le présent document.
Les V. parahaemolyticus ne possèdent pas tous des facteurs de pathogénicité. Afin de confirmer le
caractère pathogène des souches, il est préférable de rechercher la présence des gènes de l’hémolysine
thermostable directe (tdh), ou de l’hémolysine apparentée à la TDH (trh). Il convient d’effectuer cette
recherche par des essais de PCR. La confirmation par PCR peut également réduire l’interprétation
subjective des essais d’identification biochimique et accélérer le processus d’identification.
Si leur fiabilité a été démontrée, les kits d’essais biochimiques, actuellement disponibles dans le
commerce, peuvent être utilisés pour identifier les espèces de Vibrio, à condition de les ensemencer avec
une suspension des bactéries à identifier dans un milieu ou un diluant suffisamment salé, et tant que la
base de données ou le tableau d’identification du kit est basé sur des réactions obtenues en utilisant des
milieux similaires à ceux décrits dans le présent document. Ces kits doivent être utilisés conformément
aux instructions du fabricant.
Si leur fiabilité a été démontrée, les kits de détection moléculaire, actuellement disponibles dans
le commerce, peuvent être utilisés pour identifier les espèces de Vibrio. Ces kits doivent être utilisés
conformément aux instructions du fabricant.
9.5.2 Choix des colonies pour la confirmation et la préparation de cultures pures
Pour la confirmation, prélever, à partir de chaque milieu sélectif (9.4), au moins une colonie bien
isolée considérée comme caractéristique ou analogue à chacune des espèces de Vibrio potentiellement
pathogènes recherchées. Si le résultat de la première colonie isolée soumise à essai est négatif, il
convient de soumettre à essai quatre autres colonies bien isolées.
Dans les échantillons où il est considéré comme important d’optimiser la recherche de
V. parahaemolyticus potentiellement pathogènes sur la base de la présence d’hémolysine thermostable
directe et d’hémolysine apparentée à celle-ci, il est recommandé de prélever au moins cinq colonies, voire
si possible la totalité, présentant une morphologie caractéristique des colonies de V. parahaemolyticus
pour les essais en aval.
Ensemencer les colonies sélectionnées à la surface de boîtes de gélose nutritive salée (GNS) (5.3) ou
d’un milieu approprié laissé au choix des laboratoires afin d’obtenir des colonies isolées. Incuber à
37 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 3 h.
NOTE 1 Les produits alimentaires, notamment les produits de la mer, peuvent contenir de grandes quantités de
bactéries, y compris des espèces de Vibrio non pathogènes, qui peuvent se développer par le processus de culture
sélective. Le repiquage d’un faible nombre de colonies peut empêcher de déceler des espèces potentiellement
pathogènes. Cette non-détection est particulièrement critique lors de l’utilisation de gélose TCBS sur laquelle des
espèces non Vibrio ou des colonies d’espèces de Vibrio non entéropathogènes peuvent présenter une m
...