ISO 27105:2016

Milk and cheese — Determination of hen's egg white lysozyme content by high performance liquid chromatography

ISO 27105:2016 specifies a method for the quantitative determination of hen's egg white lysozyme content in milk and cheese. The method is suitable for measuring low levels of hen's egg white lysozyme with a quantification limit of 10 mg/kg.

Lait et fromages — Détermination de la teneur en lysozyme de blanc d'oeuf par chromatographie liquide haute performance

ISO 27105:2016 spécifie une méthode pour la détermination quantitative de la teneur en lysozyme de blanc d'?uf dans le lait et les fromages. La méthode est adaptée au mesurage de faibles niveaux de lysozyme de blanc d'?uf, avec une limite de quantification de 10 mg/kg.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 23-Mar-2016
• ICS: 67.100.01 - Milk and milk products in general
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 08-Nov-2022

Relations

• Revises: ISO/TS 27105:2009 - Milk and milk products — Determination of hen's egg white lysozyme by HPLC
• Effective Date: 20-Jul-2013
• Consolidated By: ISO 6412-1:2017 - Technical product documentation — Simplified representation of pipelines — Part 1: General rules and orthogonal representation
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 27105
IDF
216
First edition
2016-04-01
Milk and cheese — Determination
of hen’s egg white lysozyme
content by high performance liquid
chromatography
Lait et fromages — Détermination de la teneur en lysozyme de blanc
d’oeuf par chromatographie liquide haute performance
Reference numbers
ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
ISO and IDF 2016
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ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO and IDF 2016, Published in Switzerland

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

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written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
ISO copyright office International Dairy Federation

Ch. de Blandonnet 8 • CP 401 Silver Building • Bd Auguste Reyers 70/B • B-1030 Brussels

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ii © ISO and IDF 2016 – All rights reserved
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ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
Contents Page

Forewords .....................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

3 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

4 Reagents and reference substances ................................................................................................................................................. 1

4.1 Reagents and materials ................................................................................................................................................................... 1

4.2 Lysozyme ..................................................................................................................................................................................................... 2

5 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 2

6 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 3

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Preparation of lysozyme standard solution ................................................................................................................... 3

7.1.1 Lysozyme standard stock solution ................................................................................................................... 3

7.1.2 Lysozyme standard working solution ........................................................................................................... 3

7.2 Test portion ................................................................................................................................................................................................ 3

7.2.1 Milk .............................................................................................................................................................................................. 3

7.2.2 Cheese ....................................................................................................................................................................................... 3

7.2.3 Preparation of test solution .................................................................................................................................... 3

7.3 HPLC determination ........................................................................................................................................................................... 4

7.3.1 Chromatographic conditions ................................................................................................................................. 4

8 Calculation and expression of results ............................................................................................................................................. 5

8.1 Single-point calibration ................................................................................................................................................................... 5

8.2 Expression of results .......................................................................................................................................................................... 6

9 Precision ....................................................................................................................................................................................................................... 6

9.1 Interlaboratory test............................................................................................................................................................................. 6

9.2 Repeatability ............................................................................................................................................................................................. 6

9.3 Reproducibility ....................................................................................................................................................................................... 6

10 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 6

Annex A (informative) Verification by LC/MS.............................................................................................................................................. 8

Annex B (informative) Interlaboratory test ...............................................................................................................................................10

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................11

© ISO and IDF 2016 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
Forewords

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical

Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and

milk products and the International Dairy Federation (IDF) and it is being published jointly by ISO and IDF.

This first edition of ISO 27105|IDF 216 cancels and replaces ISO/TS 27105|IDF/RM 216:2009, which has

been technically revised.
iv © ISO and IDF 2016 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)

IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the

interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National

Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national

interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and

governments/food control authorities.

ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis

and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International

Standards using the logos and reference numbers of both organizations.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

ISO 27105|IDF 216 was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Additives and

contaminants and ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk

products.

All work was carried out by the ISO/IDF Project Group on Determination of hen’s egg white lysozyme content

by high performance liquid chromatography of the Standing Committee on Analytical Methods for Additives

and Contaminants under the aegis of the project leaders, T. Berger (CH) and Prof. L. Pellegrino (IT).

This first edition of ISO 27105|IDF 216 cancels and replaces ISO/TS 27105|IDF/RM 216:2009, which has

been technically revised.
© ISO and IDF 2016 – All rights reserved v
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ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
Introduction

Lysozyme (EC 3.2.1.17, muramidase) is an enzyme widely dispersed in nature; it appears, e.g. in hen’s

egg white (approximately 3 % to 4 %), saliva and in tear liquid. Lysozyme has a preservative effect

because of the lytic activity on the cell wall of some bacteria. Hen’s egg white lysozyme is used in cheese

making to prevent late blowing of semi-hard and hard cheeses.
vi © ISO and IDF 2016 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 27105:2016(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 216:2016(E)
Milk and cheese — Determination of hen’s egg
white lysozyme content by high performance liquid
chromatography
1 Scope

This International Standard specifies a method for the quantitative determination of hen’s egg white

lysozyme content in milk and cheese.

The method is suitable for measuring low levels of hen’s egg white lysozyme with a quantification limit

of 10 mg/kg.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
hen’s egg white lysozyme content
mass fraction of substance determined by the procedure specified
Note 1 to entry: The lysozyme content is expressed as milligram per kilogram.
3 Principle

Casein and denatured whey proteins from milk and cheese are precipitated isoelectrically at pH 4,3

(cheese) or at pH 2,2 (milk). Acid-soluble hen’s egg white lysozyme is then determined by reversed-

phase high-performance liquid chromatography (HPLC) and fluorescence detection. The lysozyme

peak can be verified by LC/MS (see Annex A).
4 Reagents and reference substances

Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and only distilled water

or water of equivalent purity.
4.1 Reagents and materials
4.1.1 Sodium chloride solution, c(NaCl) = 1 mol/l.
Dissolve 58,44 g of sodium chloride in 1 l water.
4.1.2 Hydrochloric acid, c(HCl) = 1 mol/l.

Dissolve 4,0 ml of hydrochloric acid with mass fraction 37 % in a 50 ml one-mark volumetric flask.

Dilute to the mark with water.
4.1.3 Sodium hydroxide, c(NaOH) = 1 mol/l.

Dissolve 2,6 ml of sodium hydroxide with a mass fraction of 50 % in a 50 ml one-mark volumetric flask.

Dilute to the mark with water.
4.1.4 Trifluoracetic acid (CF COOH), analytical grade.
© ISO and IDF 2016 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
4.1.5 Acetonitrile (CH CN), HPLC grade.
4.1.6 Water, HPLC grade.
4.2 Lysozyme

Pure hen’s egg white lysozyme . Sufficiently pure and characterized lysozyme is difficult to obtain. A

control on lot-to-lot variability is needed.
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 pH-meter, accurate to 0,1 unit.
5.2 Fluted filter, diameter 15 cm .
5.3 Membrane filter, pore size 0,22 μm .

5.4 Balance, capable of weighing to the nearest 100 mg, with a readability of 10 mg.

5.5 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,1 mg, with a readability of 0,01 mg.

5.6 Magnetic stirrer.

5.7 Homogenizer , capable of spinning at a rotational frequency of 3 000 rpm to 3 500 rpm.

5.8 HPLC equipment.
5.8.1 Gradient pumping system, capable of operating with a speed of 1,0 ml/min.
5.8.2 Manual or automatic injector, capable of injecting amounts of 50 μl.
5.8.3 Column heater, c
...

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 27105
ISO/TC 34/SC 5 Secretariat: NEN
Voting begins on: Voting terminates on:
2014-10-29 2015-01-29
Milk and cheese — Determination of hen’s egg white
lysozyme content by
high performance liquid chromatography

Lait et fromages — Détermination de la teneur en lysozyme du blanc d’oeuf par chromatographie liquide à

haute performance
ICS: 67.100.01
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THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
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STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
USER PURPOSES, DRAFT INTERNATIONAL
STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO
BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
Reference number
NATIONAL REGULATIONS.
ISO/DIS 27105:2014(E)
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED
TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
NOTIFICATION OF ANY RELEVANT PATENT
RIGHTS OF WHICH THEY ARE AWARE AND TO
PROVIDE SUPPORTING DOCUMENTATION. ISO 2014
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/DIS 27105:2014(E)
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This ISO document is a Draft International Standard and is copyright-protected by ISO. Except as

permitted under the applicable laws of the user’s country, neither this ISO draft nor any extract

from it may be reproduced, stored in a retrieval system or transmitted in any form or by any means,

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Violators may be prosecuted.
ii © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/CD 27105
Contents Page

Forew ord ..............................................................................................................................................................3

Forew ord ..............................................................................................................................................................4

1  Scope ......................................................................................................................................................5

2  Terms and definitions ...........................................................................................................................5

3  Principle ..................................................................................................................................................5

4  Reagents and reference substances ...................................................................................................5

5  Apparatus ...............................................................................................................................................6

6  Sampling .................................................................................................................................................6

7  Procedure ...............................................................................................................................................7

8  Calculation and expression of results .................................................................................................9

9  Precision .................................................................................................................................................9

10  Test report ............................................................................................................................................10

Annex A (informative) Verification by LC/MS ...............................................................................................11

Annex B (informative) Interlaboratory trial ...................................................................................................13

Bibliography ......................................................................................................................................................14

2 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 3 ----------------------
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 27105 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and

milk products.

This edition cancels and replaces the ISO/TS 27105|IDF/RM 216:2009, which has been technically revised.

ISO 27105 | IDF 216 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,

Milk and milk products and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and

IDF.
© ISO 2013 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/CD 27105
Foreword

IDF (the International Dairy Federation) ) is a non-profit private sector organization representing the

interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National

Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national interest

groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and governments/food

control authorities.

ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis and sampling

for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International Standards using the

logos and reference numbers of both organizations.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any patent

rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on the ISO list of

patent declarations received (see www.iso.org/patents).

This International Standard was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Dairy

Microorganisms and the ISO Technical Committee 34 on Food products, Subcommittee 5 on Milk and milk

products (ISO/TC 34/SC 5).

All work was carried out by the ISO-IDF Project Group on Determination of hen’s egg white lysozyme content

by high performance liquid chromatography of the Standing Committee on Analytical Methods for Additives

and Contaminants under the aegis of the project leaders, T. Berger (CH) and Prof. L. Pellegrino (IT).

4 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 5 ----------------------
Milk and cheese– Determination of hen’s egg white lysozyme by
HPLC
1 Scope

This standard specifies a method for the quantitative determination of hen's egg white lysozyme content in

milk and cheese.

The method is suitable for measuring low levels of hen's egg white lysozyme with a quantification limit of

10 mg per kilogram.

NOTE Lysozyme (EC 3.2.1.17, muramidase) is an enzyme widely dispersed in nature, it appears e.g. in hen's egg

white (approximately 3 % - 4 %), saliva and in tear liquid. Lysozyme has a preservative effect because of the lytic activity

on the cell wall of some bacteria. Hen's egg white lysozyme is used in cheese making to prevent late blowing of semi-hard

and hard cheeses.
2 Terms and definitions
For the purpose of this document, the following term and definition applies.
2.1 Hen's egg white lysozyme content

Mass fraction of substance determined by the procedure specified in this standard.

NOTE The lysozyme content is expressed as milligram per kilogram.
3 Principle

Casein and denatured whey proteins from milk and cheese are precipitated isoelectrically at pH 4,3 (cheese)

or at pH 2,2 (milk). Acid-soluble hen's egg white lysozyme is then determined by reversed-phase HPLC and

fluorescence detection. The lysozyme peak can be verified by LC/MS (see annex A).

4 Reagents and reference substances

Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and only distilled water or water

of equivalent purity.
4.1 Reagents
4.1.1 Sodium chloride solution, c(NaCl) = 1 mol/l.
Dissolve 58,44 g of sodium chloride in 1 l water.
4.1.2 Hydrochloric acid, c(HCl) = 1 mol/l.

Dissolve 4,0 ml of hydrochloric acid with mass fraction 37 % in a 50 ml one-mark volumetric flask. Dilute to the

50 ml mark with water.
4.1.3 Sodium hydroxide, c(NaOH) = 1 mol/l.

Dissolve 2,6 ml of sodium hydroxide with a mass fraction of 50 % in a 50 ml one-mark volumetric flask. Dilute

to the 50 ml mark with water.
© ISO 2013 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/CD 27105
4.1.4 Trifluoracetic acid (CF COOH), analytical grade.
4.1.5 Acetonitrile (CH CN), HPLC grade.
4.1.6 Water, HPLC grade.
4.2 Lysozyme

Pure hen's egg white lysozyme, e.g. Lysozyme, SIGMA L-6876 . It has to be noted that sufficient pure and

characterized lysozyme is difficult to obtain. A control on lot-to-lot variability is needed.

5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 pH-Meter, accurate to 0,1 unit
5.2 Fluted filter, e.g. Schleicher&Schuell 595½, Ø 15 cm .

5.3 Membrane filter, pore size 0,22 m, e.g. Millipore Millex-GV PVDF 0,22 m . Filters of other

producers need to be tested for applicability.

5.4 Balance, capable of weighing to the nearest 100 mg, with a readability of 10 mg.

5.5 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,1 mg, with a readability of 0,01 mg.

5.6 Magnetic stirrer

5.7 Homogenizer, Ultra turrax® or another giving equivalent results and capable of spinning at a

rotational frequency of 3000 to 3500 rpm.
5.8 HPLC equipment
5.8.1 Gradient pumping system, capable of operating with a speed of 1,0 ml/min.
5.8.2 Manual or automatic injector, capable of injecting amounts of 50 μl.

5.8.3 Column heater, capable of maintaining a column temperature of 45 °C ± 2 °C.

5.8.4 Column, reversed phase, e.g. PLRP-S 300 Å , 5 µm, 250 mm x 4,6 mm

5.8.5 Fluorescence detector, capable of operating at 280 nm excitation and at 340 nm emission.

6 Sampling

1) SIGMA L-6876, Schleicher&Schuell 595½, Millipore Millex-GV PVDF 0,22 m, Ultra Turrax®, PLRP-S 300 Å

(Polymer Laboratories, UK) are products available commercially. This information is given for the convenience of users of

this standard and does not constitute an endorsement by either ISO or IDF of these products.

6 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------

Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method

[1]
is given in ISO 707 | IDF 50 .

It is important that the laboratory receives a sample, which is representative and has not been damaged or

changed during transport or storage.
7 Procedure
7.1 Preparation of lysozyme standard solution
7.1.1 Lysozyme standard stock solution

Weigh to the nearest 0,01 mg, 10 mg of lysozyme (4.2) into a 10 ml one-mark volumetric flask and wait for

complete dissolution. Dilute to the 10 ml mark with sodium chloride solution (4.1.1).

Prepare fresh the standard stock solutions daily.
7.1.2 Lysozyme
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 27105
FIL
216
Première édition
2016-04-01
Lait et fromages — Détermination de
la teneur en lysozyme de blanc d’oeuf
par chromatographie liquide haute
performance
Milk and cheese — Determination of hen’s egg white lysozyme
content by high performance liquid chromatography
Numéros de référence
ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
ISO et FIL 2016
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO et FIL 2016, Publié en Suisse

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l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office International Dairy Federation

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ii © ISO et FIL 2016 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

3 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 1

4 Réactifs et substances de référence .................................................................................................................................................. 1

4.1 Réactifs et matériaux ......................................................................................................................................................................... 1

4.2 Lysozyme ..................................................................................................................................................................................................... 2

5 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 2

6 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 3

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Préparation de la solution étalon de lysozyme ........................................................................................................... 3

7.1.1 Solution étalon mère de lysozyme .................................................................................................................... 3

7.1.2 Solution étalon de travail de lysozyme ......................................................................................................... 3

7.2 Prise d’essai ............................................................................................................................................................................................... 3

7.2.1 Lait ............................................................................................................................................................................................... 3

7.2.2 Fromage ................................................................................................................................................................................... 3

7.2.3 Préparation de la solution pour essai ............................................................................................................ 3

7.3 Détermination par CLHP ................................................................................................................................................................ 4

7.3.1 Conditions chromatographiques ....................................................................................................................... 4

8 Calcul et expression des résultats ...................................................................................................................................................... 5

8.1 Étalonnage à un seul point............................................................................................................................................................ 5

8.2 Expression des résultats ................................................................................................................................................................. 6

9 Fidélité ............................................................................................................................................................................................................................ 6

9.1 Essai interlaboratoires ..................................................................................................................................................................... 6

9.2 Répétabilité ................................................................................................................................................................................................ 6

9.3 Reproductibilité ..................................................................................................................................................................................... 6

10 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 6

Annexe A (informative) Vérification par chromatographie liquide couplée à la

spectrométrie de masse (CL-SM) ......................................................................................................................................................... 8

Annexe B (informative) Essai interlaboratoires ....................................................................................................................................10

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................11

© ISO et FIL 2016 – Tous droits réservés iii
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ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à

l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes

de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —

Informations supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires,

sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers ainsi que la Fédération Internationale du Lait (FIL). Il est publié

conjointement par l’ISO et la FIL.

Cette première édition de l’ISO 27105|FIL 216 annule et remplace l’ISO/TS 27105|FIL/MR 216:2009, qui

a fait l’objet d’une révision technique.
iv © ISO et FIL 2016 – Tous droits réservés
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ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)

La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente

les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont

organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de

groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des

acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des

universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.

L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes

d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient

conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux

organisations.

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

L’ISO 27105|FIL 216 a été élaborée par le Comité permanent de la FIL chargé des Méthodes d’analyse des

additifs et contaminants et par le Comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5,

Lait et produits laitiers.

L’ensemble des travaux a été confié au groupe de projet mixte ISO/FIL, Détermination de la teneur en

lysozyme de blanc d’œuf par chromatographie liquide haute performance du Comité permanent chargé

des Méthodes d’analyse des additifs et contaminants, sous la conduite de leurs chefs de projet, T. Berger

(CH) et Prof. L. Pellegrino (IT).

Cette première édition de l’ISO 27105|FIL 216 annule et remplace l’ISO/TS 27105|FIL/MR 216:2009, qui

a fait l’objet d’une révision technique.
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ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
Introduction

Le lysozyme (EC 3.2.1.17, muramidase) est une enzyme très répandue dans la nature; elle est présente,

par exemple, dans le blanc d’œuf (environ 3 % à 4 %), la salive et les larmes. Le lysozyme a un effet

conservateur en raison de l’activité lytique sur la paroi de la cellule de certaines bactéries. Le lysozyme

de blanc d’œuf est utilisé dans la fabrication du fromage afin d’empêcher le gonflement tardif des

fromages à pâte demi-dure ou dure.
vi © ISO et FIL 2016 – Tous droits réservés
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ISO 27105:2016(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 216:2016(F)
Lait et fromages — Détermination de la teneur en
lysozyme de blanc d’oeuf par chromatographie liquide
haute performance
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale spécifie une méthode pour la détermination quantitative de la teneur

en lysozyme de blanc d’œuf dans le lait et les fromages.

La méthode est adaptée au mesurage de faibles niveaux de lysozyme de blanc d’œuf, avec une limite de

quantification de 10 mg/kg.
2 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

2.1
teneur en lysozyme de blanc d’œuf
fraction massique de substance, déterminée selon le mode opératoire spécifié

Note 1 à l’article: La teneur en lysozyme est exprimée en milligrammes par kilogramme.

3 Principe

Précipitation isoélectrique de la caséine et des protéines de lactosérum dénaturé provenant du lait

et du fromage à pH 4,3 (fromage) ou à pH 2,2 (lait), puis détermination du lysozyme de blanc d’œuf

soluble dans l’acide par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse et

détection par fluorescence. Le pic du lysozyme peut être vérifié par chromatographie liquide couplée à

la spectrométrie de masse (CL-SM) (voir Annexe A).
4 Réactifs et substances de référence

Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, et

uniquement de l’eau distillée ou de pureté équivalente.
4.1 Réactifs et matériaux
4.1.1 Solution de chlorure de sodium, c(NaCl) = 1 mol/l.
Dissoudre 58,44 g de chlorure de sodium dans 1 l d’eau.
4.1.2 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l.

Dissoudre 4,0 ml d’acide chlorhydrique de fraction massique 37 % dans une fiole jaugée à un trait de

50 ml. Compléter au trait de jauge avec de l’eau.
4.1.3 Hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l.

Dissoudre 2,6 ml d’hydroxyde de sodium de fraction massique 50 % dans une fiole jaugée à un trait de

50 ml. Compléter au trait de jauge avec de l’eau.
© ISO et FIL 2016 – Tous droits réservés 1
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ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
4.1.4 Acide trifluoroacétique (CF COOH), qualité analytique.
4.1.5 Acétonitrile, (CH CN), qualité CLHP.
4.1.6 Eau, qualité CLHP.
4.2 Lysozyme

Lysozyme de blanc d’œuf pur . Un lysozyme suffisamment pur et caractérisé est difficile à obtenir. Il

est nécessaire de contrôler la variabilité d’un lot à l’autre.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, les matériels suivants:
5.1 pH-mètre, ayant une précision de 0,1 unité.
5.2 Filtre cylindrique, de diamètre 15 cm .
5.3 Membrane filtrante, de taille de pore 0,22 μm .
5.4 Balance, capable de peser à 100 mg près et d’une résolution de 10 mg.

5.5 Balance analytique, capable de peser à 0,1 mg près et d’une résolution de 0,01 mg.

5.6 Agitateur magnétique.

5.7 Homogénéisateur , capable de tourner à une fréquence de rotation de 3 000 tr/min à

3 500 tr/min.
5.8 Matériel de CLHP.

5.8.1 Système de pompage permettant de réaliser une élution par gradient, capable de

fonctionner à une vitesse de 1,0 ml/min.

5.8.2 Injecteur manuel ou automatique, capable d’injecter des quantités de 50 μl.

5.8.3 Four à colonne, capable de maintenir une température de 45 °C ± 2 °C.

1) Lysozyme SIGMA L-6876 est un exemple de produit disponible sur le marché. Cette information est donnée par

souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de

l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit.
2) Fluted filter Schleich
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE
ISO/DIS 27105
ISO/TC 34/SC 5 Secrétariat: NEN
Début de vote: Vote clos le:
2014-10-29 2015-01-29
Lait et fromages — Détermination de la teneur en
lysozyme de blanc d’oeuf par chromatographie liquide
haute performance

Milk and cheese — Determination of hen’s egg white lysozyme content by high performance liquid

chromatography
ICS: 67.100.01
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR
OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC
SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE
AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES
FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR
POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES
POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
Numéro de référence
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
ISO/DIS 27105:2014(F)
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE. ISO 2014
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ISO/DIS 27105:2014(F)
Notice de droit d’auteur

Ce document de l’ISO est un projet de Norme internationale qui est protégé par les droits d’auteur

de l’ISO. Sauf autorisé par les lois en matière de droits d’auteur du pays utilisateur, aucune partie de

ce projet ISO ne peut être reproduite, enregistrée dans un système d’extraction ou transmise sous

quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie,

les enregistrements ou autres, sans autorisation écrite préalable.

Les demandes d’autorisation de reproduction doivent être envoyées à l’ISO à l’adresse ci-après ou au

comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Toute reproduction est soumise au paiement de droits ou à un contrat de licence.
Les contrevenants pourront être poursuivis.
ii © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 27105
Sommaire Page

Avant-propos ..................................................................................................................................................... iv

Avant-propos ...................................................................................................................................................... v

1 Domaine d'application .......................................................................................................................... 1

2 Termes et définitions ............................................................................................................................ 1

3 Principe................................................................................................................................................... 1

4 Réactifs et substances de référence ................................................................................................... 1

5 Appareillage ........................................................................................................................................... 2

6 Échantillonnage ..................................................................................................................................... 3

7 Mode opératoire ..................................................................................................................................... 3

8 Calcul et expression des résultats ...................................................................................................... 5

9 Fidélité .................................................................................................................................................... 6

10 Rapport d'essai ...................................................................................................................................... 6

Annexe A (informative) Vérification par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de

masse (CL-SM) ....................................................................................................................................... 7

Annexe B (informative) Essai interlaboratoires ............................................................................................. 9

Bibliographie ..................................................................................................................................................... 10

© ISO 2014 – Tous droits réservés iii
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ISO/DIS 27105
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée

aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du

comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 27105 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait

et produits laitiers.

Cette édition annule et remplace l'ISO/TS 27105 | FIL/RM 216:2009, qui a fait l'objet d'une révision technique.

L'ISO 27105 | FIL 216 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité

SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération Internationale du Lait (FIL). Elle est publiée conjointement par

l’ISO et la FIL.
iv © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 27105
Avant-propos

La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente les

intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont organisés

en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de groupes d’intérêt

nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des acteurs de l'industrie de

transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des universitaires et des

représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.

L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes

d'analyse et d'échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient

conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux

organisations.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les références

aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l'élaboration du document

sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par l’ISO (voir

www.iso.org/brevets).

La présente Norme internationale a été élaborée par le Comité permanent de la FIL chargé des Méthodes

d'analyse des additifs et contaminants et par le comité technique ISO/TC 34 Produits alimentaires, sous-

comité SC 5 Lait et produits laitiers (ISO/TC 34/SC 5).

L'ensemble des travaux a été confié au groupe de projet mixte ISO/FIL, Détermination de la teneur en

lysozyme de blanc d'œuf par chromatographie liquide haute performance du Comité permanent chargé des

Méthodes d'analyse des additifs et contaminants, sous la conduite de leurs chefs de projet, T. Berger (CH) et

Prof. L. Pellegrino (IT).
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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 27105
Lait et fromage — Détermination de la teneur en lysozyme de
blanc d’œuf par chromatographie liquide haute performance
1 Domaine d'application

La présente Norme spécifie une méthode pour la détermination quantitative de la teneur en lysozyme de

blanc d'œuf dans le lait et les fromages.

La méthode est adaptée au mesurage de faibles niveaux de lysozyme de blanc d'œuf, avec une limite de

quantification de 10 mg par kilogramme.

NOTE Le lysozyme (EC 3.2.1.17, muramidase) est une enzyme très répandue dans la nature ; elle est présente par

exemple dans le blanc d’œuf (environ 3 % à 4 %), la salive et les larmes. Le lysozyme a un effet conservateur en raison

de l’activité lytique sur la paroi de la cellule de certaines bactéries. Le lysozyme de blanc d'œuf est utilisé dans la

fabrication du fromage afin d’empêcher le gonflement tardif des fromages à pâte demi-dure ou dure.

2 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

2.1
teneur en lysozyme de blanc d'œuf

fraction massique de substance, déterminée selon le mode opératoire spécifié dans la présente Norme

NOTE La teneur en lysozyme est exprimée en milligrammes par kilogramme.
3 Principe

Précipitation isoélectrique de la caséine et des protéines de lactosérum dénaturé provenant du lait et du

fromage à pH 4,3 (fromage) ou à pH 2,2 (lait), puis détermination du lysozyme de blanc d'œuf soluble dans

l’acide par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse et détection par

fluorescence. Le pic du lysozyme peut être vérifié par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de

masse (CL-SM) (voir Annexe A).
4 Réactifs et substances de référence

Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, et uniquement de

l’eau distillée ou de pureté équivalente.
4.1 Réactifs
4.1.1 Solution de chlorure de sodium, c(NaCl) = 1 mol/l.
Dissoudre 58,44 g de chlorure de sodium dans 1 l d’eau.
4.1.2 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l.

Dissoudre 4,0 ml d’acide chlorhydrique de fraction massique 37 % dans une fiole jaugée à un trait de 50 ml.

Diluer avec de l’eau et compléter à 50 ml.
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ISO/DIS 27105
4.1.3 Hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l.

Dissoudre 2,6 ml d’hydroxyde de sodium de fraction massique 50 % dans une fiole jaugée à un trait de 50 ml.

Diluer avec de l’eau et compléter à 50 ml.
4.1.4 Acide trifluoroacétique (CF COOH), qualité analytique.
4.1.5 Acétonitrile, (CH CN), qualité CLHP.
4.1.6 Eau, qualité CLHP.
4.2 Lysozyme

Lysozyme de blanc d'œuf pur, par exemple Lysozyme, SIGMA L-6876 . Il est à noter qu'il est difficile

d'obtenir un lysozyme suffisamment pur et caractérisé. Il est nécessaire de contrôler la variabilité d'un lot à

l'autre.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier :
5.1 pH-mètre, ayant une précision de 0,1 unité
5.2 Filtre cylindrique, par exemple Schleicher & Schuell 595½, Ø 15 cm .

5.3 Membrane filtrante, de taille de pore 0,22 m, par exemple Millipore Millex-GV PVDF 0,22 m . Les

filtres d'autres fabricants doivent être soumis à des essais d'applicabilité.
5.4 Balance, capable de peser à 100 mg près et d'une résolution de 10 mg.

5.5 Balance analytique, capable de peser à 0,1 mg près et d'une résolution de 0,01 mg.

5.6 Agitateur magnétique

5.7 Homogénéisateur, Ultra turrax® ou un autre appareil donnant des résultats équivalents, et capable

de tourner à une fréquence de rotation de 3000 tr/min à 3500 tr/min.
5.8 Matériel de CLHP

5.8.1 Système de pompage permettant de réaliser une élution par gradient, capable de fonctionner à

une vitesse de 1,0 ml/min.

5.8.2 Injecteur manuel ou automatique, capable d’injecter des quantités de 50 μl.

5.8.3 Four à colonne, capable de maintenir une température de 45 °C ± 2 °C.
5.8.4 Colonne, phase inverse, par exemple PLRP-S 300 Å , 5 µm, 250 mm x 4,6 mm

5.8.5 Détecteur de fluorescence, capable de fonctionner à une longueur d’onde d’excitation de 280 nm et

une longueur d’onde d’émission de 340 nm.
1 )

SIGMA L-6876, Schleicher&Schuell 595½, Millipore Millex-GV PVDF 0,22 m, Ultra Turrax®, PLRP-S 300 Å

(Polymer Laboratories, Royaume Uni) sont des produits disponibles sur le marché. Cette information est donnée par souci

de commodité à l’intention des utilisateurs de la présente Norme et ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou de la

FIL à l’égard de ces produits.
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ISO/DIS 27105
6 Échantillonnage

L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une

[1]
méthode d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 707 | FIL 50 .

Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif, n’ayant été ni endommagé, ni modifié

lors du transport ou du stockage.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation de la solution étalon de lysozyme
7.1.1 Solution étalon mère de lysozyme

Peser, à 0,01 mg près, 10 mg de lysozyme (4.2) dans une fiole jaugée à un trait de 10 ml et attendre la

dissolution complète. Diluer avec la
...