ISO 23266:2020
(Main)Soil quality — Test for measuring the inhibition of reproduction in oribatid mites (Oppia nitens) exposed to contaminants in soil
Soil quality — Test for measuring the inhibition of reproduction in oribatid mites (Oppia nitens) exposed to contaminants in soil
This document specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining effects of soil contaminants and individual chemical substances on the reproduction of the oribatid mite Oppia nitens by dermal and alimentary uptake. This chronic (28-day) test is applicable to soils and soil materials of unknown quality (e.g., contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites under concern and waste materials). This method is not intended to replace the earthworm or Collembola tests since it represents another taxonomic group (= mites; i.e., arachnids), nor the predatory mite test since this species represents a different trophic level and ecological niche. Effects of substances are assessed using standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For contaminated soils, the effects are determined in the test soil and in a control soil. According to the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) should be either an uncontaminated soil with similar properties to the soil sample to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g., artificial soil). Information is provided on how to use this method for testing substances under temperate conditions. This document is not applicable to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than 1, or to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa at 25 °C. NOTE The stability of the test substance cannot be assured over the test period. No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.
Qualité du sol — Essai de détermination de l'inhibition de la reproduction chez les acariens oribates (Oppia nitens) exposés aux contaminants dans le sol
Le présent document spécifie l'une des méthodes d'évaluation de la fonction d'habitat des sols et détermine les effets des contaminants et substances chimiques individuelles du sol sur la reproduction de l'acarien oribate, Oppia nitens, par absorption par voie dermique et alimentaire. Cet essai chronique (28 jours) est applicable aux sols et matériaux de type sol de qualité inconnue (par exemple, sites contaminés, sols amendés, sols après remédiation, sols agricoles ou autres sites sujets à préoccupation et déchets). Cette méthode n'est pas destinée à remplacer ni les essais sur vers de terre ou sur collemboles car elle représente un autre groupe taxonomique (= acariens; à savoir, arachnides), ni l'essai sur acariens prédateurs car cette espèce représente un niveau trophique et une niche écologique différents. Les effets des substances sont évalués en utilisant un sol standard, de préférence un substrat défini de sol artificiel. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol témoin. Selon l'objectif de l'étude, il convient que le substrat témoin et le substrat de dilution (séries de dilutions du sol contaminé) soient un sol non contaminé ayant des propriétés similaires à celles du sol à analyser (sol de référence) ou un sol standard (par exemple, sol artificiel). Des informations sont fournies sur la façon d'utiliser cette méthode pour analyser les substances dans des conditions tempérées. Le présent document n'est pas applicable aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/sol est supérieur à 1, ou aux substances dont la pression de vapeur dépasse 300 Pa à 25 °C. NOTE La stabilité de la substance d'essai ne peut pas être garantie tout au long de la période d'essai. La méthode d'essai ne prévoit pas de contrôler la persistance de la substance soumise à essai.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23266
First edition
2020-06
Soil quality — Test for measuring the
inhibition of reproduction in oribatid
mites (Oppia nitens) exposed to
contaminants in soil
Qualité du sol — Essai de détermination de l'inhibition de la
reproduction chez les acariens oribates (Oppia nitens) exposés aux
contaminants dans le sol
Reference number
©
ISO 2020
© ISO 2020
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Published in Switzerland
ii © ISO 2020 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 4
5 Reagents and material . 4
6 Apparatus . 7
7 Procedure. 7
7.1 Experimental design . 7
7.1.1 General. 7
7.1.2 Range-finding test (preliminary test) . 7
7.1.3 Definitive test . 8
7.2 Preparation of test mixture . 8
7.2.1 Testing contaminated soil . 8
7.2.2 Testing substances added to the test substrate . 9
7.2.3 Preparation of control containers .10
7.3 Addition of the mites .10
7.4 Test conditions and measurements .10
7.5 Determination of adult survival and reproductive output .10
8 Calculation and expression of results .11
8.1 Calculation .11
8.2 Expression of results .11
9 Validity of the test .11
10 Statistical analysis .12
10.1 General .12
10.2 Single-concentration tests .12
10.3 Multi-concentration tests.12
10.3.1 Range-finding test .12
10.3.2 Definitive test .12
11 Test report .13
Annex A (informative) Techniques for rearing and breeding of Oppia nitens .15
Annex B (normative) Determination of water holding capacity .18
Annex C (informative) Guidance on adjustment of pH of artificial soil .19
Annex D (informative) Extraction and counting of Oppia nitens .20
Annex E (informative) Performance of the method .24
Bibliography .29
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see
www .iso .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv © ISO 2020 – All rights reserved
Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in soil
[1] [2]
and are proposed to complement conventional chemical analysis (see ISO 15799 and ISO 17616 ).
ISO 15799 includes a list and short characterization of recommended and standardized test systems
and ISO 17616 gives guidance on the choice and evaluation of the bioassays. Aquatic test systems with
soil eluate are applied to obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching the
groundwater by the water path (retention function of soils), whereas terrestrial test systems are used
to assess the habitat function of soils with regards to supporting soil biota and interactions within.
Mites (Acari) are a world-wide and diverse group of arthropods belonging to a sub-class of Arachnida
with over 40 000 species recorded, divided into two super-orders (Acariformes and Parasitiformes).
Due to their relative small size (a few μm to a few cm), they occupy specific ecological niches on plants
[5]
as well as in soils .
In recent years, there has been an increase in the development of biological test methods for assessing
contaminated soil, which has historically lagged behind that for other media (e.g., water and sediment).
Ecotoxicology tests for soil are challenged, among other things, by the complexity of soil systems
(e.g., lack of homogeneity) and the variety of exposure routes (e.g., via alimentary uptake, exposure
to pore water or soil vapours, or direct contact with soil particles). A recently developed method
[3]
(ISO 21285 ) assesses the effects of contaminated soil on the reproduction of the predatory mite
(Hypoaspis aculeifer), mainly through alimentary uptake. Oribatid mites represent a different but
essential ecological niche than H. aculeifer within soil, contributing to carbon mineralization and soil
formation, as well as nitrogen and phosphorous release through grazing activities. Oribatid mites are
among the most diverse and abundant micro-arthropod species within soil, however, their slower
metabolism and development, coupled with low fecundity, long life span, and limited dispersal capacity
[6]
increase the potential for susceptibility and sensitivity to short- and long-term disturbances . The
[7][8][9]
use of oribatid mites in the context of soil ecotoxicology testing has been thoroughly reviewed
[10][11]
. Recent research using Oppia nitens for soil testing has demonstrated applicability and relative
sensitivity of the species for the assessment of contaminated soils from both agronomic regions, and
[6][12][13][14][15]
those from the boreal and taiga ecozones . Research has also demonstrated its sensitivity
[16][17][18][19] [20][21] [16][17][22]
to metals , pesticides , and organic compounds . Oppia nitens is an oribatid
mite, inhabiting the upper organic layer of soil, and is a member of the largest oribatid family (Oppiidae)
with approximately 1 000 species in 129 genera widely distributed throughout Holarctic and Antarctic
[23]
regions . They are sexually reproducing, polyphagous fungivores that can be easily reared in the
[10]
laboratory in soil or on plaster of Paris, and on a diet of Baker’s yeast .
This method outlines procedures for conducting 28-day tests for determining the effects of
contaminated soils on the survival and reproduction of the oribatid mite, Oppia nitens. Optionally, the
method can be used for testing chemicals added to standard soils (e.g., artificial soil) for their lethal
and sublethal hazard potential to oribatid mites. The performance of this method has been assessed
[15]
in an international inter-laboratory investigation , as summarized in Annex E. Mites represent
communities that cannot be omitted from environmental hazard assessment. This species is considered
to be representative of non-predatory soil mites.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 23266:2020(E)
Soil quality — Test for measuring the inhibition of
reproduction in oribatid mites (Oppia nitens) exposed to
contaminants in soil
WARNING — Contaminated soils may contain unknown mixtures of toxic, mutagenic, or
otherwise harmful chemicals or infectious microorganisms. Occupational health risks may
arise from dust or evaporated chemicals during handling and incubation. Precautions should be
taken to avoid skin contact.
1 Scope
This document specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining
effects of soil contaminants and individual chemical substances on the reproduction of the oribatid
mite Oppia nitens by dermal and alimentary uptake. This chronic (28-day) test is applicable to soils
and soil materials of unknown quality (e.g., contaminated sites, amended soils, soils after remediation,
agricultural or other sites under concern and waste materials). This method is not intended to replace
the earthworm or Collembola tests since it represents another taxonomic group (= mites; i.e., arachnids),
nor the predatory mite test since this species represents a different trophic level and ecological niche.
Effects of substances are assessed using standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For
contaminated soils, the effects are determined in the test soil and in a control soil. According to the
objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) should be
either an uncontaminated soil with similar properties to the soil sample to be tested (reference soil) or
a standard soil (e.g., artificial soil).
Information is provided on how to use this method for testing substances under temperate conditions.
This document is not applicable to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than
1, or to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa at 25 °C.
NOTE The stability of the test substance cannot be assured over the test period. No provision is made in the
test method for monitoring the persistence of the substance under test.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level
using barium chloride solution
ISO 11265, Soil quality — Determination of the specific electrical conductivity
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis —
Gravimetric method
ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic
conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.2
effect concentration
ECx
concentration (mass fraction) of a test sample or test substance that causes x % of an effect on a given
end-point within a given exposure period when compared with a control
EXAMPLE An EC50 is a concentration estimated to cause an effect on a test end-point in 50 % of an exposed
population over a defined exposure period.
Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).
When substances are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil in milligrams
per kilogram.
3.3
effect rate
ERx
rate of a soil to be tested that causes an x % of an effect on a given end-point within a given exposure
period when compared with a control
3.4
lethal concentration
LCx
concentration (mass fraction) of a test sample or test substance that causes x % mortality within a
given exposure period when compared with a control
EXAMPLE An LC50 is a concentration estimated to cause mortality in 50 % of an exposed population over a
defined exposure period.
Note 1 to entry: The LCx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).
When substances are tested, the LCx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil in milligrams
per kilogram.
3.5
limit test
single concentration test consisting of at least five replicates each, the test soil (3.14) without any
dilution or the highest concentration of test substance mixed into the control soil and the control
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3.6
lowest observed effect concentration
LOEC
lowest tested concentration (mass fraction) of a test sample or test substance that has a statistically
significant effect (probability p < 0,05)
Note 1 to entry: In this test, the LOEC is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture
(dry mass) or as a mass of test substance per dry mass of the soil to be tested. All test concentrations above the
LOEC should usually show an effect that is statistically different from the control.
3.7
lowest observed effect rate
LOER
lowest rate of a soil to be tested in a control soil at which a statistically significant effect is observed
3.8
no observed effect concentration
NOEC
highest tested concentration (mass fraction) of a test sample or test substance immediately below the
LOEC at which no effect is observed
Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect
(probability p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control.
3.9
no observed effect rate
NOER
lowest rate of a soil to be tested immediately below the LOER which, when compared to the control, has
no statistically significant effect (probability p < 0,05) within a given exposure period
3.10
reproduction
mean number of offspring per test vessel after a 28-day incubation under the specified test conditions
3.11
reference soil
uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic
carbon content and texture) to the test soil (3.14)
3.12
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (pH, texture, organic matter content) are
within a known range
EXAMPLE Euro soils, artificial soil, LUFA standard soil.
Note 1 to entry: The properties of standard soils can differ from those of the test soil.
3.13
control soil
reference or standard soil (3.12) used as a control and as a medium for preparing dilution series with
test soils/samples or a reference substance, which fulfils the validity criteria
Note 1 to entry: In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving
the test validity criteria before using the soil in a definitive test.
3.14
test soil
sample of field-collected soil or chemical-spiked soil to be evaluated for toxicity to mites
3.15
test mixture
mixture of contaminated soil or the test substance (e.g. chemical, biosolid, waste) with control soil (3.13)
Note 1 to entry: Test mixtures are given in percent of contaminated soil based on soil dry mass.
3.16
test mixture ratio
ratio of test soil to control soil in a test mixture (3.15)
Note 1 to entry: Different ratios may be applied in a dilution series to establish a dose-response relationship.
4 Principle
The effects on reproduction of adult, laboratory-cultured mites, Oppia nitens, exposed to the test soil
are compared to those observed for organisms in control soil. If appropriate, effects based on exposure
to a test mixture of contaminated soil and control soil, or a range of concentrations of a test substance
mixed into control soil, are determined. Test mixtures are prepared at the start of the test and are not
renewed during the test period.
The test is started with 15 adult mites from age-synchronized cultures (aged 8 to 10 d after ecdysis
(i.e., moult) to adult form) per test vessel. The test is performed in 30 mL glass vessels with a wet-
weight equivalent to a volume of ~20 mL of soil, and a minimum of five replicates are prepared for
each treatment. The test runs for 28 d at (20 ± 2) °C by which time offspring (F ) have emerged from
eggs laid by the adults and the number of offspring produced is determined. Survival of the adults is
also determined at the end of the test. The results obtained from the tests are compared with a control
or, where a serial dilution design is used, to determine the concentration resulting in x % reduction
of juveniles produced compared to the control (ECx, 28 d), depending on the experimental design. An
estimate of the test concentration resulting in x % mortality (LCx, 28 d) is an optional test endpoint. If a
multi-concentration hypothesis test design is used, the reproductive output of the mites exposed to the
test mixtures is compared to that of the controls in order to determine the concentration which causes
no effects on mortality and reproduction (NOEC).
In cases where there is no prior knowledge of the dilution/concentration of the soil to be tested or the
test substance likely to have an effect, then it is useful to conduct the test in two steps:
— a range-finding test is carried out to give an indication of the effect dilution/concentration, and
the dilution/concentration resulting in no mortality. Dilutions/concentrations to be used in the
definitive test can then be selected; and
— the definitive test to determine lethal and sub-lethal effects of (dilutions of) contaminated soil or
the concentration of a substance which, when evenly mixed into the standard soil, results in: 1)
x % inhibition of reproduction, ECx (e.g., EC10, EC20, or EC50), or 2) causes no significant effects
on numbers of offspring hatched from eggs compared with the control for estimation of the NOEC
and LOEC.
The use of a reference soil is an essential requirement to demonstrate the present status of the test
population, and to avoid misinterpretation of results.
5 Reagents and material
5.1 Biological material
In this test, adult mites, Oppia nitens C.L. Koch 1836, aged 8 to 10 d (i.e., 8 to 10-d post-ecdysis to adult
form), established from newly emerged adults collected over a 1- to 3-d period, are required to start the
test. The mites shall be selected from an age-synchronised culture. A method for culturing Oppia nitens
and for obtaining age-synchronised test organisms is provided in Annex A.
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Adult Oppia nitens are obtained from laboratory cultures maintained under conditions of temperature,
photoperiod, and food similar to those in the test. Species identification should be confirmed by
qualified personnel experienced in identifying soil mites using the distinguishing taxonomic features,
[26]
described in taxonomic keys , or using DNA-based taxonomic identification (i.e., barcoding) as
[4]
outlined in ISO 21286 . All mites used in a test shall be derived from the same population and source.
Sources of animals to be used to establish cultures include government or private laboratories that are
[24]
culturing Oppia nitens for soil toxicity tests, or commercial biological suppliers .
5.2 Test mixture can consist of field-collected soil or control soil mixed with the test soil or spiked
with the test substance.
5.2.1 Field-collected soil or waste
The sample(s) can be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern, or
waste materials (e.g., dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment works, plant-
derived compost, or manure) under consideration for possible land disposal.
The field-collected soils used in this test shall be passed through a sieve of 4 to 10 mm square mesh
to remove coarse fragments and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air-dried without
heating before sieving. Storage of the test soil should be as short as possible. The soil shall be stored
in accordance with ISO 18400-206 using containers that minimize losses of soil contaminants by
volatilization and sorption to the container walls. If soils or test mixtures have been stored, they should
be mixed a second time immediately before use. Soil pH should not be corrected as it can influence
bioavailability of soil contaminants.
NOTE A 4-mm mesh sieve is appropriate for use with any mineral-based soil with relatively low organic
matter (e.g., agricultural soil), however for forest soils or wetland soils with higher organic matter content, sieves
with larger mesh sizes (e.g., 6 to 8 mm for forest soils and 8 to 10 mm for wetland soils) could be required.
For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled
from a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390;
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) water holding capacity according to Annex B;
e) cationic exchange capacity in accordance with ISO 11260;
f) electrical conductivity in accordance with ISO 11265
g) organic carbon in accordance with ISO 10694;
h) percentage of material removed by the sieve.
NOTE It is important to measure the water holding capacity of all mixtures used in the test.
5.2.2 Control soil, either a) reference soil (3.11) or b) standard soil (3.12) that allows the presence of
oribatid mites. Control soil and soil used for dilution shall not differ in one test (either a) or b)).
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should
be treated and characterized like the test soils. If a toxic contamination or unusual soil properties
cannot be ruled out, standard control soils should be preferred.
b) For testing the effects of substances mixed into soil, standard soils (e.g. artificial soil, LUFA
standard soil) shall be used as test substrate. The properties of the field-collected standard soil
shall be reported.
The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:
Percentage expressed
on dry mass basis
— Sphagnum peat finely ground (a particle size of (2 ± 1) mm 10 %
is acceptable) and with no visible plant remains
— Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
— Industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 50 % 70 %
of particle size 0,05 mm to 0,2 mm)
NOTE It has been demonstrated that Oppia nitens can conform with the validity criteria (survival and
[24]
reproduction) when tested in field soils with lower organic matter content (e.g., 2,6 %) , and experience shows
that the validity criteria can be achieved in artificial soil with 10 % peat. It is therefore not necessary, before
using such a soil in a definitive test, to demonstrate the suitability of the artificial soil in complying with the
[24]
validity criteria, unless the peat content is lowered more than specified above .
Prepare the artificial soil at least three days prior to starting the test, by mixing the dry constituents
listed above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. Guidance on the adjustment of pH of the
[24]
artificial soil is provided in Annex C; the optimal pH range for the O. nitens test is 7,0 ± 0,5 pH units .
A portion of the deionized water required is added while mixing is continued. Allowance should be
made for any water that is used for introducing the test substance into the soil. The amount of calcium
carbonate required can vary, depending on the properties of the individual batch of sphagnum peat
and should be determined by measuring sub-samples immediately before the test. Store the mixed
artificial soil at room temperature for at least three days to equilibrate acidity. To determine pH and
the maximum water holding capacity, the dry artificial soil is pre-moistened one or two days before
starting the test by adding deionized water to obtain approximately half of the required final water
content of 50 % to 70 % of the maximum water holding capacity.
The total water holding capacity is determined according to Annex B; the pH is determined according
to ISO 10390.
5.3 Food
As a suitable food source, a sufficient amount, e.g., 0,5 mg to 1 mg, of granulated dried baker’s yeast,
commercially available for household use, is added to each container at the beginning of the test (Day 0)
and every 7 days up to and including Day 21.
5.4 Reference substance
The ECx of a reference substance shall be determined to provide assurance that the laboratory test
conditions are adequate and to verify that the response of the test organisms did not change over time.
The reference substance can be tested in parallel to the determination of the toxicity of each test sample
at one concentration, which shall be demonstrated beforehand in a dose response study to result in an
effect of about 50 %. In this case, the number of replicates should be the same as that in the controls.
Alternatively, the reference substance is tested 1 to 2 times a year in a dose-response test. Depending
on the design chosen, the number of concentrations and replicates and the spacing factor differ (see
7.1.3), but a response of 10 % to 90 % effect should be achieved (spacing factor of 1,8). Boric acid is a
[14][15][19]
suitable reference substance that has been shown to affect reproduction .
The EC50 for boric acid based on the number of juveniles should fall in the range between 290 mg/kg
(dry mass) soil and 410 mg/kg (dry mass) soil in artificial soil, and in the range between 80 mg/kg (dry
[15]
mass) soil and 120 mg/kg (dry mass) soil in field-collected soil including standard LUFA 2.2 .
5.4.1 Boric acid (CAS 10043-35-3), H BO (99 %).
3 3
WARNING — When handling these substances, appropriate precautions should be taken to avoid
ingestion or skin contact.
6 © ISO 2020 – All rights reserved
6 Apparatus
Use laboratory equipment and the following apparatus.
6.1 Test containers made of glass (e.g., glass shell vials) or other chemically inert material of a capacity
of about 30 mL (about 2,6 cm inner diameter), should be used. Test containers shall be covered to prevent
mites from escaping but shall allow gas exchange and light penetration (e.g. perforated transparent cover
or removable lid that allows for aeration on a weekly basis).
6.2 Apparatus to determine the dry mass of the substrate, in accordance with ISO 11465.
6.3 Large-scale laboratory mixer, for the preparation of the test mixture (5.2).
6.4 Suitable accurate balances.
6.5 Apparatus, capable of measuring temperature, pH, and water content of the test substrate.
6.6 Apparatus for heat extraction of mites, as described in Annex D.
6.7 Test environment
6.7.1 Enclosure, capable of being controlled at a temperature of (20 ± 2) °C.
6.7.2 Light Source, capable of delivering a light intensity of 400 lx to 800 lx at the substrate surface
with a controlled light:dar k cycle of between 12 h:12 h and 16 h:8 h.
7 Procedure
7.1 Experimental design
7.1.1 General
A sample of field-collected test soil can be tested at a single concentration (typically 100 %), or evaluated
for toxicity in a multi-concentration test, whereby a series of dilutions are prepared by mixing measured
quantities with a control soil. When testing substances spiked into soil, a series of concentrations
is prepared by mixing quantities of the test substance with a standard soil (e.g., artificial soil). The
concentrations are expressed in milligrams of test substance per kilogram of dried control soil.
Depending on the knowledge of relevant response levels, a preliminary test may precede the definitive
test. Each definitive multi-concentration test consists of a series of soil mixtures (treatments).
7.1.2 Range-finding test (preliminary test)
A preliminary test to find the range of mixture ratio (e.g. 0 %, 1 %, 5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % soil), or
of the test substance (e.g., 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg and 1 000 mg/kg; the concentrations
being expressed in milligrams of test substance per kilogram of dried control soil), affecting O. nitens is
optional. The range-finding test is conducted with reduced replication (e.g., 3 replicates), relative to the
definitive test. The duration of the range-finding test is 28 d, after which mortality of the adult mites
and the number of juveniles is determined. Based on the results of the range finding test, the EC50
for inhibition of reproduction should be estimated. The concentration/dilution range in the definitive
test should preferably be chosen so that it includes concentrations that span a wide range, including a
low concentration that evokes no adverse effects (similar to the negative control treatment) and a high
concentration that results in “complete” or severe effects. To keep the wide range of concentrations and
also obtain the important mid-range effects, it might be necessary to use additional treatments in order
to split the selected range more finely.
When no effects are observed, even at 100 % contaminated soil or at concentrations of 1 000 mg test
substance/kg standard soil (dry mass), the definitive test can be designed as a limit test.
7.1.3 Definitive test
The design of the definitive test depends on the test objectives. Typically, the habitat properties of
samples of a field-collected soil are characterized by comparison of the biological effects found in the
soil to be tested with those found in a reference soil, or if not available or not appropriate due to toxicity
or atypical physicochemical characteristics, in a standard soil. Results for the standard soil assist in
distinguishing contaminant effects from non-contaminant effects caused by soil physicochemical
properties. Regardless of whether a reference soil or standard soil is used for the statistical comparisons,
[24]
the results from standard soil shall be used to judge the validity and acceptability of the test .
If for characterization purposes a test design including serial dilution series is required, three designs
are possible:
1) for the ECx approach, a minimum of 7 concentrations plus the control treatment(s) shall be used,
and more (i.e., ≥10 plus controls) are recommended to improve the likelihood of bracketing each
[25]
endpoint sought . The spacing factor can be variable; smaller at lower concentrations, larger at
high concentrations. Five replicates for each treatment plus the controls are recommended;
NOTE If a range-finding test is conducted prior to definitive testing, fewer concentrations (e.g., 6 or 5) can be
possible in the definitive test, since more information on the effect concentration/dilution range will be available.
2) for the NOEC hypothesis approach, at least five concentrations or test mixtures in a geometric
series should be used. Five replicates for each treatment plus eight controls are recommended; or
3) for the mixed approach, 6 to 8 concentrations or test mixtures in a geometric series should be used.
Five replicates for each treatment plus eight controls are recommended. This mixed approach
allows a NOER/NOEC as well as an ERx/ECx evaluation.
Regardless of the test design chosen, the test concentrations shall be spaced by a factor not exceeding 2.
A limit test can be sufficient if, in the range-finding test, no toxic effect was observed. In the limit test,
only the highest concentration tested in the range-finding test (i.e., 1,000 mg/kg) or test soil without any
dilution (100 %) and the control shall be tested with a minimum of five replicates for each treatment.
To facilitate checking of the physicochemical analyses at the beginning and end of the test, use of
additional containers for each concentration and for the control is recommended.
Each test container (replicate) is filled with the wet-weight equivalent to measured volume of about
20 mL at optimal soil moisture content (see 7.2.1). To ensure easy migration of mites, the substrate in
the test container should be smoothed but not compressed.
7.2 Preparation of test mixture
7.2.1 Testing contaminated soil
According to the selected dilution range, the test soil is mixed with the reference soil or the standard
soil thoroughly (either manually or by using a hand mixer). The homogeneity of the mixture is checked
visually. The total mass of the soil to be tested and the reference soil or the standard soil shall be the
wet weight equivalent to a volume of about 20 mL in each test container (6.1). The test mixture shall be
wetted with deionised water to reach 40 % to 60 % of the total water holding capacity, or that which
results in a crumbly texture (i.e. 2 to 3 mm clumps) that is optimal for testing, determined according
to Annex B. In some cases, e.g. when testing forest soils, wetland soils, or waste materials, higher or
lower percentages might be required. A rough check of the soil moisture content can be obtained by
gently squeezing the soil by hand, if the moisture content is optimal, small drops of water should appear
between the fingers.
8 © ISO 2020 – All rights reserved
Determine the pH for each test mixture (one container per concentration) according to ISO 10390 at the
beginning and end of the test (when acid or basic substances are tested, do not adjust the pH).
Proceed simultaneously with the replicate requirement per concentration according to the selected
test design (7.1.3).
For soils collected as distinct horizons (e.g., boreal or taiga soils), each horizon shall be tested separately
[24]
in independent definitive tests .
WARNING — Contaminated soils can contain unknown mixtures of toxic, mutagenic, or
otherwise harmful substances or infectious micro-organisms. Occupational health risks can
arise from dust or evaporated substances as well as via dermal contact during handling and
incubation.
7.2.2 Testing substances added to the test substrate
Standard soil is used to prepare the test sample. For each test container (6.1), the mass of the substrate
used shall be the wet-weight equivalent to a volume of about 20 ml. Substances are added to the test
substrate and mixed thoroughly.
For the introduction of test substances, use either method a), b) or c), as appropriate:
a) water-soluble substance
— immediately before starting the test, dissolve the quantity of the test substance in the water or
a portion of it required to wet the soil samples for the replicates of one concentration in order
to meet the requirements of 5.2.2, and mix it thoroughly with the soil before introducing it into
the test containers;
b) substances insoluble in water but soluble in organic solvents
— dissolve the quantity of test substance required to obtain the desired concentration in a volatile
solvent (such as acetone or hexane) mix it with a portion of the quartz sand required for artificial
soil or a portion of the soil sample if a standard field soil is being used. After evaporating the
solvent by placing the container under a fume hood, add the remainder of the soil and the water
and mix it thoroughly before introducing it into the test containers.
NOTE Ultrasonic dispersion, organic solvents, emulsifiers or dispersants can be used to disperse
substances with low aqueous solubility. When such auxiliary substances are used, all test concentrations
and any additional controls will contain the same minimum amount of auxiliary substance.
WARNING — Take appropriate precautions when dealing with solvent vapour to avoid danger
from inhalation or explosion, and to avoid damage to extraction equipment, pumps, etc.
c) substances insoluble in water or organic solvents
— for a substance insoluble in a volatile solvent, prepare a mixture of 10 g of finely ground industrial
quartz sand (see 5.2.2) or standard field soil and the quantity of the test substance required to
obtain the desired concentration. Add that mixture to the remainder of the soil (i.e. artificial or
standard field soil, respectively), add the water and mix thoroughly before introducing it into
test containers.
Base the concentrations selected to provide the ECx or the NOEC/LOEC on the results of the range-
finding test. Space the concentrations by a factor not exceeding 2.
Substances mixed into a reference or control soil do not need to be tested at concentrations higher than
1 000 mg/kg mass of reference or standard soil.
Proceed simultaneously with all replicates per concentration and the control(s) required according to
the selected approach.
Determine the pH for each test mixture (one container per concentration) according to
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 23266
Première édition
2020-06
Qualité du sol — Essai de
détermination de l'inhibition de
la reproduction chez les acariens
oribates (Oppia nitens) exposés aux
contaminants dans le sol
Soil quality — Test for measuring the inhibition of reproduction in
oribatid mites (Oppia nitens) exposed to contaminants in soil
Numéro de référence
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ISO 2020
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 4
5 Réactifs et matériel . 5
6 Appareillage . 7
7 Mode opératoire. 8
7.1 Plan d’expérience . 8
7.1.1 Généralités . 8
7.1.2 Essai préliminaire . 8
7.1.3 Essai définitif . 8
7.2 Préparation du mélange d’essai . 9
7.2.1 Essai sur sol contaminé . . 9
7.2.2 Essai sur substances ajoutées au substrat d’essai .10
7.2.3 Préparation des récipients témoins .10
7.3 Ajout des acariens .11
7.4 Conditions d’essai et mesurages .11
7.5 Détermination de la survie et de l’efficacité de reproduction des adultes .11
8 Calcul et expression des résultats .12
8.1 Calcul .12
8.2 Expression des résultats .12
9 Validité de l’essai .12
10 Analyse statistique .13
10.1 Généralités .13
10.2 Essais à une seule concentration .13
10.3 Essais multi-concentrations .13
10.3.1 Essai préliminaire .13
10.3.2 Essai définitif .14
11 Rapport d’essai .14
Annexe A (informative) Techniques d’élevage d’Oppia nitens .16
Annexe B (normative) Détermination de la capacité de rétention d’eau .19
Annexe C (informative) Recommandations relatives à l’ajustement du pH d’un sol artificiel .21
Annexe D (informative) Extraction et comptage d’Oppia nitens .22
Annexe E (informative) Performance de la méthode .26
Bibliographie .32
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iis .orgoiso// fr/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique.
Il convient que l'utilisateur adresse tout retour d'information ou toute question concernant le présent
document à l'organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l'adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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Introduction
Les systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur
les effets des contaminants présents dans les sols et sont proposés pour compléter l’analyse
[1] [2]
chimique conventionnelle (voir l’ISO 15799 et l’ISO 17616 ). L’ISO 15799 contient une liste et une
brève caractérisation des systèmes d’essai recommandés et normalisés et l’ISO 17616 donne des
recommandations sur le choix et l’évaluation des essais biologiques. Les systèmes d’essai aquatiques
avec un éluat de sol sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur la fraction des contaminants
susceptibles d’être entraînés jusque dans les eaux souterraines par le cheminement de l’eau (fonction
de rétention des sols), alors que les systèmes d’essai terrestres sont utilisés pour évaluer la fonction
d’habitat des sols concernant le fait de subvenir aux besoins du biote du sol et de ses interactions.
Les acariens sont un groupe divers d’arthropodes, présent dans le monde entier, appartenant à une
sous-classe des Arachnides, avec plus de 40 000 espèces comptabilisées, divisé en deux superordres
(Acariformes et Parasitiformes). En raison de leur taille relativement petite (de quelques micromètres
à quelques centimètres), ils occupent des niches écologiques spécifiques sur les végétaux et dans les
[5]
sols .
Dans les dernières années, il y a eu une augmentation des méthodes d’essai biologiques pour évaluer
les sols contaminés, en retard par rapport aux autres milieux (par exemple, eau et sédiment). Les
essais écotoxicologiques pour les sols sont confrontés, entre autres, à la complexité des systèmes
terrestres (par exemple, manque d’homogénéité) et de la variété des voies d’exposition (par exemple,
absorption par voie alimentaire, exposition à l’eau interstitielle ou aux vapeurs du sol, ou contact
[3]
direct avec les particules de sol). Une méthode développée récemment (ISO 21285 ) évalue les effets
d’un sol contaminé sur la reproduction de l’acarien prédateur (Hypoaspis aculeifer), principalement
par absorption par voie alimentaire. Les acariens oribates représentent une niche différente de H.
aculeifer dans le sol, mais pour autant essentielle, contribuant à la minéralisation du carbone et à la
formation du sol, ainsi qu’au rejet d’azote et de phosphore par les activités de pâturage. Les acariens
oribates comptent parmi les espèces de microarthropodes les plus variées et les plus abondantes du
sol. Toutefois, leur métabolisme et leur croissance plus lents, couplés à une faible fécondité, une longue
durée de vie et une capacité de dispersion limitée augmentent le risque de vulnérabilité et de sensibilité
[6]
aux perturbations à court et long terme . L’utilisation d’acariens oribates dans le cadre des essais
[7][8][9][10][11]
écotoxicologiques terrestre a été étudiée en détail . Les recherches récentes utilisant Oppia
nitens pour les essais sur sols ont démontré une applicabilité et une sensibilité relative de l’espèce pour
l’évaluation des sols contaminés des zones agronomiques ainsi que des écozones des plaines boréales
[6][12][13][14][15] [16][17]
et de la taïga . Les recherches ont également démontré sa sensibilité aux métaux
[18][19] [20][21] [16][17][22]
, aux pesticides et aux composés organiques . Oppia nitens est un acarien oribate
peuplant la couche organique supérieure du sol, et est un membre de la plus grande famille des oribates
(Oppiidae), comptant environ 1 000 espèces dans 129 genres répartis dans les zones holarctiques et
[23]
antarctiques . Ce sont des fongivores polyphages, se reproduisant par voie sexuée, qui peuvent être
facilement élevés en laboratoire dans le sol ou sur le plâtre de Paris, et nourris avec de la levure de
[10]
boulanger .
Cette méthode décrit les modes opératoires pour réaliser des essais de 28 jours déterminant les effets de
sols contaminés sur la survie et la reproduction de l’acarien oribate, Oppia nitens. En option, la méthode
peut être utilisée pour évaluer le danger létal et sublétal des substances chimiques ajoutées aux sols
standards (par exemple, sol artificiel) pour les acariens oribates. La performance de cette méthode a
[15]
été évaluée lors d’une étude interlaboratoires internationale , comme synthétisé à l’Annexe E. Les
acariens représentent des communautés qui ne peuvent pas être exclues de l’évaluation des dangers
pour l’environnement. Cette espèce est considérée comme étant représentative des acariens non
prédateurs du sol.
NORME INTERNATIONALE ISO 23266:2020(F)
Qualité du sol — Essai de détermination de l'inhibition de
la reproduction chez les acariens oribates (Oppia nitens)
exposés aux contaminants dans le sol
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de substances
chimiques toxiques, mutagènes ou nocives ou des micro-organismes infectieux. Des risques pour
la santé au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l’évaporation de substances
chimiques pendant la manipulation et l’incubation. Il convient de prendre des précautions pour
éviter tout contact avec la peau.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie l’une des méthodes d’évaluation de la fonction d’habitat des sols et
détermine les effets des contaminants et substances chimiques individuelles du sol sur la reproduction
de l’acarien oribate, Oppia nitens, par absorption par voie dermique et alimentaire. Cet essai chronique
(28 jours) est applicable aux sols et matériaux de type sol de qualité inconnue (par exemple, sites
contaminés, sols amendés, sols après remédiation, sols agricoles ou autres sites sujets à préoccupation et
déchets). Cette méthode n’est pas destinée à remplacer ni les essais sur vers de terre ou sur collemboles
car elle représente un autre groupe taxonomique (= acariens; à savoir, arachnides), ni l’essai sur acariens
prédateurs car cette espèce représente un niveau trophique et une niche écologique différents.
Les effets des substances sont évalués en utilisant un sol standard, de préférence un substrat défini de
sol artificiel. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un
sol témoin. Selon l’objectif de l’étude, il convient que le substrat témoin et le substrat de dilution (séries
de dilutions du sol contaminé) soient un sol non contaminé ayant des propriétés similaires à celles du
sol à analyser (sol de référence) ou un sol standard (par exemple, sol artificiel).
Des informations sont fournies sur la façon d’utiliser cette méthode pour analyser les substances dans
des conditions tempérées.
Le présent document n’est pas applicable aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/
sol est supérieur à 1, ou aux substances dont la pression de vapeur dépasse 300 Pa à 25 °C.
NOTE La stabilité de la substance d’essai ne peut pas être garantie tout au long de la période d’essai. La
méthode d’essai ne prévoit pas de contrôler la persistance de la substance soumise à essai.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d'échange cationique et du taux de saturation en
bases échangeables à l'aide d'une solution de chlorure de baryum
ISO 11265, Qualité du sol — Détermination de la conductivité électrique spécifique
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des
sols — Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de
sols destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol du fait de l’activité humaine
3.2
concentration efficace
CEx
concentration (fraction massique) d’un échantillon pour essai ou d’une substance d’essai qui engendre
un effet de x % sur un critère d’effet donné durant une période d’exposition déterminée, par rapport à
un témoin
EXEMPLE Une CE50 est une concentration estimée produire un effet de 50 % d’une population exposée sur
un critère d’effet donné durant une période d’exposition déterminée.
Note 1 à l'article: La CEx est exprimée en pourcentage de sol soumis à essai (masse sèche) par mélange de sols
(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CEx est exprimée en masse de substance d’essai
par masse sèche de sol en milligrammes par kilogramme.
3.3
taux efficace
REx
taux d’un sol soumis à essai qui engendre un effet de x % sur un critère d’effet donné durant une période
d’exposition déterminée, par rapport à un témoin
3.4
concentration létale
CLx
concentration (fraction massique) d’un échantillon pour essai ou d’une substance d’essai qui engendre
une mortalité de x % durant une période d’exposition déterminée, par rapport à un témoin
EXEMPLE Une CL50 est une concentration estimée provoquer une mortalité de 50 % chez une population
exposée sur une période d’exposition définie.
Note 1 à l'article: La CLx est exprimée en pourcentage de sol soumis à essai (masse sèche) par mélange de sols
(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CLx est exprimée en masse de substance d’essai
par masse sèche de sol en milligrammes par kilogramme.
3.5
essai limite
essai à une seule concentration comprenant au moins cinq réplicats chacun, le sol d’essai (3.14) sans
dilution ou la concentration maximale de substance d’essai mélangée dans le sol témoin et le témoin
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3.6
concentration minimale avec effet observé
CMEO
concentration d’essai minimale (fraction massique) d’un échantillon pour essai ou d’une substance
d’essai ayant un effet statistiquement significatif (probabilité p < 0,05)
Note 1 à l'article: Dans cet essai, la CMEO est exprimée en pourcentage de sol soumis à essai (masse sèche) par
mélange de sols (masse sèche) ou en masse de substance d’essai par masse sèche de sol soumis à essai. Il convient
que toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO présentent généralement un effet statistiquement
différent du témoin.
3.7
taux minimal avec effet observé
RMEO
taux minimal d’un sol soumis à essai dans un sol témoin pour lequel un effet statistiquement significatif
est observé
3.8
concentration sans effet observé
CSEO
concentration d’essai maximale (fraction massique) d’un échantillon pour essai ou d’une substance
d’essai, immédiatement inférieure à la CMEO, à laquelle aucun effet n’est observé
Note 1 à l'article: Dans cet essai, la concentration correspondant à la CSEO ne présente aucun effet statistiquement
significatif (probabilité p < 0,05) durant une période d’exposition déterminée, en comparaison avec le témoin.
3.9
taux sans effet observé
RSEO
taux minimal d’un sol soumis à essai, immédiatement inférieur au RMEO, qui, en comparaison avec le
témoin, ne présente aucun effet statistiquement significatif (probabilité p < 0,05) durant une période
d’exposition déterminée
3.10
reproduction
nombre moyen de juvéniles par récipient d’essai après une incubation de 28 jours dans les conditions
d’essai spécifiées
3.11
sol de référence
sol non contaminé avec des propriétés pédologiques (concentrations en éléments nutritifs, pH, teneur
en carbone organique et texture) comparables à celles du sol d’essai (3.14)
3.12
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les principales propriétés (pH, texture, teneur en matières
organiques) se situent dans une gamme connue
EXEMPLE Euro-sols, sol artificiel, sol standard LUFA.
Note 1 à l'article: Les propriétés des sols standards peuvent différer de celles du sol d’essai.
3.13
sol témoin
sol de référence ou sol standard (3.12) utilisé comme témoin et comme milieu pour préparer une série
de dilution avec des sols/échantillons d’essai ou une substance de référence, qui satisfait aux critères de
validité
Note 1 à l'article: Dans le cas d’un sol naturel, il est recommandé de démontrer sa capacité à être utilisé pour un
essai et à remplir les critères de validité de l’essai avant de l’utiliser dans un essai définitif.
3.14
sol d’essai
échantillon de sol prélevé sur le terrain ou de sol dopé avec une substance chimique, dont la toxicité doit
être évaluée vis-à-vis des acariens
3.15
mélange d’essai
mélange d’un sol contaminé ou d’une substance d’essai (par exemple, substance chimique, biosolide,
déchet) avec un sol témoin (3.13)
Note 1 à l'article: Les mélanges d’essai sont exprimés en pourcentage de sol contaminé par masse sèche de sol.
3.16
ratio de mélange d’essai
ratio entre le sol d’essai et le sol témoin dans un mélange d’essai (3.15)
Note 1 à l'article: Différents ratios peuvent être appliqués dans une série de dilutions pour établir une relation
dose-effet.
4 Principe
Les effets sur la reproduction d’acariens adultes Oppia nitens élevés en laboratoire et exposés au sol
d’essai, sont comparés à ceux observés pour les organismes présents dans le sol témoin. Si cela est
approprié, les effets sont déterminés sur la base de l’exposition à un mélange d’essai de sol contaminé et
de sol témoin ou à une gamme de concentrations d’une substance d’essai mélangée dans le sol témoin.
Les mélanges d’essai sont préparés au début de l’essai et ne sont pas renouvelés au cours de la période
d’essai.
L’essai commence avec 15 acariens adultes provenant d’élevages synchronisés (8 jours à 10 jours après
exuviation (c’est-à-dire, mue) jusqu’au stade adulte) par récipient d’essai. L’essai est effectué dans des
récipients en verre de 30 ml contenant le sol (poids humide) équivalent à un volume d’environ 20 ml,
et au moins cinq réplicats sont préparés pour chaque traitement. L’essai se déroule pendant 28 jours
à (20 ± 2) °C après quoi les juvéniles (F ) éclosent des œufs pondus par les adultes et le nombre de
juvéniles produits est déterminé. La survie des adultes est également déterminée à la fin de l’essai.
Les résultats de l’essai, en fonction du plan d’expérience, sont comparés avec un témoin ou, lorsqu’une
dilution en série est utilisée, pour déterminer la concentration entraînant une réduction de x % des
juvéniles produits en comparaison avec le témoin (CEx, 28 jours). Une estimation de la concentration
d’essai entraînant une mortalité de x % (CLx, 28 jours) est un critère d’effet facultatif. Si un test
d’hypothèse à plusieurs concentrations est utilisé, l’efficacité de reproduction des acariens exposés aux
mélanges d’essai est comparée à celle des témoins afin de déterminer la concentration sans effet sur la
mortalité et la reproduction (CSEO).
Dans le cas où il n'y a aucune connaissance préalable de la dilution/concentration du sol soumis à essai
ou de la substance d’essai susceptible d’avoir un effet, il est utile d’effectuer cet essai en deux étapes:
— un essai préliminaire est réalisé pour obtenir une indication de la dilution/concentration produisant
un effet, et de la dilution/concentration ne provoquant pas de mortalité. Les dilutions/concentrations
à utiliser au cours de l’essai définitif peuvent ensuite être choisies; et
— l’essai définitif pour déterminer les effets létaux et sublétaux de (dilutions de) sols contaminés ou
de la concentration d’une substance qui, lorsqu’elle est uniformément répartie dans le sol standard:
1) provoque x % d’inhibition de la reproduction, CEx (par exemple, CE10, CE20 ou CE50), ou 2) n’a
pas d’effet significatif sur le nombre de juvéniles éclos des œufs comparativement au témoin pour
l’estimation de la CSEO et de la CMEO.
L’utilisation d’un sol de référence est une exigence essentielle pour démontrer l’état actuel de la
population d’essai et éviter une mauvaise interprétation des résultats.
4 © ISO 2020 – Tous droits réservés
5 Réactifs et matériel
5.1 Matériel biologique
Dans cet essai, des acariens adultes, Oppia nitens C.L. Koch 1836, âgés de 8 jours à 10 jours (c’est-à-
dire, 8 jours à 10 jours après exuviation jusqu’au stade adulte), choisis parmi des adultes récemment
apparus prélevés sur une période de 1 jour à 3 jours, sont requis pour commencer l’essai. Les acariens
doivent être choisis à partir d’un élevage synchronisé. L’Annexe A fournit une méthode d’élevage d’Oppia
nitens et d’obtention d’organismes d’essai synchronisés.
Les acariens adultes Oppia nitens sont obtenus à partir d’élevages de laboratoire maintenus dans des
conditions de température, de photopériode et d’alimentation similaires à celles utilisées pendant
l’essai. Il convient de faire confirmer l’identification de l’espèce par un personnel qualifié expérimenté
dans le domaine de l’identification des acariens du sol à l’aide des caractéristiques taxonomiques
[26]
distinctives, décrites dans les clés taxonomiques , ou par l’identification taxonomique reposant sur
[4]
l’analyse de l’ADN (c’est-à-dire, code-barres ADN) telle qu’indiquée dans l’ISO 21286 . Tous les acariens
utilisés dans un essai doivent provenir de la même population et avoir la même origine. Les animaux à
utiliser pour établir les élevages peuvent provenir de laboratoires publics ou privés élevant Oppia nitens
[24]
pour des essais de toxicité du sol, ou de fournisseurs biologiques du commerce .
5.2 Mélange d’essai, comprenant le sol prélevé sur le terrain ou le sol témoin mélangé avec le sol
d’essai ou dopé avec la substance d’essai.
5.2.1 Sol ou déchets prélevé(s) sur le terrain
L’échantillon ou les échantillons peut/peuvent être un sol prélevé sur un site industriel, agricole ou sur
un autre site d’intérêt, ou des déchets (par exemple, matériau de dragage, boue résiduaire des stations
d’épuration des eaux usées, compost végétal ou fumier) envisagés pour un épandage éventuel.
Les sols prélevés sur le terrain et utilisés au cours de cet essai doivent être tamisés entre 4 mm
et 10 mm (tamis à mailles carrées), pour éliminer les gros fragments, et être soigneusement mélangés.
Si nécessaire, le sol peut être séché à l’air, sans chauffer, avant le tamisage. Il convient que la durée
de conservation du sol d’essai soit la plus courte possible. Le sol doit être conservé conformément
à l’ISO 18400-206 en utilisant des récipients qui limitent les pertes de contaminants du sol par
volatilisation et sorption sur les parois des récipients. Si des sols ou des mélanges d’essai ont été
conservés, il convient de les mélanger une nouvelle fois avant de les utiliser. Il convient de ne pas
rectifier le pH du sol car il peut avoir une incidence sur la biodisponibilité des contaminants du sol.
NOTE Un tamis de 4 mm peut être utilisé pour tout sol minéral ayant une teneur relativement faible en
matière organique (par exemple, sol agricole). Cependant, pour les sols forestiers ou les sols de zones humides
ayant une teneur en matière organique élevée, des tamis plus larges (par exemple, de 6 mm à 8 mm pour les sols
forestiers et de 8 mm à 10 mm pour les sols de zones humides) peuvent être requis.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées pour
chaque échantillon de sol prélevé sur site:
a) pH conformément à l’ISO 10390;
b) texture (sable, loam, limon) conformément à l’ISO 11277;
c) teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
d) capacité de rétention d’eau conformément à l’Annexe B;
e) capacité d'échange cationique conformément à l’ISO 11260;
f) conductivité électrique conformément à l’ISO 11265;
g) carbone organique conformément à l’ISO 10694;
h) pourcentage de matériel retenu par le tamis.
NOTE Il est important de mesurer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai.
5.2.2 Sol témoin, soit a) un sol de référence (3.11) soit b) un sol standard (3.12) permettant la
présence d’acariens oribates. Le sol témoin et le sol utilisé pour la dilution ne doivent pas différer l’un de
l’autre au cours d’un essai [soit a) soit b)].
a) Si des sols de référence provenant de zones non contaminées voisines d’un site contaminé sont
disponibles, il convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les sols d’essai.
S’il est impossible d’exclure une contamination toxique ou des propriétés inhabituelles du sol, il
convient de privilégier les sols témoins standards.
b) Pour évaluer les effets de substances mélangées au sol, des sols standards (par exemple, sol
artificiel, sol standard LUFA) doivent être utilisés comme substrat d’essai. Les propriétés du sol
standard prélevé sur le terrain doivent être consignées dans le rapport.
Le substrat dénommé «sol artificiel» peut être utilisé comme un sol standard et a la composition
suivante:
Pourcentage exprimé en masse
sèche
— Tourbe de sphaignes, finement moulue [une granulométrie 10 %
de (2 ± 1) mm est acceptable], exempte de tout résidu végétal visible
— Argile kaolinique contenant au moins 30 % de kaolinite 20 %
— Sable de quartz industriel (contenant en majorité du sable fin 70 %
constitué à plus de 50 % de grains d’une granulométrie de 0,05 mm
à 0,2 mm)
NOTE Il a été démontré qu’Oppia nitens peut remplir les critères de validité (survie et reproduction) lorsqu’il
[24]
est soumis à essai dans des sols ayant une plus faible teneur en carbone organique (par exemple 2,6 %) et
l’expérience montre que les critères de validité peuvent être remplis dans un sol artificiel contenant 10 % de
tourbe. Par conséquent, avant d’utiliser un tel sol dans un essai définitif, il n’est pas nécessaire de démontrer
que le sol artificiel permet de remplir les critères de validité, sauf si la teneur en tourbe est inférieure à la valeur
[24]
spécifiée ci-dessus .
Préparer le sol artificiel au moins trois jours avant le début de l’essai, en mélangeant soigneusement
les constituants secs indiqués ci-dessus dans un mélangeur de laboratoire de grandes dimensions.
L’Annexe C fournit des recommandations relatives à l’ajustement du pH du sol artificiel; la gamme de
[24]
pH optimale pour l’essai sur O. nitens est de (7,0 ± 0,5) unités de pH . Une partie de l’eau déionisée
nécessaire est ajoutée pendant le mélange. Il convient de tenir compte de l’eau qui est utilisée pour
introduire la substance d’essai dans le sol. La quantité de carbonate de calcium nécessaire peut varier
selon les propriétés du lot particulier de tourbe de sphaignes et il convient qu’elle soit déterminée
par des mesurages effectués sur des sous-échantillons immédiatement avant l’essai. Conserver le sol
artificiel mélangé à température ambiante pendant au moins trois jours pour équilibrer l’acidité. Pour
déterminer le pH et la capacité maximale de rétention d’eau, le sol artificiel sec est pré-humidifié un
ou deux jours avant le début de l’essai en ajoutant de l’eau déionisée de manière à atteindre environ
la moitié de la teneur finale en eau requise, comprise entre 50 % et 70 % de la capacité maximale de
rétention d’eau.
La capacité totale de rétention d’eau est déterminée conformément à l’Annexe B; le pH est déterminé
conformément à l’ISO 10390.
5.3 Nourriture
Une source de nourriture appropriée est la levure du boulanger sèche granulée, disponible dans le
commerce pour l’usage domestique, fournie en quantité suffisante, par exemple de 0,5 mg à 1 mg. Elle
est ajoutée à chaque récipient au début de l’essai (Jour 0) et tous les 7 jours jusqu’au Jour 21 inclus.
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5.4 Substance de référence
La CEx d’une substance de référence doit être déterminée pour s’assurer que les conditions d’essai en
laboratoire sont adéquates et pour vérifier que la réponse des organismes d’essai n’a pas évolué dans
le temps. La substance de référence peut être soumise à essai parallèlement à la détermination de la
toxicité de chaque échantillon pour essai à une concentration qui doit être démontrée au préalable
lors d’une étude dose-réponse comme produisant un effet d’environ 50 %. Dans ce cas, il convient que
le nombre de réplicats soit identique à celui des témoins. En variante, la substance de référence est
soumise à essai une à deux fois par an lors d’un essai dose-réponse. Selon le dispositif choisi, le nombre
de concentrations et de réplicats ainsi que le facteur de séparation diffèrent (voir 7.1.3), mais il convient
d’obtenir une réponse de 10 % à 90 % d’effet (facteur de séparation de 1,8). L’acide borique est une
[14][15][19]
substance de référence appropriée ayant montré un effet sur la reproduction .
Il convient que la CE50 de l’acide borique basée sur le nombre de juvéniles se situe entre 290 mg/kg
(masse sèche) de sol et 410 mg/kg (masse sèche) de sol dans le sol artificiel, et entre 80 mg/kg (masse
sèche) de sol et 120 mg/kg (masse sèche) de sol dans le sol prélevé sur le terrain, notamment le sol
[15]
standard LUFA 2.2 .
5.4.1 Acide borique (CAS 10043-35-3), H BO (99 %).
3 3
AVERTISSEMENT — Lors de la manipulation de ces substances, il convient de prendre toutes les
précautions nécessaires pour éviter toute ingestion ou tout contact avec la peau.
6 Appareillage
Utiliser du matériel de laboratoire et l’appareillage suivant.
6.1 Récipients d’essai, en verre (par exemple, flacons en verre) ou autre matériau chimiquement
inerte, d’une capacité d’environ 30 ml (environ 2,6 cm de diamètre intérieur). Les récipients d’essai
doivent être couverts pour empêcher les acariens de sortir mais doivent permettre les échanges gazeux
et une pénétration de la lumière (par exemple, couvercle transparent perforé ou amovible permettant
une aération hebdomadaire).
6.2 Appareillage permettant de déterminer la masse sèche du substrat, conformément à
l’ISO 11465.
6.3 Mélangeur de laboratoire de grandes dimensions pour la préparation du mélange d’essai (5.2).
6.4 Balance de précision adaptée.
6.5 Appareillage permettant de mesurer la température, le pH et la teneur en eau du substrat d’essai.
6.6 Appareillage d’extraction à la chaleur des acariens, comme décrit à l’Annexe D.
6.7 Environnement d’essai
6.7.1 Enceinte, thermostatée à (20 ± 2) °C.
6.7.2 Source lumineuse, permettant de fournir aux récipients une intensité lumineuse de 400 lux
à 800 lux à la surface du substrat, selon un cycle contrôlé lumière/obscurité compris entre 12 h:12 h
et 16 h:8 h.
7 Mode opératoire
7.1 Plan d’expérience
7.1.1 Généralités
Un échantillon de sol prélevé sur le terrain peut être soumis à essai à une seule concentration
(généralement 100 %) ou faire l’objet d’une évaluation de sa toxicité lors d’un essai multi-concentrations
pour lequel une série de dilutions est préparée en mélangeant des quantités déterminées avec un
sol témoin. Lorsque des substances incorporées dans le sol sont soumises à essai, une gamme de
concentrations est préparée en mélangeant des quantités de la substance d’essai avec un sol standard
(par exemple, un sol artificiel). Les concentrations sont exprimées en milligrammes de substance d’essai
par kilogramme de sol témoin équivalent sec. Selon la connaissance des niveaux de réponse pertinents,
un essai préliminaire peut précéder l’essai définitif. Chaque essai définitif multi-concentrations
comprend une gamme de mélanges de sols (traitements).
7.1.2 Essai préliminaire
Il est facultatif de réaliser un essai préliminaire permettant de déterminer la gamme de ratios de
mélange (par exemple 0 %, 1 %, 5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % de sol) ou la gamme de concentrations
en substance d’essai (par exemple 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg et 1 000 mg/kg; les
concentrations étant exprimées en milligrammes de substance d’essai par kilogramme de sol témoin
sec) ayant un effet sur O. nitens. L’essai préliminaire est effectué avec un nombre de réplicats réduit
(par exemple, 3 réplicats) par rapport à l’essai définitif. La durée de l’essai préliminaire est de 28 jours,
après quoi la mortalité des acariens adultes et le nombre de juvéniles sont déterminés. D’après les
résultats de l’essai préliminaire, il convient d’estimer la CE50 pour l’inhibition de la reproduction. Lors
de l’essai définitif, il convient de choisir de préférence la gamme de concentrations/dilutions de façon
qu’elle inclue les concentrations qui couvrent une large gamme, y compris une faible concentration
qui n’a aucun effet indésirable (tout comme le traitement témoin négatif) et une concentration élevée
qui provoque des effets « totaux » ou graves. Pour que la gamme de concentrations reste large et afin
d’obtenir les effets importants de milieu de gamme, il peut être nécessaire d’utiliser des traitements
supplémentaires pour fractionner plus finement la gamme sélectionnée.
Lorsqu’aucun effet n’est observé, même dans 100 % de sol contaminé ou à une concentration en
substance d’essai de 1 000 mg/kg de sol standard (masse sèche), l’essai définitif peut être conçu comme
un essai limite.
7.1.3 Essai définitif
La conception de l’essai définitif dépend des objectifs de l’essai. Les propriétés d’habitat des échantillons
de sol prélevés sur site sont généralement caractérisées en comparant les effets biologiques observés
dans le sol soumis à essai avec ceux observés dans un sol de référence, ou si celui-ci n’est pas disponible
ou n’est pas approprié en raison de sa toxicité ou de caractéristiques physico-chimiques atypiques, dans
un sol standard. Les résultats pour le sol standard aident à faire la distinction entre les effets liés aux
contaminants et les effets non liés aux contaminants, provoqués par des propriétés physico-chimiques.
Indépendamment du fait qu’un sol de référence ou un sol standard soit utilisé pour les comparaisons
statistiques, les résultats obtenus à partir du sol standard doivent être utilisés pour évaluer la validité
[24]
et l’acceptabilité de l’essai .
Si, à des fins de caractérisation, un plan d’expérience incluant une série de dilutions est nécessaire, trois
conceptions sont possibles:
1) pour l’approche CEx, au moins 7 concentrations plus le(s) traitement(s) témoin(s) doivent être
utilisés, et davantage (c’est-à-dire ≥ 10 plus les témoins) sont recommandés pour augmenter la
[25]
probabilité d’encadrer chaque critère visé . Le facteur de séparation peut être variable: plus petit
pour les concentrations plus faibles, plus important pour les concentrations élevées. Cinq réplicats
pour chaque traitement plus les témoins sont recommandés;
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NOTE Si un essai préliminaire est effectué avant l’essai définitif, il est possible d’utiliser moins de
concentrations (par exemple, 6 ou 5) lors de l’essai définitif, car davantage d’informations seront disponibles
sur la gamme de concentrations/dilutions ayant un effet.
2) pour l’approche CSEO, il convient d’utiliser une série géométrique d’au moins cinq concentrations ou
mélanges d’essai. Cinq réplicats pour chaque traitement plus huit témoins sont recommandés; ou
3) pour l’approche mixte, il convient d’utiliser une série géométrique de 6 à 8 concentrations ou
mélanges d’essai. Cinq réplicats pour chaque traitement plus huit témoins sont recommandés. Cette
méthode mixte permet d’évaluer un RSEO/une CSEO ainsi qu’un REx/une CEx.
Quel que soit le plan d’expérience choisi, les concentrations d’essai doivent être espacées par un facteur
n’excédant pas 2.
Un essai limite peut être suffisant si, lors de l’essai préliminaire, aucun effet toxique n’a été observé.
Lors de l’essai limite, seule la concentration maximale soumise à essai lors de l’essai préliminaire (c’est-
à-dire 1 000 mg/kg) ou le sol d’essai non dilué (100 %) et le témoin doivent être soumis à essai avec au
moins cinq réplicats pour chaque traitement.
Pour faciliter la vérification des analyses physico-chimiques au début et à la fin de l’essai, il est
recommandé d’utiliser des récipients supplémentaires pour chaque concentration et pour le témoin.
Chaque récipient d’essai (réplicat) est rempli avec le poids humide équivalent au volume mesuré
d’environ 20 ml à une teneur optimale en eau du sol (voir 7.2.1). Pour assurer une m
...
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