Soil quality — Test for measuring the inhibition of reproduction in oribatid mites (Oppia nitens) exposed to contaminants in soil

This document specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining effects of soil contaminants and individual chemical substances on the reproduction of the oribatid mite Oppia nitens by dermal and alimentary uptake. This chronic (28-day) test is applicable to soils and soil materials of unknown quality (e.g., contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites under concern and waste materials). This method is not intended to replace the earthworm or Collembola tests since it represents another taxonomic group (= mites; i.e., arachnids), nor the predatory mite test since this species represents a different trophic level and ecological niche. Effects of substances are assessed using standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For contaminated soils, the effects are determined in the test soil and in a control soil. According to the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) should be either an uncontaminated soil with similar properties to the soil sample to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g., artificial soil). Information is provided on how to use this method for testing substances under temperate conditions. This document is not applicable to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than 1, or to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa at 25 °C. NOTE The stability of the test substance cannot be assured over the test period. No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.

Qualité du sol — Essai de détermination de l'inhibition de la reproduction chez les acariens oribates (Oppia nitens) exposés aux contaminants dans le sol

Le présent document spécifie l'une des méthodes d'évaluation de la fonction d'habitat des sols et détermine les effets des contaminants et substances chimiques individuelles du sol sur la reproduction de l'acarien oribate, Oppia nitens, par absorption par voie dermique et alimentaire. Cet essai chronique (28 jours) est applicable aux sols et matériaux de type sol de qualité inconnue (par exemple, sites contaminés, sols amendés, sols après remédiation, sols agricoles ou autres sites sujets à préoccupation et déchets). Cette méthode n'est pas destinée à remplacer ni les essais sur vers de terre ou sur collemboles car elle représente un autre groupe taxonomique (= acariens; à savoir, arachnides), ni l'essai sur acariens prédateurs car cette espèce représente un niveau trophique et une niche écologique différents. Les effets des substances sont évalués en utilisant un sol standard, de préférence un substrat défini de sol artificiel. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol témoin. Selon l'objectif de l'étude, il convient que le substrat témoin et le substrat de dilution (séries de dilutions du sol contaminé) soient un sol non contaminé ayant des propriétés similaires à celles du sol à analyser (sol de référence) ou un sol standard (par exemple, sol artificiel). Des informations sont fournies sur la façon d'utiliser cette méthode pour analyser les substances dans des conditions tempérées. Le présent document n'est pas applicable aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/sol est supérieur à 1, ou aux substances dont la pression de vapeur dépasse 300 Pa à 25 °C. NOTE La stabilité de la substance d'essai ne peut pas être garantie tout au long de la période d'essai. La méthode d'essai ne prévoit pas de contrôler la persistance de la substance soumise à essai.

General Information

Status
Published
Publication Date
07-Jun-2020
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
28-Apr-2020
Completion Date
08-Jun-2020
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ISO 23266:2020 - Soil quality -- Test for measuring the inhibition of reproduction in oribatid mites (Oppia nitens) exposed to contaminants in soil
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ISO 23266:2020 - Qualité du sol -- Essai de détermination de l'inhibition de la reproduction chez les acariens oribates (Oppia nitens) exposés aux contaminants dans le sol
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23266
First edition
2020-06
Soil quality — Test for measuring the
inhibition of reproduction in oribatid
mites (Oppia nitens) exposed to
contaminants in soil
Qualité du sol — Essai de détermination de l'inhibition de la
reproduction chez les acariens oribates (Oppia nitens) exposés aux
contaminants dans le sol
Reference number
ISO 23266:2020(E)
ISO 2020
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ISO 23266:2020(E)
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Published in Switzerland
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ISO 23266:2020(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 2

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 4

5 Reagents and material .................................................................................................................................................................................... 4

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 7

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 7

7.1 Experimental design .......................................................................................................................................................................... 7

7.1.1 General...................................................................................................................................................................................... 7

7.1.2 Range-finding test (preliminary test) ............................................................................................................ 7

7.1.3 Definitive test ...................................................................................................................................................................... 8

7.2 Preparation of test mixture .......................................................................................................................................................... 8

7.2.1 Testing contaminated soil ........................................................................................................................................ 8

7.2.2 Testing substances added to the test substrate .................................................................................... 9

7.2.3 Preparation of control containers ..................................................................................................................10

7.3 Addition of the mites ......................................................................................................................................................................10

7.4 Test conditions and measurements ...................................................................................................................................10

7.5 Determination of adult survival and reproductive output .............................................................................10

8 Calculation and expression of results ..........................................................................................................................................11

8.1 Calculation ...............................................................................................................................................................................................11

8.2 Expression of results .......................................................................................................................................................................11

9 Validity of the test .............................................................................................................................................................................................11

10 Statistical analysis ............................................................................................................................................................................................12

10.1 General ........................................................................................................................................................................................................12

10.2 Single-concentration tests ..........................................................................................................................................................12

10.3 Multi-concentration tests............................................................................................................................................................12

10.3.1 Range-finding test ........................................................................................................................................................12

10.3.2 Definitive test ...................................................................................................................................................................12

11 Test report ................................................................................................................................................................................................................13

Annex A (informative) Techniques for rearing and breeding of Oppia nitens ........................................................15

Annex B (normative) Determination of water holding capacity ..........................................................................................18

Annex C (informative) Guidance on adjustment of pH of artificial soil .........................................................................19

Annex D (informative) Extraction and counting of Oppia nitens ..........................................................................................20

Annex E (informative) Performance of the method ...........................................................................................................................24

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................29

© ISO 2020 – All rights reserved iii
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ISO 23266:2020(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to

the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see

www .iso .org/ iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,

Biological characterization.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 23266:2020(E)
Introduction

Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in soil

[1] [2]

and are proposed to complement conventional chemical analysis (see ISO 15799 and ISO 17616 ).

ISO 15799 includes a list and short characterization of recommended and standardized test systems

and ISO 17616 gives guidance on the choice and evaluation of the bioassays. Aquatic test systems with

soil eluate are applied to obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching the

groundwater by the water path (retention function of soils), whereas terrestrial test systems are used

to assess the habitat function of soils with regards to supporting soil biota and interactions within.

Mites (Acari) are a world-wide and diverse group of arthropods belonging to a sub-class of Arachnida

with over 40 000 species recorded, divided into two super-orders (Acariformes and Parasitiformes).

Due to their relative small size (a few μm to a few cm), they occupy specific ecological niches on plants

[5]
as well as in soils .

In recent years, there has been an increase in the development of biological test methods for assessing

contaminated soil, which has historically lagged behind that for other media (e.g., water and sediment).

Ecotoxicology tests for soil are challenged, among other things, by the complexity of soil systems

(e.g., lack of homogeneity) and the variety of exposure routes (e.g., via alimentary uptake, exposure

to pore water or soil vapours, or direct contact with soil particles). A recently developed method

[3]

(ISO 21285 ) assesses the effects of contaminated soil on the reproduction of the predatory mite

(Hypoaspis aculeifer), mainly through alimentary uptake. Oribatid mites represent a different but

essential ecological niche than H. aculeifer within soil, contributing to carbon mineralization and soil

formation, as well as nitrogen and phosphorous release through grazing activities. Oribatid mites are

among the most diverse and abundant micro-arthropod species within soil, however, their slower

metabolism and development, coupled with low fecundity, long life span, and limited dispersal capacity

[6]

increase the potential for susceptibility and sensitivity to short- and long-term disturbances . The

[7][8][9]

use of oribatid mites in the context of soil ecotoxicology testing has been thoroughly reviewed

[10][11]

. Recent research using Oppia nitens for soil testing has demonstrated applicability and relative

sensitivity of the species for the assessment of contaminated soils from both agronomic regions, and

[6][12][13][14][15]

those from the boreal and taiga ecozones . Research has also demonstrated its sensitivity

[16][17][18][19] [20][21] [16][17][22]
to metals , pesticides , and organic compounds . Oppia nitens is an oribatid

mite, inhabiting the upper organic layer of soil, and is a member of the largest oribatid family (Oppiidae)

with approximately 1 000 species in 129 genera widely distributed throughout Holarctic and Antarctic

[23]

regions . They are sexually reproducing, polyphagous fungivores that can be easily reared in the

[10]
laboratory in soil or on plaster of Paris, and on a diet of Baker’s yeast .

This method outlines procedures for conducting 28-day tests for determining the effects of

contaminated soils on the survival and reproduction of the oribatid mite, Oppia nitens. Optionally, the

method can be used for testing chemicals added to standard soils (e.g., artificial soil) for their lethal

and sublethal hazard potential to oribatid mites. The performance of this method has been assessed

[15]

in an international inter-laboratory investigation , as summarized in Annex E. Mites represent

communities that cannot be omitted from environmental hazard assessment. This species is considered

to be representative of non-predatory soil mites.
© ISO 2020 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23266:2020(E)
Soil quality — Test for measuring the inhibition of
reproduction in oribatid mites (Oppia nitens) exposed to
contaminants in soil

WARNING — Contaminated soils may contain unknown mixtures of toxic, mutagenic, or

otherwise harmful chemicals or infectious microorganisms. Occupational health risks may

arise from dust or evaporated chemicals during handling and incubation. Precautions should be

taken to avoid skin contact.
1 Scope

This document specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining

effects of soil contaminants and individual chemical substances on the reproduction of the oribatid

mite Oppia nitens by dermal and alimentary uptake. This chronic (28-day) test is applicable to soils

and soil materials of unknown quality (e.g., contaminated sites, amended soils, soils after remediation,

agricultural or other sites under concern and waste materials). This method is not intended to replace

the earthworm or Collembola tests since it represents another taxonomic group (= mites; i.e., arachnids),

nor the predatory mite test since this species represents a different trophic level and ecological niche.

Effects of substances are assessed using standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For

contaminated soils, the effects are determined in the test soil and in a control soil. According to the

objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) should be

either an uncontaminated soil with similar properties to the soil sample to be tested (reference soil) or

a standard soil (e.g., artificial soil).

Information is provided on how to use this method for testing substances under temperate conditions.

This document is not applicable to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than

1, or to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa at 25 °C.

NOTE The stability of the test substance cannot be assured over the test period. No provision is made in the

test method for monitoring the persistence of the substance under test.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 10390, Soil quality — Determination of pH

ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary

analysis)

ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level

using barium chloride solution
ISO 11265, Soil quality — Determination of the specific electrical conductivity

ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by

sieving and sedimentation

ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis —

Gravimetric method
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ISO 23266:2020(E)

ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic

conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory

3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.2
effect concentration
ECx

concentration (mass fraction) of a test sample or test substance that causes x % of an effect on a given

end-point within a given exposure period when compared with a control

EXAMPLE An EC50 is a concentration estimated to cause an effect on a test end-point in 50 % of an exposed

population over a defined exposure period.

Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).

When substances are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil in milligrams

per kilogram.
3.3
effect rate
ERx

rate of a soil to be tested that causes an x % of an effect on a given end-point within a given exposure

period when compared with a control
3.4
lethal concentration
LCx

concentration (mass fraction) of a test sample or test substance that causes x % mortality within a

given exposure period when compared with a control

EXAMPLE An LC50 is a concentration estimated to cause mortality in 50 % of an exposed population over a

defined exposure period.

Note 1 to entry: The LCx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).

When substances are tested, the LCx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil in milligrams

per kilogram.
3.5
limit test

single concentration test consisting of at least five replicates each, the test soil (3.14) without any

dilution or the highest concentration of test substance mixed into the control soil and the control

2 © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 23266:2020(E)
3.6
lowest observed effect concentration
LOEC

lowest tested concentration (mass fraction) of a test sample or test substance that has a statistically

significant effect (probability p < 0,05)

Note 1 to entry: In this test, the LOEC is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture

(dry mass) or as a mass of test substance per dry mass of the soil to be tested. All test concentrations above the

LOEC should usually show an effect that is statistically different from the control.

3.7
lowest observed effect rate
LOER

lowest rate of a soil to be tested in a control soil at which a statistically significant effect is observed

3.8
no observed effect concentration
NOEC

highest tested concentration (mass fraction) of a test sample or test substance immediately below the

LOEC at which no effect is observed

Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect

(probability p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control.

3.9
no observed effect rate
NOER

lowest rate of a soil to be tested immediately below the LOER which, when compared to the control, has

no statistically significant effect (probability p < 0,05) within a given exposure period

3.10
reproduction

mean number of offspring per test vessel after a 28-day incubation under the specified test conditions

3.11
reference soil

uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic

carbon content and texture) to the test soil (3.14)
3.12
standard soil

field-collected soil or artificial soil whose main properties (pH, texture, organic matter content) are

within a known range
EXAMPLE Euro soils, artificial soil, LUFA standard soil.

Note 1 to entry: The properties of standard soils can differ from those of the test soil.

3.13
control soil

reference or standard soil (3.12) used as a control and as a medium for preparing dilution series with

test soils/samples or a reference substance, which fulfils the validity criteria

Note 1 to entry: In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving

the test validity criteria before using the soil in a definitive test.
3.14
test soil

sample of field-collected soil or chemical-spiked soil to be evaluated for toxicity to mites

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ISO 23266:2020(E)
3.15
test mixture

mixture of contaminated soil or the test substance (e.g. chemical, biosolid, waste) with control soil (3.13)

Note 1 to entry: Test mixtures are given in percent of contaminated soil based on soil dry mass.

3.16
test mixture ratio
ratio of test soil to control soil in a test mixture (3.15)

Note 1 to entry: Different ratios may be applied in a dilution series to establish a dose-response relationship.

4 Principle

The effects on reproduction of adult, laboratory-cultured mites, Oppia nitens, exposed to the test soil

are compared to those observed for organisms in control soil. If appropriate, effects based on exposure

to a test mixture of contaminated soil and control soil, or a range of concentrations of a test substance

mixed into control soil, are determined. Test mixtures are prepared at the start of the test and are not

renewed during the test period.

The test is started with 15 adult mites from age-synchronized cultures (aged 8 to 10 d after ecdysis

(i.e., moult) to adult form) per test vessel. The test is performed in 30 mL glass vessels with a wet-

weight equivalent to a volume of ~20 mL of soil, and a minimum of five replicates are prepared for

each treatment. The test runs for 28 d at (20 ± 2) °C by which time offspring (F ) have emerged from

eggs laid by the adults and the number of offspring produced is determined. Survival of the adults is

also determined at the end of the test. The results obtained from the tests are compared with a control

or, where a serial dilution design is used, to determine the concentration resulting in x % reduction

of juveniles produced compared to the control (ECx, 28 d), depending on the experimental design. An

estimate of the test concentration resulting in x % mortality (LCx, 28 d) is an optional test endpoint. If a

multi-concentration hypothesis test design is used, the reproductive output of the mites exposed to the

test mixtures is compared to that of the controls in order to determine the concentration which causes

no effects on mortality and reproduction (NOEC).

In cases where there is no prior knowledge of the dilution/concentration of the soil to be tested or the

test substance likely to have an effect, then it is useful to conduct the test in two steps:

— a range-finding test is carried out to give an indication of the effect dilution/concentration, and

the dilution/concentration resulting in no mortality. Dilutions/concentrations to be used in the

definitive test can then be selected; and

— the definitive test to determine lethal and sub-lethal effects of (dilutions of) contaminated soil or

the concentration of a substance which, when evenly mixed into the standard soil, results in: 1)

x % inhibition of reproduction, ECx (e.g., EC10, EC20, or EC50), or 2) causes no significant effects

on numbers of offspring hatched from eggs compared with the control for estimation of the NOEC

and LOEC.

The use of a reference soil is an essential requirement to demonstrate the present status of the test

population, and to avoid misinterpretation of results.
5 Reagents and material
5.1 Biological material

In this test, adult mites, Oppia nitens C.L. Koch 1836, aged 8 to 10 d (i.e., 8 to 10-d post-ecdysis to adult

form), established from newly emerged adults collected over a 1- to 3-d period, are required to start the

test. The mites shall be selected from an age-synchronised culture. A method for culturing Oppia nitens

and for obtaining age-synchronised test organisms is provided in Annex A.
4 © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 23266:2020(E)

Adult Oppia nitens are obtained from laboratory cultures maintained under conditions of temperature,

photoperiod, and food similar to those in the test. Species identification should be confirmed by

qualified personnel experienced in identifying soil mites using the distinguishing taxonomic features,

[26]

described in taxonomic keys , or using DNA-based taxonomic identification (i.e., barcoding) as

[4]

outlined in ISO 21286 . All mites used in a test shall be derived from the same population and source.

Sources of animals to be used to establish cultures include government or private laboratories that are

[24]

culturing Oppia nitens for soil toxicity tests, or commercial biological suppliers .

5.2 Test mixture can consist of field-collected soil or control soil mixed with the test soil or spiked

with the test substance.
5.2.1 Field-collected soil or waste

The sample(s) can be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern, or

waste materials (e.g., dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment works, plant-

derived compost, or manure) under consideration for possible land disposal.

The field-collected soils used in this test shall be passed through a sieve of 4 to 10 mm square mesh

to remove coarse fragments and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air-dried without

heating before sieving. Storage of the test soil should be as short as possible. The soil shall be stored

in accordance with ISO 18400-206 using containers that minimize losses of soil contaminants by

volatilization and sorption to the container walls. If soils or test mixtures have been stored, they should

be mixed a second time immediately before use. Soil pH should not be corrected as it can influence

bioavailability of soil contaminants.

NOTE A 4-mm mesh sieve is appropriate for use with any mineral-based soil with relatively low organic

matter (e.g., agricultural soil), however for forest soils or wetland soils with higher organic matter content, sieves

with larger mesh sizes (e.g., 6 to 8 mm for forest soils and 8 to 10 mm for wetland soils) could be required.

For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled

from a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390;
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) water holding capacity according to Annex B;
e) cationic exchange capacity in accordance with ISO 11260;
f) electrical conductivity in accordance with ISO 11265
g) organic carbon in accordance with ISO 10694;
h) percentage of material removed by the sieve.

NOTE It is important to measure the water holding capacity of all mixtures used in the test.

5.2.2 Control soil, either a) reference soil (3.11) or b) standard soil (3.12) that allows the presence of

oribatid mites. Control soil and soil used for dilution shall not differ in one test (either a) or b)).

a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should

be treated and characterized like the test soils. If a toxic contamination or unusual soil properties

cannot be ruled out, standard control soils should be preferred.

b) For testing the effects of substances mixed into soil, standard soils (e.g. artificial soil, LUFA

standard soil) shall be used as test substrate. The properties of the field-collected standard soil

shall be reported.
© ISO 2020 – All rights reserved 5
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ISO 23266:2020(
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 23266
Première édition
2020-06
Qualité du sol — Essai de
détermination de l'inhibition de
la reproduction chez les acariens
oribates (Oppia nitens) exposés aux
contaminants dans le sol
Soil quality — Test for measuring the inhibition of reproduction in
oribatid mites (Oppia nitens) exposed to contaminants in soil
Numéro de référence
ISO 23266:2020(F)
ISO 2020
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ISO 23266:2020(F)
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ISO 23266:2020(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 2

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 4

5 Réactifs et matériel ............................................................................................................................................................................................ 5

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 7

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 8

7.1 Plan d’expérience .................................................................................................................................................................................. 8

7.1.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 8

7.1.2 Essai préliminaire ........................................................................................................................................................... 8

7.1.3 Essai définitif ....................................................................................................................................................................... 8

7.2 Préparation du mélange d’essai ............................................................................................................................................... 9

7.2.1 Essai sur sol contaminé ........................................................................................................................................... ... 9

7.2.2 Essai sur substances ajoutées au substrat d’essai ...........................................................................10

7.2.3 Préparation des récipients témoins .............................................................................................................10

7.3 Ajout des acariens .............................................................................................................................................................................11

7.4 Conditions d’essai et mesurages ...........................................................................................................................................11

7.5 Détermination de la survie et de l’efficacité de reproduction des adultes .......................................11

8 Calcul et expression des résultats ...................................................................................................................................................12

8.1 Calcul ............................................................................................................................................................................................................12

8.2 Expression des résultats ..............................................................................................................................................................12

9 Validité de l’essai ...............................................................................................................................................................................................12

10 Analyse statistique ..........................................................................................................................................................................................13

10.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................13

10.2 Essais à une seule concentration ..........................................................................................................................................13

10.3 Essais multi-concentrations .....................................................................................................................................................13

10.3.1 Essai préliminaire ........................................................................................................................................................13

10.3.2 Essai définitif ....................................................................................................................................................................14

11 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................14

Annexe A (informative) Techniques d’élevage d’Oppia nitens ................................................................................................16

Annexe B (normative) Détermination de la capacité de rétention d’eau ....................................................................19

Annexe C (informative) Recommandations relatives à l’ajustement du pH d’un sol artificiel ..............21

Annexe D (informative) Extraction et comptage d’Oppia nitens ...........................................................................................22

Annexe E (informative) Performance de la méthode .......................................................................................................................26

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................32

© ISO 2020 – Tous droits réservés iii
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ISO 23266:2020(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iis .orgoiso// fr/ avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,

Caractérisation biologique.

Il convient que l'utilisateur adresse tout retour d'information ou toute question concernant le présent

document à l'organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l'adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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ISO 23266:2020(F)
Introduction

Les systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur

les effets des contaminants présents dans les sols et sont proposés pour compléter l’analyse

[1] [2]

chimique conventionnelle (voir l’ISO 15799 et l’ISO 17616 ). L’ISO 15799 contient une liste et une

brève caractérisation des systèmes d’essai recommandés et normalisés et l’ISO 17616 donne des

recommandations sur le choix et l’évaluation des essais biologiques. Les systèmes d’essai aquatiques

avec un éluat de sol sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur la fraction des contaminants

susceptibles d’être entraînés jusque dans les eaux souterraines par le cheminement de l’eau (fonction

de rétention des sols), alors que les systèmes d’essai terrestres sont utilisés pour évaluer la fonction

d’habitat des sols concernant le fait de subvenir aux besoins du biote du sol et de ses interactions.

Les acariens sont un groupe divers d’arthropodes, présent dans le monde entier, appartenant à une

sous-classe des Arachnides, avec plus de 40 000 espèces comptabilisées, divisé en deux superordres

(Acariformes et Parasitiformes). En raison de leur taille relativement petite (de quelques micromètres

à quelques centimètres), ils occupent des niches écologiques spécifiques sur les végétaux et dans les

[5]
sols .

Dans les dernières années, il y a eu une augmentation des méthodes d’essai biologiques pour évaluer

les sols contaminés, en retard par rapport aux autres milieux (par exemple, eau et sédiment). Les

essais écotoxicologiques pour les sols sont confrontés, entre autres, à la complexité des systèmes

terrestres (par exemple, manque d’homogénéité) et de la variété des voies d’exposition (par exemple,

absorption par voie alimentaire, exposition à l’eau interstitielle ou aux vapeurs du sol, ou contact

[3]

direct avec les particules de sol). Une méthode développée récemment (ISO 21285 ) évalue les effets

d’un sol contaminé sur la reproduction de l’acarien prédateur (Hypoaspis aculeifer), principalement

par absorption par voie alimentaire. Les acariens oribates représentent une niche différente de H.

aculeifer dans le sol, mais pour autant essentielle, contribuant à la minéralisation du carbone et à la

formation du sol, ainsi qu’au rejet d’azote et de phosphore par les activités de pâturage. Les acariens

oribates comptent parmi les espèces de microarthropodes les plus variées et les plus abondantes du

sol. Toutefois, leur métabolisme et leur croissance plus lents, couplés à une faible fécondité, une longue

durée de vie et une capacité de dispersion limitée augmentent le risque de vulnérabilité et de sensibilité

[6]

aux perturbations à court et long terme . L’utilisation d’acariens oribates dans le cadre des essais

[7][8][9][10][11]

écotoxicologiques terrestre a été étudiée en détail . Les recherches récentes utilisant Oppia

nitens pour les essais sur sols ont démontré une applicabilité et une sensibilité relative de l’espèce pour

l’évaluation des sols contaminés des zones agronomiques ainsi que des écozones des plaines boréales

[6][12][13][14][15] [16][17]
et de la taïga . Les recherches ont également démontré sa sensibilité aux métaux
[18][19] [20][21] [16][17][22]

, aux pesticides et aux composés organiques . Oppia nitens est un acarien oribate

peuplant la couche organique supérieure du sol, et est un membre de la plus grande famille des oribates

(Oppiidae), comptant environ 1 000 espèces dans 129 genres répartis dans les zones holarctiques et

[23]

antarctiques . Ce sont des fongivores polyphages, se reproduisant par voie sexuée, qui peuvent être

facilement élevés en laboratoire dans le sol ou sur le plâtre de Paris, et nourris avec de la levure de

[10]
boulanger .

Cette méthode décrit les modes opératoires pour réaliser des essais de 28 jours déterminant les effets de

sols contaminés sur la survie et la reproduction de l’acarien oribate, Oppia nitens. En option, la méthode

peut être utilisée pour évaluer le danger létal et sublétal des substances chimiques ajoutées aux sols

standards (par exemple, sol artificiel) pour les acariens oribates. La performance de cette méthode a

[15]

été évaluée lors d’une étude interlaboratoires internationale , comme synthétisé à l’Annexe E. Les

acariens représentent des communautés qui ne peuvent pas être exclues de l’évaluation des dangers

pour l’environnement. Cette espèce est considérée comme étant représentative des acariens non

prédateurs du sol.
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NORME INTERNATIONALE ISO 23266:2020(F)
Qualité du sol — Essai de détermination de l'inhibition de
la reproduction chez les acariens oribates (Oppia nitens)
exposés aux contaminants dans le sol

AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de substances

chimiques toxiques, mutagènes ou nocives ou des micro-organismes infectieux. Des risques pour

la santé au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l’évaporation de substances

chimiques pendant la manipulation et l’incubation. Il convient de prendre des précautions pour

éviter tout contact avec la peau.
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie l’une des méthodes d’évaluation de la fonction d’habitat des sols et

détermine les effets des contaminants et substances chimiques individuelles du sol sur la reproduction

de l’acarien oribate, Oppia nitens, par absorption par voie dermique et alimentaire. Cet essai chronique

(28 jours) est applicable aux sols et matériaux de type sol de qualité inconnue (par exemple, sites

contaminés, sols amendés, sols après remédiation, sols agricoles ou autres sites sujets à préoccupation et

déchets). Cette méthode n’est pas destinée à remplacer ni les essais sur vers de terre ou sur collemboles

car elle représente un autre groupe taxonomique (= acariens; à savoir, arachnides), ni l’essai sur acariens

prédateurs car cette espèce représente un niveau trophique et une niche écologique différents.

Les effets des substances sont évalués en utilisant un sol standard, de préférence un substrat défini de

sol artificiel. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un

sol témoin. Selon l’objectif de l’étude, il convient que le substrat témoin et le substrat de dilution (séries

de dilutions du sol contaminé) soient un sol non contaminé ayant des propriétés similaires à celles du

sol à analyser (sol de référence) ou un sol standard (par exemple, sol artificiel).

Des informations sont fournies sur la façon d’utiliser cette méthode pour analyser les substances dans

des conditions tempérées.

Le présent document n’est pas applicable aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/

sol est supérieur à 1, ou aux substances dont la pression de vapeur dépasse 300 Pa à 25 °C.

NOTE La stabilité de la substance d’essai ne peut pas être garantie tout au long de la période d’essai. La

méthode d’essai ne prévoit pas de contrôler la persistance de la substance soumise à essai.

2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels

amendements).
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH

ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche

(analyse élémentaire)

ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d'échange cationique et du taux de saturation en

bases échangeables à l'aide d'une solution de chlorure de baryum

ISO 11265, Qualité du sol — Détermination de la conductivité électrique spécifique

ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des

sols — Méthode par tamisage et sédimentation
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ISO 23266:2020(F)

ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode

gravimétrique

ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de

sols destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire

3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol du fait de l’activité humaine
3.2
concentration efficace
CEx

concentration (fraction massique) d’un échantillon pour essai ou d’une substance d’essai qui engendre

un effet de x % sur un critère d’effet donné durant une période d’exposition déterminée, par rapport à

un témoin

EXEMPLE Une CE50 est une concentration estimée produire un effet de 50 % d’une population exposée sur

un critère d’effet donné durant une période d’exposition déterminée.

Note 1 à l'article: La CEx est exprimée en pourcentage de sol soumis à essai (masse sèche) par mélange de sols

(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CEx est exprimée en masse de substance d’essai

par masse sèche de sol en milligrammes par kilogramme.
3.3
taux efficace
REx

taux d’un sol soumis à essai qui engendre un effet de x % sur un critère d’effet donné durant une période

d’exposition déterminée, par rapport à un témoin
3.4
concentration létale
CLx

concentration (fraction massique) d’un échantillon pour essai ou d’une substance d’essai qui engendre

une mortalité de x % durant une période d’exposition déterminée, par rapport à un témoin

EXEMPLE Une CL50 est une concentration estimée provoquer une mortalité de 50 % chez une population

exposée sur une période d’exposition définie.

Note 1 à l'article: La CLx est exprimée en pourcentage de sol soumis à essai (masse sèche) par mélange de sols

(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CLx est exprimée en masse de substance d’essai

par masse sèche de sol en milligrammes par kilogramme.
3.5
essai limite

essai à une seule concentration comprenant au moins cinq réplicats chacun, le sol d’essai (3.14) sans

dilution ou la concentration maximale de substance d’essai mélangée dans le sol témoin et le témoin

2 © ISO 2020 – Tous droits réservés
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ISO 23266:2020(F)
3.6
concentration minimale avec effet observé
CMEO

concentration d’essai minimale (fraction massique) d’un échantillon pour essai ou d’une substance

d’essai ayant un effet statistiquement significatif (probabilité p < 0,05)

Note 1 à l'article: Dans cet essai, la CMEO est exprimée en pourcentage de sol soumis à essai (masse sèche) par

mélange de sols (masse sèche) ou en masse de substance d’essai par masse sèche de sol soumis à essai. Il convient

que toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO présentent généralement un effet statistiquement

différent du témoin.
3.7
taux minimal avec effet observé
RMEO

taux minimal d’un sol soumis à essai dans un sol témoin pour lequel un effet statistiquement significatif

est observé
3.8
concentration sans effet observé
CSEO

concentration d’essai maximale (fraction massique) d’un échantillon pour essai ou d’une substance

d’essai, immédiatement inférieure à la CMEO, à laquelle aucun effet n’est observé

Note 1 à l'article: Dans cet essai, la concentration correspondant à la CSEO ne présente aucun effet statistiquement

significatif (probabilité p < 0,05) durant une période d’exposition déterminée, en comparaison avec le témoin.

3.9
taux sans effet observé
RSEO

taux minimal d’un sol soumis à essai, immédiatement inférieur au RMEO, qui, en comparaison avec le

témoin, ne présente aucun effet statistiquement significatif (probabilité p < 0,05) durant une période

d’exposition déterminée
3.10
reproduction

nombre moyen de juvéniles par récipient d’essai après une incubation de 28 jours dans les conditions

d’essai spécifiées
3.11
sol de référence

sol non contaminé avec des propriétés pédologiques (concentrations en éléments nutritifs, pH, teneur

en carbone organique et texture) comparables à celles du sol d’essai (3.14)
3.12
sol standard

sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les principales propriétés (pH, texture, teneur en matières

organiques) se situent dans une gamme connue
EXEMPLE Euro-sols, sol artificiel, sol standard LUFA.

Note 1 à l'article: Les propriétés des sols standards peuvent différer de celles du sol d’essai.

3.13
sol témoin

sol de référence ou sol standard (3.12) utilisé comme témoin et comme milieu pour préparer une série

de dilution avec des sols/échantillons d’essai ou une substance de référence, qui satisfait aux critères de

validité

Note 1 à l'article: Dans le cas d’un sol naturel, il est recommandé de démontrer sa capacité à être utilisé pour un

essai et à remplir les critères de validité de l’essai avant de l’utiliser dans un essai définitif.

© ISO 2020 – Tous droits réservés 3
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ISO 23266:2020(F)
3.14
sol d’essai

échantillon de sol prélevé sur le terrain ou de sol dopé avec une substance chimique, dont la toxicité doit

être évaluée vis-à-vis des acariens
3.15
mélange d’essai

mélange d’un sol contaminé ou d’une substance d’essai (par exemple, substance chimique, biosolide,

déchet) avec un sol témoin (3.13)

Note 1 à l'article: Les mélanges d’essai sont exprimés en pourcentage de sol contaminé par masse sèche de sol.

3.16
ratio de mélange d’essai
ratio entre le sol d’essai et le sol témoin dans un mélange d’essai (3.15)

Note 1 à l'article: Différents ratios peuvent être appliqués dans une série de dilutions pour établir une relation

dose-effet.
4 Principe

Les effets sur la reproduction d’acariens adultes Oppia nitens élevés en laboratoire et exposés au sol

d’essai, sont comparés à ceux observés pour les organismes présents dans le sol témoin. Si cela est

approprié, les effets sont déterminés sur la base de l’exposition à un mélange d’essai de sol contaminé et

de sol témoin ou à une gamme de concentrations d’une substance d’essai mélangée dans le sol témoin.

Les mélanges d’essai sont préparés au début de l’essai et ne sont pas renouvelés au cours de la période

d’essai.

L’essai commence avec 15 acariens adultes provenant d’élevages synchronisés (8 jours à 10 jours après

exuviation (c’est-à-dire, mue) jusqu’au stade adulte) par récipient d’essai. L’essai est effectué dans des

récipients en verre de 30 ml contenant le sol (poids humide) équivalent à un volume d’environ 20 ml,

et au moins cinq réplicats sont préparés pour chaque traitement. L’essai se déroule pendant 28 jours

à (20 ± 2) °C après quoi les juvéniles (F ) éclosent des œufs pondus par les adultes et le nombre de

juvéniles produits est déterminé. La survie des adultes est également déterminée à la fin de l’essai.

Les résultats de l’essai, en fonction du plan d’expérience, sont comparés avec un témoin ou, lorsqu’une

dilution en série est utilisée, pour déterminer la concentration entraînant une réduction de x % des

juvéniles produits en comparaison avec le témoin (CEx, 28 jours). Une estimation de la concentration

d’essai entraînant une mortalité de x % (CLx, 28 jours) est un critère d’effet facultatif. Si un test

d’hypothèse à plusieurs concentrations est utilisé, l’efficacité de reproduction des acariens exposés aux

mélanges d’essai est comparée à celle des témoins afin de déterminer la concentration sans effet sur la

mortalité et la reproduction (CSEO).

Dans le cas où il n'y a aucune connaissance préalable de la dilution/concentration du sol soumis à essai

ou de la substance d’essai susceptible d’avoir un effet, il est utile d’effectuer cet essai en deux étapes:

— un essai préliminaire est réalisé pour obtenir une indication de la dilution/concentration produisant

un effet, et de la dilution/concentration ne provoquant pas de mortalité. Les dilutions/concentrations

à utiliser au cours de l’essai définitif peuvent ensuite être choisies; et

— l’essai définitif pour déterminer les effets létaux et sublétaux de (dilutions de) sols contaminés ou

de la concentration d’une substance qui, lorsqu’elle est uniformément répartie dans le sol standard:

1) provoque x % d’inhibition de la reproduction, CEx (par exemple, CE10, CE20 ou CE50), ou 2) n’a

pas d’effet significatif sur le nombre de juvéniles éclos des œufs comparativement au témoin pour

l’estimation de la CSEO et de la CMEO.

L’utilisation d’un sol de référence est une exigence essentielle pour démontrer l’état actuel de la

population d’essai et éviter une mauvaise interprétation des résultats.
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5 Réactifs et matériel
5.1 Matériel biologique

Dans cet essai, des acariens adultes, Oppia nitens C.L. Koch 1836, âgés de 8 jours à 10 jours (c’est-à-

dire, 8 jours à 10 jours après exuviation jusqu’au stade adulte), choisis parmi des adultes récemment

apparus prélevés sur une période de 1 jour à 3 jours, sont requis pour commencer l’essai. Les acariens

doivent être choisis à partir d’un élevage synchronisé. L’Annexe A fournit une méthode d’élevage d’Oppia

nitens et d’obtention d’organismes d’essai synchronisés.

Les acariens adultes Oppia nitens sont obtenus à partir d’élevages de laboratoire maintenus dans des

conditions de température, de photopériode et d’alimentation similaires à celles utilisées pendant

l’essai. Il convient de faire confirmer l’identification de l’espèce par un personnel qualifié expérimenté

dans le domaine de l’identification des acariens du sol à l’aide des caractéristiques taxonomiques

[26]

distinctives, décrites dans les clés taxonomiques , ou par l’identification taxonomique reposant sur

[4]

l’analyse de l’ADN (c’est-à-dire, code-barres ADN) telle qu’indiquée dans l’ISO 21286 . Tous les acariens

utilisés dans un essai doivent provenir de la même population et avoir la même origine. Les animaux à

utiliser pour établir les élevages peuvent provenir de laboratoires publics ou privés élevant Oppia nitens

[24]
pour des essais de toxicité du sol, ou de fournisseurs biologiques du commerce .
5.2 Mélange d’essai, comprenant le sol prélevé sur le terrai
...

Questions, Comments and Discussion

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