Microbiology of the food chain — Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method

ISO 18743:2015 specifies a method of detection of Trichinella spp. muscle stage larvae in meat of individual animal carcasses intended for human consumption. It is applicable to the examination of meat from domestic and sylvatic animal species, which can be infected by nematodes of the genus Trichinella. This method does not allow the identification of the species or genotype of detected parasites; species or genotype identification can be carried out by molecular methods. The method described in this International Standard is intended to be used in conjunction with the guidelines in the OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines and by the International Commission on Trichinellosis (ICT) for Trichinella testing and the inspection of carcasses intended for human consumption, unless it has been demonstrated by other means that the animal was not at risk for exposure to Trichinella. The artificial digestion/magnetic stirrer method is considered to be the standard method because it has proven to give the most reliable results in validation studies. NOTE Provided equivalence with the method described within this International Standard can be documented, alternative methods can be used for analysis.

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche des larves de Trichinella dans la viande par une méthode de digestion artificielle

ISO 18743:2015 décrit une méthode de détection de larves musculaires de Trichinella spp. dans la viande provenant de carcasses individuelles d'animaux destinées à la consommation humaine. Elle est applicable à l'examen de viande d'espèces animales domestiques et sauvages qui peuvent être infectées par des nématodes du genre Trichinella. Cette méthode ne permet pas d'identifier l'espèce ou le génotype des parasites détectés; l'identification de l'espèce ou du génotype peut être réalisée à l'aide de méthodes moléculaires. La méthode décrite dans la présente Norme internationale est destinée à être utilisée en association avec les lignes directrices du Manuel des tests de diagnostic et des vaccins de l'OIE et celles émises par la Commission internationale sur la trichinellose (ICT) pour la recherche de Trichinella et l'inspection de carcasses destinées à la consommation humaine, sauf s'il a été prouvé par d'autres moyens que l'animal ne risquait pas d'avoir été exposé à Trichinella. La méthode de digestion artificielle utilisant un agitateur magnétique est considérée comme la méthode normalisée puisqu'il a été démontré, lors d'études de validation, qu'elle donne les résultats les plus fiables. NOTE Si l'équivalence avec la méthode décrite dans la présente Norme internationale peut être documentée, d'autres méthodes peuvent être utilisées pour l'analyse.

General Information

Status
Published
Publication Date
10-Sep-2015
Current Stage
9093 - International Standard confirmed
Start Date
08-Dec-2020
Completion Date
08-Dec-2020
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ISO 18743:2015 - Microbiology of the food chain -- Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18743
First edition
2015-09-15
Microbiology of the food chain —
Detection of Trichinella larvae in meat
by artificial digestion method
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche des larves de
Trichinella dans la viande par une méthode de digestion
artificielle
Reference number
ISO 18743:2015(E)
ISO 2015
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 18743:2015(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2015, Published in Switzerland

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

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ii © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO 18743:2015(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

4.2 Sample size ................................................................................................................................................................................................. 2

4.3 Blending/grinding of the muscle sample ......................................................................................................................... 2

4.4 Preparation of the digest fluid ................................................................................................................................................... 2

4.5 Digestion of the chopped meat ................................................................................................................................................. 2

4.6 Filtration of the digest fluid ......................................................................................................................................................... 3

4.7 Sedimentation of the digest fluid ............................................................................................................................................ 3

4.8 Microscopic examination ............................................................................................................................................................... 3

4.9 Verification of findings ..................................................................................................................................................................... 3

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 3

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 4

7 Sampling, labelling, and transport .................................................................................................................................................... 5

8 Sample preparation ........................................................................................................................................................................................... 5

9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 5

9.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 5

9.2 Blending/grinding ............................................................................................................................................................................... 5

9.3 Preparation of the digest fluid ................................................................................................................................................... 6

9.4 Digestion of the chopped meat in the glass beaker ................................................................................................. 6

9.5 Filtration of the digest fluid ......................................................................................................................................................... 6

9.6 Sedimentation of the digest fluid in the separatory funnel .............................................................................. 7

9.7 Collection of the primary and secondary sediment ................................................................................................ 7

9.8 Microscopic examination ............................................................................................................................................................... 7

10 Documentation ....................................................................................................................................................................................................... 8

11 Expression of the results .............................................................................................................................................................................. 8

12 Safety measures ..................................................................................................................................................................................................... 8

Annex A (normative) Sample collection ........................................................................................................................................................... 9

Annex B (normative) Frozen samples .............................................................................................................................................................11

Annex C (informative) Artificial digestion magnetic stirrer method ..............................................................................12

Annex D (informative) Example of a laboratory worksheet for recording data when testing

pooled samples by digestion assay .................................................................................................................................................14

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................15

© ISO 2015 – All rights reserved iii
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ISO 18743:2015(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical

Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,

Microbiology.
iv © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO 18743:2015(E)
Introduction

Trichinella spp. are the causative agents of human trichinellosis, a disease which is a public health

hazard and, as a result, also represents an economic problem in porcine animal production. Due to

the zoonotic importance of this infection in many countries, the main efforts have focused on control

and/or eradication of Trichinella from domestic pigs, the most important source of human infection

worldwide. Digestion methods for detection of Trichinella larvae in muscle samples from pigs and other

susceptible animal species intended for human consumption (e.g. horses, wild boars, walruses, and

bears), are effective for preventing clinical trichinellosis in humans. Due to the limits of sensitivity of

digestion methods, these methods might not detect infected animals with very small numbers of larvae

in muscle samples, that can pose a risk for subclinical infections in humans.
© ISO 2015 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 18743:2015(E)
Microbiology of the food chain — Detection of Trichinella
larvae in meat by artificial digestion method

WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory

practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if

any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and

health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.

1 Scope

This International Standard specifies a method of detection of Trichinella spp. muscle stage larvae in meat

of individual animal carcasses intended for human consumption. It is applicable to the examination of meat

from domestic and sylvatic animal species, which can be infected by nematodes of the genus Trichinella.

This method does not allow the identification of the species or genotype of detected parasites; species

or genotype identification can be carried out by molecular methods.

The method described in this International Standard is intended to be used in conjunction with the

guidelines in the OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines and by the International Commission

on Trichinellosis (ICT) for Trichinella testing and the inspection of carcasses intended for human

consumption, unless it has been demonstrated by other means that the animal was not at risk for

exposure to Trichinella.

The artificial digestion/magnetic stirrer method is considered to be the standard method because it

has proven to give the most reliable results in validation studies.

NOTE Provided equivalence with the method described within this International Standard can be

documented, alternative methods can be used for analysis.
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for the application of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 7218:2007, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for

microbiological examinations

International Commission on Trichinellosis (ICT), “Quality Assurance in Digestion Testing Programs

for Trichinella”, Recommendations and Guidelines. 2012

World Organisation for Animal Health (OIE), Chapter 2.1.16 — “Trichinellosis”, Manual of Diagnostic

Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. 2012
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Trichinella muscle larvae

first larval stage (L1) of nematodes belonging to the genus Trichinella, which is located in striated

muscles of animals worldwide and can infect humans

Note 1 to entry: These larvae are approximately 0,7 mm to 1,1 mm in length and 0,03 mm in width.

© ISO 2015 – All rights reserved 1
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ISO 18743:2015(E)
3.2
digestion assay

method to detect Trichinella larvae in muscle tissue by an enzymatic digestion step to release larvae

from muscle tissues followed by filtration and sedimentation steps, and detection of recovered larvae

by microscopy
3.3
larvae per gram
lpg
number of Trichinella larvae present in one gram of muscle tissue
4 Principle
4.1 General

The artificial digestion method, which is accepted as the international reference method (see OIE,

Terrestrial Manual 2012, Chapter 2.1.16 — Trichinellosis, page 307), relies on enzymatic degradation of

muscle fibres in a fluid composed of pepsin and hydrochloric acid followed by a series of sedimentation

and washing steps; equivalent validated methods can also be used. Test performance is greatly

influenced by the sample size (1 g samples will enable the reliable detection of infections of ≥3 lpg, and

3 g to 5 g samples will enable reliable detection of ≥1 lpg), by the type of the selected muscle, by the

method used, and by the skills of the technician performing the test. A sensitivity of at least one to

three larvae per gram shall be achieved to protect human health; consequently, an appropriate size

of muscle sample should be collected from a predilection muscle of the target animal. There are no

internal quality controls that can be used while performing the method. Some key elements in the

principle of its use are as follows (see 4.2 to 4.9).
4.2 Sample size

For inspection of individual food animal carcasses for public health purposes, the sample shall be

collected from predilection sites (see Annex A) and the sample size shall be risk-based, as determined

by a competent authority, but not less than 1 g per carcass.
4.3 Blending/grinding of the muscle sample

Meat samples are chopped using a blender or grinder to increase the surface area for enzymatic

degradation. The blending or grinding procedure shall be adjusted to maximize digestion efficiency.

NOTE Too little blending or grinding can result in poor digestion, while too much blending or grinding can

damage or disrupt muscle larvae.
4.4 Preparation of the digest fluid

Pepsin is commercially available in powder, granular, and liquid forms. The activity of the pepsin shall

be certified and pepsin shall be stored according to the manufacturer’s recommendation.

NOTE The use of a liquid pepsin formulation can be advantageous as it could reduce the risk of occupational

hazard, such as allergic reaction in laboratory staff.
4.5 Digestion of the chopped meat

Viable Trichinella larvae are resistant to the pepsin-HCl digest fluid and therefore can be recovered free

from muscle tissue. Dead Trichinella larvae can be destroyed by artificial digestion.

To facilitate an efficient and rapid digestion, a maximum ratio of 1:20, meat to digest fluid, and a

temperature of 45 °C ± 2 °C, shall be maintained throughout the process. The time required for digestion

shall be at least 30 min, but in the case of muscle samples which are less digestible, such as from wildlife

2 © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO 18743:2015(E)

carcasses, or the tongue of many species (see Annex A), the digestion time should be increased but,

unless otherwise validated for a particular sample matrix, shall not exceed 60 min in total.

NOTE If the time-temperature conditions are less than the required values, there might be an incomplete

digestion of the muscle tissue. Conversely, elevated temperature (over 50 °C) or prolonged digestion times might

result in the destruction of larvae or the inactivation of the pepsin.
4.6 Filtration of the digest fluid

Following digestion, the digest fluid shall be filtered through a sieve with specific mesh size (6.11), in

order to retain undigested tissue, but allowing larvae to pass through. Sieves shall be free of debris

prior to use and shall be pre-wetted to allow digest fluid to pass through quickly.

4.7 Sedimentation of the digest fluid

Sedimentation of larvae is performed in a separatory funnel (primary sedimentation) and a glass

tube (secondary sedimentation). Larvae are collected in these primary and secondary sediments.

Sedimentation times shall be of 30 min and 10 min for the primary and secondary sedimentation,

respectively (see Annex B for sedimentation times for frozen muscle samples). If the sedimentation

times are less than stipulated above, not all larvae might be settled and might not be recovered in the

collected sediment.
4.8 Microscopic examination

Microscopic examination of the secondary sediment allows qualified analysts to recognize Trichinella

larvae and distinguish from many other nematodes, organisms, or artefacts. Knowledge of the

basic morphological characteristics of Trichinella larvae, including size (0,7 mm to 1,1 mm in length

and 0,03 mm in width), shape, and colour is required to examine the sediment (see Figure C.1 and

Figure C.2). The most distinguishing feature of Trichinella larvae, not recognized by stereomicroscopy

but by compound microscopy, is the stichosome, which consists of a series of discoid cells lining the

oesophagus and occupying the anterior half of the body. Trichinella larvae can appear coiled (when

cold) or motile (when warm), or C-shaped (when dead).

To be qualified to perform routine digestion testing, the analyst shall adequately perform the artificial

digestion/magnetic stirrer method using Trichinella spiked samples (proficiency testing panel)

to consistently recover and identify larvae. Analysts should be qualified based on performance of

proficiency testing in accordance with guidance from the International Commission on Trichinellosis.

4.9 Verification of findings

If positive or doubtful findings occur, confirmation and identification at the species level should

be performed by a qualified reference laboratory, as defined by “ICT guidelines Recommendations

for Quality Assurance in Digestion Testing Programs for Trichinella”, Part 1 — Quality assurance in

regulatory testing for Trichinella, i.e. “a laboratory formally recognised by a national or international

authority for a required level of scientific and diagnostic expertise for a particular animal disease

and/or testing methodology”.
5 Reagents
5.1 Tap water, heated to 47 °C ± 2 °C.

5.2 Hydrochloric acid (25 %, molar concentration: 7,8 to 7,9, or any other percentage).

5.3 Pepsin (Powder or granular: 1: 10.000 NF, 1: 12.500 BP, 2.000 FIP; liquid: 660 U/ml).

© ISO 2015 – All rights reserved 3
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ISO 18743:2015(E)

NOTE The activity of pepsin powder is expressed per gram, either in “NF” (US National Formulary), “BP”

(British Pharmacopoea), or “FIP” (Fédération Internationale de Pharmacie); activity of liquid pepsin is expressed

in European Pharmacopoeia units per millilitre with a minimum of 660 U/ml. Other pepsin activities can be

used, provided the final activity in the digest fluid is equivalent to the activity of 10g of 1:10.000 NF.

5.4 Ethanol (70 % to 90 % ethyl alcohol).
5.5 Sodium hypochlorite.
6 Apparatus

Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.

6.1 Labelled collection trays or plastic bags, for samples.

6.2 Knives, scissors, and forceps, for cutting samples and removing non-digestible tissue.

6.3 Calibrated scale, for weighing samples and/or pepsin (accuracy ± 0,1 g).

6.4 Glass, plastic, or steel blender, with a sharp chopping blade (regularly inspected and/or exchanged).

6.5 Magnetic stirrer, with an adjustable heating plate or magnetic stirrer put in an incubator.

6.6 Thermometer, (accurate to at least ±0,5 °C, minimum range of temperatures from 20 °C to 70 °C).

6.7 Stir bar, (5 cm in length minimum).
6.8 Glass beakers, (minimum 3 l capacity).
6.9 Aluminium foil, or lids, to cover the top of the glass beaker.

6.10 Funnels (glass, plastic, or steel), (minimum diameter of approximately 15 cm).

6.11 Sieve, made of brass or stainless steel, specific mesh size between 180 µm to 200 µm (with

diameter of approximately 10 cm or larger).

6.12 Conical glass separatory funnels (minimum 2,5 l in capacity), preferably with

polytetrafluoroethylene (PTFE) safety plugs (stopcocks).
6.13 Tubes or measuring cylinders, (50 ml or 100 ml glass).

6.14 Petri dishes (approximately 90 mm in diameter), gridded with squares of approximately 1 cm, or

equivalent equipment for larval counting.

6.15 Stereo-microscope, with a sub-stage transmitted adjustable light source, or trichinoscope with a

horizontal table. Image capture and storage capability (camera) are recommended, but not required to

document suspect results.
6.16 Pipettes, with capacity of 1 ml, 10 ml, and 25 ml.
4 © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO 18743:2015(E)
6.17 Small vials, for collection of recovered larvae.

Plasticware or teflonware should not be used for beakers or separatory funnels (other than stopcocks)

since a rough surface and electrostatic charge can contribute to larval adherence to the inner surface of

the equipment.

Equipment listed at 6.2, 6.4, and 6.11 should be regularly cleaned and free of any tissues which could

contain larvae from previous analyses.
7 Sampling, labelling, and transport

Sampling, labelling, and transport are not part of the method specified in this International Standard,

but are indicated in Annex A. If there are no specific International Standards dealing with sampling

of the animal carcasses or parts of them, it is recommended that the interested parties come to an

agreement on this subject.

In order to obtain the required sensitivity for Trichinella testing in animals, an appropriate size of

muscle sample shall be collected from a predilection muscle (see Annex A). Muscle samples taken from

the carcass for digestion testing should be at least twice the mass required for examination to allow for

trimming of non-digestible tissues.

At the reception of the samples, laboratory personnel shall check the suitability of samples for testing

by checking mass, composition, condition, labelling, and correspondence with transmission documents

(receipt as specified in ISO 7218:2007, 8.3).

Muscle samples should be tested as soon as possible or stored at 2 °C to 8 °C to slow decomposition and

avoid freezing.
8 Sample preparation

Samples used for testing shall be free from fat, tendons, and fascia. If tongue tissue is used, the tough

indigestible surface layer of connective tissue shall be removed before testing. The minimum individual

sample size for testing by artificial digestion should be determined by the competent authority (see

“ICT guidelines Recommendations for Quality Assurance in Digestion Testing Programs for Trichinella”,

Part 5. Recommendations on essential components and minimum requirements for a Trichinella testing

laboratory certification program — B.6 Sample collection and handling). Samples from individual

animals may be pooled; the maximum muscle mass in a pool to be digested shall be 100 g, but up to 15 g

of additional muscle tissue may be added when needed. For pools with a lower total muscle mass (e.g.

50 g), the digest fluid volume and ingredients may be adjusted accordingly to a minimum of 1 l.

9 Procedure
9.1 General
A scheme of the magnetic stirrer method is shown in Figure C.1.
9.2 Blending/grinding

For blending/grinding, a small amount (50 ml to 100 ml per 100 g meat) of digest fluid or tap

water (45 °C ± 2 °C) shall be added to the meat in the blender/grinder to facilitate homogenization.

Blending/grinding should be continued until the meat is chopped or minced thoroughly (usually three

bursts of 5 s to 10 s each) but shall not last so long as to harm the larvae.
© ISO 2015 – All rights reserved 5
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ISO 18743:2015(E)
9.3 Preparation of the digest fluid

The pepsin used for the preparation of digest fluid shall have the appropriate activity required for

digestion. (see 5.3). Digest fluid shall be made fresh for each analysis. The steps for preparing digest

fluid are as follows:

a) add 16 ml of 25 % hydrochloric acid (see Clause 5) to a glass beaker containing 2 l of tap water

preheated to 45 °C ± 2 °C;

b) place a stirring rod in the beaker, place the beaker on a preheated magnetic stirrer or on a magnetic

stirrer in the incubator, and commence the stirring;

c) add 10 g of powder or granular pepsin (1: 10.000 NF) or 30 ml of liquid pepsin (660 U/ml).

NOTE 1 The most critical step is the obligatory sequence of mixing of the digest fluid: 1. water, 2. hydrochloric

acid, and 3. pepsin. This will prevent degradation of pepsin which might result from direct exposure to

concentrated hydrochloric acid.

NOTE 2 Stock solutions of hydrochloric acid are available in formulations other than 25 % and are to be

adjusted accordingly. For example, if a 37 % stock solution of hydrochloric acid (molar concentration: 12,1) is

used, 11 ml is added to 2 l of preheated tap water.

NOTE 3 Other activities of pepsin can be used, provided the final activity in the digest fluid is equivalent to

the activity of 10g of 1:10.000 NF.
9.4 Digestion of the chopped meat in the glass beaker

a) After blending/grinding, the meat is transferred to a 3 l glass beaker which contains the digest

fluid (see 9.3). To avoid loss of larvae due to adhering muscle tissue, the blending/grinding

equipment should be thoroughly rinsed with the digest fluid in the beaker and the blender bowl

should also be thoroughly rinsed with a small quantity of digest fluid which is then poured back

into the glass beaker.

b) Cover the glass beaker with aluminium foil to decrease evaporation and keep a constant

temperature, 45 °C ± 2 °C.
c) Regularly monitor the temperature of the digest fluid using a thermometer.

d) Ensure that during stirring, the digest fluid rotates at a sufficiently high speed to create a deep

vortex without splashing.

e) Digest the sample for 30 min; if necessary, the digestion time can be increased but shall not

exceed 60 min in total.
9.5 Filtration of the digest fluid

a) Ensure that the stopcock of the separatory funnel is fully closed. Pour the digest fluid carefully (to

avoid overflow and spillage) into the separatory funnel through a sieve with specific mesh size (6.11).

b) Rinse the glass beaker and the sieve with an additional volume of tap water (minimum of 100 ml) to

avoid larval loss due to adhering muscle tissue or larvae sticking on the surfaces of the glassware

and the sieve.

c) The digestion process is considered satisfactory if residual debris remaining on the sieve consists

primarily of indigestible non-muscle tissue (typically consisting of fascia and connective tissue) of

no greater than 5 % of the original sample mass.

d) If undigested muscle tissue or non-muscle tissue remains on the sieve in excess of that described

above, the digestion procedure shall be repeated. In the case of excessive undigested muscle tissue,

the remaining fraction shall be digested and examined in addition to the initial digest, or new

samples shall be collected and the entire method repeated (i.e. start procedure again from 9.2).

6 © ISO 2015 – All rights reser
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 18743
Première édition
2015-09-15
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Recherche des larves
de Trichinella dans la viande par une
méthode de digestion artificielle
Microbiology of the food chain — Detection of Trichinella larvae
in meat by artificial digestion method
Numéro de référence
ISO 18743:2015(F)
ISO 2015
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 18743:2015(F)
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ii © ISO 2015 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 18743:2015(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

4.2 Taille de l’échantillon ......................................................................................................................................................................... 2

4.3 Broyage de l’échantillon de muscle ....................................................................................................................................... 2

4.4 Préparation du liquide de digestion ..................................................................................................................................... 3

4.5 Digestion de la viande hachée ................................................................................................................................................... 3

4.6 Filtration du liquide de digestion ........................................................................................................................................... 3

4.7 Sédimentation du liquide de digestion .............................................................................................................................. 3

4.8 Examen microscopique ................................................................................................................................................................... 3

4.9 Vérification des résultats ................................................................................................................................................................ 4

5 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 4

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 4

7 Prélèvement d’échantillons, étiquetage et transport .................................................................................................... 5

8 Préparation des échantillons .................................................................................................................................................................. 5

9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 6

9.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 6

9.2 Broyage .......................................................................................................................................................................................................... 6

9.3 Préparation du liquide de digestion ..................................................................................................................................... 6

9.4 Digestion de la viande hachée dans le bécher en verre ....................................................................................... 6

9.5 Filtration du liquide de digestion ........................................................................................................................................... 7

9.6 Sédimentation du liquide de digestion dans l’ampoule à décanter........................................................... 7

9.7 Collecte des sédiments primaire et secondaire .......................................................................................................... 7

9.8 Examen microscopique ................................................................................................................................................................... 8

10 Documentation ....................................................................................................................................................................................................... 8

11 Expression des résultats............................................................................................................................................................................... 9

12 Mesures de sécurité ........................................................................................................................................................................................... 9

Annexe A (normative) Prélèvement d’échantillons ...........................................................................................................................10

Annexe B (normative) Échantillons congelés ...........................................................................................................................................12

Annexe C (informative) Méthode de digestion artificielle utilisant l’agitateur magnétique ..................13

Annexe D (informative) Exemple de fiche technique de laboratoire pour consigner les

données lors de la recherche par digestion d’échantillons regroupés .....................................................15

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................16

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ISO 18743:2015(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer

un engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à

l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes

de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —

Informations supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 9, Microbiologie.
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ISO 18743:2015(F)
Introduction

Le genre Trichinella spp. est l’agent pathogène responsable de la trichinellose humaine, une maladie

qui présente un risque pour la santé publique et, par conséquent, représente également un problème

économique dans le domaine de la production porcine. En raison de l’importance zoonotique de cette

infection dans de nombreux pays, les efforts se sont essentiellement concentrés sur la maîtrise et/ou

l’éradication de Trichinella chez le porc domestique, qui est la principale source d’infection humaine

dans le monde. Les méthodes de digestion permettant la détection des larves de Trichinella dans les

échantillons de muscle de porcs et d’autres espèces animales sensibles destinées à la consommation

humaine (par exemple, chevaux, sangliers, morses et ours) sont efficaces pour prévenir la trichinellose

clinique chez l’homme. En raison des limites de sensibilité des méthodes de digestion, il est possible

que ces dernières ne détectent pas les animaux infectés par un très petit nombre de larves dans les

échantillons de muscle, ce qui peut constituer un risque d’infections subcliniques chez l’homme.

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NORME INTERNATIONALE ISO 18743:2015(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche des
larves de Trichinella dans la viande par une méthode de
digestion artificielle

AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse

bien les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de

traiter de tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe

à l’utilisateur de la présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et

de sécurité et de s’assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.

1 Domaine d’application

La présente Norme internationale décrit une méthode de détection de larves musculaires de Trichinella

spp. dans la viande provenant de carcasses individuelles d’animaux destinées à la consommation

humaine. Elle est applicable à l’examen de viande d’espèces animales domestiques et sauvages qui

peuvent être infectées par des nématodes du genre Trichinella.

Cette méthode ne permet pas d’identifier l’espèce ou le génotype des parasites détectés; l’identification

de l’espèce ou du génotype peut être réalisée à l’aide de méthodes moléculaires.

La méthode décrite dans la présente Norme internationale est destinée à être utilisée en association

avec les lignes directrices du Manuel des tests de diagnostic et des vaccins de l’OIE et celles émises par

la Commission internationale sur la trichinellose (ICT) pour la recherche de Trichinella et l’inspection de

carcasses destinées à la consommation humaine, sauf s’il a été prouvé par d’autres moyens que l’animal

ne risquait pas d’avoir été exposé à Trichinella.

La méthode de digestion artificielle utilisant un agitateur magnétique est considérée comme la méthode

normalisée puisqu’il a été démontré, lors d’études de validation, qu’elle donne les résultats les plus fiables.

NOTE Si l’équivalence avec la méthode décrite dans la présente Norme internationale peut être documentée,

d’autres méthodes peuvent être utilisées pour l’analyse.
2 Références normatives

Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à

l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 7218:2007, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations

Commission internationale sur la trichinellose (ICT), « Quality Assurance in Digestion Testing Programs

for Trichinella », Recommendations and Guidelines. 2012

Organisation mondiale de la santé animale (OIE), chapitre 2.1.16 — « Trichinellose », Manuel des tests de

ème
diagnostic et des vaccins pour les animaux terrestres 7 éd. 2012
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

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ISO 18743:2015(F)
3.1
larves musculaires de Trichinella

premier stade larvaire (L1) des nématodes du genre Trichinella qui est localisé dans les muscles striés

de tous les animaux sensibles et qui peut infecter les hommes

Note 1 à l’article: Ces larves ont une longueur d’environ 0,7 mm à 1,1 mm et une largeur de 0,03 mm.

3.2
test de digestion

méthode de détection des larves de Trichinella dans le tissu musculaire par une étape de digestion

enzymatique pour libérer les larves du tissu musculaire suivie d’une étape de filtration et de

sédimentation, et enfin d’une détection des larves collectées par microscopie
3.3
larves par gramme
lpg
nombre de larves de Trichinella présentes dans un gramme de tissu musculaire
4 Principe
4.1 Généralités

La méthode de digestion artificielle, qui est reconnue comme la méthode de référence internationale

(voir l’OIE, Manuel terrestre 2012, chapitre 2.1.16 — Trichinellose, page 307), repose sur la dégradation

enzymatique de fibres musculaires dans un liquide constitué de pepsine et d’acide chlorhydrique,

suivie d’une série d’étapes de sédimentation et de rinçage; des méthodes équivalentes validées

peuvent également être utilisées. La performance de l’analyse est fortement influencée par la taille

de l’échantillon (des échantillons de 1 g permettront une détection fiable d’infections ≥ 3 lpg et des

échantillons de 3 g à 5 g permettront une détection fiable d’infections ≥ 1 lpg), par le type de muscle

sélectionné, par la méthode utilisée et par les compétences du technicien réalisant l’analyse. Une

sensibilité d’au moins une à trois larves par gramme doit être obtenue pour protéger la santé humaine;

par conséquent, il convient de prélever un échantillon de muscle de taille appropriée dans un muscle de

prédilection de l’animal concerné. Il n’existe pas de contrôle qualité interne pouvant être utilisé lors de

la mise en œuvre de la méthode. Certains éléments clés relatifs à son principe d’utilisation sont donnés

ci-dessous (voir 4.2 à 4.9).
4.2 Taille de l’échantillon

Dans le cadre de l’inspection sanitaire de carcasses d’animaux destinées à la consommation humaine,

l’échantillon doit être prélevé sur des sites de prédilection (voir l’Annexe A) et la taille de l’échantillon

doit être basée sur une évaluation de risques, conformément à la prescription de l’autorité compétente,

mais elle ne doit pas être inférieure à 1 g par carcasse.
4.3 Broyage de l’échantillon de muscle

Les échantillons de viande sont hachés à l’aide d’un mixeur ou d’un broyeur afin d’augmenter la surface

pour la dégradation enzymatique. Le mode opératoire de mélange ou de broyage doit être ajusté de

façon à optimiser l’efficacité de la digestion.

NOTE Un broyage insuffisant peut induire une mauvaise digestion, alors qu’un broyage excessif peut

endommager ou abîmer les larves musculaires.
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ISO 18743:2015(F)
4.4 Préparation du liquide de digestion

La pepsine est disponible dans le commerce sous forme de poudre, de granulés et de liquide. L’activité

de la pepsine doit être certifiée et la pepsine doit être conservée conformément aux recommandations

du fabricant.

NOTE L’utilisation de pepsine sous forme liquide peut être avantageuse car elle peut réduire les risques

professionnels tels que les réactions allergiques du personnel de laboratoire.
4.5 Digestion de la viande hachée

Les larves viables de Trichinella sont résistantes au liquide de digestion contenant la pepsine et l’acide

chlorhydrique et peuvent ainsi être récupérées exemptes de tissu musculaire. Les larves mortes de

Trichinella peuvent être détruites par la digestion artificielle.

Pour favoriser une digestion efficace et rapide, un rapport maximal de 1:20 entre la viande et le liquide de

digestion, et une température de 45 °C ± 2 °C, doivent être maintenus tout au long de l’étape de digestion.

La durée de la digestion requise doit être d’au moins 30 min, mais dans le cas d’échantillons de muscle

moins digestibles, notamment ceux provenant de carcasses d’animaux sauvages, ou de la langue de

nombreuses espèces animales (voir l’Annexe A), il convient d’augmenter la durée de digestion sans qu’elle

ne dépasse toutefois 60 min au total, sauf en cas de validation pour une matrice d’échantillons donnée.

NOTE Si les conditions de durée et de température sont inférieures aux valeurs requises, la digestion du tissu

musculaire peut être incomplète. À l’inverse, une température élevée (plus de 50 °C) ou une durée de digestion

prolongée peut détruire les larves ou inactiver la pepsine.
4.6 Filtration du liquide de digestion

Après digestion, le liquide de digestion doit être filtré sur un tamis d’une taille de maille spécifique (6.11),

pour retenir le tissu non digéré tout en laissant passer les larves. Avant d’être utilisés, les tamis doivent

être exempts de débris et préalablement humidifiés pour laisser passer rapidement le liquide de digestion.

4.7 Sédimentation du liquide de digestion

La sédimentation des larves est effectuée dans une ampoule à décanter (première sédimentation) et

dans une éprouvette en verre (deuxième sédimentation). Les larves sont collectées lors de ces première

et deuxième sédimentations. Les première et deuxième sédimentations doivent respectivement durer

30 min et 10 min (voir l’Annexe B concernant les durées de sédimentation des échantillons de muscles

congelés). Si les durées de sédimentation sont inférieures aux durées stipulées ci-dessus, il se peut que

les larves ne sédimentent pas toutes et ne soient pas collectées dans le sédiment prélevé.

4.8 Examen microscopique

L’examen microscopique du deuxième sédiment permet aux analystes qualifiés d’identifier les larves de

Trichinella et de les distinguer des nombreux autres nématodes, organismes ou artéfacts. La connaissance

des caractéristiques morphologiques de base des larves de Trichinella, notamment la taille (0,7 mm à

1,1 mm de longueur et 0,03 mm de largeur), la forme et la couleur, est requise pour examiner le sédiment

(voir la Figure C.1 et la Figure C.2). La principale caractéristique distinctive des larves de Trichinella, non

reconnue à la loupe binoculaire mais observée au microscope optique, est le stichosome, qui est constitué

d’une série de cellules discoïdes encerclant l’œsophage et occupant la moitié antérieure de la larve. Les

larves de Trichinella peuvent apparaître enroulées en spirale (lorsque l’environnement est froid) ou

mobiles (lorsque l’environnement est chaud), ou encore en forme de « C »lorsqu’elles sont mortes.

Pour être habilité à effectuer la méthode de digestion de routine, l’analyste doit savoir appliquer la

méthode de digestion artificielle utilisant un agitateur magnétique sur des échantillons artificiellement

contaminés par Trichinella (un lot d’essai d’aptitude) afin de collecter et d’identifier les larves de façon

constante. Il convient que les analystes soient qualifiés sur la base de leur performance lors d’un essai

d’aptitude conformément aux lignes directrices de la Commission internationale sur la trichinellose.

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ISO 18743:2015(F)
4.9 Vérification des résultats

En cas de résultats positifs ou douteux, il convient d’effectuer une confirmation et une identification

au niveau de l’espèce par un laboratoire de référence certifié, conformément aux lignes directrices de

l’ICT «Quality Assurance in Digestion Testing Programs for Trichinella», Part 1 — Quality assurance in

regulatory testing for Trichinella, c’est-à-dire «un laboratoire officiellement reconnu par une autorité

nationale ou internationale pour un niveau requis d’expertise scientifique et de diagnostic pour une

maladie animale particulière et/ou une méthodologie d’essai».
5 Réactifs
5.1 Eau du robinet, chauffée à 47 °C ± 2 °C.

5.2 Acide chlorhydrique (25 %, concentration molaire: 7,8 à 7,9, ou tout autre pourcentage).

5.3 Pepsine (sous forme de poudre ou de granulés: 1:10 000 NF, 1:12 500 BP, 2 000 FIP; sous forme

liquide: 660 U/ml).

NOTE L’activité de la pepsine en poudre est exprimée par gramme, dans les unités « NF » (US National

Formulary), « BP » (British Pharmacopoeia) ou « FIP » (Fédération Internationale de Pharmacie); l’activité de

la pepsine liquide est exprimée en unités par millilitres de la Pharmacopée européenne, avec un minimum de

660 U/ml. D’autres activités pepsiques peuvent être utilisées à condition que l’activité finale dans le liquide de

digestion soit équivalente à l’activité de 10 g de 1:10 000 NF.
5.4 Éthanol (alcool éthylique à 70 % à 90 %).
5.5 Hypochlorite de sodium.
6 Appareillage

Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218), et en particulier, ce qui suit.

6.1 Bacs de collecte étiquetés ou sacs en plastique pour échantillons.

6.2 Couteaux, ciseaux et pinces pour couper les échantillons et éliminer le tissu non digestible.

6.3 Balance étalonnée pour peser les échantillons et/ou la pepsine (précise à ± 0,1 g).

6.4 Broyeur en verre, en plastique ou en acier équipé d’une lame de hachage tranchante

(régulièrement contrôlée et/ou remplacée).

6.5 Agitateur magnétique équipé d’une plaque chauffante réglable ou agitateur magnétique placé

dans un incubateur.

6.6 Thermomètre (précis à au moins ± 0,5 °C, gamme minimale de températures de 20 °C à 70 °C).

6.7 Barreau magnétique (d’une longueur minimale de 5 cm).
6.8 Béchers en verre (d’une capacité minimale de 3 l).
6.9 Feuille d’aluminium, ou couvercles pour recouvrir le bécher en verre.

6.10 Entonnoirs (en verre, en plastique ou en acier) (d’un diamètre minimal d’environ 15 cm).

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ISO 18743:2015(F)

6.11 Tamis en laiton ou en acier inoxydable, d’une taille de maille spécifique comprise entre 180 µm et

200 µm (d’un diamètre d’environ 10 cm ou plus).

6.12 Ampoules à décanter coniques en verre (d’une capacité minimale de 2,5 l), de préférence

équipées de robinets de sécurité en polytétrafluoroéthylène (PTFE).
6.13 Tubes ou éprouvettes graduées (en verre, de 50 ml ou 100 ml).

6.14 Boîtes de Petri (d’un diamètre d’environ 90 mm) quadrillées en carrés d’environ 1 cm, ou matériel

équivalent pour le dénombrement des larves.

6.15 Loupe binoculaire à rétroéclairage, ou trichinoscope à table horizontale. Il est recommandé de

disposer d’un système de capture et d’enregistrement d’images (appareil photo ou caméra) mais cela

n’est pas obligatoire pour rendre des résultats de suspicion.
6.16 Pipettes d’une capacité de 1 ml, 10 ml et 25 ml.
6.17 Petits flacons pour prélever les larves collectées.

Il convient de ne pas utiliser de béchers ou d’ampoules à décanter (autres que les robinets) en plastique

ou en téflon étant donné qu’une surface rugueuse et une charge électrostatique peuvent favoriser

l’adhérence des larves sur la surface interne du matériel.

Il convient que l’équipement répertorié en 6.2, 6.4 et 6.11 soit régulièrement nettoyé et exempt de tissus

susceptibles de contenir des larves d’analyses précédentes.
7 Prélèvement d’échantillons, étiquetage et transport

Le prélèvement des échantillons, leur étiquetage et leur transport ne font pas partie de la méthode

décrite dans la présente Norme internationale mais sont indiqués dans l’Annexe A. S’il n’existe aucune

Norme internationale relative au prélèvement des échantillons à partir des carcasses d’animaux ou de

morceaux de celles-ci, il est recommandé aux parties concernées de trouver un accord à ce sujet.

Pour obtenir la sensibilité requise pour la recherche de Trichinella chez les animaux, un échantillon de

muscle de taille appropriée doit être prélevé sur un muscle de prédilection (voir l’Annexe A). Il convient

que les échantillons de muscle prélevés sur une carcasse pour la recherche par digestion soient au

moins deux fois plus lourds que la masse requise pour l’examen, ceci afin de compenser l’élimination

des tissus non digestibles.

Dès réception des échantillons, le personnel du laboratoire doit contrôler la conformité des échantillons

pour l’analyse en vérifiant la masse, la composition, l’état, l’étiquetage et la correspondance avec les

documents transmis (réception conforme à l’ISO 7218:2007, 8.3).

Il convient de soumettre à l’analyse les échantillons de muscle le plus vite possible ou de les conserver

entre 2 °C et 8 °C pour ralentir la décomposition et éviter la congélation.
8 Préparation des échantillons

Les échantillons soumis à l’analyse ne doivent contenir ni graisse, ni tendons, ni fascia. En cas

d’utilisation de tissu lingual, la couche superficielle non digestible et dure du tissu conjonctif doit être

retirée avant l’analyse. Il convient que l’autorité compétente détermine la taille minimale d’échantillon

pour la recherche par digestion artificielle (voir les lignes directrices de l’ICT «Quality Assurance in

Digestion Testing Programs for Trichinella», Part 5 — Recommendations on essential components

and minimum requirements for a Trichinella testing laboratory certification program — B.6 Sample

collection and handling). Les échantillons d’animaux individuels peuvent être regroupés; la masse

maximale de muscle dans un mélange à digérer doit être de 100 g, mais il est possible d’ajouter jusqu’à

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15 g de tissu musculaire supplémentaire en cas de besoin. Pour les mélanges ayant une masse totale de

muscle moins élevée (par exemple, 50 g), le volume et les ingrédients du liquide de digestion peuvent

être ajustés en conséquence, dans la limite de 1 l minimum.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
La Figure C.1 illustre un schéma de la méthode utilisant l’agitateur magnétique.
9.2 Broyage

Pour le broyage, une petite quantité (50 ml à 100 ml pour 100 g de viande) de liquide de digestion ou d’eau

du robinet (45 °C ± 2 °C) doit être ajoutée à la viande dans le broyeur pour faciliter l’homogénéisation. Il

convient de poursuivre le broyage jusqu’à ce que la viande soit bien hachée ou émincée (généralement

trois séries de 5 s à 10 s), mais il ne doit pas être trop poussé afin de ne pas abîmer les larves.

9.3 Préparation du liquide de digestion

La pepsine utilisée pour préparer le liquide de digestion doit présenter l’activité appropriée pour la

digestion (voir en 5.3). Le liquide de digestion doit être préparé extemporanément pour chaque analyse.

Les étapes de préparation du liquide de digestion sont les suivantes:

a) ajouter 16 ml d’acide chlorhydrique à 25 % (voir l’Article 5) dans un bécher en verre contenant 2 l

d’eau du robinet préchauffée à 45 °C ± 2 °C;

b) placer un barreau magnétique dans le bécher, installer le bécher sur un agitateur magnétique

préchauffé ou sur un agi
...

Questions, Comments and Discussion

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