ISO 18743:2015
(Main)Microbiology of the food chain — Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method
Microbiology of the food chain — Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method
ISO 18743:2015 specifies a method of detection of Trichinella spp. muscle stage larvae in meat of individual animal carcasses intended for human consumption. It is applicable to the examination of meat from domestic and sylvatic animal species, which can be infected by nematodes of the genus Trichinella. This method does not allow the identification of the species or genotype of detected parasites; species or genotype identification can be carried out by molecular methods. The method described in this International Standard is intended to be used in conjunction with the guidelines in the OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines and by the International Commission on Trichinellosis (ICT) for Trichinella testing and the inspection of carcasses intended for human consumption, unless it has been demonstrated by other means that the animal was not at risk for exposure to Trichinella. The artificial digestion/magnetic stirrer method is considered to be the standard method because it has proven to give the most reliable results in validation studies. NOTE Provided equivalence with the method described within this International Standard can be documented, alternative methods can be used for analysis.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche des larves de Trichinella dans la viande par une méthode de digestion artificielle
ISO 18743:2015 décrit une méthode de détection de larves musculaires de Trichinella spp. dans la viande provenant de carcasses individuelles d'animaux destinées à la consommation humaine. Elle est applicable à l'examen de viande d'espèces animales domestiques et sauvages qui peuvent être infectées par des nématodes du genre Trichinella. Cette méthode ne permet pas d'identifier l'espèce ou le génotype des parasites détectés; l'identification de l'espèce ou du génotype peut être réalisée à l'aide de méthodes moléculaires. La méthode décrite dans la présente Norme internationale est destinée à être utilisée en association avec les lignes directrices du Manuel des tests de diagnostic et des vaccins de l'OIE et celles émises par la Commission internationale sur la trichinellose (ICT) pour la recherche de Trichinella et l'inspection de carcasses destinées à la consommation humaine, sauf s'il a été prouvé par d'autres moyens que l'animal ne risquait pas d'avoir été exposé à Trichinella. La méthode de digestion artificielle utilisant un agitateur magnétique est considérée comme la méthode normalisée puisqu'il a été démontré, lors d'études de validation, qu'elle donne les résultats les plus fiables. NOTE Si l'équivalence avec la méthode décrite dans la présente Norme internationale peut être documentée, d'autres méthodes peuvent être utilisées pour l'analyse.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18743
First edition
2015-09-15
Microbiology of the food chain —
Detection of Trichinella larvae in meat
by artificial digestion method
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche des larves de
Trichinella dans la viande par une méthode de digestion
artificielle
Reference number
©
ISO 2015
© ISO 2015, Published in Switzerland
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii © ISO 2015 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Sample size . 2
4.3 Blending/grinding of the muscle sample . 2
4.4 Preparation of the digest fluid . 2
4.5 Digestion of the chopped meat . 2
4.6 Filtration of the digest fluid . 3
4.7 Sedimentation of the digest fluid . 3
4.8 Microscopic examination . 3
4.9 Verification of findings . 3
5 Reagents . 3
6 Apparatus . 4
7 Sampling, labelling, and transport . 5
8 Sample preparation . 5
9 Procedure. 5
9.1 General . 5
9.2 Blending/grinding . 5
9.3 Preparation of the digest fluid . 6
9.4 Digestion of the chopped meat in the glass beaker . 6
9.5 Filtration of the digest fluid . 6
9.6 Sedimentation of the digest fluid in the separatory funnel . 7
9.7 Collection of the primary and secondary sediment . 7
9.8 Microscopic examination . 7
10 Documentation . 8
11 Expression of the results . 8
12 Safety measures . 8
Annex A (normative) Sample collection . 9
Annex B (normative) Frozen samples .11
Annex C (informative) Artificial digestion magnetic stirrer method .12
Annex D (informative) Example of a laboratory worksheet for recording data when testing
pooled samples by digestion assay .14
Bibliography .15
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
iv © ISO 2015 – All rights reserved
Introduction
Trichinella spp. are the causative agents of human trichinellosis, a disease which is a public health
hazard and, as a result, also represents an economic problem in porcine animal production. Due to
the zoonotic importance of this infection in many countries, the main efforts have focused on control
and/or eradication of Trichinella from domestic pigs, the most important source of human infection
worldwide. Digestion methods for detection of Trichinella larvae in muscle samples from pigs and other
susceptible animal species intended for human consumption (e.g. horses, wild boars, walruses, and
bears), are effective for preventing clinical trichinellosis in humans. Due to the limits of sensitivity of
digestion methods, these methods might not detect infected animals with very small numbers of larvae
in muscle samples, that can pose a risk for subclinical infections in humans.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 18743:2015(E)
Microbiology of the food chain — Detection of Trichinella
larvae in meat by artificial digestion method
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if
any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
1 Scope
This International Standard specifies a method of detection of Trichinella spp. muscle stage larvae in meat
of individual animal carcasses intended for human consumption. It is applicable to the examination of meat
from domestic and sylvatic animal species, which can be infected by nematodes of the genus Trichinella.
This method does not allow the identification of the species or genotype of detected parasites; species
or genotype identification can be carried out by molecular methods.
The method described in this International Standard is intended to be used in conjunction with the
guidelines in the OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines and by the International Commission
on Trichinellosis (ICT) for Trichinella testing and the inspection of carcasses intended for human
consumption, unless it has been demonstrated by other means that the animal was not at risk for
exposure to Trichinella.
The artificial digestion/magnetic stirrer method is considered to be the standard method because it
has proven to give the most reliable results in validation studies.
NOTE Provided equivalence with the method described within this International Standard can be
documented, alternative methods can be used for analysis.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for the application of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 7218:2007, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
International Commission on Trichinellosis (ICT), “Quality Assurance in Digestion Testing Programs
for Trichinella”, Recommendations and Guidelines. 2012
World Organisation for Animal Health (OIE), Chapter 2.1.16 — “Trichinellosis”, Manual of Diagnostic
Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. 2012
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Trichinella muscle larvae
ML
first larval stage (L1) of nematodes belonging to the genus Trichinella, which is located in striated
muscles of animals worldwide and can infect humans
Note 1 to entry: These larvae are approximately 0,7 mm to 1,1 mm in length and 0,03 mm in width.
3.2
digestion assay
method to detect Trichinella larvae in muscle tissue by an enzymatic digestion step to release larvae
from muscle tissues followed by filtration and sedimentation steps, and detection of recovered larvae
by microscopy
3.3
larvae per gram
lpg
number of Trichinella larvae present in one gram of muscle tissue
4 Principle
4.1 General
The artificial digestion method, which is accepted as the international reference method (see OIE,
Terrestrial Manual 2012, Chapter 2.1.16 — Trichinellosis, page 307), relies on enzymatic degradation of
muscle fibres in a fluid composed of pepsin and hydrochloric acid followed by a series of sedimentation
and washing steps; equivalent validated methods can also be used. Test performance is greatly
influenced by the sample size (1 g samples will enable the reliable detection of infections of ≥3 lpg, and
3 g to 5 g samples will enable reliable detection of ≥1 lpg), by the type of the selected muscle, by the
method used, and by the skills of the technician performing the test. A sensitivity of at least one to
three larvae per gram shall be achieved to protect human health; consequently, an appropriate size
of muscle sample should be collected from a predilection muscle of the target animal. There are no
internal quality controls that can be used while performing the method. Some key elements in the
principle of its use are as follows (see 4.2 to 4.9).
4.2 Sample size
For inspection of individual food animal carcasses for public health purposes, the sample shall be
collected from predilection sites (see Annex A) and the sample size shall be risk-based, as determined
by a competent authority, but not less than 1 g per carcass.
4.3 Blending/grinding of the muscle sample
Meat samples are chopped using a blender or grinder to increase the surface area for enzymatic
degradation. The blending or grinding procedure shall be adjusted to maximize digestion efficiency.
NOTE Too little blending or grinding can result in poor digestion, while too much blending or grinding can
damage or disrupt muscle larvae.
4.4 Preparation of the digest fluid
Pepsin is commercially available in powder, granular, and liquid forms. The activity of the pepsin shall
be certified and pepsin shall be stored according to the manufacturer’s recommendation.
NOTE The use of a liquid pepsin formulation can be advantageous as it could reduce the risk of occupational
hazard, such as allergic reaction in laboratory staff.
4.5 Digestion of the chopped meat
Viable Trichinella larvae are resistant to the pepsin-HCl digest fluid and therefore can be recovered free
from muscle tissue. Dead Trichinella larvae can be destroyed by artificial digestion.
To facilitate an efficient and rapid digestion, a maximum ratio of 1:20, meat to digest fluid, and a
temperature of 45 °C ± 2 °C, shall be maintained throughout the process. The time required for digestion
shall be at least 30 min, but in the case of muscle samples which are less digestible, such as from wildlife
2 © ISO 2015 – All rights reserved
carcasses, or the tongue of many species (see Annex A), the digestion time should be increased but,
unless otherwise validated for a particular sample matrix, shall not exceed 60 min in total.
NOTE If the time-temperature conditions are less than the required values, there might be an incomplete
digestion of the muscle tissue. Conversely, elevated temperature (over 50 °C) or prolonged digestion times might
result in the destruction of larvae or the inactivation of the pepsin.
4.6 Filtration of the digest fluid
Following digestion, the digest fluid shall be filtered through a sieve with specific mesh size (6.11), in
order to retain undigested tissue, but allowing larvae to pass through. Sieves shall be free of debris
prior to use and shall be pre-wetted to allow digest fluid to pass through quickly.
4.7 Sedimentation of the digest fluid
Sedimentation of larvae is performed in a separatory funnel (primary sedimentation) and a glass
tube (secondary sedimentation). Larvae are collected in these primary and secondary sediments.
Sedimentation times shall be of 30 min and 10 min for the primary and secondary sedimentation,
respectively (see Annex B for sedimentation times for frozen muscle samples). If the sedimentation
times are less than stipulated above, not all larvae might be settled and might not be recovered in the
collected sediment.
4.8 Microscopic examination
Microscopic examination of the secondary sediment allows qualified analysts to recognize Trichinella
larvae and distinguish from many other nematodes, organisms, or artefacts. Knowledge of the
basic morphological characteristics of Trichinella larvae, including size (0,7 mm to 1,1 mm in length
and 0,03 mm in width), shape, and colour is required to examine the sediment (see Figure C.1 and
Figure C.2). The most distinguishing feature of Trichinella larvae, not recognized by stereomicroscopy
but by compound microscopy, is the stichosome, which consists of a series of discoid cells lining the
oesophagus and occupying the anterior half of the body. Trichinella larvae can appear coiled (when
cold) or motile (when warm), or C-shaped (when dead).
To be qualified to perform routine digestion testing, the analyst shall adequately perform the artificial
digestion/magnetic stirrer method using Trichinella spiked samples (proficiency testing panel)
to consistently recover and identify larvae. Analysts should be qualified based on performance of
proficiency testing in accordance with guidance from the International Commission on Trichinellosis.
4.9 Verification of findings
If positive or doubtful findings occur, confirmation and identification at the species level should
be performed by a qualified reference laboratory, as defined by “ICT guidelines Recommendations
for Quality Assurance in Digestion Testing Programs for Trichinella”, Part 1 — Quality assurance in
regulatory testing for Trichinella, i.e. “a laboratory formally recognised by a national or international
authority for a required level of scientific and diagnostic expertise for a particular animal disease
and/or testing methodology”.
5 Reagents
5.1 Tap water, heated to 47 °C ± 2 °C.
5.2 Hydrochloric acid (25 %, molar concentration: 7,8 to 7,9, or any other percentage).
5.3 Pepsin (Powder or granular: 1: 10.000 NF, 1: 12.500 BP, 2.000 FIP; liquid: 660 U/ml).
NOTE The activity of pepsin powder is expressed per gram, either in “NF” (US National Formulary), “BP”
(British Pharmacopoea), or “FIP” (Fédération Internationale de Pharmacie); activity of liquid pepsin is expressed
in European Pharmacopoeia units per millilitre with a minimum of 660 U/ml. Other pepsin activities can be
used, provided the final activity in the digest fluid is equivalent to the activity of 10g of 1:10.000 NF.
5.4 Ethanol (70 % to 90 % ethyl alcohol).
5.5 Sodium hypochlorite.
6 Apparatus
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Labelled collection trays or plastic bags, for samples.
6.2 Knives, scissors, and forceps, for cutting samples and removing non-digestible tissue.
6.3 Calibrated scale, for weighing samples and/or pepsin (accuracy ± 0,1 g).
6.4 Glass, plastic, or steel blender, with a sharp chopping blade (regularly inspected and/or exchanged).
6.5 Magnetic stirrer, with an adjustable heating plate or magnetic stirrer put in an incubator.
6.6 Thermometer, (accurate to at least ±0,5 °C, minimum range of temperatures from 20 °C to 70 °C).
6.7 Stir bar, (5 cm in length minimum).
6.8 Glass beakers, (minimum 3 l capacity).
6.9 Aluminium foil, or lids, to cover the top of the glass beaker.
6.10 Funnels (glass, plastic, or steel), (minimum diameter of approximately 15 cm).
6.11 Sieve, made of brass or stainless steel, specific mesh si
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 18743
Première édition
2015-09-15
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Recherche des larves
de Trichinella dans la viande par une
méthode de digestion artificielle
Microbiology of the food chain — Detection of Trichinella larvae
in meat by artificial digestion method
Numéro de référence
©
ISO 2015
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2015, Publié en Suisse
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii © ISO 2015 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Taille de l’échantillon . 2
4.3 Broyage de l’échantillon de muscle . 2
4.4 Préparation du liquide de digestion . 3
4.5 Digestion de la viande hachée . 3
4.6 Filtration du liquide de digestion . 3
4.7 Sédimentation du liquide de digestion . 3
4.8 Examen microscopique . 3
4.9 Vérification des résultats . 4
5 Réactifs . 4
6 Appareillage . 4
7 Prélèvement d’échantillons, étiquetage et transport . 5
8 Préparation des échantillons . 5
9 Mode opératoire. 6
9.1 Généralités . 6
9.2 Broyage . 6
9.3 Préparation du liquide de digestion . 6
9.4 Digestion de la viande hachée dans le bécher en verre . 6
9.5 Filtration du liquide de digestion . 7
9.6 Sédimentation du liquide de digestion dans l’ampoule à décanter. 7
9.7 Collecte des sédiments primaire et secondaire . 7
9.8 Examen microscopique . 8
10 Documentation . 8
11 Expression des résultats. 9
12 Mesures de sécurité . 9
Annexe A (normative) Prélèvement d’échantillons .10
Annexe B (normative) Échantillons congelés .12
Annexe C (informative) Méthode de digestion artificielle utilisant l’agitateur magnétique .13
Annexe D (informative) Exemple de fiche technique de laboratoire pour consigner les
données lors de la recherche par digestion d’échantillons regroupés .15
Bibliographie .16
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie.
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés
Introduction
Le genre Trichinella spp. est l’agent pathogène responsable de la trichinellose humaine, une maladie
qui présente un risque pour la santé publique et, par conséquent, représente également un problème
économique dans le domaine de la production porcine. En raison de l’importance zoonotique de cette
infection dans de nombreux pays, les efforts se sont essentiellement concentrés sur la maîtrise et/ou
l’éradication de Trichinella chez le porc domestique, qui est la principale source d’infection humaine
dans le monde. Les méthodes de digestion permettant la détection des larves de Trichinella dans les
échantillons de muscle de porcs et d’autres espèces animales sensibles destinées à la consommation
humaine (par exemple, chevaux, sangliers, morses et ours) sont efficaces pour prévenir la trichinellose
clinique chez l’homme. En raison des limites de sensibilité des méthodes de digestion, il est possible
que ces dernières ne détectent pas les animaux infectés par un très petit nombre de larves dans les
échantillons de muscle, ce qui peut constituer un risque d’infections subcliniques chez l’homme.
NORME INTERNATIONALE ISO 18743:2015(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche des
larves de Trichinella dans la viande par une méthode de
digestion artificielle
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse
bien les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de
traiter de tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe
à l’utilisateur de la présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et
de sécurité et de s’assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale décrit une méthode de détection de larves musculaires de Trichinella
spp. dans la viande provenant de carcasses individuelles d’animaux destinées à la consommation
humaine. Elle est applicable à l’examen de viande d’espèces animales domestiques et sauvages qui
peuvent être infectées par des nématodes du genre Trichinella.
Cette méthode ne permet pas d’identifier l’espèce ou le génotype des parasites détectés; l’identification
de l’espèce ou du génotype peut être réalisée à l’aide de méthodes moléculaires.
La méthode décrite dans la présente Norme internationale est destinée à être utilisée en association
avec les lignes directrices du Manuel des tests de diagnostic et des vaccins de l’OIE et celles émises par
la Commission internationale sur la trichinellose (ICT) pour la recherche de Trichinella et l’inspection de
carcasses destinées à la consommation humaine, sauf s’il a été prouvé par d’autres moyens que l’animal
ne risquait pas d’avoir été exposé à Trichinella.
La méthode de digestion artificielle utilisant un agitateur magnétique est considérée comme la méthode
normalisée puisqu’il a été démontré, lors d’études de validation, qu’elle donne les résultats les plus fiables.
NOTE Si l’équivalence avec la méthode décrite dans la présente Norme internationale peut être documentée,
d’autres méthodes peuvent être utilisées pour l’analyse.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 7218:2007, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
Commission internationale sur la trichinellose (ICT), « Quality Assurance in Digestion Testing Programs
for Trichinella », Recommendations and Guidelines. 2012
Organisation mondiale de la santé animale (OIE), chapitre 2.1.16 — « Trichinellose », Manuel des tests de
ème
diagnostic et des vaccins pour les animaux terrestres 7 éd. 2012
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
larves musculaires de Trichinella
LM
premier stade larvaire (L1) des nématodes du genre Trichinella qui est localisé dans les muscles striés
de tous les animaux sensibles et qui peut infecter les hommes
Note 1 à l’article: Ces larves ont une longueur d’environ 0,7 mm à 1,1 mm et une largeur de 0,03 mm.
3.2
test de digestion
méthode de détection des larves de Trichinella dans le tissu musculaire par une étape de digestion
enzymatique pour libérer les larves du tissu musculaire suivie d’une étape de filtration et de
sédimentation, et enfin d’une détection des larves collectées par microscopie
3.3
larves par gramme
lpg
nombre de larves de Trichinella présentes dans un gramme de tissu musculaire
4 Principe
4.1 Généralités
La méthode de digestion artificielle, qui est reconnue comme la méthode de référence internationale
(voir l’OIE, Manuel terrestre 2012, chapitre 2.1.16 — Trichinellose, page 307), repose sur la dégradation
enzymatique de fibres musculaires dans un liquide constitué de pepsine et d’acide chlorhydrique,
suivie d’une série d’étapes de sédimentation et de rinçage; des méthodes équivalentes validées
peuvent également être utilisées. La performance de l’analyse est fortement influencée par la taille
de l’échantillon (des échantillons de 1 g permettront une détection fiable d’infections ≥ 3 lpg et des
échantillons de 3 g à 5 g permettront une détection fiable d’infections ≥ 1 lpg), par le type de muscle
sélectionné, par la méthode utilisée et par les compétences du technicien réalisant l’analyse. Une
sensibilité d’au moins une à trois larves par gramme doit être obtenue pour protéger la santé humaine;
par conséquent, il convient de prélever un échantillon de muscle de taille appropriée dans un muscle de
prédilection de l’animal concerné. Il n’existe pas de contrôle qualité interne pouvant être utilisé lors de
la mise en œuvre de la méthode. Certains éléments clés relatifs à son principe d’utilisation sont donnés
ci-dessous (voir 4.2 à 4.9).
4.2 Taille de l’échantillon
Dans le cadre de l’inspection sanitaire de carcasses d’animaux destinées à la consommation humaine,
l’échantillon doit être prélevé sur des sites de prédilection (voir l’Annexe A) et la taille de l’échantillon
doit être basée sur une évaluation de risques, conformément à la prescription de l’autorité compétente,
mais elle ne doit pas être inférieure à 1 g par carcasse.
4.3 Broyage de l’échantillon de muscle
Les échantillons de viande sont hachés à l’aide d’un mixeur ou d’un broyeur afin d’augmenter la surface
pour la dégradation enzymatique. Le mode opératoire de mélange ou de broyage doit être ajusté de
façon à optimiser l’efficacité de la digestion.
NOTE Un broyage insuffisant peut induire une mauvaise digestion, alors qu’un broyage excessif peut
endommager ou abîmer les larves musculaires.
2 © ISO 2015 – Tous droits réservés
4.4 Préparation du liquide de digestion
La pepsine est disponible dans le commerce sous forme de poudre, de granulés et de liquide. L’activité
de la pepsine doit être certifiée et la pepsine doit être conservée conformément aux recommandations
du fabricant.
NOTE L’utilisation de pepsine sous forme liquide peut être avantageuse car elle peut réduire les risques
professionnels tels que les réactions allergiques du personnel de laboratoire.
4.5 Digestion de la viande hachée
Les larves viables de Trichinella sont résistantes au liquide de digestion contenant la pepsine et l’acide
chlorhydrique et peuvent ainsi être récupérées exemptes de tissu musculaire. Les larves mortes de
Trichinella peuvent être détruites par la digestion artificielle.
Pour favoriser une digestion efficace et rapide, un rapport maximal de 1:20 entre la viande et le liquide de
digestion, et une température de 45 °C ± 2 °C, doivent être maintenus tout au long de l’étape de digestion.
La durée de la digestion requise doit être d’au moins 30 min, mais dans le cas d’échantillons de muscle
moins digestibles, notamment ceux provenant de carcasses d’animaux sauvages, ou de la langue de
nombreuses espèces animales (voir l’Annexe A), il convient d’augmenter la durée de digestion sans qu’elle
ne dépasse toutefois 60 min au total, sauf en cas de validation pour une matrice d’échantillons donnée.
NOTE Si les conditions de durée et de température sont inférieures aux valeurs requises, la digestion du tissu
musculaire peut être incomplète. À l’inverse, une température élevée (plus de 50 °C) ou une durée de digestion
prolongée peut détruire les larves ou inactiver la pepsine.
4.6 Filtration du liquide de digestion
Après digestion, le liquide de digestion doit être filtré sur un tamis d’une taille de maille spécifique (6.11),
pour retenir le tissu non digéré tout en laissant passer les larves. Avant d’être utilisés, les tamis doivent
être exempts de débris et préalablement humidifiés pour laisser passer rapidement le liquide de digestion.
4.7 Sédimentation du liquide de digestion
La sédimentation des larves est effectuée dans une ampoule à décanter (première sédimentation) et
dans une éprouvette en verre (deuxième sédimentation). Les larves sont collectées lors de ces première
et deuxième sédimentations. Les première et deuxième sédimentations doivent respectivement durer
30 min et 10 min (voir l’Annexe B concernant les durées de sédimentation des échantillons de muscles
congelés). Si les durées de sédimentation sont inférieures aux durées stipulées ci-dessus, il se peut que
les larves ne sédimentent pas toutes et ne soient pas collectées dans le sédiment prélevé.
4.8 Examen microscopique
L’examen microscopique du deuxième sédiment permet aux analystes qualifiés d’identifier les larves de
Trichinella et de les distinguer des nombreux autres nématodes, organismes ou artéfacts. La connaissance
des caractéristiques morphologiques de base des larves de Trichinella, notamment la taille (0,7 mm à
1,1 mm de longueur et 0,03 mm de largeur), la forme et la couleur, est requise pour examiner le sédiment
(voir la Figure C.1 et la Figure C.2). La principale caractéristique distinctive des larves de Trichinella, non
reconnue à la loupe binoculaire mais observée au microscope optique, est le stichosome, qui est constitué
d’une série de cellules discoïdes encerclant l’œsophage et occupant la moitié antérieure de la larve. Les
larves de Trichinella peuvent apparaître enroulées en spirale (lorsque l’environnement est froid) ou
mobiles (lorsque l’environnement est chaud), ou encore en forme de « C »lorsqu’elles sont mortes.
Pour être habilité à effectuer la méthode de digestion de routine, l’analyste doit savoir appliquer la
méthode de digestion artificielle utilisant un agitateur magnétique sur des échantillons artificiellement
contaminés par Trichinella (un lot d’essai d’aptitude) afin de collecter et d’identifier les larves de façon
constante. Il convient que les analystes soient qualifiés sur la base de leur performance lors d’un essai
d’aptitude conformément aux lignes directrices de la Commission internationale sur la trichinellose.
4.9 Vérification des résultats
En cas de résultats positifs ou douteux, il convient d’effectuer une confirmation et une identification
au niveau de l’espèce par un laboratoire de référence certifié, conformément aux lignes directrices de
l’ICT «Quality Assurance in Digestion Testing Programs for Trichinella», Part 1 — Quality assurance in
regulatory testing for Trichinella, c’est-à-dire «un laboratoire officiellement reconnu par une autorité
nationale ou internationale pour un niveau requis d’expertise scientifique et de diagnostic pour une
maladie animale particulière et/ou une méthodologie d’essai».
5 Réactifs
5.1 Eau du robinet, chauffée à 47 °C ± 2 °C.
5.2 Acide chlorhydrique (25 %, concentration molaire: 7,8 à 7,9, ou tout autre pourcentage).
5.3 Pepsine (sous forme de poudre ou de granulés: 1:10 000 NF, 1:12 500 BP, 2 000 FIP; sous forme
liquide: 660 U/ml).
NOTE L’activité de la pepsine en poudre est exprimée par gramme, dans les unités « NF » (US National
Formulary), « BP » (British Pharmacopoeia) ou « FIP » (Fédération Internationale de Pharmacie); l’activité de
la pepsine liquide est exprimée en unités par millilitres de la Pharmacopée européenne, avec un minimum de
660 U/ml. D’autres activités pepsiques peuvent être utilisées à condition que l’activité finale dans le liquide de
digestion soit équivalente à l’activité de 10 g de 1:10 000 NF.
5.4 Éthanol (alcool éthylique à 70 % à 90 %).
5.5 Hypochlorite de sodium.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218), et en particulier, ce qui suit.
6.1 Bacs de collecte étiquetés ou sacs en plastique pour échantillons.
6.2 Couteaux, ciseaux et pinces pour couper les échantillons et éliminer le tissu non digestible.
6.3 Balance étalonnée pour peser les échantillons et/ou la pepsine (précise à ± 0,1 g).
6.4 Broyeur en verre, en plastique ou en acier équipé d’une lame de hachage tranchante
(régulièrement contrôlée et/ou remplacée).
6.5 Agitateur magnétique équipé d’une plaque chauffante réglable ou agitateur magnétique placé
dans un incubateur.
6.6 Thermomètre (précis à au moins ± 0,5 °C, gamme minimale de températures de 20 °C à 70 °C).
6.7 Barreau magnétique (d’une longueur minimale de 5 cm).
6.8 Béchers en verre (d’une capacité minimale de 3 l).
6.9 Feuille d’aluminium, ou couvercles pour recouvrir le bécher en verre.
6.10 Entonnoirs (en verre, en plastique ou en acier) (d’un diamètre minimal d’environ 15 cm).
4 © ISO 2015 – Tous droits réservés
6.11 Tamis en laiton ou en acier inoxydable, d’une taille de maille spécifique comprise entre 180 µm et
200 µm (d’un diamètre d’environ 10 cm ou plus).
6.12 Ampoules à décanter coniques en verre (d’une capacité minimale de 2,5 l), de préférence
équipées de robinets de sécurité en polytétrafluoroéthylène (PTFE).
6.13 Tubes ou éprouvettes graduées (en verre, de 50 ml ou 100 ml).
6.14 Boîtes de Petri (d’un diamètre d’environ 90 mm) quadrillées en carrés d’environ 1 cm, ou matériel
équivalent pour le dénombrement des larves.
6.15 Loupe binoculaire à rétroéclairage, ou trichinoscope à table
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
Loading comments...