ISO 20541:2008
(Main)Milk and milk products — Determination of nitrate content — Method by enzymatic reduction and molecular-absorption spectrometry after Griess reaction
Milk and milk products — Determination of nitrate content — Method by enzymatic reduction and molecular-absorption spectrometry after Griess reaction
ISO 20541|IDF 197:2008 specifies a method for the determination of the nitrate content of milk and milk products by molecular-absorption spectrometry after Griess reaction (preceded by enzymatic reduction). The method is, in particular, applicable to whole, partly skimmed, skimmed and dried milk, hard, semi-hard and soft cheeses, processed cheese, whey cheese, caseins, caseinates, dried whey and milk protein concentrates. The method can be used at contents corresponding to a measured concentration in the sample solution (with blank subtracted) of more than 0,2 mg/l.
Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur en nitrates — Méthode par réduction enzymatique et spectrométrie d'absorption moléculaire après réaction de Griess
L'ISO 20541|FIL 197:2008 spécifie une méthode de détermination de la teneur en nitrates du lait et des produits laitiers par spectrométrie d'absorption moléculaire après une réaction de Griess (précédée d'une réduction enzymatique). Cette méthode s'applique notamment au lait entier, demi-écrémé, écrémé et au lait en poudre; aux fromages à pâte dure, demi-dure, et molle; au fromage fondu, au fromage de lactosérum, aux caséines, aux caséinates, au lactosérum en poudre et aux concentrés de protéine de lait. La méthode peut s'appliquer aux teneurs en nitrates équivalentes à une concentration mesurée de la solution échantillon (après soustraction correspondant au blanc) supérieure à 0,2 mg/l.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 20541
IDF
197
Первое издание
2008-09-01
Молоко и молочные продукты.
Определение содержания нитратов.
Метод с применением
ферментативного восстановления и
молекулярно-абсорбционной
спектрометрии после реакции Грисса
Milk and milk products — Determination of nitrate content — Method by
enzymatic reduction and molecular-absorption spectrometry after
Griess reaction
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочные номера
ISO 20541:2008(R)
IDF 197:2008(R)
©
ISO и IDF 2008
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20541:2008(R)
IDF 197:2008(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или вывести на экран, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на загрузку интегрированных шрифтов в компьютер, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO и IDF 2008
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO или IDF по соответствующему адресу, указанному ниже.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Brussels
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO и IDF 2008 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20541:2008(R)
IDF 197:2008(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
Предисловие .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .1
4 Сущность метода.2
5 Реактивы .2
6 Оборудование .4
7 Отбор проб.5
8 Подготовка пробы для испытания .6
8.1 Порошковое молоко, порошковая сыворотка и концентраты молочного белка.6
8.2 Казеины и казеинаты .6
8.3 Сыр.6
8.4 Сывороточный сыр .6
9 Процедура.6
9.1 Приготовление испытательного образца.6
9.2 Удаление жира и белка.7
9.3 Холостое испытание с использованием реактивов.8
9.4 Определение.8
9.5 Калибровка .10
10 Вычисление и выражение результатов.10
10.1 Содержание нитрита (матричный холостой раствор) (см. Раздел 4, Примечание 3) .10
10.2 Общее содержание нитрита/нитрата .11
10.3 Содержание нитрата .11
11 Прецизионность.12
11.1 Межлабораторные испытания.12
11.2 Повторяемость .12
11.3 Воспроизводимость .12
12 Протокол испытания.13
Приложение А (информативное) Межлабораторные испытания .14
Библиография.17
© ISO и IDF 2008 – Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20541:2008(R)
IDF 197:2008(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией
национальных организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных
стандартов обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член,
заинтересованный в деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть
представленным в этом комитете. Международные правительственные и неправительственные
организации, имеющие связи с ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации
в области электротехники, ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной
электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются по правилам, указанным в Директивах ISO/IEC,
Часть 2.
Главная задача технических комитетов состоит в разработке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Обращается внимание на возможность патентования некоторых элементов данного международного
стандарта. ISO не несет ответственности за идентификацию какого-либо или всех таких патентных
прав.
ISO 20541|IDF 197 был подготовлен Техническим комитетом ISO/ТС 34, Пищевые продукты,
Подкомитетом SC 5, Молоко и молочные продукты, и Международной молочной федерацией (IDF). Он
публикуется совместно ISO и IDF.
iv © ISO и IDF 2008 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20541:2008(R)
IDF 197:2008(R)
Предисловие
Международная молочная федерация (IDF) является некоммерческой организацией,
представляющей мировой молочный сектор. Членами IDF являются национальные комитеты в каждой
стране-члене, а также региональные молочные ассоциации, подписавшие официальное соглашение о
сотрудничестве с IDF. Все члены IDF имеют право быть представленными в постоянных комитетах IDF,
выполняющих техническую работу. IDF сотрудничает с ISO в разработке стандартных методов
анализа и отбора проб молока и молочных продуктов.
Проекты международных стандартов, принятые рабочими группами и постоянными комитетами,
рассылаются национальным комитетам на голосование. Для их публикации в качестве международных
стандартов требуется одобрение не менее 50 % национальных комитетов, принимающих участие в
голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего международного стандарта могут быть
объектом патентных прав. IDF не может нести ответственность за идентификацию какого-либо одного
или всех патентных прав.
Международный стандарт ISO 20541⏐IDF 197 был подготовлен Международной молочной федерацией
(IDF) и Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом SC 5, Молоко и
молочные продукты. Этот стандарт публикуется совместно ISO и IDF
Вся работа была проделана объединенной рабочей группой ISO-IDF Второстепенные соединения
Постоянного комитета Второстепенные компоненты и определение физических свойств при
поддержке руководителей этого проекта г-на M. Carl (DE) и г-жи C. Bäckman (FL).
© ISO и IDF 2008 – Все права сохраняются v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 20541:2008(R)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ
IDF 197:2008(R)
Молоко и молочные продукты. Определение содержания
нитратов. Метод с применением ферментативного
восстановления и молекулярно-абсорбционной
спектрометрии после реакции Грисса
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Использование этого международного стандарта может включать
опасные материалы, операции и оборудование. Настоящий стандарт не претендует на
рассмотрение всех проблем безопасности, связанных с его использованием. Пользователь сам
должен устанавливать соответствующие меры по безопасности и защите здоровья и
обеспечивать соответствие национальным регламентам.
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод для определения содержания нитратов в
молоке и молочных продуктах методом молекулярно-абсорбционной спектрометрии после реакции
Грисса (с предшествующим ферментативным восстановлением).
Метод, в частности, применяется для цельного, частично снятого, снятого и сухого молока, твердых,
полутвердых и мягких сыров, плавленого и сывороточного сыра, казеинов, казеинатов, сухой
сыворотки и концентратов молочного белка.
Этот метод можно использовать при содержаниях, соответствующих измеренной концентрации в
растворе пробы (без учета холостого раствора) более 0,2 мг/л.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы являются обязательными при применении данного
документа. Для жестких ссылок применяется только цитированное издание документа. Для плавающих
ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного ссылочного документа
(включая любые изменения).
ISO 565, Сита контрольные. Проволочная ткань, перфорированные пластины и листы,
изготовленные гальваническим методом. Номинальные размеры отверстий
ISO 648, Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной меткой
ISO 835, Посуда лабораторная стеклянная. Мерные градуированные пипетки
ISO 1042, Посуда лабораторная стеклянная. Мерные колбы с одной меткой
ISO 3696, Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытания
3 Термины и определения
Применительно к настоящему документу используются следующие термины и определения.
© ISO and IDF 2008 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 20541:2008(R)
IDF 197:2008(R)
3.1
содержание нитритов
nitrite content
массовая доля нитритных соединений, определенная методом, установленным в настоящем
международном стандарте
3.2
содержание нитратов
nitrate content
массовая доля нитратных соединений, определенная методом, установленным в настоящем
международном стандарте
−
ПРИМЕЧАНИЕ Содержание нитратов выражается как массовая доля в миллиграммах ионов нитрата (NO ) на
3
килограмм продукта.
4 Сущность метода
Испытательный образец диспергируют в теплой воде. Жир и белки удаляют или посредством
осаждения с использованием реактивов Карреза или посредством центробежного
ультрафильтрования с использованием конических мембран (см. Примечания 1 и 2). Нитрат
восстанавливают до нитрита в части фильтрата посредством нитратредуктазы. При добавлении
сульфаниламида и N-(1-нафтил)этилендиамида дихлорида проявляется красно-фиолетовый
азокраситель в частях как невосстановленного фильтрата (для нитрита), так и восстановленного
раствора (для нитрата), и оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм (или Hg 546 нм).
Содержание нитрита в пробе и общее содержание нитрита после восстановления нитрата вычисляют,
сравнивая измеренные оптические плотности с оптическими плотностями серии калибровочных
растворов нитрита натрия. Содержание нитрата определяют по разности между этими двумя
содержаниями.
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Две альтернативные процедуры для удаления жира и белка описаны в 9.2.1 и 9.2.2.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Для сухой сыворотки, концентрата сывороточного белка и аналогичных продуктов
предпочтительнее использовать ультрафильтрование вместо осаждения Карреза, так как последнее часто
приводит к помутнению и в результате к плохой прецизионности.
ПРИМЕЧАНИЕ 3 Низкий уровень эндогенного нитрита не протоколируют, но учитывают в матричном холостом
растворе.
5 Реактивы
Если не установлено иначе, используют только реактивы признанной аналитической чистоты без
нитратов и нитритов и воду, соответствующую классу 3 по ISO 3696 как минимум, также без нитратов и
нитритов. Для растворов фермента или кофермента используют свежеприготовленную воду двойной
дистилляции или эквивалентной чистоты.
5.1 Раствор гидроксида натрия, c(NaOH) = 1 моль/л.
5.2 Раствор хлорида натрия, c(NaCI) = 0,9 г/100 мл.
5.3 Соляная кислота, ρ (HCI) = 1,19 г/мл.
20
5.4 Раствор соляной кислоты, c(HCI) = 2 моль/л.
Тщательно добавляют 160 мл соляной кислоты (5.3) приблизительно к 700 мл воды в мерной колбе
вместимостью 1 000 мл с одной меткой (6.4) при регулярном вращении. Охлаждают содержимое до
комнатной температуры. Разбавляют до метки водой и тщательно перемешивают.
2 © ISO и IDF 2008 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 20541:2008(R)
IDF 197:2008(R)
5.5 Реактивы Карреза, указанные ниже:
5.5.1 Реактив Карреза I: Раствор гексацианоферрата(II) калия, c(K [Fe(CN) ].3H O) = 150 г/л.
4 6 2
Растворяют 15,0 г тригидрата гексацианоферрата(II) калия в воде в мерной колбе
вместимостью1 00 мл с одной меткой (6.4). Разбавляют до метки водой и перемешивают.
5.5.2 Реактив Карреза II: Раствор сульфата цинка, c(ZnSO .7H O) = 300 г/л.
4 2
Растворяют 30,0 г гептагидрата сульфата цинка в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл с одной
меткой (6.4). Разбавляют до метки водой и перемешивают
5.6 Стандартные растворы, указанные ниже:
5.6.1 Исходный раствор нитрита натрия (NaNO ).
2
Отвешивают точно (75,0 ± 0,1) мг предварительно высушенного (при 102 °C в течение 2 ч) нитрита
натрия в мерную колбу вместимостью1 00 мл с одной меткой. Растворяют в подходящем количестве
воды. Разбавляют до метки водой и перемешивают. Полученный исходный раствор содержит 500 мг
нитрита на литр.
Приготовляют калибровочные растворы, разбавляя исходный раствор водой, чтобы получить
несколько растворов с различными концентрациями нитрита в диапазоне от 0,05 мг/л до 5,0 мг/л.
При хранении при комнатной температуре исходный раствор нитрита натрия остается устойчивым
1 день.
5.6.2 Исходный раствор нитрата калия (KNO ).
3
Отвешивают точно (81,5 ± 0,1) мг предварительно высушенного (при 102 °C в течение 2 ч) нитрата
калия в мерную колбу вместимостью 1 00 мл с одной меткой. Растворяют в подходящем количестве
воды. Разбавляют до метки водой и перемешивают. Полученный исходный раствор содержит 500 мг
нитрата на литр.
Приготовляют калибровочные растворы, разбавляя исходный раствор водой, чтобы получить
несколько растворов с различными концентрациями нитрата в диапазоне от 0,05 мг/л до 5,0 мг/л.
При хранении при 4 °C исходный раствор нитрата калия остается устойчивым 1 неделю.
5.7 Буферный раствор фосфата калия, pH = 7,5.
Точно отвешивают (57,6 ± 0,1) мг гидрофосфата дикалия (K HPO .3H O) в мерную колбу
2 4 2
вместимостью 100 мл с одной меткой. Растворяют его в подходящем количестве воды. Разбавляют до
метки водой и перемешивают.
Точно отвешивают (17,0 ± 0,1) мг дигидрофосфата калия (KH PO ) в мерную колбу вместимостью
2 4
50 мл с одной меткой. Растворяют его в подходящем количестве воды. Разбавляют до метки водой и
перемешивают.
С помощью устройства для измерения pH (6.18) регулируют pH раствора гидрофосфата дикалия до
pH 7,5 путем добавления раствора дигидрофосфата калия.
При хранении при 4 °C буферный раствор фосфата калия остается устойчивым 2 недели.
5.8 Раствор NADPH/FAD.
Отвешивают точно (5,6 ± 0,1) мг 3-никотинамидадениндинуклеотидфосфата (восстановленного), соль
тетранатрия (β-NADPH-Na , с массовой долей не менее 98 %), и (80,0 ± 0,1) мг
4
© ISO и IDF 2008 – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 20541:2008(R)
IDF 197:2008(R)
флавинадениндинуклеотида, соль динатрия (FAD-Na , с массовой долей не менее 88 %), в мерную
2
колбу вместимостью 25 мл с одной меткой.
Растворяют их в подходящем количестве буферного раствора фосфата калия (5.7). Разбавляют до
метки буферным раствором (5.7) и перемешивают.
Раствор NADPH/FAD приготовляют непосредственно перед использованием.
5.9 Раствор нитратредуктазы (NR).
Отвешивают 65 мг нитратредуктазы (NR) из Aspergillus niger (EC 1.6.6.2, лиофизат, содержащий
приблизительно 0,4 Ед/мг) в пробирку вместимостью 10 мл. Добавляют 5 мл воды и перемешивают.
При хранении при 4 °C раствор нитратредуктазы остается устойчивым 2 недели.
5.10 Цветные реактивы, указанные ниже:
5.10.1 Раствор цветного реактива I: Сульфаниламид (NH C H SO NH ).
2 6 4 2 2
Отвешивают 400 мг сульфаниламида в мерную колбу вместимостью 50 мл с одной меткой (6.4).
Растворяют в растворе соляной кислоты, при необходимости нагревая в водяной бане.
Раствор охлаждают до комнатной температуры. Разбавляют до метки раствором соляной кислоты (5.4)
и перемешивают. Полученный таким образом раствор реактива при необходимости фильтруют.
При хранении при 4 °C раствор цветного реактива I остается устойчивым 4 недели.
5.10.2 Раствор цветного реактива II: N-(1-Нафтил)этилендиамин дигидрохлорид
(C H NHCH CH NH .2HCI).
10 7 2 2 2
Отвешивают 50 мг N-(1-нафтил)этилендиамин дихлорида в мерную колбу вместимостью 50 мл с одной
меткой (6.4). Растворяют в подходящем количестве воды.
Разбавляют водой до метки 50 мл и перемешивают. Полученный таким образом раствор при
необходимости фильтруют.
При хранении при 4 °C раствор цветного реактива II остается устойчивым 4 недели.
5.11 Комплекты реактивов также имеются в продаже. При использовании таких комплектов строго
следуйте указаниям этого международного стандарта (в частности, в случае 5.8).
6 Оборудование
Всю стеклянную посуду тщательно очищают и промывают водой для гарантии отсутствия нитратов и
нитритов.
Обычное лабораторное оборудование, в частности следующее:
6.1 Аналитические весы, обеспечивающие взвешивание с точностью до 0,1 мг.
6.2 Контейнер для пробы с герметической крышкой.
6.3 Конические колбы вместимостью 100 мл, 500 мл и 1 000 мл с притертыми стеклянными
пробками.
6.4 Мерные колбы с номинальной вместимостью 25 мл, 50 мл, 100 мл и 1 000 мл, соответствующие
требованиям ISO 1042, класс A.
4 © ISO и IDF 2008 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 20541:2008(R)
IDF 197:2008(R)
6.5 Пипетки, обеспечивающие подачу 1 мл, 2 мл, 5 мл и 10 мл соответственно, удовлетворяющие
требованиям ISO 648, класс A, или ISO 835. В соответствующих случаях можно использовать бюретки
вместо пипеток.
6.6 Градуированные пипетки для частичной подачи, используемые в ферментных тестах.
6.7 Градуированные цилиндры вместимостью 20 мл и 50 мл.
6.8 Стаканы вместимостью 20 мл и 50 мл.
6.9 Центрифуга с охлаждающим устройством, обеспечивающая центрифугирование чашек (6.10) и
конических мембран (6.21) с центробежным ускорение 3 000 г.
6.10 Чашки центрифуги диаметром 15 мм.
6.11 Мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм для использования со шприцем.
6.12 Стеклянная воронка подходящего диаметра.
6.13 Спектрометр, подходящий для измерения оптической плотности при длине волны 540 нм, или
фотометр для измерения спектральных линий с ртутной лампой и фильтром, подходящий для
измерения оптической плотности при длине волны 546 нм.
6.14 Оптические кюветы полумикронного типа (одноразовые или стеклянные кюветы), с длиной
оптического пути 1 см.
6.15 Мельница, подходящая для измельчения испытуемого образца, если необходимо. Для
избежания потери влаги устройство не должно создавать нежелательный нагрев.
6.16 Лабораторное сито из плетеной проволочной ткани, диаметром 200 мм, с отверстиями
номинального размера 500 мкм и приемный лоток, соответствующие требованиям ISO 565.
6.17 Магнитная мешалка.
6.18 Устройство для измерения pH, состоящее из pH-метра и стеклянных/контрольных электродов,
обеспечивающее измерение при 20 °C.
6.19 Водяная баня с встряхивающим приспособлением, поддерживающая температуру (70 ± 0,5) °C.
6.20 Нагревательная плита.
6.21 Конические мембраны, MWCO 5 000 D, вместимостью 4 мл, для центробежного
ультрафильтрования раствора пробы.
7 Отбор проб
Отбор проб не является частью метода, установленного в этом международном стандарте.
Рекомендованный метод отбора проб дан в ISO 707⎪IDF 50.
Важно, чтобы лаборатория получила действительно представительную пробу без повреждений или
изменений во время транспортировки или хранения.
Лабораторную пробу хранят таким образом, чтобы предотвратить любые повреждения и изменения.
© ISO и IDF 2008 – Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 20541:2008(R)
IDF 197:2008(R)
8 Подготовка пробы для испытания
8.1 Порошковое молоко, порошковая сыворотка и концентраты молочного белка
Пробу для испытания переносят в контейнер для проб (6.2), вместимость которого в два раза больше
объема этой пробы. Контейнер сразу же закрывают. Пробу тщательно перемешивают многократным
встряхиванием и переворачиванием контейнера.
8.2 Казеины и казеинаты
8.2.1 После переноса всей пробы для испытания в контейнер для проб (6.2) подходящей
вместимости ее при необходимости тщательно перемешивают многократным встряхиванием и
переворачиванием контейнера.
8.2.2 Переносят 50 г пробы для испытания в лабораторное сито (6.16). Если порция 50 г полностью
или почти полностью проходит через сито, тогда через него пропускают всю перемешанную пробу для
испытания (см. 8.2.1). Если испытуемая проба не проходит полностью через сито, используют
мельницу (6.15), чтобы обеспечить прохождение.
Всю просеянную пробу для испытания сразу же переносят в контейнер для проб (6.2). Тщательно
перемешивают в закрытом контейнере. Во время этих операций следует принимать меры
предосторожности, чтобы избежать изменений влагосодержания продукта.
После того как проба для испытания готова, как можно быстрее переходят к приготовлению
испытательного образца (см. 9.1).
8.3 Сыр
8.3.1 Перед анализом удаляют корку или плесневую поверхность с пробы для испытания, чтобы
проба была типичной для сыра, который обычно потребляется.
8.3.2 Пробу для испытания измельчают посредством подходящего устройства (6.15). Измельченную
массу быстро перемешивают и, если возможно, измельчают второй раз и снова тщательно
перемешивают. Мельницу очищают после измельчения каждой пробы. Если испытуемая проба не
может быть измельчена, ее тщательно перемешивают путем интенсивного встряхивания и круговых
движений.
8.3.3 По возможности сразу же после измельчения пробу переносят в контейнер (6.2) для
предстоящего анализа, который желательно проводить без задержки. Если задержка неизбежна,
следует принять все меры предосторожности для правильного сохранения пробы, не допуская
конденсации влаги на внутренней поверхности контейнера.
8.3.4 Не следует использовать измельченный сыр, который показывает рост плесени или начинает
портиться.
8.4 Сывороточный сыр
Пробу для испытания приготовляют по 8.3.2.
9 Процедура
9.1 Приготовление испытательного образца
9.1.1 Молоко
Отвешивают с точностью до 0,1 мг приблизительно от 10 г до 15 г испытуемой пробы. Переносят
6 © ISO и IDF 2008 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 20541:2008(R)
IDF 197:2008(R)
навеску количественно в коническую колбу вместимостью 100 мл (6.3). Добавляют постепенно 50 мл
кипящей воды.
Встряхивают смесь в водяной бане (6.19), поддерживаемой при 70 °C, в течение 15 мин.
9.1.2 Сухое молоко, сухая сыворотка, казеины, казеинаты и концентраты молочного белка
Отвешивают с точностью до 0,1 мг приблизительно от 2,0 г до 2,5 г испытуемой пробы. Переносят
навеску количественно в коническую колбу вместимостью 100 мл (6.3). Добавляют постепенно 50 мл
кипящей воды.
Встряхивают смесь в водяной бане (6.19), поддерживаемой при 70 °C, в течение 15 мин.
9.1.3 Сыр, плавленый сыр и сывороточный сыр
Отвешивают с точностью до 0,1 мг приблизительно 3 г испытуемой пробы (см. 8.3 или 8.4). Навеску
тщательно перемешивают с 15 мл воды, например, с помощью стеклянной палочки, чтобы получить
смесь без комков. Переносят смесь количественно в коническую колбу вместимостью 100 мл (6.3).
Добавляют постепенно 30 мл воды при 70 °C.
Встряхивают смесь в водяной бане (6.19), поддерживаемой при 70 °C, в течение 15 мин.
9.2 Удаление жира и белка
9.2.1 Осаждение с использованием реактивов Карреза и фильтрование
Приготовленный испытательный образец (см. 9.1.1, 9.1.2 или 9.1.3) охлаждают до комнатной
температуры. Добавляют последовательно 5 мл реактива Карреза I (5.5.1) и затем 5 мл реактива
Карреза II (5.5.2) при интенсивном перемешивании вращением или с помощью магнитной мешалки во
время и после каждого добавления. Регулируют значение pH до 8,0 ± 0,1, используя раствор
гидроксида натрия (5.1).
Переносят суспензию количественно в мерную колбу вместимостью 100 мл с одной меткой (6.4).
Разбавляют до метки водой и тщательно перемешивают. Помещают аликвоту в центрифужную чашку
(6.10) и устанавливают чашку в центрифугу (6.9). Центрифугируют при центробежной скорости 3 000g
при 20 °C в течение 15 мин.
Промывают мембранный фильтр (6.11) 5 мл раствора хлорида натрия (5.2) и затем 5 мл воды.
Фильтруют прозрачную надсадочную жидкость, полученную центрифугированием, через очищенный
мембранный фильтр (6.11). Отбрасывают первые несколько миллилитров и используют оставшийся
фильтрат для анализа (см. 9.4).
Важно получить прозрачный фильтрат в течение установленного времени. Если он не получается
(например, когда анализируют хорошо созревшие сыры), увеличивают объем каждого о реактива,
используемого для осаждения (5.5.1 и 5.5.2), и уменьшают объем горячей воды, используемой по 9.1,
соответственно.
9.2.2 Центробежное ультрафильтрование
Вместо осаждения жира и белка посредством реактивов Карреза I и II (см. 9.2.1) можно использовать
ультрафильтрование испытательного образца посредством конических мембран в центрифуге, чтобы
получить прозрачный фильтрат для анализа (см. 9.4).
Испытательный образец охлаждают до комнатной температуры (см. 9.1.1, 9.1.2 или 9.1.3). Регулируют
значение pH до 8,0 ± 0,1. Суспензию переносят количественно в мерную колбу вместимостью 100 мл с
одной меткой (6.4). Разбавляют до метки водой и тщательно перемешивают.
© ISO и IDF 2008 – Все права сохраняются 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 20541:2008(R)
IDF 197:2008(R)
Промывают коническую мембрану (6.21) 4 мл раствора хлорида натрия (5.2) и затем 4 мл воды.
Переносят аликвоту на очищенную коническую мембрану и помещают мембрану в центрифугу (6.9).
Центрифугируют при центробежном ускорении 3 000g при 20 °C в течение 20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Конические мембраны для использования в центрифуге коммерчески доступны, например
1)
весьма подходящим продуктом является концентратор размером 4 мм Vivaspin с полиэфирсульфоновой
мембраной и с отсечкой по молекулярной массе 5 000 D.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Нет необходимости фильтровать всю суспензию через коническую мембрану. Можно
использовать для предварительного фильтрования 5-мкм мембранные фильтры (6.11), чтобы избежать
закупоривания мембраны и ускорить процесс фильтрования.
9.3 Холостое испытание с использованием реактивов
Параллельно с проведением определения (см. 9.4) проводят холостое испытание с использованием
реактив
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20541
IDF
197
First edition
2008-09-01
Milk and milk products — Determination
of nitrate content — Method by enzymatic
reduction and molecular-absorption
spectrometry after Griess reaction
Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur en nitrates —
Méthode par réduction enzymatique et spectrométrie d'absorption
moléculaire après réaction de Griess
Reference numbers
ISO 20541:2008(E)
IDF 197:2008(E)
©
ISO and IDF 2008
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20541:2008(E)
IDF 197:2008(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. Neither the ISO Central
Secretariat nor the IDF accepts any liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies
and IDF national committees. In the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the ISO Central Secretariat at the
address given below.
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO and IDF 2008
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO or IDF at the respective
address below.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Brussels
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Published in Switzerland
ii © ISO and IDF 2008 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20541:2008(E)
IDF 197:2008(E)
Contents Page
Foreword. iv
Foreword. v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
5 Reagents. 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling. 5
8 Preparation of test sample. 5
8.1 Dried milk, dried whey and milk protein concentrates . 5
8.2 Caseins and caseinates . 5
8.3 Cheese . 6
8.4 Whey cheese . 6
9 Procedure . 6
9.1 Preparation of the test portion . 6
9.2 Removal of fat and protein . 6
9.3 Reagent blank test. 7
9.4 Determination. 7
9.5 Calibration . 9
10 Calculation and expression of results. 9
10.1 Nitrite (matrix blank) content (see Clause 4, Note 3). 9
10.2 Total nitrite/nitrate content . 9
10.3 Nitrate content. 10
11 Precision. 10
11.1 Interlaboratory testing. 10
11.2 Repeatability. 10
11.3 Reproducibility. 11
12 Test report . 11
Annex A (informative) Interlaboratory trials . 12
Bibliography . 15
© ISO and IDF 2008 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20541:2008(E)
IDF 197:2008(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 20541⎪IDF 197 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and
IDF.
iv © ISO and IDF 2008 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20541:2008(E)
IDF 197:2008(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit organization representing the dairy sector worldwide.
IDF membership comprises National Committees in every member country as well as regional dairy
associations having signed a formal agreement on cooperation with IDF. All members of IDF have the right to
be represented on the IDF Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in
the development of standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the
National Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of
the IDF National Committees casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 20541⎪IDF 197 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee
ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF
and ISO.
All work was carried out by the Joint ISO-IDF Action Team Minor compounds of the Standing Committee on
Minor components and characterization of physical properties under the aegis of its project leaders,
Mr. M. Carl (DE) and Mrs. C. Bäckman (FL).
© ISO and IDF 2008 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 20541:2008(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 197:2008(E)
Milk and milk products — Determination of nitrate content —
Method by enzymatic reduction and molecular-absorption
spectrometry after Griess reaction
WARNING — The use of this International Standard may involve hazardous materials, operations and
equipment. This standard does not purport to address all the safety problems associated with its use.
It is the responsibility of the user of this standard to establish safety and health practices and
determine the applicability of regulatory limitations prior to use.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the nitrate content of milk and milk
products by molecular-absorption spectrometry after Griess reaction (preceded by enzymatic reduction).
The method is, in particular, applicable to whole, partly skimmed, skimmed and dried milk, hard, semi-hard
and soft cheeses, processed cheese, whey cheese, caseins, caseinates, dried whey and milk protein
concentrates.
The method can be used at contents corresponding to a measured concentration in the sample solution (with
blank subtracted) of more than 0,2 mg/l.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references only the edition cited applies. For undated references the last edition of the referenced document
(including any amendments) applies.
ISO 565, Test sieves — Metal wire cloth, perforated metal plate and electroformed sheet — Nominal sizes of
openings
ISO 648, Laboratory glassware — Single-volume pipettes
ISO 835, Laboratory glassware — Graduated pipettes
ISO 1042, Laboratory glassware — One-mark volumetric flasks
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
nitrite content
mass fraction of nitrite compounds determined by the procedure specified in this International Standard
© ISO and IDF 2008 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 20541:2008(E)
IDF 197:2008(E)
3.2
nitrate content
mass fraction of nitrate compounds determined by the procedure specified in this International Standard
−
NOTE The nitrate content is expressed as the mass fraction in milligrams of nitrate ion (NO ) per kilogram of
3
product.
4 Principle
A test portion is dispersed in warm water. The fat and proteins are removed either by precipitation using
Carrez reagents and filtering or by centrifugal ultra-filtration using membrane cones (see Notes 1 and 2). The
nitrate is reduced to nitrite in a portion of the filtrate by means of nitrate reductase. A red-violet azo dye is
developed, in portions of both the unreduced filtrate (for nitrite) and the reduced solution (for nitrate), by
addition of sulfanilamide and N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride, and the absorbance measured
at a wavelength of 540 nm (or Hg 546 nm). The nitrite content of the sample and the total nitrite content after
reduction of nitrate are calculated by comparing the measured absorbances with those of a set of sodium
nitrite calibration solutions. The nitrate content is calculated from the difference between these two contents.
NOTE 1 The two alternative procedures for removal of fat and protein are described in 9.2.1 and 9.2.2.
NOTE 2 For whey powder, whey protein concentrate and similar products, ultra-filtration is used in preference to
Carrez precipitation as the latter often leads to turbidity problems and, as a consequence, to poor precision.
NOTE 3 The low endogenous nitrite level is not reported but taken into account in the matrix blank solution.
5 Reagents
Unless otherwise specified, use only reagents of recognized analytical grade, free of nitrate and nitrite, and
water complying with ISO 3696 grade 3 at least, free from nitrate and nitrite. Water used for preparation of
enzyme or coenzyme solutions shall be freshly double-distilled or of equivalent purity.
5.1 Sodium hydroxide solution, c(NaOH) = 1 mol/l.
5.2 Sodium chloride solution, c(NaCI) = 0,9 g/100 ml.
5.3 Hydrochloric acid, ρ (HCI) = 1,19 g/ml.
20
5.4 Hydrochloric acid solution, c(HCI) = 2 mol/l.
Carefully add 160 ml of hydrochloric acid (5.3) to about 700 ml of water in a 1 000 ml one-mark volumetric
flask (6.4) while regularly swirling the contents. Cool the contents to room temperature. Dilute to the mark with
water and mix carefully.
5.5 Carrez reagents, as follows:
5.5.1 Carrez reagent I: Potassium hexacyanoferrate(II) solution, c(K [Fe(CN) ].3H O) = 150 g/l.
4 6 2
Dissolve 15,0 g of potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate in water in a 100 ml one-mark volumetric flask
(6.4). Dilute to the mark with water and mix.
5.5.2 Carrez reagent II: Zinc sulfate solution, c(ZnSO .7H O) = 300 g/l.
4 2
Dissolve 30,0 g of zinc sulfate heptahydrate in water in a 100 ml one-mark volumetric flask (6.4). Dilute to the
mark with water and mix.
2 © ISO and IDF 2008 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 20541:2008(E)
IDF 197:2008(E)
5.6 Standard solutions, as follows:
5.6.1 Sodium nitrite (NaNO ) stock solution.
2
Accurately weigh (75,0 ± 0,1) mg of pre-dried (at 102 °C for 2 h) sodium nitrite into a 100 ml one-mark
volumetric flask. Dissolve it in a suitable amount of water. Dilute to the mark with water and mix. The nitrite
stock solution obtained contains 500 mg of nitrite per litre.
Prepare calibration solutions by diluting the stock solution with water to give several solutions with different
nitrite concentrations in the range from 0,05 mg/I to 5,0 mg/I.
When stored at room temperature, the sodium nitrite stock solution remains stable for 1 day.
5.6.2 Potassium nitrate (KNO ) stock solution.
3
Accurately weigh (81,5 ± 0,1) mg of pre-dried (at 102 °C for 2 h) potassium nitrate into a 100 ml one-mark
volumetric flask. Dissolve it in a suitable amount of water. Dilute to the 100 ml mark with water and mix. The
obtained nitrate stock solution contains 500 mg of nitrate per litre.
Prepare calibration solutions by diluting the stock solution with water to give several solutions with different
nitrate concentrations in the range from 0,05 mg/I to 5,0 mg/I.
When stored at 4 °C, the potassium nitrate stock solution remains stable for 1 week.
5.7 Potassium phosphate buffer solution, pH = 7,5.
Accurately weigh (57,6 ± 0,1) mg of dipotassium hydrogen phosphate (K HPO .3H O) into a 100 ml one-mark
2 4 2
volumetric flask. Dissolve it in a suitable amount of water. Dilute to the mark with water and mix.
Accurately weigh (17,0 ± 0,1) mg of potassium dihydrogen phosphate (KH PO ) into a 50 ml one-mark
2 4
volumetric flask. Dissolve it in a suitable amount of water. Dilute to the mark with water and mix.
Using the pH-measurement unit (6.18), adjust the pH of the dipotassium hydrogen phospate solution to pH 7,5
by addition of potassium dihydrogen phosphate solution.
When stored at 4 °C, the potassium phosphate buffer solution remains stable for 2 weeks.
5.8 NADPH/FAD solution.
Weigh accurately (5,6 ± 0,1) mg of 3-nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate (reduced form),
tetrasodium salt (β-NADPH-Na , with a mass fraction of at least 98 %), and (80,0 ± 0,1) mg flavine-adenine
4
dinucleotide, disodium salt (FAD-Na , with a mass fraction of at least 88 %), into a 25 ml one-mark volumetric
2
flask.
Dissolve them in a suitable amount of potassium phosphate buffer solution (5.7). Dilute to the mark with the
buffer solution (5.7) and mix.
Freshly prepare the NADPH/FAD solution immediately before use.
5.9 Nitrate reductase (NR) solution.
Weigh 65 mg of nitrate reductase (NR) from Aspergillus niger (EC 1.6.6.2, Iyophilizate containing
approximately 0,4 U/mg) into a 10 ml measuring tube. Add 5 ml of water and mix.
When stored at 4 °C, the nitrate reductase solution remains stable for 2 weeks.
© ISO and IDF 2008 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 20541:2008(E)
IDF 197:2008(E)
5.10 Colour reagents, as follows:
5.10.1 Colour reagent solution I: Sulfanilamide (NH C H SO NH ).
2 6 4 2 2
Weigh 400 mg of sulfanilamide into a 50 ml one-mark volumetric flask (6.4). Dissolve it, heating on a water-
bath if necessary, in hydrochloric acid solution (5.4).
Cool the solution to room temperature. Dilute to the mark with the hydrochloric acid solution (5.4) and mix. If
necessary, filter the reagent solution thus obtained.
When stored at 4 °C, colour reagent solution I remains stable for 4 weeks.
5.10.2 Colour reagent solution II: N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride
(C H NHCH CH NH .2HCI).
10 7 2 2 2
Weigh 50 mg of N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride into a 50 ml one-mark volumetric flask (6.4).
Dissolve it in a suitable amount of water.
Dilute to the 50 ml mark with water and mix. If necessary, filter the solution thus obtained.
When stored at 4 °C, colour reagent solution II remains stable for 4 weeks.
5.11 Reagent kits are also commercially available. Carefully follow the instructions of this International
Standard when using such kits (in particular in the case of 5.8).
6 Apparatus
Clean all glassware thoroughly and rinse with water to ensure that it is free from nitrate and nitrite.
Usual laboratory equipment and, in particular, the following:
6.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,1 mg.
6.2 Sample container, with an airtight Iid.
6.3 Conical flasks, of capacities 100 ml, 500 ml and 1 000 ml, with ground-glass stoppers.
6.4 One-mark volumetric flasks, of nominal capacities 25 ml, 50 ml, 100 ml and 1 000 ml, complying with
the requirements of ISO 1042, class A.
6.5 Pipettes, capable of delivering 1 ml, 2 ml, 5 ml and 10 ml, respectively, complying with the
requirements of ISO 648, class A, or ISO 835. Where appropriate, burettes may be used instead of pipettes.
6.6 Graduated pipettes, of the partial-delivery type, as used in enzyme tests.
6.7 Graduated cylinders, of capacities 20 ml and 50 ml.
6.8 Beakers, of capacities 20 ml and 50 ml.
6.9 Centrifuge, with cooling device, capable of centrifuging cups (6.10) and membrane cones (6.21) with a
centrifugal acceleration of 3 000g.
6.10 Centrifuge cups, of diameter 15 mm.
6.11 Membrane filter, of pore size 0,45 µm, for use with a syringe.
6.12 Glass funnel, of suitable diameter.
4 © ISO and IDF 2008 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 20541:2008(E)
IDF 197:2008(E)
6.13 Spectrometer, suitable for measuring absorbance at a wavelength of 540 nm, or spectral line
photometer with a mercury lamp and filter, suitable for measuring absorbance at a wavelength of 546 nm.
6.14 Optical cells, semi-micro type (disposable or glass cuvettes), of optical path length 1 cm.
6.15 Grinding device, suitable for grinding the test sample, if necessary. To avoid loss of moisture, the
device shall not produce undue heat.
6.16 Test sieve, of woven wire cloth, of diameter 200 mm, with openings of nominal size 500 µm and a
receiver complying with the requirements of ISO 565.
6.17 Magnetic stirrer.
6.18 pH-measurement unit, consisting of a pH-meter and glass/reference electrodes, capable of measuring
at 20 °C.
6.19 Water bath, with shaking facility, capable of operating at (70 ± 0,5) °C.
6.20 Hotplate.
6.21 Membrane cones, MWCO 5 000 D, capacity 4 ml, for centrifugal ultra-filtration of the sample solution.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
is given in ISO 707⎪IDF 50.
It is important that the laboratory receives a sample that is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Store the laboratory sample in such a way that deterioration and change in composition are prevented.
8 Preparation of test sample
8.1 Dried milk, dried whey and milk protein concentrates
Transfer the test sample to a sample container (6.2) of capacity about twice the volume of the test sample.
Close the container immediately. Mix the test sample thoroughly by repeatedly shaking and inverting the
container.
8.2 Caseins and caseinates
8.2.1 Thoroughly mix the test sample, if necessary after transferring all of it to a sample container (6.2) of
suitable capacity, by repeatedly shaking and inverting the container.
8.2.2 Transfer 50 g of the test sample to a test sieve (6.16). If the 50 g portion completely, or nearly
completely, passes through the sieve, pass the whole mixed test sample (see 8.2.1) through the sieve. If the
test sample does not pass completely through the sieve, use the grinding device (6.15) to ensure that it does.
Immediately transfer the entire sieved test sample to a sample container (6.2). Mix thoroughly in the closed
container. During these operations, take precautions to avoid any change in the water content of the product.
After the test sample has been prepared, proceed with the preparation of the test portion (see 9.1) as soon as
possible.
© ISO and IDF 2008 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 20541:2008(E)
IDF 197:2008(E)
8.3 Cheese
8.3.1 Prior to the analysis, remove any rind or mouldy surface layer from the test sample so as to provide a
test sample representative of the cheese as it is usually consumed.
8.3.2 Grind the test sample by means of a suitable device (6.15). Mix the ground mass quickly and, if
possible, grind a second time and again mix thoroughly. Clean the grinding device after grinding each sample.
If the test sample cannot be ground, mix it thoroughly by intensive stirring and kneading.
8.3.3 As soon as possible after grinding, transfer the test sample to a sample container (6.2) to await the
determination, which should preferably be carried out without delay. If delay is unavoidable, take all
precautions to ensure proper conservation of the test sample while preventing condensation of moisture on
the inside surface of the container.
8.3.4 Do not use ground cheese which shows mould growth or is beginning to deteriorate.
8.4 Whey cheese
Prepare the test sample as specified in 8.3.2.
9 Procedure
9.1 Preparation of the test portion
9.1.1 Milk
Weigh out, to the nearest 0,1 mg, approximately 10 g to 15 g of test sample. Transfer the test portion
quantitatively to a 100 ml conical flask (6.3). Add progressively 50 ml of boiling water.
Shake the mixture in a water bath (6.19), maintained at 70 °C, for 15 min.
9.1.2 Dried milk, dried whey, caseins, caseinates and milk protein concentrates
Weigh out, to the nearest 0,1 mg, approximately 2,0 g to 2,5 g of test sample (see 8.1 or 8.2). Transfer the
test portion quantitatively to a 100 ml conical flask (6.3). Add progressively 50 ml of boiling water.
Shake the mixture in a water bath (6.19), maintained at 70 °C, for 15 min.
9.1.3 Cheese, processed cheese and whey cheese
Weigh out, to the nearest 0,1 mg, approximately 3 g of test sample (see 8.3 or 8.4). Carefully mix the test
portion with 15 ml of water, using e.g. a glass rod, to obtain a lump-free mixture. Transfer the mixture
quantitatively to a 100 ml conical flask (6.3). Add progressively 30 ml of water at 70 °C.
Shake the mixture in a water bath (6.19), maintained at 70 °C, for 15 min.
9.2 Removal of fat and protein
9.2.1 By Carrez precipitation and filtration
Cool the prepared test portion (see 9.1.1, 9.1.2 or 9.1.3) to room temperature. Add, in the following order,
while swirling or stirring on the magnetic stirrer (6.17) thoroughly during and after each addition, 5 ml of Carrez
reagent I (5.5.1) and 5 ml of Carrez reagent II (5.5.2). Adjust the pH-value to 8,0 ± 0,1 using sodium hydroxide
solution (5.1).
6 © ISO and IDF 2008 – All rights reserved
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 20541:2008(E)
IDF 197:2008(E)
Transfer the suspension quantitatively to a 100 ml one-mark volumetric flask (6.4). Dilute to the mark with
water and mix carefully. Transfer an aliquot to a centrifuge cup (6.10) and place the cup in the centrifuge (6.9).
Centrifuge at a centrifugal acceleration of 3 000g at 20 °C for 15 min.
Rinse a membrane filter (6.11) with 5 ml of sodium chloride solution (5.2) and subsequently with 5 ml of water.
Filter the clear supernatant liquid obtained from the centrifugation through the cleaned membrane filter (6.11).
Discard the first few millilitres and use the rest of the filtrate for the determination (see 9.4).
It is essential to obtain a clear filtrate within the time specified. If it is not obtained (for example, if well-matured
cheeses are being analysed), use a larger volume of each precipitation reagent (5.5.1 and 5.5.2) and reduce
the volume of hot water used in 9.1 accordingly.
9.2.2 By centrifugal ultra-filtration
Instead of precipitation of fat and protein by Carrez reagents I and II (see 9.2.1), ultra-filtration of the test
portion by membrane cones in a centrifuge can be used to obtain a clear filtrate for the determination (see 9.4).
Cool the test portion (see 9.1.1, 9.1.2 or 9.1.3) to room temperature. Adjust the pH-value to 8,0 ± 0,1. Transfer
the suspension quantitatively to a 100 ml one-mark volumetric flask (6.4). Dilute to the mark with water and
mix carefully.
Rinse a membrane cone (6.21) with 4 ml of sodium chloride solution (5.2) and subsequently with 4 ml of water.
Transfer an aliquot to the cleaned membrane cone and place the cone in the centrifuge (6.9). Centrifuge at a
centrifugal acceleration of 3 000g at 20 °C for 20 min.
1)
NOTE 1 Membrane cones for use in a centrifuge are commercially available, e.g. the Vivaspin 4 ml concentrator with
a polyethersulfone membrane and a molecular mass cut-off of 5 000 D is a particularly suitable product.
NOTE 2 It is not necessary to filter all the test portion suspension in the membrane cone. Pre-filtering of the sample
with 5 µm membrane filters (6.11) can be used to avoid clogging of the membrane and to speed up the filtration.
9.3 Reagent blank test
Carry out a reagent blank test in parallel with the determination (see 9.4). Prepare the reagent blank solution
as described in 9.1 and 9.2, but replacing the test portion in 9.1 by an equal volume of water.
9.4 Determination
Using a spectrometer (6.13) at a wavelength of 540 nm or Hg 546 nm and semi-micro optical cells (6.14),
carry out the determination at between 20 °C and 25 °C.
Before transferring the sample solution or reagent blank solution, rinse the pipette with sample solution or
reagent blank solution, respectively.
For pipetting of the reagent solutions, piston pipettes may be used. For pipetting of sample and reagent blank
solutions, use graduated pipettes of the type used in enzyme tests (6.6).
®
1) Vivaspin is the name of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
the users of this International Standard but does not constitute an endorsement by either ISO or IDF of the product named.
© ISO and IDF 2008 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 20541:2008(E)
IDF 197:2008(E)
For the nitrate and nitrite (total nitrite) determination, proceed in accordance
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20541
FIL
197
Première édition
2008-09-01
Lait et produits laitiers — Détermination
de la teneur en nitrates — Méthode par
réduction enzymatique et spectrométrie
d'absorption moléculaire après réaction
de Griess
Milk and milk products — Determination of nitrate content — Method by
enzymatic reduction and molecular-absorption spectrometry after
Griess reaction
Numéros de référence
ISO 20541:2008(F)
FIL 197:2008(F)
©
ISO et FIL 2008
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20541:2008(F)
FIL 197:2008(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO et la FIL
déclinent toute responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO et les comités nationaux de la FIL. Dans le cas peu probable où
surviendrait un problème d'utilisation, veuillez en informer le Secrétariat central de l'ISO à l'adresse donnée ci-dessous.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO et FIL 2008
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
soit de l'ISO soit de la FIL, à l'une ou l'autre des adresses ci-après.
ISO copyright office Fédération Internationale de Laiterie
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Bruxelles
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Publié en Suisse
ii © ISO et FIL 2008 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20541:2008(F)
FIL 197:2008(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Avant-propos. v
1 Domaine d'application.1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions.1
4 Principe.2
5 Réactifs .2
6 Appareillage .4
7 Échantillonnage .5
8 Préparation de l'échantillon pour essai.5
8.1 Lait en poudre, lactosérum en poudre, concentrés de protéines de lait.5
8.2 Caséines et caséinates .5
8.3 Fromage.6
8.4 Fromage de lactosérum .6
9 Mode opératoire.6
9.1 Préparation de la prise d'essai.6
9.2 Élimination des matières grasses et des protéines.6
9.3 Essai à blanc du réactif.7
9.4 Détermination.7
9.5 Étalonnage.9
10 Calcul et expression des résultats.9
10.1 Teneur en nitrite (blanc de la matrice) (voir Article 4, Note 3).9
10.2 Teneur totale en nitrite/nitrate .9
10.3 Teneur en nitrate.10
11 Fidélité .10
11.1 Essai interlaboratoires .10
11.2 Répétabilité.10
11.3 Reproductibilité.11
12 Rapport d'essai .11
Annexe A (informative) Essais interlaboratoires .12
Bibliographie .15
© ISO et FIL 2008 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20541:2008(F)
FIL 197:2008(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 20541⎪FIL 197 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL). Elle est publiée conjointement
par l'ISO et la FIL.
iv © ISO et FIL 2008 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20541:2008(F)
FIL 197:2008(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une organisation sans but lucratif représentant le secteur
laitier mondial. Les membres de la FIL se composent des Comités nationaux dans chaque pays membre et
des associations laitières régionales avec lesquelles la FIL a signé des accords de coopération. Tout membre
de la FIL a le droit de faire partie des Comités permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux
techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et
d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d'Action et les Comités permanents sont
soumis aux Comités nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 50 % au moins des Comités nationaux de la FIL votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 20541⎪FIL 197 a été élaborée par la Fédération internationale de laiterie (FIL) et le comité technique
ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée conjointement
par l'ISO et la FIL.
L'ensemble des travaux a été confié à l'Équipe d'Action mixte ISO/FIL Composants mineurs du Comité
permanent chargé des Composants mineurs et caractérisation des propriétés physiques, sous la conduite de
ses chefs de projet, Mr M. Carl (DE) et Mme C. Bäckman (FL).
© ISO et FIL 2008 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 20541:2008(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 197:2008(F)
Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur en
nitrates — Méthode par réduction enzymatique et spectrométrie
d'absorption moléculaire après réaction de Griess
AVERTISSEMENT — La présente Norme internationale peut impliquer l'utilisation de produits et la
mise en œuvre de modes opératoires et d'appareillages à caractère dangereux. La présente Norme
internationale n'a pas pour but d'aborder tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Il
incombe à l'utilisateur de la présente Norme internationale d'établir, avant de l'utiliser, des pratiques
d'hygiène et de sécurité et de déterminer l'applicabilité des restrictions réglementaires.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la teneur en nitrates du lait et
des produits laitiers par spectrométrie d'absorption moléculaire après une réaction de Griess (précédée d'une
réduction enzymatique).
Cette méthode s'applique notamment au lait entier, demi-écrémé, écrémé et au lait en poudre; aux fromages
à pâte dure, demi-dure et molle; au fromage fondu, au fromage de lactosérum, aux caséines, aux caséinates,
au lactosérum en poudre et aux concentrés de protéine de lait.
La méthode peut s'appliquer aux teneurs en nitrates équivalentes à une concentration mesurée de la solution
échantillon (après soustraction correspondant au blanc) supérieure à 0,2 mg/l.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 565, Tamis de contrôle — Tissus métalliques, tôles métalliques perforées et feuilles électroformées —
Dimensions nominales des ouvertures
ISO 648, Verrerie de laboratoire — Pipettes à un volume
ISO 835, Verrerie de laboratoire — Pipettes graduées
ISO 1042, Verrerie de laboratoire — Fioles jaugées à un trait
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
teneur en nitrite
fraction massique des composés de nitrite déterminée selon le mode opératoire spécifié dans la présente
Norme internationale
© ISO et FIL 2008 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 20541:2008(F)
FIL 197:2008(F)
3.2
teneur en nitrate
fraction massique des composés de nitrate déterminée selon le mode opératoire spécifié dans la présente
Norme internationale
−
NOTE La teneur en nitrate est exprimée en fraction massique, en milligrammes d'ion nitrate (NO ) par kilogramme
3
de produit.
4 Principe
Une prise d'essai est dispersée dans l'eau chaude. Les matières grasses et les protéines sont éliminées soit
par précipitation de Carrez et filtration, soit par ultrafiltration en utilisant des membranes coniques pour la
centrifugation (voir Notes 1 et 2). Dans une prise du filtrat, le nitrate est réduit en nitrite par une solution de
nitrate réductase. Dans les prises du filtrat non réduit (pour le nitrite) et de la solution réduite (pour le nitrate),
un colorant azoïque rouge-violet est développé en ajoutant de la sulfanilamide et du N-naphtyl-1
éthylènediamine dichlorhydrate, et l'absorbance est mesurée à une longueur d'onde de 540 nm (ou Hg
546 nm). La teneur en nitrite de l'échantillon et la teneur totale en nitrites après réduction du nitrate sont
calculées en comparant les absorbances mesurées avec celles d'un jeu de solutions d'étalonnage de nitrite
de sodium. La teneur en nitrates est calculée par la différence entre ces deux teneurs.
NOTE 1 Les deux modes opératoires relatifs à l'élimination des matières grasses et des protéines sont décrits en 9.2.1
et en 9.2.2.
NOTE 2 Pour le lactosérum en poudre, le lactosérum concentré en protéines et les produits similaires, l'ultrafiltration
est préférée à la précipitation de Carrez, car celle-ci entraîne souvent des problèmes de turbidité et, en conséquence, une
faible fidélité.
NOTE 3 La faible teneur endogène en nitrite n'est pas consignée, mais prise en compte dans la solution à blanc de la
matrice.
5 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, ne contenant ni
nitrate ni nitrite, et de l'eau au moins de qualité 3, conformément à l'ISO 3696, sans nitrate ni nitrite. L'eau
utilisée lors de la préparation des solutions d'enzymes ou de coenzymes doit être fraîchement bidistillée, ou
de pureté équivalente.
5.1 Solution d'hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l.
5.2 Solution de chlorure de sodium, c(NaCI) = 0,9 g/100 ml.
5.3 Acide chlorhydrique ρ (HCl) = 1,19 g/ml.
20
5.4 Solution d'acide chlorhydrique, c(HCI) = 2 mol/l.
Ajouter avec précaution 160 ml d'acide chlorhydrique (5.3) à environ 700 ml d'eau dans une fiole jaugée de
1 000 ml (6.4), tout en agitant régulièrement le contenu. Refroidir le contenu à température ambiante. Diluer
au trait avec de l'eau et mélanger avec précaution.
5.5 Réactifs de Carrez, comme suit:
5.5.1 Réactif de Carrez I: Solution d'hexacyanoferrate(II) de potassium, c(K [Fe(CN) ],3H O) = 150 g/l.
4 6 2
Dissoudre 15,0 g d'hexacyanoferrate(II) de potassium trihydraté dans de l'eau, dans une fiole jaugée de
100 ml (6.4). Diluer au trait avec de l'eau et mélanger.
2 © ISO et FIL 2008 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 20541:2008(F)
FIL 197:2008(F)
5.5.2 Réactif de Carrez II: Solution de sulfate de zinc, c(ZnSO ,7H O) = 300g/l.
4 2
Dissoudre 30,0 g de sulfate de zinc heptahydraté dans de l'eau, dans une fiole jaugée de 100 ml (6.4). Diluer
au trait avec de l'eau et mélanger.
5.6 Solutions étalons, comme suit:
5.6.1 Solution mère de nitrite de sodium (NaNO ).
2
Peser précisément (75,0 ± 0,1) mg de nitrite de sodium préséché (à 102 °C pendant 2 h), dans une fiole
jaugée de 100 ml. Dissoudre dans une quantité d'eau suffisante. Diluer au trait avec de l'eau et mélanger. La
solution mère de nitrite obtenue contient 500 mg de nitrite par litre.
Préparer des solutions d'étalonnage en diluant la solution mère avec de l'eau pour obtenir des concentrations
en nitrite comprises entre 0,05 mg/l et 5,0 mg/l.
À température ambiante, la solution mère de nitrite de sodium reste stable pendant une journée.
5.6.2 Solution mère de nitrate de potassium (KNO ).
3
Peser précisément (81,5 ± 0,1) mg de nitrate de potassium préséché (à 102 °C pendant 2 h) dans une fiole
jaugée de 100 ml. Dissoudre dans une quantité d'eau suffisante. Diluer au trait avec de l'eau et mélanger. La
solution mère de nitrate obtenue contient 500 mg de nitrate par litre.
Préparer des solutions d'étalonnage en diluant la solution mère avec de l'eau pour obtenir des concentrations
en nitrate comprises entre 0,05 mg/l et 5,0 mg/l.
À une température de 4 °C, la solution mère de nitrate de potassium reste stable pendant une semaine.
5.7 Solution tampon de phosphate de potassium, pH = 7,5.
Peser précisément (57,6 ± 0,1) mg d'hydrogénophosphate de dipotassium (K HPO ,3H O) dans une fiole
2 4 2
jaugée de 100 ml. Dissoudre dans une quantité d'eau suffisante. Diluer au trait avec de l'eau et mélanger.
Peser précisément (17,0 ± 0,1) mg de dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ) dans une fiole jaugée
2 4
de 50 ml. Dissoudre dans une quantité d'eau suffisante. Diluer au trait avec de l'eau et mélanger.
Utiliser un pH-mètre (6.18) pour ajuster le pH de la solution d'hydrogénophosphate de dipotassium à un
pH = 7,5, par addition de solution de dihydrogénophosphate de potassium.
À une température de 4 °C, la solution reste stable pendant deux semaines.
5.8 Solution NADPH/FAD.
Dans une fiole jaugée de 25 ml, peser précisément (5,6 ± 0,1) mg de sel de tétrasodium 3-nicotinamide-
adénine dinucléotide phosphate réduit (β-NADPH-Na , fraction massique d'au moins 98 %) et (80,0 ± 0,1) mg
4
de sel de disodium flavine-adénine dinucléotide (FAD-Na , fraction massique d'au moins 88 %).
2
Dissoudre dans une quantité appropriée de solution tampon de phosphate de potassium (5.7). Diluer au trait
avec la solution tampon (5.7) et mélanger.
Préparer la solution NADPH/FAD extemporanément.
5.9 Solution de nitrate réductase (NR).
Peser 65 mg de nitrate réductase (NR) d'Aspergillus niger (CE 1.6.6.2, lyophilisat contenant environ
0,4 U/mg) dans un tube jaugeur de 10 ml. Ajouter 5 ml d'eau et mélanger.
À une température de 4 °C, la solution de nitrate réductase reste stable pendant deux semaines.
© ISO et FIL 2008 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 20541:2008(F)
FIL 197:2008(F)
5.10 Réactifs de couleur, comme suit:
5.10.1 Solution I du réactif de couleur: Sulfanilamide (NH C H SO NH ).
2 6 4 2 2
Peser 400 mg de sulfanilamide dans une fiole jaugée de 50 ml (6.4). Dissoudre dans la solution d'acide
chlorhydrique (5.4), en chauffant dans un bain d'eau si nécessaire.
Refroidir la solution à température ambiante. Diluer au trait avec la solution d'acide chlorhydrique (5.4) et
mélanger. Si nécessaire, filtrer la solution obtenue.
À une température de 4 °C, la solution I du réactif de couleur reste stable pendant quatre semaines.
5.10.2 Solution II du réactif de couleur: N-naphtyl-1 éthylènediamine dichlorhydrate
(C H NHCH CH NH ,2HCI).
10 7 2 2 2
Peser 50 mg de N-naphtyl-1 éthylènediamine dichlorhydrate dans une fiole jaugée de 50 ml (6.4). Dissoudre
dans une quantité d'eau suffisante.
Diluer au trait avec de l'eau et mélanger. Si nécessaire, filtrer la solution obtenue.
À une température de 4 °C, la solution II du réactif de couleur reste stable pendant quatre semaines.
5.11 Des kits de réactifs sont également disponibles dans le commerce. Suivre soigneusement les
instructions de la présente Norme internationale lors de l'utilisation de ces kits (en particulier dans le cas de
5.8).
6 Appareillage
Nettoyer soigneusement toute la verrerie et rincer avec de l'eau de manière qu'il ne reste ni nitrate ni nitrite.
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit:
6.1 Balance analytique, capable de peser à 0,1 mg près.
6.2 Récipient pour échantillon, fourni avec un couvercle hermétique.
6.3 Fioles coniques, de capacité 100 ml, 500 ml et 1 000 ml, munis de bouchons en verre rodé.
6.4 Fioles jaugées, de capacité nominale 25 ml, 50 ml, 100 ml et 1 000 ml conformes aux exigences de
l'ISO 1042, classe A.
6.5 Pipettes, de capacité 1 ml, 2 ml, 5 ml et 10 ml, conformes aux exigences de l'ISO 648, classe A, ou de
l'ISO 835. Le cas échéant, il est possible de remplacer les pipettes par des burettes.
6.6 Pipettes graduées, de type à écoulement partiel, pour essais avec enzymes.
6.7 Éprouvettes graduées, de capacité 20 ml et 50 ml.
6.8 Béchers, de capacité 20 ml et 50 ml.
6.9 Centrifugeuse, munie d'un dispositif de refroidissement, produisant une accélération des godets de la
centrifugeuse (6.10) et des membranes coniques (6.21) de 3 000g.
6.10 Godets pour centrifugeuse, de diamètre 15 mm.
6.11 Filtre à membrane, ayant une porosité de 0,45 µm, à utiliser avec une seringue.
6.12 Entonnoir en verre, de diamètre approprié.
6.13 Spectromètre, permettant de mesurer l'absorbance à une longueur d'onde de 540 nm, ou photomètre
à raie spectrale muni d'une lampe à mercure et d'un filtre, permettant de mesurer l'absorbance à une
longueur d'onde de 546 nm.
4 © ISO et FIL 2008 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 20541:2008(F)
FIL 197:2008(F)
6.14 Cuves optiques, de type semi-micro (récipients jetables ou en verre) et dont le parcours optique est
égal à 1 cm.
6.15 Broyeur, pour broyer l'échantillon pour essai si nécessaire. Pour éviter toute perte d'humidité, le
broyeur ne doit pas entraîner une production excessive de chaleur.
6.16 Tamis de contrôle, en tissu métallique, de diamètre 200 mm et de dimension nominale d'ouverture
500 µm; muni d'un récepteur conforme aux exigences de l‘ISO 565.
6.17 Agitateur magnétique.
6.18 Appareil de mesure du pH, composé d'un pH-mètre et d'électrodes de verre/de référence, permettant
de mesurer à une température de 20 °C.
6.19 Bain d'eau, muni d'un agitateur, réglable à (70 ± 0,5) °C.
6.20 Plaque chauffante.
6.21 Membrane conique, 5 000 MWCO, de capacité 4 ml, pour l'ultrafiltration et la centrifugation de la
solution échantillon.
7 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
méthode d'échantillonnage recommandée est indiquée dans l'ISO 707⎪FIL 50.
Il convient que le laboratoire reçoive un échantillon parfaitement représentatif, n'ayant pas été endommagé ou
modifié lors du transport ou du stockage.
Conserver les échantillons pour essai de façon à éviter toute détérioration et modification de la composition.
8 Préparation de l'échantillon pour essai
8.1 Lait en poudre, lactosérum en poudre, concentrés de protéines de lait
Transférer l'échantillon pour essai dans un récipient (6.2) dont la capacité est d'environ deux fois supérieure
au volume de l'échantillon pour essai. Fermer immédiatement le récipient. Mélanger soigneusement
l'échantillon pour essai en agitant de manière répétée et en retournant le récipient.
8.2 Caséines et caséinates
8.2.1 Mélanger soigneusement l'échantillon pour essai, si nécessaire, après avoir transféré tout l'échantillon
dans un récipient (6.2) d'une capacité appropriée, en agitant de manière répétée et en retournant le récipient.
8.2.2 Transférer 50 g de l'échantillon pour essai sur le tamis de contrôle (6.16). Si la prise de 50 g passe
complètement, ou bien si elle passe à travers le tamis dans sa quasi-totalité, passer la totalité de l'échantillon
pour essai mélangé (8.2.1), à travers le tamis. Si l'échantillon pour essai ne passe pas complètement à
travers le tamis, utiliser le broyeur (6.15) afin de s'assurer qu'il passe.
Transférer immédiatement la totalité de l'échantillon pour essai tamisé dans un récipient (6.2). Mélanger
soigneusement dans le récipient fermé. Au cours de ces différentes étapes, veiller à éviter toute variation de
la teneur en eau du produit.
Après avoir préparé l'échantillon pour essai, commencer dès que possible la préparation de la prise d'essai
(voir 9.1)
© ISO et FIL 2008 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 20541:2008(F)
FIL 197:2008(F)
8.3 Fromage
8.3.1 Avant l'analyse, enlever la croûte ou la surface moisie de l'échantillon pour essai afin que l'échantillon
pour essai soit représentatif des fromages consommés d'ordinaire.
8.3.2 Broyer l'échantillon pour essai avec un broyeur (6.15). Mélanger rapidement la masse moulue, puis
broyer une deuxième fois si possible et mélanger de nouveau soigneusement. Nettoyer le broyeur après le
broyage de chaque échantillon. Si l'échantillon pour essai ne peut pas être broyé, le mélanger soigneusement
par agitation et malaxage approfondis.
8.3.3 Après broyage, transférer dès que possible l'échantillon pour essai dans un récipient hermétique (6.2)
en attendant la détermination qu'il convient de réaliser, de préférence sans délai. Dans le cas contraire,
prendre toutes les précautions nécessaires pour garantir la bonne conservation de l'échantillon pour essai et
pour empêcher la condensation d'humidité sur la surface intérieure du récipient.
8.3.4 Ne pas utiliser de fromage broyé présentant un développement de moisissure ou un début de
détérioration.
8.4 Fromage de lactosérum
Préparer l'échantillon pour essai comme spécifié en 8.3.2.
9 Mode opératoire
9.1 Préparation de la prise d'essai
9.1.1 Lait
Peser, à 0,1 mg près, environ 10 g à 15 g de l'échantillon pour essai. Transférer la prise d'essai
quantitativement dans une fiole conique de 100 ml (6.3). Ajouter progressivement 50 ml d'eau bouillante.
Agiter le mélange dans un bain d'eau (6.19) maintenu à 70 °C, pendant 15 min.
9.1.2 Lait en poudre, lactosérum en poudre, caséines, caséinates et concentrés de protéines de lait
Peser, à 0,1 mg près, environ 2,0 g à 2,5 g de l'échantillon pour essai (voir 8.1 ou 8.2). Transférer la prise
d'essai quantitativement dans une fiole conique de 100 ml (6.3). Ajouter progressivement 50 ml d'eau
bouillante.
Agiter le mélange dans un bain d'eau (6.19) maintenu à 70 °C, pendant 15 min.
9.1.3 Fromage, fromage fondu et fromage de lactosérum
Peser, à 0,1 mg près, environ 3 g de l'échantillon d'essai (voir 8.3 ou 8.4). Mélanger soigneusement la prise
d'essai avec 15 ml d'eau, en utilisant par exemple une baguette de verre, jusqu'à l'obtention d'un mélange
sans aucun grumeau. Transférer quantitativement le mélange dans une fiole conique de 100 ml (6.3). Ajouter
progressivement 30 ml d'eau à 70 °C.
Agiter le mélange dans un bain d'eau (6.19) maintenu à 70 °C, pendant 15 min.
9.2 Élimination des matières grasses et des protéines
9.2.1 Par précipitation et filtration de Carrez
Refroidir la prise d'essai préparée (voir 9.1.1, 9.1.2 ou 9.1.3) à température ambiante. Ajouter, dans l'ordre
suivant, tout en remuant ou en agitant soigneusement avec l'agitateur magnétique (6.17), pendant et après
6 © ISO et FIL 2008 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 20541:2008(F)
FIL 197:2008(F)
chaque ajout: 5 ml de réactif de Carrez I (5.5.1) et 5 ml de réactif Carrez II (5.5.2). Ajuster le pH à (8,0 ± 0,1)
en utilisant la solution d'hydroxyde de sodium (5.1).
Transférer quantitativement la suspension dans une fiole jaugée de 100 ml (6.4). Diluer au trait avec de l'eau
et mélanger avec soin. Transférer une partie aliquote dans un godet de centrifugeuse (6.10) et placer le godet
dans la centrifugeuse (6.9). Centrifuger à une accélération centrifuge de 3 000g et à une température de
20 °C pendant 15 min.
Rincer une membrane filtrante (6.11) avec 5 ml de solution de chlorure de sodium (5.2), puis avec 5 ml d'eau.
Filtrer le liquide surnageant après la centrifugation sur la membrane filtrante nettoyée (6.11). Rejeter les
quelques premiers millilitres et utiliser le reste du filtrat pour la détermination (voir 9.4).
Il est primordial d'obtenir un filtrat clair dans le temps spécifié. Si ce n'est pas le cas, (par exemple pour
l'analyse de fromages à pâte fermentée), utiliser un volume plus important de chaque réactif de précipitation
(5.5.1 et 5.5.2) et réduire en conséquence le volume d'eau chaude utilisé en 9.1.
9.2.2 Par ultrafiltration
Au lieu de précipiter les matières grasses et les protéines par les réactifs de Carrez I et II (voir 9.2.1),
l'ultrafiltration de la prise d'essai, sur mem
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.