ISO 11866-1:1997
(Main)Milk and milk products — Enumeration of presumptive Escherichia coli — Part 1: Most probable number technique
Milk and milk products — Enumeration of presumptive Escherichia coli — Part 1: Most probable number technique
Relates to a method for the enumeration of presumptive Escherichia coli by means of the culture technique involving a liquid medium, and calculation of the number of Escherichia coli per gram or per millilitre by the most probable number (MPN) after incubation at 37 °C.
Lait et produits laitiers — Dénombrement d'Escherichia coli présumés — Partie 1: Technique du nombre le plus probable
La présente partie de l'ISO 11866 prescrit une méthode pour le dénombrement d'Escherichia coli présumés, au moyen de la technique de culture en milieu liquide et calcul du nombre d'Escherichia coli par gramme ou par millilitre, par la technique du nombre le plus probable (NPP) après incubation à 37 °C puis à 44 °C. Cette méthode est applicable aux -- lait et produits laitiers liquides; -- lait sec, lactosérum sucré sec, babeurre sec et lactose; -- caséine acide, caséine lactique et caséine présure; - caséinates et lactosérum acide sec; -- fromage et fromages fondus; -- beurre ; -- produits laitiers congelés (y compris les glaces de consommation); -- crème anglaise, desserts et crème. La méthode prescrite dans la présente partie de l'ISO 11866 est la méthode recommandée pour les échantillons supposés contenir un nombre relativement faible d'Escherichia coli présumés (moins de 100 par gramme ou 10 par millilitre). ATTENTION -- Certaines espèces pathogènes d'Escherichia coli ne se développent pas à 44 °C. Les possibilités d'application de la présente partie de l'ISO 11866 sont limitées du fait que cette méthode est sujette à de grandes variations. Il est recommandé d'appliquer cette méthode et d'interpréter les résultats à la lumière des renseignements donnés à l'article 12.
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
IS0
INTERNATIONAL
11866-I
STANDARD
First edition
1997-02-I 5
Milk and milk products - Enumeration of
presumptive Escherichia co/i -
Part 1:
Most probable number technique
Lait et prod&s laitiers - Dknombrement d’Escherichia coli p&urn& -
Pariie I: Technique du nombre le plus probable
Reference number
IS0 11866-l :I 997(E)
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IS0 11866-l : 1997(E)
Foreword
IS0 (the Internationa .I Organization for Standardization) is a worldwide federation of nationa ,I standards bodies (IS0
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through IS0 technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. IS0 collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
This part of IS0 11866 was prepared by Technical Committee ISOnC 34, Agricultural food products, Subcommittee
SC 5, Milk and milk products, in collaboration with the International Dairy Federation (IDF) and AOAC
INTERNATIONAL, and will also be published by these organizations.
IS0 11866 consists of the following parts, under the general title Milk and milk products - Enumeration of
presumptive Escherichia coli:
Par? I: Most probable number technique
-
- Part 2: Most probable number technique using 4-methylumbelliferyl-P-D-glucuronide (MUG)
- Part 3: Colony-count technique at 44 “C using membranes
The method specified in IS0 11866-I is preferred for samples in which comparatively low numbers of Escherichia
co/i are suspected.
Annex A forms an integral part of this part of IS0 11866. Annex B is for information only.
0 IS0 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
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Internet central @ iso.ch
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Printed in Switzerland
ii
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INTERNATIONAL STANDARD @ IS0 IS0 11866-l : 1997(E)
Milk and milk products - Enumeration of presumptive Escherichia
co/i -
Part 1:
Most probable number technique
1 Scope
This part of IS0 11866 specifies a method for the enumeration of presumptive Escherichia co/; by means of the
culture technique involving a liquid medium, and calculation of the number of presumptive Escherichia co/; per gram
or per millilitre by the most probable number (MPN) technique after incubation at 37 *C then incubation at 44 *C.
The method is applicable to
- milk, liquid milk products;
- dried milk, dried sweet whey, dried buttermilk, lactose;
- acid casein, lactic casein and rennet casein;
- caseinate and dried acid whey;
- cheese and processed cheese;
- butter;
- frozen milk products (including edible ices);
- custard, desserts and cream.
The method specified in this part of IS0 11866 is preferred for samples in which comparatively low numbers of
presumptive Escherichia co/i (less than 100 per gram or IO per millilitre) are suspected.
CAUTION - Some Escherichia co/; pathogenic species do not grow at 44 “C. The applicability of this part of
IS0 11866 is limited by the susceptibility of the method to a large degree of variability. The method should,
therefore, be used and the results interpreted in the light of the information given in clause 12.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this part of
IS0 11866. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to revision, and
parties to agreements based on this part of IS0 11866 are encouraged to investigate the possibility of applying the
most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and IS0 maintain registers of currently valid
International Standards.
IS0 7218: 1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for microbiological examina Cons.
1
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0 IS0
IS0 11866-l :1997(E)
IS0 8261: I 989; Milk and milk products - Preparation of test samples and dilutions for microbiological examination.
3 Definition
For the purposes of this part of IS0 11866, the following definition applies.
3.1 presumptive fscherichia co/i: Bacteria which at 44 “C cause fermentation of lactose with the production of
gas, and which at 44 *C produce indole from tryptophan, when the test is carried out in accordance with the method
specified in this part of IS0 11866.
4 Principle
4.1 Inoculation of three tubes of double-strength liquid selective enrichment medium [5.3.1 .I a)] with a specified
quantity of test sample if the initial product is liquid, or with a specified quantity of the initial suspension in the case
of other products.
4.2 Inoculation of three tubes of single-strength liquid selective enrichment medium [5.3.1 .I b)] with a specified
quantity of test sample if the initial product is liquid, or with a specified quantity of the initial suspension in the case
of other products.
Then, under the same conditions, i noculation of single- streng th medium [5.3.1 b)] with decimal dil utions of the test
sampl e or of the initial suspension.
4.3 Incubation of the tubes of double- and single-strength medium at 37 “C for 24 h to 48h. Examination of the
tubes for gas formation.
44 . Inoculation, fro m the tubes of double- and single-strength medium which have given rise to gas formation, of a
new series of tubes contai ning the second selective medium (5.3.2).
4.5 Incubation at 44 *C for 24 h to 48 h and examination of the new series of tubes (4.4) for gas formation.
. Inoculation, from the tubes of liquid selective medium (4.5) which have given rise to gas formation, of a new
46
series of tubes containing tryptone water (5.4).
4.7 Incubation at 44 *C for 24 h to 48 h and examination of this new series of tubes (4.6) for indole production.
4.8 Identification of those tubes inoculated originally in 4.1 and/or 4.2, which show in step 4.5 production of gas
from the second selective medium at 44 *C and in step 4.7 formation of indole from tryptone water at 44 “C, as
being positive for presumptive Escherichia co/i.
4.9 Determination of the MPN index from the numbers of positive tubes (4.8) of selected dilutions by means of an
MPN table (annex A) and calculation of the most probable number (MPN) of presumptive Escherichia co/i per gram
or per millilitre of the original sample.
5 Dilution fluid, culture media and reagent
5.1 General
For current laboratory practice, see IS0 7218 and IS0 8261.
If the prepared culture media and reagents are not used immediately, they shall, unless otherwise stated, be stored
in the dark at a temperature between 0 *C and +5 “C for no longer than 1 month, under conditions which do not
produce any change in their composition.
5.2 Dilution fluid
See IS0 8261.
2
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0 IS0 IS0 118664 : 1997(E)
5.3 Culture media
5.3.1 Lauryl sulfate tryptose broth (selective enrichment medium)
5.3.1 .l Composition
a) b)
Double-strength medium Single-strength medium
Tryptone
4090 g 2090 g
Lactose
IO,0 g 590 g
Dipotassium hydrogen phosphate (K,HPO,)
595 g 2775 g
Potassium dihydrogen phosphate (KH,PO,) 55 g 275 g
Sodium chloride
IO,0 g 50 g
Sodium lauryl sulfate [CH,(CH,),,OSO,Na]
02 g 091 g
Water 1000 ml 1000 ml
5.3.1.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water, by heating if necessary.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is 6,8 at 25 “C.
Transfer the media in quantities of 10 ml to tubes of dimensions 16 mm x 160 mm (6.2) containing inverted Durham
tubes (6.3) in the case of single-strength medium, and to test tubes of dimensions 20 mm x 200 mm (6.2) containing
inverted Durham tubes (6.3) in the case of the double-strength medium.
Sterilize for 15 min in the autoclave (6.1) set at 121 “C.
The inverted Durham tubes shall not contain air bubbles after sterilization.
5.3.2 EC broth (second selective medium)
5.3.2.1 Components
Tryptose or trypticase
20,o g
Lactose
50 g
Bile salts (No. 3)‘)
195 g
Dipotassium hydrogen phosphate (K,HPO,) 470 g
Potassium dihydrogen phosphate (KH,PO,,)
13 g
Sodium chloride
50 g
1 000 ml
Water
1) See reference [3].
5.3.2.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water, by heating if necessary.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is 6,8 at 25 “C.
Transfer the medium in quantities of 10 ml to test tubes of dimensions 16 mm x 160 mm (6.2) containing inverted
Durham tubes (6.3).
Sterilize for 15 min in the autoclave (6.1) set at 121 “C.
The inverted Durham tubes shall not contain air bubbles after sterilization.
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0 IS0
IS0 11866-l : 1997(E)
5.4 Tryptone water
5.4.1 Components
Tryptone
1070 g
Sodium chloride
50 g
Water 1 000 ml
5.4.2 Preparation
Dissolve the components in the water, by heating if necessary.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is 7,3 at 20 “C.
Dispense the medium in quantities of 5 ml to 10 ml into tubes of dimensions 16 mm x 160 mm (6.2).
Sterilize for 15 min in the autoclave (6.1) set at 121 “C.
5.5 lndole reagent (Kovacs reagent)
5.5.1 Composition
4-Dimethylaminobenzaldehyde
590 g
75,0 ml
2-Methylbutan-l-01 or pentan-l-01
25,0 ml
Hydrochloric acid (p,, 1 ,I 8 g/ml to 1 ,I 9 g/ml)
5.5.2 Preparation
Dissolve the 4-dimethylaminobenzaldehyde in the alcohol by heating gently to between 50 “C and 55 “C by means
of the water bath (6.5).
Cool and add the hydrochloric acid.
Protect from light and store at approximately 4 “C.
The colour of the reagent shall be light yellow to light brown
6 Apparatus and glassware
For general requirements, see IS0 7218 and IS0 8261. Glassware shall be resistant to repeated sterilization.
Usual microbiological laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 Autoclave, capable of operating at 121 “C + 1 “C.
For details, see IS0 7218.
6.2 Test tubes, of dimensions approximately 16 mm x 160 mm and 20 mm x 200 mm, or flasks or bottles of
suitable capacity.
6.3 Durham tubes, of size suitable for use in the test tubes (6.2).
6.4 Water bath, capable of operating at 44 “C k- 0,5 “C.
6.5 Water bath, capable of operating at between 50 “C and 55 “C.
6.6 Incubator, capable of maintaining a temperature of 37 “C + 1 “C at all points within it.
4
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IS0 11866-I :1997(E)
6.7 Loops, made of platinum/iridium or nickel/chromium or plastic, approximately
3 mm in diameter, or sterile
disposable bags.
6.8 pH-meter, accurate to within * 0,l pH units at 25 “C.
6.9 Total-delivery pipettes, with nominal capacities of 1 ml and 10 ml.
7 Sampling
which is truly representative and has not
It is important that the laboratory receive a sample
been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this part of IS0 11866. A recommended sampling method i
...
NORME
ISO
INTERNATIONALE
118664
Première édition
1997-02- 15
Lait et produits laitiers - Dénombrement
d’Escherichia coli présumés -
Partie 1:
Technique du nombre le plus probable
Milk and milk products - Enumeration ofpresumptive Escherichia coli -
Part 1: Most probable number technique
Numéro de référence
ISO 11866-l :1997(F)
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ISO 11866-l :1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 118664 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec la Fédération internationale de laiterie
(FIL) et I’AOAC INTERNATIONAL et sera également publiée par ces organisations.
L’ISO 11866 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait et produits laitiers -
Dénombrement d’Escherichia coli présumés:
Partie 1: Technique du nombre le plus probable
- Pariie 2: Technique du nombre le plus probable avec utilisation de 4-méthylumbelliféryl-/l-D-glucuronide
(Mw
Partie 3: Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes à 44 “C
La méthode prescrite dans I’ISO 11866-l est particulièrement applicable aux échantillons supposés contenir un
nombre relativement faible d’kcherichia coli présumés.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente partie de I’ISO 11866. L’annexe B est donnée uniquement à titre
d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
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Imprimé en Suisse
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NORME INTERNATIONALE @ ISO ISO 118664 : 1997(F)
Lait et produits laitiers - Dénombrement d’Escherichia coli
présumés
Partie 1:
Technique du nombre le plus probable
1 Domaine d’application
La présente partie de I’ISO 11866 prescrit une méthode pour le dénombrement d’Escherichia Co/i présumés, au
moyen de la technique de culture en milieu liquide et calcul du nombre d’Escherichia Co/i par gramme ou par
millilitre, par la technique du nombre le plus probable (NPP) après incubation à 37 “C puis à 44 OC.
Cette méthode est applicable aux
- lait et produits laitiers liquides;
lait sec, lactosérum sucré sec, babeurre sec et lactose;
-
- caséine acide, caséine lactique et caséine présure;
- caséinates et lactosérum acide sec;
- fromage et fromages fondus;
- beurre;
- produits laitiers congelés (y compris les glaces de consommation);
- crème anglaise, desserts et crème.
La méthode prescrite dans la présente partie de I’ISO II 866 est la méthode recommandée pour les échantillons
supposés contenir un nombre relativement faible d’fscherichia coli présumés (moins de 100 par gramme ou 10 par
millilitre).
ATTENTION - Certaines espèces pathogènes d’kcherichia Co/i ne se développent pas à 44 “C. Les possibilités
d’application de la présente partie de I’ISO 11866 sont limitées du fait que cette méthode est sujette à de grandes
variations. II est recommandé d’appliquer cette méthode et d’interpréter les résultats à la lumière des
renseignements donnés à l’article 12.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de I’ISO II 866. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de I’ISO II 866 sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
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0 ISO
ISO 11866-l :1997(F)
ISO 7218: 1996, Microbiologie des aliments - Règles générales pour les examens microbiologiques.
Préparation des échantillons pour essai et des dilutions en vue de
ISO 82613 989, Lait et produits laitiers -
l’examen microbiologique.
3 Définitions
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO II 866, la définition suivante s’applique.
31 Escherichia coli présumés:
Bactéries qui, à 44 OC, fermentent le lactose avec production de gaz et qui, à 44 OC, produisent de I’indole à partir
du tryptophane, dans les conditions prescrites dans la présente partie de I’ISO 11866.
4 Principe
4.1 Ensemencement de trois tubes de milieu sélectif liquide d’enrichissement double concentration [voir 53.1 .l a)]
avec une quantité déterminée de l’échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou avec une quantité
déterminée de suspension mère dans le cas d’autres produits.
4.2 Ensemencement de trois tubes de milieu sélectif liquide d’enrichissement simple concentration [voir 5.3.1.1 b)]
avec une quantité déterminée de l’échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou avec une quantité
déterminée de suspension mère dans le cas d’autres produits.
Puis, dans les mêmes conditions, ensemencement du milieu simple concentration C5.3.1 b)] avec des dilutions
décimales de l’échantillon pour essai ou de la suspension mère.
4.3 Incubation des tubes de milieu double ou simple concentration à 37 “C pendant 24 h à 48 h. Examen des
tubes pour la formation de gaz.
4.4 Ensemencement, à partir des tubes de milieu double ou simple concentration ayant donné lieu à un
dégagement gazeux, d’une nouvelle série de tubes contenant le second milieu sélectif (5.3.2).
4.5 Incubation à 44 “C pendant 24 h à 48 h et examen de cette nouvelle série de tubes (4.4) pour la formation de
.
gaz
4.6 Ensemencement, à partir des tubes contenant le milieu sélectif liquide (4.5) ayant donné lieu à un dégagement
gazeux, d’une nouvelle série de tubes contenant de l’eau tryptonée (5.4).
4.7 Incubation à 44 OC pendant 24 h à 48 h et examen de cette nouvelle série de tubes (4.6) pour la formation
d’indole.
4.8 Identification comme étant positifs pour Escherichia coli présumés, des tubes préalablement ensemencés en
4.1 et/ou 4.2, présentant une formation de gaz en 4.5, à partir du second milieu sélectif à 44 “C, et une formation
d’indole en 4.7, à partir de l’eau tryptonée à 44 “C.
4.9 Détermination du coefficient NPP d’après le nombre de tubes positifs (4.8) de dilutions choisies, au moyen
d’une table NPP (voir l’annexe A) et calcul du nombre le plus probable (NPP) d’Escherichia coli présumés par
gramme ou par millilitre d’échantillon original.
5 Diluant, milieu de culture et réactif
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoires, voir I’ISO 7218 et I’ISO 8261.
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0 ISO ISO 11866-l : 1997(F)
Si les milieux de culture et les réactifs préparés ne sont pas utilisés extemporanément, ils doivent, sauf indications
contraires, être conservés à l’obscurité à une température située entre 0 “C et + 5 OC pendant 1 mois au maximum,
dans des conditions évitant toute modification de leur composition.
5.2 Diluant
Voir I’ISO 8261.
5.3 Milieux de culture
53.1 Bouillon à la tryptose et au lauryl sulfate (milieu sélectif d’enrichissement)
5.3.1 .l Composition
a) b)
Milieu double Milieu simple
concentration concentration
Tryptose
4w g 20’0 g
Lactose
IW g 590 g
Hydrogénophosphate dipotassique (K,HPO,)
5’5 g 2975 g
Dihydrogénophosphate de potassium (KH,PO,)
5s g 2975 g
Chlorure de sodium
10’0 g 570 g
Lauryl sulfate de sodium [CH,(CH,), ,OSOsNa]
092 g 091 g
1 000 ml 1000 ml
Eau
5.3.1.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en chauffant si nécessaire.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 6,8 à 25 OC.
Répartir les milieux, par quantités de 10 ml, dans des tubes de 16 mm x 160 mm (6.2) contenant des cloches de
Durham (6.3) dans le cas du milieu simple concentration, et dans des tubes de 20 mm x 200 mm (6.2) contenant
des cloches de Durham (6.3) dans le cas du milieu double concentration.
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant 15 min.
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de bulles d’air après stérilisation.
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0 ISO
ISO 11866-l : 1997(F)
5.3.2 Bouillon EC (second milieu sélectif)
5.3.2.1 Composition
Tryptose ou trypticase
2090 g
Lactose
50 g
Sels biliaires n”3l)
1s g
Hydrogénophosphate dipotassique (K,HPO,)
490 g
Dihydrogénophosphate de potassium (KH,PO,)
1s g
Chlorure de sodium
5’0 g
1000 ml
Eau
1) Voir la référence [3].
5.3.2.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en chauffant si nécessaire.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 6,8 à 25 OC.
Répartir le milieu, par quantités de 10 ml dans des tubes de 16 mm x 160 mm (6.2) contenant des cloches de
Durham (6.3).
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant 15 min.
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de bulles d’air après stérilisation.
5.4 Eau tryptonée
5.4.1 Composition
Ttyptone
IW g
Chlorure de sodium
50 g
1 000 g
Eau
5.4.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau, en chauffant si nécessaire.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,3 à 25 “C.
Répartir le milieu, par quantités de 5 ml à 10 ml, dans des tubes de 16 mm x 160 mm (6.2).
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant 15 min.
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0 ISO
ISO 118664 : 1997(F)
5.5 Réactif pour la recherche de I’indole (réactif de Kovacs)
5.5.1 Composition
Diméthylamino-4 benzaldéhyde
590 g
75,0 ml
Méthyl-2 butanol-l ou pentanol-1
250 ml
Acide chlorhydrique (pZO = 1,18 g/ml à 1,19 g/ml)
5.52 Préparation
Dissoudre le diméthylamino-4 benzaldéhyde dans l’alcool en chauffant doucement entre 50 “C et 55 OC au moyen
du bain d’eau (6.5).
Refroidir et ajouter l’acide chlorhydrique.
Mettre à l’abri de la lumière et conserver à environ 4 OC.
Le réactif doit être de couleur jaune clair à brun clair.
6 Appareillage et verrerie
Voir NS0 7218 et I’ISO 8261 pour les spécifications générales. La verrerie doit résister à des stérilisations répétées.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Autoclave, réglable à 121 “C + 1 OC.
Pour plus de détails, voir NS0 7218.
6.2 Tubes à essais, d’environ 16 mm x 160 mm et 20 mm x 200 mm, ou fioles ou flacons de capacités
appropriées.
6.3 Cloches de Durham, de dimensions appropriées en vue de leur utilisation dans les tubes à essais (6.2).
6.4 Bain d’eau, réglable à 44 “C + 0,5 OC.
6.5 Bain d’eau, réglable entre 50 “C et 55 OC.
6.6 Étuve, permettant de maintenir une température de 37 OC If: 1 OC en tous points.
6.7 Anses bouclées, en platine iridié ou en nickel-chrome ou en matière plastique, d’environ 3 mm de diamètre,
ou sacs jetables stériles.
6.8 pH-mètre, précis à -F: 0,l unité de pH à 25 OC.
6.9 Pipettes à écoulement total, de 1 ml et 10 ml de capacités nominales.
7 Échantillonnage
II est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode prescrite dans la présente partie de I’ISO 11866. Une méthode
d’échantillonnage recommandée est donnée dans NS0 707.
5
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0 ISO
ISO 11866-l : 1997(F)
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformé
...
NORME
ISO
INTERNATIONALE
118664
Première édition
1997-02- 15
Lait et produits laitiers - Dénombrement
d’Escherichia coli présumés -
Partie 1:
Technique du nombre le plus probable
Milk and milk products - Enumeration ofpresumptive Escherichia coli -
Part 1: Most probable number technique
Numéro de référence
ISO 11866-l :1997(F)
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ISO 11866-l :1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 118664 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec la Fédération internationale de laiterie
(FIL) et I’AOAC INTERNATIONAL et sera également publiée par ces organisations.
L’ISO 11866 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait et produits laitiers -
Dénombrement d’Escherichia coli présumés:
Partie 1: Technique du nombre le plus probable
- Pariie 2: Technique du nombre le plus probable avec utilisation de 4-méthylumbelliféryl-/l-D-glucuronide
(Mw
Partie 3: Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes à 44 “C
La méthode prescrite dans I’ISO 11866-l est particulièrement applicable aux échantillons supposés contenir un
nombre relativement faible d’kcherichia coli présumés.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente partie de I’ISO 11866. L’annexe B est donnée uniquement à titre
d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Internet central @ iso.ch
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
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NORME INTERNATIONALE @ ISO ISO 118664 : 1997(F)
Lait et produits laitiers - Dénombrement d’Escherichia coli
présumés
Partie 1:
Technique du nombre le plus probable
1 Domaine d’application
La présente partie de I’ISO 11866 prescrit une méthode pour le dénombrement d’Escherichia Co/i présumés, au
moyen de la technique de culture en milieu liquide et calcul du nombre d’Escherichia Co/i par gramme ou par
millilitre, par la technique du nombre le plus probable (NPP) après incubation à 37 “C puis à 44 OC.
Cette méthode est applicable aux
- lait et produits laitiers liquides;
lait sec, lactosérum sucré sec, babeurre sec et lactose;
-
- caséine acide, caséine lactique et caséine présure;
- caséinates et lactosérum acide sec;
- fromage et fromages fondus;
- beurre;
- produits laitiers congelés (y compris les glaces de consommation);
- crème anglaise, desserts et crème.
La méthode prescrite dans la présente partie de I’ISO II 866 est la méthode recommandée pour les échantillons
supposés contenir un nombre relativement faible d’fscherichia coli présumés (moins de 100 par gramme ou 10 par
millilitre).
ATTENTION - Certaines espèces pathogènes d’kcherichia Co/i ne se développent pas à 44 “C. Les possibilités
d’application de la présente partie de I’ISO 11866 sont limitées du fait que cette méthode est sujette à de grandes
variations. II est recommandé d’appliquer cette méthode et d’interpréter les résultats à la lumière des
renseignements donnés à l’article 12.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de I’ISO II 866. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de I’ISO II 866 sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
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0 ISO
ISO 11866-l :1997(F)
ISO 7218: 1996, Microbiologie des aliments - Règles générales pour les examens microbiologiques.
Préparation des échantillons pour essai et des dilutions en vue de
ISO 82613 989, Lait et produits laitiers -
l’examen microbiologique.
3 Définitions
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO II 866, la définition suivante s’applique.
31 Escherichia coli présumés:
Bactéries qui, à 44 OC, fermentent le lactose avec production de gaz et qui, à 44 OC, produisent de I’indole à partir
du tryptophane, dans les conditions prescrites dans la présente partie de I’ISO 11866.
4 Principe
4.1 Ensemencement de trois tubes de milieu sélectif liquide d’enrichissement double concentration [voir 53.1 .l a)]
avec une quantité déterminée de l’échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou avec une quantité
déterminée de suspension mère dans le cas d’autres produits.
4.2 Ensemencement de trois tubes de milieu sélectif liquide d’enrichissement simple concentration [voir 5.3.1.1 b)]
avec une quantité déterminée de l’échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou avec une quantité
déterminée de suspension mère dans le cas d’autres produits.
Puis, dans les mêmes conditions, ensemencement du milieu simple concentration C5.3.1 b)] avec des dilutions
décimales de l’échantillon pour essai ou de la suspension mère.
4.3 Incubation des tubes de milieu double ou simple concentration à 37 “C pendant 24 h à 48 h. Examen des
tubes pour la formation de gaz.
4.4 Ensemencement, à partir des tubes de milieu double ou simple concentration ayant donné lieu à un
dégagement gazeux, d’une nouvelle série de tubes contenant le second milieu sélectif (5.3.2).
4.5 Incubation à 44 “C pendant 24 h à 48 h et examen de cette nouvelle série de tubes (4.4) pour la formation de
.
gaz
4.6 Ensemencement, à partir des tubes contenant le milieu sélectif liquide (4.5) ayant donné lieu à un dégagement
gazeux, d’une nouvelle série de tubes contenant de l’eau tryptonée (5.4).
4.7 Incubation à 44 OC pendant 24 h à 48 h et examen de cette nouvelle série de tubes (4.6) pour la formation
d’indole.
4.8 Identification comme étant positifs pour Escherichia coli présumés, des tubes préalablement ensemencés en
4.1 et/ou 4.2, présentant une formation de gaz en 4.5, à partir du second milieu sélectif à 44 “C, et une formation
d’indole en 4.7, à partir de l’eau tryptonée à 44 “C.
4.9 Détermination du coefficient NPP d’après le nombre de tubes positifs (4.8) de dilutions choisies, au moyen
d’une table NPP (voir l’annexe A) et calcul du nombre le plus probable (NPP) d’Escherichia coli présumés par
gramme ou par millilitre d’échantillon original.
5 Diluant, milieu de culture et réactif
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoires, voir I’ISO 7218 et I’ISO 8261.
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0 ISO ISO 11866-l : 1997(F)
Si les milieux de culture et les réactifs préparés ne sont pas utilisés extemporanément, ils doivent, sauf indications
contraires, être conservés à l’obscurité à une température située entre 0 “C et + 5 OC pendant 1 mois au maximum,
dans des conditions évitant toute modification de leur composition.
5.2 Diluant
Voir I’ISO 8261.
5.3 Milieux de culture
53.1 Bouillon à la tryptose et au lauryl sulfate (milieu sélectif d’enrichissement)
5.3.1 .l Composition
a) b)
Milieu double Milieu simple
concentration concentration
Tryptose
4w g 20’0 g
Lactose
IW g 590 g
Hydrogénophosphate dipotassique (K,HPO,)
5’5 g 2975 g
Dihydrogénophosphate de potassium (KH,PO,)
5s g 2975 g
Chlorure de sodium
10’0 g 570 g
Lauryl sulfate de sodium [CH,(CH,), ,OSOsNa]
092 g 091 g
1 000 ml 1000 ml
Eau
5.3.1.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en chauffant si nécessaire.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 6,8 à 25 OC.
Répartir les milieux, par quantités de 10 ml, dans des tubes de 16 mm x 160 mm (6.2) contenant des cloches de
Durham (6.3) dans le cas du milieu simple concentration, et dans des tubes de 20 mm x 200 mm (6.2) contenant
des cloches de Durham (6.3) dans le cas du milieu double concentration.
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant 15 min.
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de bulles d’air après stérilisation.
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0 ISO
ISO 11866-l : 1997(F)
5.3.2 Bouillon EC (second milieu sélectif)
5.3.2.1 Composition
Tryptose ou trypticase
2090 g
Lactose
50 g
Sels biliaires n”3l)
1s g
Hydrogénophosphate dipotassique (K,HPO,)
490 g
Dihydrogénophosphate de potassium (KH,PO,)
1s g
Chlorure de sodium
5’0 g
1000 ml
Eau
1) Voir la référence [3].
5.3.2.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en chauffant si nécessaire.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 6,8 à 25 OC.
Répartir le milieu, par quantités de 10 ml dans des tubes de 16 mm x 160 mm (6.2) contenant des cloches de
Durham (6.3).
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant 15 min.
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de bulles d’air après stérilisation.
5.4 Eau tryptonée
5.4.1 Composition
Ttyptone
IW g
Chlorure de sodium
50 g
1 000 g
Eau
5.4.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau, en chauffant si nécessaire.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,3 à 25 “C.
Répartir le milieu, par quantités de 5 ml à 10 ml, dans des tubes de 16 mm x 160 mm (6.2).
Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 “C pendant 15 min.
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0 ISO
ISO 118664 : 1997(F)
5.5 Réactif pour la recherche de I’indole (réactif de Kovacs)
5.5.1 Composition
Diméthylamino-4 benzaldéhyde
590 g
75,0 ml
Méthyl-2 butanol-l ou pentanol-1
250 ml
Acide chlorhydrique (pZO = 1,18 g/ml à 1,19 g/ml)
5.52 Préparation
Dissoudre le diméthylamino-4 benzaldéhyde dans l’alcool en chauffant doucement entre 50 “C et 55 OC au moyen
du bain d’eau (6.5).
Refroidir et ajouter l’acide chlorhydrique.
Mettre à l’abri de la lumière et conserver à environ 4 OC.
Le réactif doit être de couleur jaune clair à brun clair.
6 Appareillage et verrerie
Voir NS0 7218 et I’ISO 8261 pour les spécifications générales. La verrerie doit résister à des stérilisations répétées.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Autoclave, réglable à 121 “C + 1 OC.
Pour plus de détails, voir NS0 7218.
6.2 Tubes à essais, d’environ 16 mm x 160 mm et 20 mm x 200 mm, ou fioles ou flacons de capacités
appropriées.
6.3 Cloches de Durham, de dimensions appropriées en vue de leur utilisation dans les tubes à essais (6.2).
6.4 Bain d’eau, réglable à 44 “C + 0,5 OC.
6.5 Bain d’eau, réglable entre 50 “C et 55 OC.
6.6 Étuve, permettant de maintenir une température de 37 OC If: 1 OC en tous points.
6.7 Anses bouclées, en platine iridié ou en nickel-chrome ou en matière plastique, d’environ 3 mm de diamètre,
ou sacs jetables stériles.
6.8 pH-mètre, précis à -F: 0,l unité de pH à 25 OC.
6.9 Pipettes à écoulement total, de 1 ml et 10 ml de capacités nominales.
7 Échantillonnage
II est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode prescrite dans la présente partie de I’ISO 11866. Une méthode
d’échantillonnage recommandée est donnée dans NS0 707.
5
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0 ISO
ISO 11866-l : 1997(F)
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformé
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Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.