Soil quality — Effects of pollutants on earthworms — Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations

ISO 11268-3: 2014 specifies techniques for determining the effects of substances on earthworms in the field and provides a basis for determining the effects of chemicals applied to or incorporated into soil, including soil injections or drilled pelleted formulations.

Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre — Partie 3: Lignes directrices relatives à la détermination des effets sur site

ISO 11268-3:2014 décrit des techniques utilisées pour étudier les effets de substances sur les vers de terre sur le terrain et constitue une base pour la détermination des effets des produits chimiques appliqués ou incorporés au sol, y compris des injections dans le sol ou l'enfouissement de granulés par semoirs.

General Information

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Published
Publication Date
14-Oct-2014
Current Stage
9093 - International Standard confirmed
Completion Date
24-Sep-2020
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ISO 11268-3:2014 - Soil quality -- Effects of pollutants on earthworms
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ISO 11268-3:2014 - Qualité du sol -- Effets des polluants vis-a-vis des vers de terre
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Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11268-3
Second edition
2014-10-15
Soil quality — Effects of pollutants
on earthworms —
Part 3:
Guidance on the determination of
effects in field situations
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre —
Partie 3: Lignes directrices relatives à la détermination des effets sur site
Reference number
ISO 11268-3:2014(E)
©
ISO 2014

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ISO 11268-3:2014(E)

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All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
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Published in Switzerland
ii © ISO 2014 – All rights reserved

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ISO 11268-3:2014(E)

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Units . 1
4 Principle . 1
5 Reagents and material . 2
6 Apparatus . 2
7 Procedure. 2
7.1 Sampling of earthworm populations . 2
7.2 Preservation . 3
7.3 Determination of biomass . 3
8 Preparation for the test . 3
8.1 Test site . 3
9 Procedure. 6
9.1 Application of test substance . . 6
9.2 Sampling dates . 6
9.3 Reference substance . 7
10 Data assessment. 7
10.1 End points . 7
10.2 Identification of earthworm species . 8
10.3 Determination of biomass with gut content . 8
11 Calculation and expression of results . 8
12 Validity of the test . 8
13 Test report . 9
Annex A (informative) Additional requirements of pesticide testing .10
Annex B (informative) Information on specific earthworm species or communities in
different climatic or geographic regions .11
Bibliography .12
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ISO 11268-3:2014(E)

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any
patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on
the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 11268-3:1999), which has been
technically revised.
ISO 11268 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Effects of pollutants
on earthworms:
— Part 1: Determination of acute toxicity to Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Part 2: Determination of effects on reproduction to Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations
iv © ISO 2014 – All rights reserved

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ISO 11268-3:2014(E)

Introduction
The earthworm field test is based on a method being developed by the German Federal Biological
[6]
Research Centre for Agriculture and Forestry for the testing of pesticides. Later, it was internationally
standardized by the International Organization for Standardization (ISO), taking into account
[7]
results and recommendations of an international workshop in 1991 in Sheffield, United Kingdom,
“Ecotoxicology of Earthworms”, as a tool for characterizing soil quality. Growing experience has shown
that the practical performance of the test can be improved. In two meetings organized by the Federal
Biological Research Centre for Agriculture and Forestry (Braunschweig, 2002) and by the German
Federal Agency for Consumer Protection and Food Safety (Lille, 2005), an ad-hoc working group of
experts from various countries and institutions proposed recommendations that should be taken into
account if revision has been approved by voting in the periodical review. A report of the discussions,
[8]
comments, and recommendations has been published.
In cases where earthworms and other organisms are used as bioindicators to assess the soil quality of a
site as a habitat for soil organisms, guidance for extraction procedures and advice for planning a survey
is given in ISO 23611-1 to ISO 23611-6.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11268-3:2014(E)
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms —
Part 3:
Guidance on the determination of effects in field situations
1 Scope
This part of ISO 11268 specifies techniques for determining the effects of substances on earthworms
in the field and provides a basis for determining the effects of chemicals applied to or incorporated into
soil, including soil injections or drilled pelleted formulations.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary analysis)
ISO 11274, Soil quality — Determination of the water-retention characteristic — Laboratory methods
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 23611-1, Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 1: Hand-sorting and formalin extraction
of earthworms
3 Units
Rates of application of test substances are expressed in kilograms per hectare (kg/ha) or litres per
hectare (l/ha) of the substance applied. When this is a formulated material, the application rate is
expressed in terms of the amount of active ingredient applied.
The concentrations of test substances incorporated in the soil are given in mg active ingredient (a.i.)/
kg soil dry mass, d . The same units are used when comparing the results of this field test with those
m
gained in laboratory studies.
4 Principle
Species, numbers, and biomass of earthworms collected by sampling plots treated with a test substance
are compared with those collected from treated control and reference plots. Sampling is performed as
specified in ISO 23611-1. The duration of the study depends on the characteristics of the test substance
but is usually of one year’s duration. Sampling dates are chosen to lie within the periods of activity of
the earthworms.
The test is of a randomized complete block design with four replicates per treatment. Statistical analysis
of numbers of each species collected at each sampling occasion is used to determine the effects of
treatments by comparing abundance, biomass, and diversity between control and treated plots.
NOTE The test also generates samples of earthworms from treated plots for residue analysis where such
information is appropriate.
© ISO 2014 – All rights reserved 1

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ISO 11268-3:2014(E)

5 Reagents and material
5.1 Formalin [formaldehyde solution, 4 % (volume fraction)].
5.2 Formalin [formaldehyde solution, 37 % (volume fraction)].
5.3 Ethanol, 70 % (volume fraction).
1)
5.4 Carbendazim, e.g. applied as Derosal® formulation (360 g a.i./l) as reference substance.
6 Apparatus
Use standard laboratory equipment and the following.
6.1 Plastic vessel, (250 ml and 500 ml) for storing the worms.
6.2 Plastic hand gloves.
6.3 Forceps.
2 2
6.4 Piece of thick plastic (1 m to 2 m ).
6.5 Spade or shovel.
6.6 Dissecting microscope, with low magnification (10× to 40×).
6.7 Balance (0,01 g to 200 g).
6.8 Water-can, (preferably 20 l) with water (20 l per sampling plot).
6.9 Pencil, note book, water resistant marker, labels.
6.10 Thermometer, e.g. for measuring air temperature.
6.11 Drying cabinet, for soil water content determination.
7 Procedure
7.1 Sampling of earthworm populations
Sampling of earthworms is done by a combination of two different methods: hand-sorting and formalin
extraction. Based on several comparative studies, this combination is clearly recommended in the various
[9] [10] [13]
reviews on earthworm ecology (e.g. , , ). For details of extraction procedures, see ISO 23611-1.
Sampling should be done at times of the year where the animals are not forced by the environmental
conditions (i.e. low soil water content and/or extremely high or low temperatures) into diapause (i.e. are
not reacting to formalin).
Due to the individual size of the worms, a large plot shall be identified: a square of 50 cm × 50 cm is
often sufficient in the Holarctic where most adult earthworms have a length approximately between
1) Derosal is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2 © ISO 2014 – All rights reserved

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ISO 11268-3:2014(E)

1 cm and 20 cm. However, at places with a low density of earthworms [e.g. soils with low pH (<4,5) or
2
which are anthropogenically used like crop sites], larger plots (i.e. 1 m ) are recommended. On the other
hand, at sites with a high earthworm density (e.g. many meadows in temperate regions), a smaller plot
2 [12]
of 0,125 m is sufficient. The individual samples are taken randomly over the test plot.
NOTE 1 If in special situations, such as in Southern Europe, anecic species do not occur, sampling by hand-
sorting up to a soil depth of 30 cm is sufficient. When sampling conditions are not optimal, e.g. at extremely low
soil water content or dense root layer, hand-sorting can even be the only effective extraction method.
In case in a behavioural sampling method formalin alone is used, an additional check by hand-sorting
is necessary and it should be performed as described in this International Standard. Hand-sorting
combined with the formalin method usually yields satisfying results. If a combination of hand-sorting
and an extraction method is used, no additional efficiency check is necessary.
7.2 Preservation
Preservation shall be carried out according to ISO 23611-1.
7.3 Determination of biomass
Determination of biomass shall be carried out according to ISO 23611-1.
8 Preparation for the test
8.1 Test site
8.1.1 Selection and description
In general, the test site should be as homogenous as possible to improve the statistical power of the
test. Gradients in environmental conditions should be avoided (e.g. adjacent ditches), canopy influences
as woodland borders, or compacted tractor tracks on the site. The site should be on level ground and
should have the same cropping and soil characteristics throughout.
Grassland is the preferred study site for testing effects of substances on earthworms. In grassland,
earthworm density and diversity are generally higher and more stable than on arable land, which makes
it easier to detect significant effects on earthworm populations. If effects on earthworms are observed
on a grassland site, a refined risk assessment should include specific scenarios (crops and regions)
covering the intended use patterns of the test substance (e.g. pesticide). Orchards are not recommended
for testing because of the heterogeneity of the site due to tree rows and strips without trees. If an
orchard is used, it shall be ensured that the higher variability is compensated by taking more samples or
restricting sampling to specific areas. A suitable grassland test area should have an earthworm density
of at least 100 individuals per square metre. With lower population densities, more samples should be
taken than recommended in 8.1.3.
If information on effects on bare soils is required, then arable plots may be used, provided that there are
at least 60 earthworms per square metre present at the start of the test according to the results of the
pre-sampling.
[11]
The experimental plots should support a mixed population of earthworms which are generally
representative of the type of environment selected. In agricultural areas, for example, important anecic
and endogeic species should be present at a sufficiently high density (at least 10 % of the population for
each group) that plots can be taken as representative. Care should be taken not to select plots where
uncharacteristic species predominate.
NOTE Due to natural reasons, a certain ecological group possibly does not occur in some regions (e.g. anecic
worms in parts of the Mediterranean). In such cases, expert knowledge is required in order to identify the
ecologically most important species of that region.
© ISO 2014 – All rights reserved 3

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ISO 11268-3:2014(E)

In order to satisfy these requirements, samples should be taken from prospective plots before the start
of the study for preliminary investigation of species distribution.
Extreme soil types, e.g. very sandy, clay, or moory soils, should be avoided when selecting the test site.
A description of the test site should contain the following physicochemical and biological information:
— particle-size distribution (as specified in ISO 11277);
— organic-carbon content (as specified in ISO 10694);
— pH-value (as specified in ISO 10390);
— water-holding capacity, WHC (in the A-horizon, as specified in ISO 11274);
max
— description of vegetation.
Determination of these characteristics should be made using standard methods.
Microclimate measurements (soil and air temperature, soil water content, rainfall quantity, sunshine
duration) are particularly important for the period of chemical application and temperature, and rainfall
quantity should be recorded over the year.
The history of the test site should be known (e.g. applications of pesticides, mineral fertilizers, sewage
sludge, tillage).
8.1.2 Design of experiment
The experimental design depends on the objectives of the study and the amount and quality of
information available from the study site. Usually (i.e. in the case of testing a chemical substance),
a negative control (i.e. plots sprayed just with water) and a positive control (i.e. plots sprayed with
a reference substance, e.g. a substance known to be toxic to earthworms) are sprayed. In general, it
should be taken into consideration that a dose-response design clearly facilitates environmental risk
assessment as compared to single-dose studies. In any case, the reasons for the selected test design shall
be explained in the study report.
The test should be designed as a randomized complete block. The number of the treatment groups and
planned sampling dates determine the number of plots and, therefore, the surface area of the field site.
2
However, the size of the individual study plots should be at least 100 m (10 m × 10 m). The samples
are taken exclusively from the central area of the plots so that around the sampling area, there is a 1 m
to 2 m wide edge strip which is also treated (see Figure 1). The sampling area of the samples taken
per treatment, plot (replicate), and date depends on the earthworm density and distribution of the
2 2 2
selected experimental field (see 7.1) and can range between 1 m and 0,125 m , but most often, 0,25 m
is appropriate.
4 © ISO 2014 – All rights reserved

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ISO 11268-3:2014(E)

Key
1 sampling area
2 edge strip
Figure 1 — Schematic view of a test plot
Samples taken on the same date should be at least 2 m apart and sampled areas should not be used for
sampling at subsequent sampling dates.
The required number of random samples depends, among other things, on the density and distribution
[14]
of the earthworm population over the test area.
For each test variant (control, reference substance, test substance), at least four replicates should be
used and four random samples taken per replicate (i.e. 16 individual samples per test variant).
2
On grassland, a sampling area of 0,25 m per individual sample is sufficient. Use of a metal or plastic
enclosure with a size of 50 cm × 50 cm (square) or a diameter of 56 cm and a height of 10 cm to 15 cm is
2
recommended. On arable land, the sample area shall usually be increased to 1 m due to low population
density or non-homogeneous distribution of the worms.
On grassland, the vegetation at the sampling area should be cut carefully before sampling so that all
earthworms appearing on the surface can be seen and collected.
Care should be taken that the entries of earthworm holes are not blocked and, therefore, operators
should avoid walking on sampling areas.
NOTE Guidance concerning application rates of pesticides is given in Annex A.
8.1.3 Maintenance of test fields
Grassland fields should be mulched regularly (two times to six times per year) using grass clippings of a
mulching lawn mower in order to keep the grass cover short. Mulching should be carried out one week
to two weeks before the application of the test substance to ensure that the grass on the surface, which
acts as a food source for some earthworms, has been in contact with the test material. The last mulch
before application of the test substance may only remain on the field, provided that it does not create a
coherent grass mat. In the case of mulching over the course of the year, the mulch should remain on the
field as it serves as food for some earthworm species.
If a test is carried out on arable land, usual agricultural practice should be used. However, ploughing and
other soil treatment measures should be avoided as much as possible during the experiment.
Pesticides should not be used on the test area, but if an application is unavoidable, then the chemical
chosen should be non-toxic to earthworms (the selection should be based on the risk assessment for
the respective compound as published in EFSA dossiers). For herbicides to be tested, arable land or
grassland should be used which is treated with another herbicide (which is not the test substance),
© ISO 2014 – All rights reserved 5

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cultivated, and re-sown on the whole site before starting the test. The same substance should also be
applied to the control plots. With respect to the interpretation of the test results, it shall be kept in mind
that even if this chemical does not affect earthworms, interactions between residues of the non-toxic
chemical and the test substance can occur. Therefore, a time gap of at least one week should be kept
between the spraying of the non-test herbicide and the herbicide to be tested.
In individual cases, artificial overhead irrigation of the test field can be useful as earthworms only
become active and rise to the surface when sufficient soil water content is present. Irrigation one week
to two weeks before sampling can facilitate or even be necessary to allow sampling since this depends
on the worms’ activity. If little or no rainfall occurs within three days after each application, irrigation of
the site is considered necessary to achieve optimal conditions for exposure. Irrigation can be necessary
to ensure exposure of earthworms. The amount used for irrigation should be realistic according to
regional and climatic conditions. An even distribution over the experimental area shall be assured at
any irrigation treatment. A total of 10 mm of precipitation (rainfall plus irrigation) within three days
after each spray application is desirable.
9 Procedure
9.1 Application of test substance
The test substance and reference substance should be fully identified in the test report and information on
physical and chemical properties should be included if this is helpful in the interpretation of the test results.
When chemicals are designed for soil application (e.g. agricultural chemicals), application rates,
formulations, and modes of application are specified by suppliers. In such cases, they should be followed.
Ideally, in such cases, application in the test should be carried out using application equipment similar to
that used in practice (e.g. when testing pesticides, application should be carried out using appropriate
agricultural spraying equipment designed to deliver equivalent volumes in the same manner). All
equipment should be adjusted prior to use to deliver the chemical at a rate equal to the maximum which
would reasonably be used in practice.
With pesticides which are applied in water, a water application rate of 200 l/ha to 300 l/ha should
be used on arable land. On grassland, 400 l/ha to 800 l/ha should be applied to ensure penetration.
If several applications are planned, they should be carried out at intervals corresponding to usual
application procedures.
Immediately after application, the concentration of the test substance in soil shall be determined once by
residue analysis to verify the actual exposure concentration in soil. Collection of soil samples for residue
[15]
analyses should be performed according to standard protocols (e.g. Reference ). Since the residue
analysis in the earthworm field study is only needed to confirm the application rate, a soil sample of
10 cm depth (including the “biological active” zone) is sufficient also in grassland studies. In light of the
wide variability in field studies, a range of 50 % to 150 % of the nominal concentration in soil should be
achieved for quality assurance measures.
When the effects of accidental spillages or leaching of chemicals are under study, then application should
aim to mimic realistic circumstances as closely as possible but with regard to sampling constraints
(e.g. even distribution over plots). As earthworms in temperate countries are most active in spring and
autumn, it is recommended that the test should begin in spring.
9.2 Sampling dates
A pre-treatment sampling should be conducted to gain information about the species composition,
density, and homogeneity of the site. A full sampling is recommended in order to use the information on
variability for the statistical evaluation of the other sampling dates. Statisticians should be consulted to
check the necessity of pre-treatment data for the statistical analysis in general.
One to two days after each application of the test substance and/or after irrigation, the soil surface shall
be searched for alive and/or dead earthworms.
6 © ISO 2014 – All rights reserved

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ISO 11268-3:2014(E)

After application of the test substance, at least three sampling dates should be planned, which shall fall
in periods of earthworm activity:
— First sampling: about one month to three months after application;
— Second sampling: about four months to six months after application;
— Third sampling: about 12 months after application.
The test duration depends on the properties of the test chemical. Any further sampling that can be
necessary should be carried out at half-year inte
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11268-3
Deuxième édition
2014-10-15
Qualité du sol — Effets des polluants
vis-à-vis des vers de terre —
Partie 3:
Lignes directrices relatives à la
détermination des effets sur site
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms —
Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations
Numéro de référence
ISO 11268-3:2014(F)
©
ISO 2014

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ISO 11268-3:2014(F)

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Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
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Publié en Suisse
ii © ISO 2014 – Tous droits réservés

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ISO 11268-3:2014(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Unités . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs et matériel . 2
6 Appareillage . 2
7 Mode opératoire. 3
7.1 Échantillonnage des populations de vers de terre . 3
7.2 Conservation . 3
7.3 Détermination de la biomasse . 3
8 Préparation de l’essai . 3
8.1 Site d’essai . 3
8.1.1 Sélection et description . 3
8.1.2 Conception expérimentale . 4
8.1.3 Entretien des terrains d’essai . 6
9 Mode opératoire. 6
9.1 Application de la substance d’essai . 6
9.2 Dates d’échantillonnage . 7
9.3 Substance de référence . 7
10 Évaluation des données . 8
10.1 Effets . 8
10.2 Identification des espèces de vers de terre . 8
10.3 Détermination de la biomasse avec le contenu du tube digestif . 9
11 Calcul et expression des résultats . 9
12 Validité de l’essai
. 9
13 Rapport d’essai . 9
Annexe A (informative) Exigences supplémentaires pour les essais de pesticides .11
Annexe B (informative) Informations concernant les espèces ou communautés spécifiques
de vers de terre dans différentes régions climatiques ou géographiques .12
Bibliographie .13
© ISO 2014 – Tous droits réservés iii

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ISO 11268-3:2014(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC
concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos - Informations
supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 190, Qualité du sol, sous–comité SC 4,
Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11268-3:1999), qui a fait l’objet
d’une révision technique.
L’ISO 11268 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Effets des
polluants vis-à-vis des vers de terre:
— Partie 1: Détermination de la toxicité aiguë vis-à-vis de Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction de Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Partie 3: Lignes directrices relatives à la détermination des effets sur site
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ISO 11268-3:2014(F)

Introduction
L’essai sur le terrain relatif aux vers de terre est fondé sur une méthode développée pour les essais
[6]
de pesticides par le Centre fédéral allemand de recherches biologiques dans les domaines agricole
et forestier. Il a ensuite été normalisé à l’échelle internationale par l’Organisation Internationale de
Normalisation (ISO) en tenant compte des résultats et des recommandations d’un atelier international
[7]
sur l’« Écotoxicologie des vers de terre », qui s’est tenu à Sheffield (Royaume-Uni) en 1991, afin
de servir d’outil pour la caractérisation de la qualité du sol. L’expérience acquise a démontré que la
performance pratique de l’essai peut être améliorée. Lors de deux réunions organisées par le Centre
fédéral de recherches biologiques dans les domaines agricole et forestier (Braunschweig, 2002) et par
l’Agence fédérale allemande de protection des consommateurs et de salubrité des aliments (Lille, 2005),
un groupe de travail ad hoc constitué d’experts provenant de différents pays et institutions a présenté des
recommandations à prendre en compte si la révision est approuvée par vote lors de la revue périodique.
[8]
Un compte-rendu des discussions, des commentaires et des recommandations a été publié .
Lorsque des vers de terre et d’autres organismes sont utilisés comme bio-indicateurs pour évaluer la
qualité du sol d’un site en tant qu’habitat pour les organismes du sol, des lignes directrices concernant
les modes opératoires d’extraction et des conseils pour planifier une étude sont donnés dans les normes
ISO 23611-1 à ISO 23611-6.
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NORME INTERNATIONALE ISO 11268-3:2014(F)
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de
terre —
Partie 3:
Lignes directrices relatives à la détermination des effets
sur site
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 11268 décrit des techniques utilisées pour étudier les effets de substances
sur les vers de terre sur le terrain et constitue une base pour la détermination des effets des produits
chimiques appliqués ou incorporés au sol, y compris des injections dans le sol ou l’enfouissement de
granulés par semoirs.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11274, Qualité du sol — Détermination des caractéristiques de la rétention en eau — Méthodes de
laboratoire
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des
sols — Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 23611-1, Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol — Partie 1: Tri manuel et extraction au
formol des vers de terre
3 Unités
Les taux d’application des substances d’essai sont exprimés en kilogrammes par hectare (kg/ha) ou
en litres par hectare (l/ha) de substance appliquée. Lorsqu’il s’agit d’un matériau composé, le taux
d’application est exprimé en fonction de la quantité de matière active appliquée.
Les concentrations de substances d’essai incorporées dans le sol sont données en mg de matière active
(m.a.)/kg de masse sèche du sol, d . Les mêmes unités sont utilisées pour comparer les résultats du
m
présent essai sur le terrain avec ceux obtenus lors d’études en laboratoire.
4 Principe
Les espèces, le nombre et la biomasse de vers de terre recueillis par parcelles d’échantillonnage traitées
avec la substance d’essai sont comparés à ceux recueillis dans les parcelles témoins et dans les parcelles
traitées de référence. L’échantillonnage est effectué comme spécifié dans l’ISO 23611-1. La durée de
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l’étude dépend des caractéristiques de la substance d’essai, mais elle est généralement fixée à 1 année.
Les dates d’échantillonnage sont choisies pour coïncider avec les périodes d’activité des vers de terre.
L’essai est réalisé avec un plan d’expérience complet randomisé à quatre réplicats par traitement.
L’analyse statistique de la population de chaque espèce prélevée à chaque échantillonnage permet de
déterminer les effets des traitements en comparant l’abondance, la biomasse et la diversité entre les
parcelles témoins et traitées.
NOTE L’essai comporte également des échantillons de vers de terre prélevés dans des parcelles traitées pour
une analyse des résidus, si celle-ci est appropriée.
5 Réactifs et matériel
5.1 Formol [solution de formaldéhyde, 4 % (fraction volumique)].
5.2 Formol [solution de formaldéhyde, 37 % (fraction volumique)].
5.3 Éthanol, 70 % (fraction volumique).
1)
5.4 Carbendazime, appliquée par exemple sous forme de Derosal® (formulation à 360 g m.a./l)
comme substance de référence.
6 Appareillage
Utiliser du matériel courant de laboratoire ainsi que ce qui suit.
6.1 Récipients en plastique (250 ml et 500 ml) pour conserver les vers de terre.
6.2 Gants en plastique.
6.3 Pinces.
2 2
6.4 Morceau de plastique épais (1 m à 2 m ).
6.5 Bêche ou pelle.
6.6 Microscope de dissection à faible grossissement (10 fois à 40 fois).
6.7 Balance (0,01 g à 200 g).
6.8 Bidon d’eau (de préférence 20 l) rempli d’eau (20 l par parcelle d’échantillonnage).
6.9 Crayon, carnet de notes, marqueur indélébile, étiquettes.
6.10 Thermomètre, par exemple pour mesurer la température de l’air.
6.11 Armoire de séchage, pour la détermination de la teneur en eau du sol.
1) Derosal est un exemple de produit adapté disponible dans le commerce. Ces informations sont données à titre
pratique aux utilisateurs du présent document et ne signifient nullement l’approbation de ce produit par l’ISO.
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7 Mode opératoire
7.1 Échantillonnage des populations de vers de terre
L’échantillonnage des vers de terre est réalisé en combinant deux méthodes différentes: le tri manuel et
l’extraction au formol. Sur la base de plusieurs études comparatives, cette combinaison est clairement
[9] [10] [13]
recommandée dans les diverses revues relatives à l’écologie des vers de terre (par exemple, , , ).
Pour des informations détaillées concernant les modes opératoires d’extraction, voir l’ISO 23611-1.
Il convient de procéder à l’échantillonnage à des périodes de l’année durant lesquelles les animaux ne
sont pas contraints par les conditions environnementales (c’est-à-dire faible teneur en eau du sol et/ou
températures extrêmement élevées ou extrêmement basses) à entrer en diapause (c’est-à-dire qu’ils ne
réagissent pas au formol).
En raison de la taille individuelle des vers, une grande parcelle doit être identifiée: un carré de
50 cm × 50 cm suffit souvent dans la zone holarctique où la plupart des verres de terre adultes ont une
longueur approximativement comprise entre 1 cm et 20 cm. Toutefois, dans les endroits où la densité en
vers de terre est faible [par exemple les sols à faible pH (< 4,5) ou qui sont exploités par l’homme comme
2
les lieux de culture], de plus grandes parcelles (c’est-à-dire de 1 m ) sont recommandées. En revanche,
dans les endroits où la densité en vers de terre est élevée (par exemple les nombreuses prairies des
2 [12]
régions tempérées), une parcelle plus petite de 0,125 m suffit . Les échantillons individuels sont
prélevés de manière aléatoire sur la parcelle d’essai.
NOTE Si, dans des situations particulières comme dans le Sud de l’Europe, les espèces anéciques n’apparaissent
pas, un échantillonnage du sol par tri manuel jusqu’à une profondeur de 30 cm suffit. Lorsque les conditions
d’échantillonnage ne sont pas optimales, par exemple lorsque la teneur en eau du sol est extrêmement faible ou
lorsque la couche de racines est dense, le tri manuel peut même être la seule méthode d’extraction efficace.
Lorsque, dans une méthode d’échantillonnage éthologique, seul le formol est utilisé, il convient de
procéder à un contrôle d’efficacité supplémentaire par tri manuel comme décrit dans la présente Norme
internationale. Un tri manuel combiné à la méthode d’extraction au formol donne généralement des
résultats satisfaisants. Lorsqu’une combinaison de tri manuel et d’une méthode extraction est utilisée,
aucun contrôle d’efficacité supplémentaire n’est nécessaire.
7.2 Conservation
La conservation doit être effectuée conformément à l’ISO 23611-1.
7.3 Détermination de la biomasse
La biomasse doit être déterminée conformément à l’ISO 23611-1.
8 Préparation de l’essai
8.1 Site d’essai
8.1.1 Sélection et description
En général, il convient que le site d’essai soit aussi homogène que possible afin d’améliorer la fiabilité
statistique de l’essai. Il convient d’éviter les gradients dans les conditions environnementales (par
exemple des fossés adjacents), l’influence des frondaisons comme en lisière de bois ou les ornières
compactées laissées par les tracteurs sur le site. Il convient que le site soit situé sur un terrain plat et
qu’il présente les mêmes caractéristiques de végétation et de composition du sol sur toute sa surface.
Les prairies sont le site d’étude préférentiel pour évaluer les effets de substances sur les vers de terre.
Dans les prairies, la densité et la diversité des vers de terre sont généralement plus élevées et plus
stables que dans les terres arables, ce qui facilite la détection d’effets significatifs sur les populations
de vers de terre. Si les effets sur les vers de terre sont observés sur le site d’une prairie, il convient que
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l’évaluation affinée des risques comprenne des scénarios spécifiques (cultures et régions) couvrant les
usages prévus de la substance d’essai (par exemple pesticide). Les vergers ne sont pas recommandés
pour les essais en raison de l’hétérogénéité du site due aux rangées d’arbres et aux bandes sans arbres.
Lorsqu’un verger est utilisé, il faut s’assurer que la grande variabilité est compensée en prélevant un
plus grand nombre d’échantillons ou en limitant l’échantillonnage à des zones spécifiques. Pour qu’une
surface d’essai dans une prairie soit acceptable, il convient qu’elle ait une densité en vers de terre d’au
moins 100 individus par mètre carré. Si la densité de population est inférieure, il convient de prélever
un plus grand nombre d’échantillons que celui recommandé en 8.1.3.
Lorsqu’il est nécessaire d’obtenir des informations relatives aux effets sur des sols nus, il est possible
d’utiliser des parcelles arables à condition qu’elles comportent au minimum 60 vers de terre par mètre
carré au début de l’essai conformément aux résultats de l’échantillonnage préalable.
[11]
Il convient que les parcelles expérimentales comportent une population mixte de vers de terre ,
généralement représentatifs du type d’environnement choisi. Dans les régions agricoles, par exemple, il
convient que les principales espèces anéciques et endogées soient présentes à une densité suffisamment
élevée (10 % de la population au moins pour chaque groupe) pour que les parcelles soient considérées
comme représentatives. Il convient de veiller à ne pas sélectionner de parcelles qui présentent
essentiellement des espèces non représentatives.
NOTE Pour des raisons naturelles, il est possible qu’un certain groupe écologique n’apparaisse pas dans
certaines régions (par exemple, les vers anéciques dans certaines régions de la Méditerranée). Dans ce cas, des
connaissances d’expert sont requises pour identifier les espèces les plus importantes d’un point de vue écologie
de cette région.
Afin de satisfaire à ces exigences, il convient de prélever des échantillons à partir de parcelles prospectives
avant le début de l’étude préliminaire sur la répartition des espèces.
Il convient d’éviter de sélectionner comme site d’essai des types de sols extrêmes, tels que les sols très
sablonneux, les terres argileuses et les landes.
Il convient que la description du site d’essai comprenne les données physico-chimiques et biologiques
suivantes:
— la répartition granulométrique des particules (comme spécifié dans l’ISO 11277);
— la teneur en carbone organique (comme spécifié dans l’ISO 10694);
— la valeur du pH (comme spécifié dans l’ISO 10390);
— la capacité de rétention en eau, WHC (dans l’horizon A, comme spécifié dans l’ISO 11274);
max
— une description de la végétation.
Il convient de déterminer ces caractéristiques à l’aide de méthodes normalisées.
Les mesurages microclimatiques (température du sol et de l’air, teneur en eau du sol, quantité de
précipitation, durée d’ensoleillement) sont particulièrement importants pour la période d’application des
produits chimiques, et il convient que la température et la quantité de précipitation soient enregistrées
sur l’ensemble de l’année.
Il convient de connaître l’histoire du site d’essai (par exemple applications de pesticides, de fertilisants
minéraux, de boues d’assainissement, travail du sol).
8.1.2 Conception expérimentale
Le plan d’expérimentation dépend des objectifs de l’étude et de la quantité et de la qualité des informations
disponibles concernant le site d’étude. En général, (c’est-à-dire dans le cas d’essais sur une substance
chimique), un témoin négatif (c’est-à-dire des parcelles pulvérisées uniquement avec de l’eau) et un
témoin positif (c’est-à-dire des parcelles pulvérisées avec une substance de référence, par exemple, une
substance connue pour être toxique vis-à-vis des vers de terre) sont pulvérisés. En général, il convient
de tenir compte du fait qu’une conception dose-réponse facilite clairement l’évaluation des risques liés
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à l’environnement par rapport à des études à dose unique. Dans tous les cas, les raisons du choix d’une
conception expérimentale donnée doivent être expliquées dans le rapport de l’étude.
Il convient que l’essai soit conçu comme un plan d’expérience complet randomisé. Le nombre de groupes
de traitement et les dates d’échantillonnage planifiées déterminent le nombre de parcelles et donc la
superficie du terrain.
2
Toutefois, il convient que l’aire de chaque parcelle d’étude soit d’au moins 100 m (10 m x 10 m). Les
échantillons sont prélevés exclusivement dans la zone centrale des parcelles de manière à réserver
une bordure également traitée d’une largeur de 1 m à 2 m autour de la surface d’échantillonnage (voir
Figure 1). La surface d’échantillonnage correspondant aux échantillons prélevés par traitement, par
parcelle (réplicat) et par date dépend de la densité en vers de terre et de leur répartition sur le terrain
2 2
expérimental sélectionné (voir 7.1) et peut aller de 1 m à 0,125 m , mais, le plus souvent, une surface de
2
0,25 m est appropriée.
Légende
1 surface d’échantillonnage
2 bordure
Figure 1 — Vue schématique d’une parcelle d’essai
Il convient que les échantillons prélevés à la même date soient espacés d’au moins 2 m et que les surfaces
utilisées pour l’échantillonnage ne soient pas réutilisées pour un échantillonnage à une date ultérieure.
Le nombre requis d’échantillons aléatoires dépend, entre autres, de la densité et de la répartition de la
[14]
population de vers de terre sur la surface d’essai.
Pour chaque variable d’essai (témoin, substance de référence, substance d’essai), il convient d’utiliser
au moins quatre réplicats et de prélever au hasard quatre échantillons par réplicat (c’est-à-dire
16 échantillons individuels par variable d’essai).
2
Pour les prairies, une surface d’échantillonnage de 0,25 m par échantillon individuel est suffisante.
Il est recommandé d’utiliser une enceinte en métal ou en plastique d’une dimension de 50 cm × 50 cm
(carré) ou d’un diamètre de 56 c et d’une hauteur de 10 cm à 15 cm. Pour une terre arable, la surface
2
d’échantillonnage doit normalement être étendue à 1 m en raison de la faible densité de population ou
de la répartition non homogène de la population animale.
Pour les prairies, il convient que la végétation sur la zone d’échantillonnage soit soigneusement coupée
avant l’échantillonnage afin de pouvoir voir et recueillir tous les vers de terre apparaissant à la surface.
Il convient de veiller à ce que les orifices de passage des vers de terre ne soient pas obstrués et, par
conséquent, que le personnel procédant à l’essai évite de marcher sur les surfaces d’échantillonnage.
NOTE Des lignes directrices concernant les taux d’application des pesticides sont données à l’Annexe A.
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8.1.3 Entretien des terrains d’essai
Il convient de pailler régulièrement les prairies (de deux à six fois par an) en utilisant les tontes obtenues
à l’aide d’une tondeuse déchiqueteuse afin que la couverture herbeuse reste courte. Il convient que le
paillage soit effectué une à deux semaines avant l’application de la substance d’essai afin de s’assurer
que l’herbe à la surface, qui servira de nourriture à certains vers de terre, a bien été en contact avec le
matériau d’essai. Le dernier paillage avant l’application de la substance d’essai peut être laissé sur le
terrain uniquement s’il ne constitue pas un tapis herbeux compact. Dans le cas d’un paillage au cours
de l’année, il convient de laisser la paille sur le terrain car elle sert de nourriture à certaines espèces de
vers de terre.
Si un essai est réalisé sur une terre arable, il convient d’utiliser la pratique agricole usuelle. Il convient
toutefois d’éviter autant que possible tout labour et autres mesures de traitement du sol pendant
l’expérience.
Il convient de ne pas utiliser de pesticides sur la surface d’essai; toutefois, si une application est inévitable,
il convient que le produit chimique choisi ne soit pas toxique pour les vers de terre [il convient que la
sélection soit fondée sur une appréciation du risque pour le composé respectif tel que publié dans les
dossiers de l’Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA)]. Lorsque des herbicides sont soumis
à essai, il convient d’utiliser une terre arable ou une prairie qui est traitée par un autre herbicide (qui
n’est pas la substance d’essai), cultivée et resemée sur la totalité du site avant le début de l’essai. Il
convient que la même substance soit également appliquée aux parcelles témoins. En ce qui concerne
l’interprétation des résultats d’essai, il faut garder à l’esprit que même si ce produit chimique n’affecte
pas les vers de terre, des interactions entre les résidus du produit chimique non toxique et la substance
d’essai peuvent se produire. Par conséquent, il convient de respecter une période d’au moins une semaine
entre la pulvérisation d’herbicides non soumis à essai et des herbicides à soumettre à essai.
Dans certains cas individuels, il est possible qu’une irrigation par aspersion artifici
...

Questions, Comments and Discussion

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