Soil quality — Determination of soil microbial diversity — Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the simple PLFA extraction method

This document specifies a simple method for the extraction of only phospholipid fatty acids (PLFA) from soils.

Qualité du sol — Détermination de la diversité microbienne du sol — Partie 2: Méthode par analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA) en utilisant la méthode simple d'extraction des PLFA

Le présent document spécifie une méthode simple permettant d'extraire uniquement les acides gras phospholipidiques (PLFA) du sol.

General Information

Status
Published
Publication Date
19-Jul-2021
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
20-Jul-2021
Completion Date
20-Jul-2021
Ref Project

RELATIONS

Buy Standard

Technical specification
ISO/TS 29843-2:2021 - Soil quality -- Determination of soil microbial diversity
English language
7 pages
sale 15% off
Preview
sale 15% off
Preview
Technical specification
ISO/TS 29843-2:2021 - Qualité du sol -- Détermination de la diversité microbienne du sol
French language
8 pages
sale 15% off
Preview
sale 15% off
Preview
Draft
ISO/PRF TS 29843-2:Version 06-mar-2021 - Soil quality -- Determination of soil microbial diversity
English language
7 pages
sale 15% off
Preview
sale 15% off
Preview
Draft
ISO/PRF TS 29843-2:Version 17-apr-2021 - Qualité du sol -- Détermination de la diversité microbienne du sol
French language
9 pages
sale 15% off
Preview
sale 15% off
Preview

Standards Content (sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 29843-2
Second edition
2021-07
Soil quality — Determination of soil
microbial diversity —
Part 2:
Method by phospholipid fatty acid
analysis (PLFA) using the simple PLFA
extraction method
Qualité du sol — Détermination de la diversité microbienne du sol —
Partie 2: Méthode par analyse des acides gras phospholipidiques
(PLFA) en utilisant la méthode simple d'extraction des PLFA
Reference number
ISO/TS 29843-2:2021(E)
ISO 2021
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2021

All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may

be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address

below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2021 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Symbols and abbreviated terms (except chemical products and reagents) ...........................................1

5 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

6 Test materials .......................................................................................................................................................................................................... 2

6.1 Soil ..................................................................................................................................................................................................................... 2

6.2 Reagents........................................................................................................................................................................................................ 2

6.3 Apparatus .................................................................................................................................................................................................... 4

7 Procedures .................................................................................................................................................................................................................. 5

7.1 Lipid extraction (Bligh-Dyer extraction) .......................................................................................................................... 5

7.2 Separation of lipids by SI column ........................................................................................................................................... 5

7.3 Derivatization — Transmethylation — Clean-up ...................................................................................................... 6

7.4 PLFA analysis ............................................................................................................................................................................................ 6

Bibliography ................................................................................................................................................................................................................................ 7

© ISO 2021 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/

iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,

Biological characterization, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)

Technical Committee CEN/TC 444, Environmental characterization of solid matrices, in accordance with

the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO/TS 29843-2:2011), which has been

technically revised.
The main changes compared to the previous edition are as follows:
— addition of specification for qualitative and quantitative analysis of PLFAs;
— use of BAME (qualitative) or FAME (quantitative) standards;
— use of GC-MS apparatus;
— precisions in 7.2 and 7.3;

— possibility to use commercial cartridges in addition to, or replacement of, home-made cartridges;

— update of bibliographic references.

A list of all the parts in the ISO/TS 29843 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv © ISO 2021 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(E)
Introduction

Phospholipids are essential components of membranes of all living cells. Extracted from soil samples

in fatty acid form (phospholipid fatty acids, PLFA) or ether-linked isoprenoid side chains (phospholipid

ether lipid, PLEL), they provide quantitative and qualitative insights into the soil's viable/active

microbial biomass. Cellular enzymes hydrolyse and release the phosphate group within minutes to

[1]

hours following cell death . The determination of total PLFA and PLEL provides a quantitative measure

of the viable biomass of soil, i.e. microorganisms of all three primary domains of the biosphere (bacteria,

archaea and microeukaryota). PLFA and PLEL can also allow for rough taxonomic differentiation within

[2],[3]

complex microbial communities . Each microbial species contains several fatty acids, with a total

[4]

composition in PLFA subject to the environmental conditions . The approach is performed to evaluate

[5]

biomass and shifts in microbial community composition , in what regards dominance of main groups

[6] 13 14

of organisms . Furthermore, combined with the use of isotope ( C or C) labelled substrates, the

lipid methods can also be used to identify the metabolically active part of the microbial community.

This approach is well established in soil ecology and serves as a phenotypic, and thus complementary,

tool to genotyping approaches for determining microbial diversity. Apart from taxonomic descriptions,

the PLFA technique enables the determination of physiological changes within microbial consortia. For

instance, the monoenic PLFA 16:1ω7c and 18:1ω7c are increasingly converted to the cyclopropyl fatty

[7]

acids cy17:0 and cy19:0 in Gram-negative bacteria in response to environmental stress .

Different methodologies are available for the determination of soil fatty acids. These methodologies

present different levels of complexity when applied and provide different levels of resolution in the

description of soil microbial communities. ISO/TS 29843-1 deals with the generally called “extended

PLFA extraction method” while this document deals with the generally called “simple PLFA extraction

[8],[9]
method” .

This document is accessible to most research and analytical laboratories involved in soil sciences. This

methodology can be used for a wide range of soils. It provides a broad diversity measurement of a soil

microbial community at the phenotypic level. It can be applied to biomass estimation and can be used to

differentiate microbial communities among different soil samples (with the aid of an adapted statistical

method). This method is especially adapted for detecting rapid changes in the soil microbial community

structure. It can also be used to give a rough description of microbial groups present in soil samples

[6]

(e.g. Gram-positive bacteria, actinomycetes, fungi ). Table 1 (adapted from Table 1 in Reference [8]),

presents a comparison of the sensitivity of the “extended PLFA” versus “simple PLFA” techniques.

Table 1 — Comparison of the sensitivity of the “simple” and “extended” PLFA techniques

in characterizing shifts in the composition of microbial communities
Property PLFA (simple) PLFA (extended)
Ability to differentiate between two communities Yes Yes
(with the aid of multivariate statistical methods)
Applicability for biomass estimation Yes Yes
Ability to register all single components of an entire No Yes
community structure (“fingerprint”)
Ability to register FAs other than EL-FAs No Yes
Estimation of number of FAs in soil samples <50 200 to 400
Capacity to determine the linkage of the FAs to lipids Yes, EL Yes, EL, NEL
in the molecule
Capacity to detect defined FAs in lower concentrations No Yes
in the soil extract
Capacity to detect unusual FAs in the soil extract No Yes
Number of available signatures of FAs for defined Few High numbers
organisms
Relationships of FAs widespread in the profile High Natura
© ISO 2021 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(E)
Table 1 (continued)
Property PLFA (simple) PLFA (extended)
Ability to identify the organisms causing the shift in No Basically yes
microbial community
FA fatty acid
EL ester-linked
NEL non-ester–linked

This method has been derived from the one first proposed in Reference [10]. This revised method

[11]

has been widely used and has also been discussed and compared to the extended PLFA extraction

[8],[9]
method in peer-reviewed articles .
vi © ISO 2021 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 29843-2:2021(E)
Soil quality — Determination of soil microbial diversity —
Part 2:
Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using
the simple PLFA extraction method
1 Scope

This document specifies a simple method for the extraction of only phospholipid fatty acids (PLFA)

from soils.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic

conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory

3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.

ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: avai
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 29843-2
Deuxième édition
2021-07
Qualité du sol — Détermination de la
diversité microbienne du sol —
Partie 2:
Méthode par analyse des acides gras
phospholipidiques (PLFA) en utilisant
la méthode simple d'extraction des
PLFA
Soil quality — Determination of soil microbial diversity —
Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the
simple PLFA extraction method
Numéro de référence
ISO/TS 29843-2:2021(F)
ISO 2021
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2021

Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2021 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d'application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Symboles et termes abrégés (à l'exception des produits chimiques et des réactifs) ....................1

5 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

6 Matériaux d'essai ................................................................................................................................................................................................. 3

6.1 Sol ....................................................................................................................................................................................................................... 3

6.2 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................... 3

6.3 Appareillage............................................................................................................................................................................................... 4

7 Modes opératoires .............................................................................................................................................................................................. 5

7.1 Extraction des lipides (extraction de Bligh-Dyer) .................................................................................................... 5

7.2 Séparation des lipides par colonne SI ................................................................................................................................. 6

7.3 Dérivation — Transméthylation — Purification ........................................................................................................ 6

7.4 Analyse PLFA ............................................................................................................................................................................................ 6

Bibliographie .............................................................................................................................................................................................................................. 8

© ISO 2021 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l'intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,

Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 444, Méthodes d'essai pour

la caractérisation environnementale des matrices solides, du Comité européen de normalisation (CEN),

conformément à l'Accord de coopération technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).

Cette seconde édition annule et remplace la première édition (ISO/TS 29843-2:2011) qui a fait l’objet

d’une révision technique.

Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:

— ajout d’une spécification pour l’analyse qualitative et quantitative des PLFA;
— utilisation des étalons BAME (qualitatif) ou FAME (quantitatif);
— utilisation d’un appareil de GC-MS;
— apport de précisions techniques en 7.2 et 7.3;

— indication de la possibilité d’utiliser des colonnes du commerce en complément ou en remplacement

des colonnes préparées au laboratoire;
— mise à jour des références bibliographiques.

Une liste de toutes les parties de la série ISO/TS 29843 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
iv © ISO 2021 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(F)
Introduction

Les phospholipides sont des composants essentiels des membranes de toutes les cellules vivantes.

Extraits d'échantillons de sol sous forme d'acides gras (acides gras phospholipidiques, PLFA) ou de

chaînes latérales isopréniques à liaison éther (lipides éther phospholipidiques, PLEL), ils apportent des

connaissances quantitatives et qualitatives relatives à la biomasse microbienne viable/active du sol.

Les enzymes cellulaires hydrolysent et libèrent le groupe phosphate dans les minutes ou les heures qui

[1]

suivent la mort cellulaire . Le dosage des PLFA et des PLEL totaux fournit une mesure quantitative

de la biomasse viable du sol, c'est-à-dire des micro-organismes des trois principaux domaines de la

biosphère (bactéries, archées et microeucaryotes). Les PLFA et les PLEL peuvent également permettre

[ 2],[3]

une différenciation taxonomique sommaire à l'intérieur de communautés microbiennes complexes .

Chaque espèce microbienne contient plusieurs acides gras, avec une composition totale en PLFA soumise

[4]

aux conditions environnementales . L’approche est mise en œuvre pour évaluer la biomasse et les

[5]

changements dans la composition des communautés microbiennes , en ce qui concerne la dominance

[6]

des principaux groupes d’organismes . Par ailleurs, combinées avec l’utilisation des substrats

13 14

marqués avec un isotope ( C ou C), les méthodes utilisant les lipides peuvent aussi être utilisées pour

identifier la partie métaboliquement active de la communauté microbienne. Cette approche est bien

établie dans le domaine de l'écologie des sols et sert d'outil phénotypique. Elle est donc complémentaire

aux approches de génotypage pour déterminer la diversité microbienne. En plus des descriptions

taxonomiques, la technique PLFA permet de déterminer les modifications physiologiques au sein des

consortiums microbiens. Par exemple, les PLFA monoéniques 16:1ω7c et 18:1ω7c sont progressivement

convertis en acides gras cyclopropyliques cy17:0 et cy19:0 dans les bactéries Gram-négatives en

[7]
réponse aux contraintes environnementales .

Il existe différentes méthodes de dosage des acides gras présents dans le sol. Ces méthodes présentent,

lors de leur application, des niveaux de complexité variables et permettent d'obtenir différents niveaux

de résolution concernant la description des communautés microbiennes du sol. L'ISO/TS 29843-1 traite

de la méthode généralement appelée «méthode étendue d'extraction des PLFA» tandis que le présent

[8],[9]

document traite de celle généralement appelée «méthode simple d'extraction des PLFA» .

Le présent document est accessible à la plupart des laboratoires d'analyse et de recherche concernés

par les sciences de la terre. Cette méthode peut être utilisée pour un large éventail de sols. Elle fournit

une mesure de la grande diversité de la communauté microbienne du sol à un niveau phénotypique. Elle

peut être appliquée à l'estimation de la biomasse et peut être utilisée pour différencier les communautés

microbiennes dans différents échantillons de sol (à l'aide d'une méthode statistique adaptée). Cette

méthode est particulièrement adaptée à la détection des modifications rapides de la structure de la

communauté microbienne du sol. Elle peut également être utilisée pour une description sommaire des

groupes microbiens présents dans les échantillons de sol (par exemple les bactéries Gram-positives, les

[6]

actinomycètes, les champignons ). Le Tableau 1 (adapté de la Référence [8]) présente une comparaison

de la sensibilité des techniques «PLFA étendue» et «PLFA simple».

Tableau 1 — ― Comparaison de la sensibilité des techniques PLFA «simple» et «étendue» pour la

caractérisation des changements dans la composition des communautés microbiennes
Propriété PLFA (simple) PLFA (étendue)
Aptitude à différencier deux communautés (à l'aide de Oui Oui
méthodes statistiques à plusieurs variables)
Applicabilité pour l'estimation de la biomasse Oui Oui
Aptitude à répertorier tous les composants simples de Non Oui
la structure d'une communauté entière («empreinte»)
Aptitude à répertorier les acides gras autres que les Non Oui
acides gras à liaison ester
FA: acides gras
EL-FA: acides gras à liaison ester
NEL-FA: acides gras sans liaison ester
© ISO 2021 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(F)
Tableau 1 (suite)
Propriété PLFA (simple) PLFA (étendue)
Estimation du nombre d'acides gras dans les échantil- <50 200 à 400
lons de sol

Capacité à doser la liaison des acides gras aux lipides Oui, liaison ester (EL) Oui, liaison ester (EL),

dans la molécule sans liaison ester (NEL)
Capacité à détecter les acides gras définis à de faibles Non Oui
concentrations dans l'extrait de sol
Capacité à détecter les acides gras inhabituels dans Non Oui
l'extrait de sol
Nombre de signatures disponibles d'acides gras pour Peu Nombre élevé
des organismes définis
Relation des acides gras répandus dans le profil Importante Naturelle
Aptitude à identifier les organismes provoquant des Non Oui, dans l'ensemble
changements dans la communauté microbienne
FA: acides gras
EL-FA: acides gras à liaison ester
NEL-FA: acides gras sans liaison ester

La présente méthode est dérivée de la première méthode proposée par la Référence [10]. Cette méthode

[11]

révisée a été largement utilisée et a également été examinée et comparée à la méthode étendue

[8],[9]
d'extraction des PLFA dans des articles évalués par des pairs .
vi © ISO 2021 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 29843-2:2021(F)
Qualité du sol — Détermination de la diversité
microbienne du sol —
Partie 2:
Méthode par analyse des acides gras phospholipidiques
(PLFA) en utilisant la méthode simple d'extraction des
PLFA
1 Domaine d'application

Le présent document spécifie une méthode simple permettant d'extraire uniquement les acides gras

phospholipidiques (PLFA) du sol.
2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les

éventuels amendements).

ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de

sols destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire

3 Termes et définitions
Aucun terme n'est défini dans le présent document.

L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponi
...

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 29843-2
Second edition
Soil quality — Determination of soil
microbial diversity —
Part 2:
Method by phospholipid fatty acid
analysis (PLFA) using the simple PLFA
extraction method
Qualité du sol — Détermination de la diversité microbienne du sol —
Partie 2: Méthode par analyse des acides gras phospholipidiques
(PLFA) en utilisant la méthode simple d'extraction des PLFA
PROOF/ÉPREUVE
Reference number
ISO/TS 29843-2:2021(E)
ISO 2021
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2021

All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may

be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address

below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii PROOF/ÉPREUVE © ISO 2021 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Symbols and abbreviated terms (except chemical products and reagents) ...........................................1

5 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

6 Test materials .......................................................................................................................................................................................................... 2

6.1 Soil ..................................................................................................................................................................................................................... 2

6.2 Reagents........................................................................................................................................................................................................ 2

6.3 Apparatus .................................................................................................................................................................................................... 4

7 Procedures .................................................................................................................................................................................................................. 5

7.1 Lipid extraction (Bligh-Dyer extraction) .......................................................................................................................... 5

7.2 Separation of lipids by SI column ........................................................................................................................................... 5

7.3 Derivatization — Transmethylation — Clean-up ...................................................................................................... 6

7.4 PLFA analysis ............................................................................................................................................................................................ 6

Bibliography ................................................................................................................................................................................................................................ 7

© ISO 2021 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/

iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,

Biological characterization, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)

Technical Committee CEN/TC 444, Environmental characterization of solid matrices, in accordance with

the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO/TS 29843-2:2011), which has been

technically revised.
The main changes compared to the previous edition are as follows:
— addition of specification for qualitative and quantitative analysis of PLFAs;
— use of BAME (qualitative) or FAME (quantitative) standards;
— use of GC-MS apparatus;
— precisions in 7.2 and 7.3;

— possibility to use commercial cartridges in addition to, or replacement of, home-made cartridges;

— update of bibliographic references.

A list of all the parts in the ISO/TS 29843 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv PROOF/ÉPREUVE © ISO 2021 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(E)
Introduction

Phospholipids are essential components of membranes of all living cells. Extracted from soil samples

in fatty acid form (phospholipid fatty acids, PLFA) or ether-linked isoprenoid side chains (phospholipid

ether lipid, PLEL), they provide quantitative and qualitative insights into the soil's viable/active

microbial biomass. Cellular enzymes hydrolyse and release the phosphate group within minutes to

[1]

hours following cell death . The determination of total PLFA and PLEL provides a quantitative measure

of the viable biomass of soil, i.e. microorganisms of all three primary domains of the biosphere (bacteria,

archaea and microeukaryota). PLFA and PLEL can also allow for rough taxonomic differentiation within

[2],[3]

complex microbial communities . Each microbial species contains several fatty acids, with a total

[4]

composition in PLFA subject to the environmental conditions . The approach is performed to evaluate

[5]

biomass and shifts in microbial community composition , in what regards dominance of main groups

[6] 13 14

of organisms . Furthermore, combined with the use of isotope ( C or C) labelled substrates, the

lipid methods can also be used to identify the metabolically active part of the microbial community.

This approach is well established in soil ecology and serves as a phenotypic, and thus complementary,

tool to genotyping approaches for determining microbial diversity. Apart from taxonomic descriptions,

the PLFA technique enables the determination of physiological changes within microbial consortia. For

instance, the monoenic PLFA 16:1ω7c and 18:1ω7c are increasingly converted to the cyclopropyl fatty

[7]

acids cy17:0 and cy19:0 in Gram-negative bacteria in response to environmental stress .

Different methodologies are available for the determination of soil fatty acids. These methodologies

present different levels of complexity when applied and provide different levels of resolution in the

description of soil microbial communities. ISO/TS 29843-1 deals with the generally called “extended

PLFA extraction method” while this document deals with the generally called “simple PLFA extraction

[8],[9]
method” .

This document is accessible to most research and analytical laboratories involved in soil sciences. This

methodology can be used for a wide range of soils. It provides a broad diversity measurement of a soil

microbial community at the phenotypic level. It can be applied to biomass estimation and can be used to

differentiate microbial communities among different soil samples (with the aid of an adapted statistical

method). This method is especially adapted for detecting rapid changes in the soil microbial community

structure. It can also be used to give a rough description of microbial groups present in soil samples

[6]

(e.g. Gram-positive bacteria, actinomycetes, fungi ). Table 1 (adapted from Table 1 in Reference [8]),

presents a comparison of the sensitivity of the “extended PLFA” versus “simple PLFA” techniques.

Table 1 — Comparison of the sensitivity of the “simple” and “extended” PLFA techniques

in characterizing shifts in the composition of microbial communities
Property PLFA (simple) PLFA (extended)
Ability to differentiate between two communities Yes Yes
(with the aid of multivariate statistical methods)
Applicability for biomass estimation Yes Yes
Ability to register all single components of an entire No Yes
community structure (“fingerprint”)
Ability to register FAs other than EL-FAs No Yes
Estimation of number of FAs in soil samples <50 200 to 400
Capacity to determine the linkage of the FAs to lipids Yes, EL Yes, EL, NEL
in the molecule
Capacity to detect defined FAs in lower concentrations No Yes
in the soil extract
Capacity to detect unusual FAs in the soil extract No Yes
Number of available signatures of FAs for defined Few High numbers
organisms
Relationships of FAs widespread in the profile High Natura
© ISO 2021 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(E)
Table 1 (continued)
Property PLFA (simple) PLFA (extended)
Ability to identify the organisms causing the shift in No Basically yes
microbial community
FA fatty acid
EL ester-linked
NEL non-ester–linked

This method has been derived from the one first proposed in Reference [10]. This revised method

[11]

has been widely used and has also been discussed and compared to the extended PLFA extraction

[8],[9]
method in peer-reviewed articles .
vi PROOF/ÉPREUVE © ISO 2021 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 29843-2:2021(E)
Soil quality — Determination of soil microbial diversity —
Part 2:
Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using
the simple PLFA extraction method
1 Scope

This document specifies a simple method for the extraction of only phospholipid fatty acids (PLFA)

from soils.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic

conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory

3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at htt
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 29843-2
Deuxième édition
Qualité du sol — Détermination de la
diversité microbienne du sol —
Partie 2:
Méthode par analyse des acides
gras phospholipidiques (PLFA)
en utilisant la méthode simple
d'extraction des PLFA
Soil quality — Determination of soil microbial diversity —
Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the
simple PLFA extraction method
PROOF/ÉPREUVE
Numéro de référence
ISO/TS 29843-2:2021(F)
ISO 2021
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2021

Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii PROOF/ÉPREUVE © ISO 2021 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d'application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Symboles et termes abrégés (à l'exception des produits chimiques et des réactifs) ....................1

5 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

6 Matériaux d'essai ................................................................................................................................................................................................. 3

6.1 Sol ....................................................................................................................................................................................................................... 3

6.2 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................... 3

6.3 Appareillage............................................................................................................................................................................................... 4

7 Modes opératoires .............................................................................................................................................................................................. 5

7.1 Extraction des lipides (extraction de Bligh-Dyer) .................................................................................................... 5

7.2 Séparation des lipides par colonne SI ................................................................................................................................. 6

7.3 Dérivation — Transméthylation — Purification ........................................................................................................ 6

7.4 Analyse PLFA ............................................................................................................................................................................................ 6

Bibliographie .............................................................................................................................................................................................................................. 8

© ISO 2021 – Tous droits réservés PROOF/ÉPREUVE iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l'intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ avant -propos .html.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité

SC 4, Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 444, Caractérisation

environnementale des matrices solides du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à

l'Accord de coopération technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).

Cette seconde édition annule et remplace la première édition (ISO/TS 29843-2:2011) qui a fait l’objet

d’une révision technique.

Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:

— ajout d’une spécification pour l’analyse qualitative et quantitative des PLFA;
— utilisation des étalons BAME (qualitatif) ou FAME (quantitatif);
— utilisation d’un appareil de GC-MS;
— apport de précisions techniques en 7.2 et 7.3;

— indication de la possibilité d’utiliser des colonnes du commerce en complément ou en remplacement

des colonnes préparées au laboratoire;
— mise à jour des références bibliographiques.

Une liste de toutes les parties de la série ISO/TS 29843 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
iv PROOF/ÉPREUVE © ISO 2021 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(F)
Introduction

Les phospholipides sont des composants essentiels des membranes de toutes les cellules vivantes.

Extraits d'échantillons de sol sous forme d'acides gras (acides gras phospholipidiques, PLFA) ou de

chaînes latérales isopréniques à liaison éther (lipides éther phospholipidiques, PLEL), ils apportent des

connaissances quantitatives et qualitatives relatives à la biomasse microbienne viable/active du sol.

Les enzymes cellulaires hydrolysent et libèrent le groupe phosphate dans les minutes ou les heures qui

[1]

suivent la mort cellulaire . Le dosage des PLFA et des PLEL totaux fournit une mesure quantitative

de la biomasse viable du sol, c'est-à-dire des micro-organismes des trois principaux domaines de la

biosphère (bactéries, archées et microeucaryotes). Les PLFA et les PLEL peuvent également permettre

[ 2],[3]

une différenciation taxonomique sommaire à l'intérieur de communautés microbiennes complexes .

Chaque espèce microbienne contient plusieurs acides gras, avec une composition totale en PLFA soumise

[4]

aux conditions environnementales . L’approche est mise en œuvre pour évaluer la biomasse et les

[5]

changements dans la composition des communautés microbiennes , en ce qui concerne la dominance

[6]

des principaux groupes d’organismes . Par ailleurs, combinées avec l’utilisation des substrats

13 14

marqués avec un isotope ( C ou C), les méthodes utilisant les lipides peuvent aussi être utilisées pour

identifier la partie métaboliquement active de la communauté microbienne. Cette approche est bien

établie dans le domaine de l'écologie des sols et sert d'outil phénotypique. Elle est donc complémentaire

aux approches de génotypage pour déterminer la diversité microbienne. En plus des descriptions

taxonomiques, la technique PLFA permet de déterminer les modifications physiologiques au sein des

consortiums microbiens. Par exemple, les PLFA monoéniques 16:1ω7c et 18:1ω7c sont progressivement

convertis en acides gras cyclopropyliques cy17:0 et cy19:0 dans les bactéries Gram-négatives en

[7]
réponse aux contraintes environnementales .

Il existe différentes méthodes de dosage des acides gras présents dans le sol. Ces méthodes présentent,

lors de leur application, des niveaux de complexité variables et permettent d'obtenir différents niveaux

de résolution concernant la description des communautés microbiennes du sol. L'ISO/TS 29843-1 traite

de la méthode généralement appelée «méthode étendue d'extraction des PLFA» tandis que le présent

[8],[9]

document traite de celle généralement appelée «méthode simple d'extraction des PLFA» .

Le présent document est accessible à la plupart des laboratoires d'analyse et de recherche concernés

par les sciences de la terre. Cette méthode peut être utilisée pour un large éventail de sols. Elle fournit

une mesure de la grande diversité de la communauté microbienne du sol à un niveau phénotypique. Elle

peut être appliquée à l'estimation de la biomasse et peut être utilisée pour différencier les communautés

microbiennes dans différents échantillons de sol (à l'aide d'une méthode statistique adaptée). Cette

méthode est particulièrement adaptée à la détection des modifications rapides de la structure de la

communauté microbienne du sol. Elle peut également être utilisée pour une description sommaire des

groupes microbiens présents dans les échantillons de sol (par exemple les bactéries Gram-positives, les

[6]

actinomycètes, les champignons ). Le Tableau 1 (adapté de la Référence [8]) présente une comparaison

de la sensibilité des techniques «PLFA étendue» et «PLFA simple».

Tableau 1 — ― Comparaison de la sensibilité des techniques PLFA «simple» et «étendue» pour la

caractérisation des changements dans la composition des communautés microbiennes
Propriété PLFA (simple) PLFA (étendue)
Aptitude à différencier deux communautés (à l'aide de Oui Oui
méthodes statistiques à plusieurs variables)
Applicabilité pour l'estimation de la biomasse Oui Oui
Aptitude à répertorier tous les composants simples de Non Oui
la structure d'une communauté entière (« empreinte »)
Aptitude à répertorier les acides gras autres que les Non Oui
acides gras à liaison ester
FA: acides gras
EL-FA: acides gras à liaison ester
NEL-FA: acides gras sans liaison ester
© ISO 2021 – Tous droits réservés PROOF/ÉPREUVE v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2021(F)
Tableau 1 (suite)
Propriété PLFA (simple) PLFA (étendue)
Estimation du nombre d'acides gras dans les échantil- □<□50 200 à 400
lons de sol

Capacité à doser la liaison des acides gras aux lipides Oui, liaison ester (EL) Oui, liaison ester (EL),

dans la molécule sans liaison ester (NEL)
Capacité à détecter les acides gras définis à de faibles Non Oui
concentrations dans l'extrait de sol
Capacité à détecter les acides gras inhabituels dans Non Oui
l'extrait de sol
Nombre de signatures disponibles d'acides gras pour Peu Nombre élevé
des organismes définis
Relation des acides gras répandus dans le profil Importante Naturelle
Aptitude à identifier les organismes provoquant des Non Oui, dans l'ensemble
changements dans la communauté microbienne
FA: acides gras
EL-FA: acides gras à liaison ester
NEL-FA: acides gras sans liaison ester

La présente méthode est dérivée de la première méthode proposée par la Référence [10]. Cette méthode

[11]

révisée a été largement utilisée et a également été examinée et comparée à la méthode étendue

[8],[9]
d'extraction des PLFA dans des articles évalués par des pairs .
vi PROOF/ÉPREUVE © ISO 2021 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 29843-2:2021(F)
Qualité du sol — Détermination de la diversité
microbienne du sol —
Partie 2:
Méthode par analyse des acides gras phospholipidiques
(PLFA) en utilisant la méthode simple d'extraction des PLFA
1 Domaine d'application

Le présent document spécifie une méthode simple permettant d'extraire uniquement les acides gras

phospholipidiques (PLFA) du sol.
2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les

éventuels amendements).

ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de

sols destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire

3 Termes et définitions
Aucun terme n'est défini dans le présent document.

L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l'adresse http
...

Questions, Comments and Discussion

Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.