Soil quality — Identification of ecotoxicological test species by DNA barcoding

This document specifies a protocol to identify ecotoxicological test specimens (mainly invertebrates and plants) to the species level, based on the DNA barcoding technique. This protocol can be used by laboratories performing DNA barcoding in order to standardize both the wet-lab and data analysis workflows as much as possible, and make them compliant with community standards and guidelines. This document does not intend to specify one particular strain for each test method, but to accurately document the species/strain which was used. NOTE 1 This does not imply that DNA barcoding is performed in parallel to each test run, but rather regularly (e.g. once a year, such as reference substance testing) and each time a new culture is started or new individuals are added to an ongoing culture. This document does not aim at duplicating or replacing morphological-based species identifications. On the contrary, DNA barcoding is proposed as a complementary identification tool where morphology is inconclusive, or to diagnose cryptic species, in order to ensure that the results obtained from different ecotoxicological laboratories are referring to the same species or strain. This document is applicable to identifications of immature forms which lack morphological diagnostic characters (eggs, larvae, juveniles), as well as the streamline identification of specimens collected in field monitoring studies, where large numbers of organisms from diverse taxa are classified. NOTE 2 In principle, all species regularly used in ecotoxicological testing can be analysed by DNA barcoding. Besides the earthwoms Eisenia fetida and E. andrei, further examples for terrestrial species are Lumbricus terrestris, L. rubellus, Allolobophora chlorotica, Aporrectodea rosea, and A. caliginosa, Dendrodrilus rubidus, Enchytraeus albidus, and E. crypticus (Haplotaxida); Folsomia candida, F. fimetaria, Proisotoma minuta, and Sinella curviseta (Collembola); Hypoaspis aculeifer and Oppia nitens (Acari); Aleochara bilineata and Poecilus cupreus (Coleoptera); Scathophaga stercoraria, Musca autumnalis (Diptera) or Pardosa sp. (Arachnida). Nematodes or snails and even plants can also be added to this list.

Qualité du sol — Identification des espèces par codes-barres ADN dans les essais d'écotoxicologie

Le présent document spécifie un protocole d'identification de spécimens d'essais écotoxicologiques (principalement des invertébrés et des végétaux) au niveau de l'espèce, reposant sur la technique du code-barres ADN. Ce protocole peut être utilisé par les laboratoires effectuant le code-barres ADN afin de normaliser le plus possible les travaux de laboratoire et les flux d'analyse de données, et de les mettre en conformité avec les normes et les lignes directrices communautaires. Le présent document ne prévoit pas de spécifier une souche particulière pour chaque méthode d'essai, mais de documenter avec exactitude l'espèce/la souche qui a été utilisée. NOTE 1 Cela ne veut pas dire que le code-barres ADN est effectué parallèlement à chaque cycle d'essai, mais qu'il est effectué régulièrement (par exemple, une fois par an, notamment pour l'essai mené avec la substance de référence) et à chaque fois qu'une nouvelle culture est démarrée ou que de nouveaux individus sont ajoutés à une culture existante. Le présent document ne vise pas à reproduire ou remplacer les identifications d'espèces reposant sur des caractéristiques morphologiques. En revanche, le code-barres ADN est proposé comme outil d'identification complémentaire lorsque l'identification morphologique est incertaine, ou pour diagnostiquer les espèces cryptiques, afin d'assurer que les résultats obtenus auprès de différents laboratoires d'écotoxicologie font référence à la même espèce ou souche. Le présent document est applicable à l'identification de formes immatures n'ayant pas de caractéristiques morphologiques de diagnostic (œufs, larves, juvéniles) ainsi qu'à l'identification rationalisée des spécimens prélevés lors d'études de surveillance sur le terrain, où un grand nombre d'organismes de taxons divers sont classés. NOTE 2 En principe, toutes les espèces régulièrement utilisées lors des essais écotoxicologiques peuvent être analysées par code-barres ADN. Outre les vers de terre Eisenia fetida et E. andrei, d'autres exemples d'espèces terrestres sont Lumbricus terrestris, L. rubellus, Allolobophora chlorotica, Aporrectodea rosea, A. caliginosa, Dendrodrilus rubidus, Enchytraeus albidus et E. crypticus (Haplotaxida) ; Folsomia candida, F. fimetaria, Proisotoma minuta et Sinella curviseta (Collembola) ; Hypoaspis aculeifer et Oppia nitens (Acari) ; Aleochara bilineata et Poecilus cupreus (Coleoptera) ; Scathophaga stercoraria, Musca autumnalis (Diptera) ou Pardosa sp. (Arachnida). De plus, les nématodes ou les escargots et même les plantes peuvent être ajoutés à cette liste non exhaustive.

General Information

Status
Published
Publication Date
26-Feb-2019
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
27-Feb-2019
Completion Date
27-Feb-2019
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ISO 21286:2019 - Soil quality -- Identification of ecotoxicological test species by DNA barcoding
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21286
First edition
2019-03
Soil quality — Identification of
ecotoxicological test species by DNA
barcoding
Qualité du sol — Identification des espèces par code-bare ADN dans
les essais d'écotoxicologie
Reference number
ISO 21286:2019(E)
ISO 2019
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ISO 21286:2019(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2019

All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may

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Published in Switzerland
ii © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21286:2019(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Reagents and material .................................................................................................................................................................................... 3

5.1 Biological material ............................................................................................................................................................................... 3

5.2 Enzyme .......................................................................................................................................................................................................... 3

5.3 Oligonucleotide PCR primers ..................................................................................................................................................... 3

5.4 Reagents........................................................................................................................................................................................................ 3

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 4

7 General requirements ..................................................................................................................................................................................... 5

7.1 Experimental precaution and contamination avoidance ................................................................................... 5

7.2 Safety precautions ................................................................................................................................................................................ 5

7.2.1 Chemical hazards............................................................................................................................................................. 5

7.2.2 Physical hazards ............................................................................................................................................................... 6

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 6

8.1 DNA isolation ............................................................................................................................................................................................ 6

8.2 Quantification .......................................................................................................................................................................................... 7

8.3 PCR .................................................................................................................................................................................................................... 7

8.3.1 Target genomic region ................................................................................................................................................ 7

8.3.2 Primer design ..................................................................................................................................................................... 7

8.3.3 Primer synthesis .............................................................................................................................................................. 7

8.3.4 PCR ............................................................................................................................................................................................... 8

8.4 Checking the amplicon size .......................................................................................................................................................... 9

8.5 Purification ................................................................................................................................................................................................. 9

8.6 Sequencing ................................................................................................................................................................................................. 9

8.7 Bioinformatics ......................................................................................................................................................................................... 9

8.7.1 General...................................................................................................................................................................................... 9

8.7.2 Electropherogram or raw sequence quality checking ..................................................................10

8.7.3 Trimming of low-quality regions and primers sequences ........................................................10

8.7.4 Sequence overlapping ..............................................................................................................................................10

8.7.5 Sequence verification ........................................................................................................................................... .....11

8.7.6 Reviewing the edited sequence ........................................................................................................................11

8.7.7 Species assignment .....................................................................................................................................................11

8.7.8 Quality of the reference databases ................................................................................................................12

9 Calculation and expression of results ..........................................................................................................................................13

10 Validity of the test .............................................................................................................................................................................................13

11 Test report ................................................................................................................................................................................................................14

Annex A (informative) Eisenia Barcoding Initiative: A ring test to evaluate the applicability

of DNA barcoding for the identification of Eisenia species ....................................................................................15

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................18

© ISO 2019 – All rights reserved iii
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ISO 21286:2019(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following

URL: www .iso .org/iso/foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,

Biological characterization.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21286:2019(E)
Introduction

Currently, test species identification is usually based on morphological characters. However, this does

not always give clear results because
a) few taxonomic experts are available,

b) closely related species can differ by a few, easily overlooked characters, and

c) even more importantly, several test species are in fact complexes of cryptic species.

A good example is the compost worm Eisenia fetida/andrei (used in ISO 11268-1, ISO 11268-2 and

ISO 17512-1), in which morphological traits alone may not be sufficient to discriminate between both

[5][36] [50]

species . Another well-known case is the predatory mite, Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer ,

[31]
which might get confused with H. miles, widely used in biological pest control .

Species misidentifications, the use of a morphospecies which is actually a complex of cryptic species, or

even species mixing in lab cultures, can be a serious problem for the reliability of the ecotoxicological

tests. Sibling species in a morphospecies complex can exhibit ecological, behavioural, and physiological

differences, and can differ also in their response to toxicants (e.g. References [2], [17], [35], [40]). This

also seems to be the case of the springtail Folsomia candida (used in ISO 11267 and ISO 17512-2), in

which considerable levels of genetic differentiation have been found among natural populations of F.

[9][19][41]

candida and among laboratory strains . Although different laboratory strains have been found

[12][9]

to exhibit only minor differences in the sensitivity towards some chemicals , other studies have

detected significant variation in phenmedipham avoidance behaviour and divergent fitness responses

[14][30]

to cadmium exposure among genetically differentiated strains . Moreover, even if two species

have similar responses to toxicants, the presence of two species within the same laboratory culture can

[36]

result in the production of sterile hybrids, which will bias the outcome of reproduction tests .

Implementing species identification via DNA barcoding can help to overcome these obstacles, ensuring

that the species or strain used for testing is well characterized. As a result, quality assurance can be

improved, making the results obtained by different ecotoxicological laboratories far more reliable and

comparable. For Eisenia fetida/E. andrei this work, including an international ringtest, has already been

[36]

performed , see Annex A. The conclusions of this ringtest can be summarized as follows.

— DNA barcoding is a reliable and practical method for identifying Eisenia species.

— Only 17 out of 28 ecotoxicological laboratories were correct in their taxonomic assignment. Most

laboratories with wrong or unknown assignments actually have E. andrei in stock.

— The existence of a cryptic species pair within E. fetida is a plausible hypothesis.

— It is important that earthworms used for ecotoxicological tests are regularly (re-)identified by DNA

barcoding.

Very probably, similar experiences and recommendations can be drawn for other invertebrates

species used in terrestrial ecotoxicology, as well as plants. Indeed, DNA barcoding has proven to be

useful for specimen identification and species delimitation in many organism groups, including other

[13][37] [16] [15] [32] [42] [28]
earthworms , enchytraeids , mites , collembolans , molluscs , nematodes and
[8]
terrestrial plants .
© ISO 2019 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21286:2019(E)
Soil quality — Identification of ecotoxicological test species
by DNA barcoding
1 Scope

This document specifies a protocol to identify ecotoxicological test specimens (mainly invertebrates

and plants) to the species level, based on the DNA barcoding technique. This protocol can be used by

laboratories performing DNA barcoding in order to standardize both the wet-lab and data analysis

workflows as much as possible, and make them compliant with community standards and guidelines.

This document does not intend to specify one particular strain for each test method, but to accurately

document the species/strain which was used.

NOTE 1 This does not imply that DNA barcoding is performed in parallel to each test run, but rather regularly

(e.g. once a year, such as reference substance testing) and each time a new culture is started or new individuals

are added to an ongoing culture.

This document does not aim at duplicating or replacing morphological-based species identifications. On

the contrary, DNA barcoding is proposed as a complementary identification tool where morphology is

inconclusive, or to diagnose cryptic species, in order to ensure that the results obtained from different

ecotoxicological laboratories are referring to the same species or strain.

This document is applicable to identifications of immature forms which lack morphological diagnostic

characters (eggs, larvae, juveniles), as well as the streamline identification of specimens collected in

field monitoring studies, where large numbers of organisms from diverse taxa are classified.

NOTE 2 In principle, all species regularly used in ecotoxicological testing can be analysed by DNA barcoding.

Besides the earthwoms Eisenia fetida and E. andrei, further examples for terrestrial species are Lumbricus

terrestris, L. rubellus, Allolobophora chlorotica, Aporrectodea rosea, and A. caliginosa, Dendrodrilus rubidus,

Enchytraeus albidus, and E. crypticus (Haplotaxida); Folsomia candida, F. fimetaria, Proisotoma minuta, and Sinella

curviseta (Collembola); Hypoaspis aculeifer and Oppia nitens (Acari); Aleochara bilineata and Poecilus cupreus

(Coleoptera); Scathophaga stercoraria, Musca autumnalis (Diptera) or Pardosa sp. (Arachnida). Nematodes or

snails and even plants can also be added to this list.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
amplicon
specific DNA product generated by PCR (3.5) using one pair of PCR primers (3.6)
3.2
DNA barcode
unique pattern of DNA sequence that identifies each species
© ISO 2019 – All rights reserved 1
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ISO 21286:2019(E)
3.3
electropherogram
trace file

combination of a graphical representation of a Sanger DNA sequence composed of colour-coded peaks

with each colour corresponding to one nucleotide
Note 1 to entry: They are automatically supplied by DNA sequencing programs.
3.4
Phred quality score
Q score
quality measure used to assess the accuracy of a sequencing reaction

Note 1 to entry: This quality measure indicates the probability that a given base is called incorrectly by the

sequencer. Phred scores are on a logarithmic scale. Therefore, if Phred assigns a Q score of 30 (Q30) to a base, this

is equivalent to the probability of an incorrect base call 1 in 1 000 times. A lower base call accuracy of 99 % (Q20)

will have an incorrect base call probability of 1 in 100, meaning that every 100 base pairs sequencing read will

likely contain an error.
3.5
polymerase chain reaction
PCR

molecular biology technique for rapidly synthesising multiple copies of a given DNA segment by using a

DNA polymerase and an oligonucleotide primer pair
3.6
PCR primer

short oligonucleotides (usually 15 to 30 nucleotides in length) that allow PCR amplification of DNA

between specific sites

Note 1 to entry: The two primers (a forward and a reverse) are base-paired to the top and bottom strand of the

template DNA, and their 3’-OH ends are in convergent direction.
4 Principle

DNA barcoding is a molecular method that uses a short and standardized DNA region (the DNA barcode)

[22]
as a genetic tag for species-level identification .

Since its inception in 2003 and the launch of the Barcode of Life project, DNA barcoding has

systematically been applied not only to biological research, but also to several industrial fields where

a correct identification of biological materials is essential, such as the food industry. For example, it

[29]

is helping to detect fraud in herbal medicinal products , and it has been adopted by the Food and

[21][44]

Drug Administration (FDA) for seafood and fish identification . In fact, DNA barcoding is likely to

[20]

become a routine test in many fields, in particular in food quality control and traceability .

Briefly, the goal of DNA barcoding is:

a) to obtain the nucleotide sequence of a standardised DNA region from an unidentified sample (a test

specimen),

b) to compare that sequence with known sequences in a reference database by using bioinformatic

methods, and
c) based on such comparison, to identify the sample to the species level.

Therefore, DNA barcoding cannot be a useful identification tool without a reliable and comprehensive

reference database, which includes enough samples of each species from across its geographic range to

account for intraspecific variability. Also, DNA barcoding relies on the premise that sequences in this

barcode region are more similar between members of a species than to sequences of any other species

(the so called barcode gap). Therefore, before applying DNA barcoding, a species delimitation study

2 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21286:2019(E)

of the target organismal group should have been carried out to assess its efficacy for discriminating

species.

It is essential that the DNA barcoding method is carried out by trained staff. On the one hand, trained

laboratory technicians are needed to optimize the wet-lab protocols for each organismal group.

On the other hand, the wet-lab pipeline needs to be supervised by scientists trained in genomics

and systematics. These scientists should also be in charge of the electropherogram and/or raw DNA

sequence file analysis and species assignment.
5 Reagents and material
5.1 Biological material

Adequate specimen preservation is a critical factor to obtain good-quality DNA from samples. Whenever

possible, specimen samples for DNA barcoding should be taken from freshly harvested or fresh-frozen

tissue. Exposure to preservation agents such as ethyl acetate or formaldehyde should be avoided, as

they destroy DNA.

Freezing at –80 °C or in liquid nitrogen (−196 °C) is the preferred method for long-term storage of

tissue samples. DNA in dried specimens generally remains stable for at least one year, but degradation

[23]
becomes increasingly problematic over time .

Ethanol-preserved material is easily analysed when fresh, but DNA will slowly become acidified and

degraded unless ethanol is regularly refreshed or buffered. For proper tissue preservation, use an

ethanol concentration of 95 % to 99 %, and ensure that the volume of ethanol is at least three times

greater than the volume of tissue. In order to maintain the ethanol concentration to at least 95 %, it is

necessary to replace the ethanol solution within the first days (at least three days) after sampling, and

[23]

tightly seal the vial to avoid evaporation . A combination of low temperatures (–20 °C) and ethanol

will help preserve the samples for long-term storage and helps prevent degradation during thawing and

re-freezing cycles.

As a general rule, DNA barcoding analysis should follow tissue collection as soon as possible, but specimens

[21][23]

adequately preserved and stored for several months will perform well in DNA extraction .

5.2 Enzyme

Taq Polymerase from Thermus aquaticus is standard for PCR. Hot start Taq polymerases and/or high

fidelity DNA polymerases have been shown to offer a high performance in DNA barcoding, allowing

for greater amplification sensitivity and increased ease of reaction setup than standard polymerases

(http: //ccdb .ca/resources/).

Alternatively, pre-optimised commercial master mixes may be used. These consist of a premixed,

ready-to-use solution containing Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl and reaction buffers at optimal

concentrations for efficient amplification of DNA templates in routine PCR.
5.3 Oligonucleotide PCR primers
For Oligonucleotide PCR primers, see 8.3.2 and 8.3.3.
5.4 Reagents
5.4.1 Nuclease-free water molecular grade water (dd H O).
5.4.2 TE buffer (Tris-EDTA buffer), 1-fold, pH 8,0.

Dissolve 1 ml of 1 mol/l Tris base (pH 8,0), 0,2 ml EDTA (0,5 mol/l) in 98,8 ml of molecular grade water.

Adjust the pH to 8,0 with concentrated HCl.
© ISO 2019 – All rights reserved 3
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ISO 21286:2019(E)
5.4.3 Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs).

5.4.4 PCR buffer, without Mg (500 mmol/l KCl, 100 mmol/l Tris-HCl, pH 8,3 at 25 °C).

Buffer is usually supplied with each enzyme as a 10-fold or fivefold concentrate. Use only the buffer

supplied with each particular enzyme.
5.4.5 Magnesium chloride, MgCl .

5.4.6 PCR additives (optional): trehalose dihydrate, bovine serum albumin (BSA), formamide,

dimethyl sulfoxide (DMSO).
5.4.7 Agarose (analytical grade, standard melting temperature).
5.4.8 TAE (gel-running buffer), 50-fold stock solution, pH 8,3.

Dissolve 242 g of Tris base [tris(hydroxymethyl)aminomethane], 57,1 ml of glacial acetic acid

(17,4 mol/l), 100 ml of 500 mmol/l EDTA solution (pH 8,0) in 842,9 ml of molecular grade water.

5.4.9 Size standard 100 base pair (bp) DNA ladder, a commercially available molecular-weight

marker suitable for sizing double-stranded DNA from 100 to 1 000 base pairs during gel electrophoresis.

5.4.10 6-fold Loading buffer, 3 ml of 100 % glycerol, 0,025 g of bromophenol blue, 0,025 g of xylene

cyanol FF in 7 ml of molecular grade water.

5.4.11 Ethidium bromide solution (0,5 μg/ml) or any safer alternative nucleic acid stain.

5.4.12 PCR purification kit, either using enzymatic reactions, magnetic beads or silica-membrane-

based cleanup.
5.4.13 5-fold Sequencing buffer (400 nm Tris-HCl, pH 9,0, 10 mmol/l MgCl ).
5.4.14 BigDye® Terminator v3.1 cycle sequencing kit .
5.4.15 Pop-7 Polymer for 3730 DNA analyzers .
5.4.16 3730 DNA analyser capillary array, 50 cm .
5.4.17 GeneScanTM 500 LIZTM DYE Size Standard .
5.4.18 Highly deionized formamide.
6 Apparatus

The usual laboratory equipment, including micropipettes, centrifuge, and the following specific

equipment.

6.1 Spectrophotometer, to measure the concentration and purity of double-stranded DNA at 260 nm.

1) This protocol has been validated using the 3730 DNA Analyzer capillary electrophoresis system and the

BigDye terminator chemistry. They are registered trademarks of Applied Biosystems. This information is given for

the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named.

Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.

4 © ISO 2019 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 21286:2019(E)
6.2 Laminar flow hood.
6.3 PCR thermal cycler.
6.4 Horizontal electrophoresis system.
6.5 Electrophoresis power supply.
6.6 Gel documentation system.

6.7 Automated DNA sequencing system, for DNA sequencing (e.g. 3730 DNA analyser, Applied

Biosystems) .
7 General requirements
7.1 Experimental precaution and contamination avoidance

Good laboratory practice and specific anti-contamination strategies are necessary to minimize

the chance of contamination during the DNA isolation and PCR steps, either from DNA previously

handled in the laboratory, amplicon carry-over from previous PCR assays, or sample-to-sample cross-

contamination.

There are some basic steps to be followed to prevent exogenous contamination and sample carry-over:

work on a clean surface, wear gloves, and use disposable or sterilised instruments. If possible, laboratories

should use separate rooms – or, at least, different benchtops and work spaces of the laboratory – for

template extraction, PCR reagent preparation, and amplification. Work shall always flow from the

cleanest to the dirtiest area. Each work area should have dedicated supplies and reagents, as well as lab

coats and gloves. It is recommended that the setting up of PCR reactions is performed in a laminar flow

hood. It is also necessary to use sterile plastic-ware and aerosol-resistant filtered pipette tips.

When handling multiple specimens, care shall be taken to avoid cross-contamination between samples.

Anything (gloves, surfaces) that comes in contact with one sample shall be discarded or cleaned before

proceeding with the next one by wiping it with 1 % bleach solution and then thoroughly rinsing it with

water. Tools used to collect a fragment of tissue (tweezers, scissors, scalpels, etc.) shall be sterilized

before and after handling each sample. To do so, soak the instruments into ethanol (70 % to 96 %) and

then hold them briefly over the flame of a Bunsen burner or a lighter to burn off the alcohol.

7.2 Safety precautions
7.2.1 Chemical hazards

WARNING 1 — Ethidium bromide (EtBr) staining is commonly used to visualize DNA in agarose

gels. EtBr is a potential mutagen and is a skin, eye, and respiratory irritant. Avoid direct skin

contact, wear nitrile gloves, and use adequate eye protection. All staining of gels should be

done in a designated area in the laboratory, and all EtBr waste should be disposed of in labelled

containers.

2) This protocol has been validated using the 3730 DNA Analyzer capillary electrophoresis system and the

BigDye terminator chemistry. They are registered trademarks of Applied Biosystems. This information is given for

the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named.

Equivalent products may be used if they can be
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21286
Première édition
2019-03
Version corrigée
2019-12
Qualité du sol — Identification des
espèces par codes-barres ADN dans
les essais d'écotoxicologie
Soil quality — Identification of ecotoxicological test species by DNA
barcoding
Numéro de référence
ISO 21286:2019(F)
ISO 2019
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ISO 21286:2019(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2019

Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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ISO 21286:2019(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d'application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Réactifs et matériel ............................................................................................................................................................................................ 3

5.1 Matériel biologique ............................................................................................................................................................................. 3

5.2 Enzyme .......................................................................................................................................................................................................... 3

5.3 Amorces oligonucléotidiques de PCR .................................................................................................................................. 4

5.4 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................... 4

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 5

7 Exigences générales .......................................................................................................................................................................................... 5

7.1 Précautions expérimentales et prévention de la contamination ................................................................. 5

7.2 Précautions de sécurité ................................................................................................................................................................... 6

7.2.1 Dangers chimiques ........................................................................................................................................... .............. 6

7.2.2 Dangers physiques ......................................................................................................................................................... 6

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 6

8.1 Isolement de l’ADN ............................................................................................................................................................................... 6

8.2 Quantification .......................................................................................................................................................................................... 7

8.3 PCR .................................................................................................................................................................................................................... 7

8.3.1 Région génomique cible ............................................................................................................................................ 7

8.3.2 Désignation d’amorces ............................................................................................................................................... 7

8.3.3 Synthèse d’amorces ....................................................................................................................................................... 8

8.3.4 PCR ............................................................................................................................................................................................... 8

8.4 Contrôle de la taille des amplicons ........................................................................................................................................ 9

8.5 Purification ................................................................................................................................................................................................. 9

8.6 Séquençage ..............................................................................................................................................................................................10

8.7 Bioinformatique ..................................................................................................................................................................................10

8.7.1 Généralités .........................................................................................................................................................................10

8.7.2 Contrôle qualité des électrophorégrammes ou des séquences brutes ..........................10

8.7.3 Rognage des séquences de faible qualité et des amorces ..........................................................11

8.7.4 Assemblage des séquences ..................................................................................................................................11

8.7.5 Vérification des séquences ...................................................................................................................................11

8.7.6 Contrôle de la séquence éditée .........................................................................................................................11

8.7.7 Assignation des espèces .........................................................................................................................................12

8.7.8 Qualité des bases de données de référence ...........................................................................................13

9 Calcul et expression des résultats ...................................................................................................................................................14

10 Validité de l’essai ...............................................................................................................................................................................................14

11 Rapport d'essai ...................................................................................................................................................................................................15

Annexe A (informative) Initiative du code-barres ADN d’Eisenia: essai interlaboratoires

visant à évaluer l’applicabilité du code-barres ADN dans le cadre de l’identification

de l’espèce Eisenia ......... ...................................................................................................................................................................................16

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................19

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ISO 21286:2019(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, de la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute autre information au sujet de

l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les

obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,

Caractérisation biologique.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.

La présente version corrigée de l’ISO 21286:2019 inclut la correction suivante: le titre du document a

été corrigé en remplaçant «code-bare» par «codes-barres».
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ISO 21286:2019(F)
Introduction

Actuellement, l’identification des espèces utilisées pour des essais standardisés repose généralement

sur des caractéristiques morphologiques. Toutefois, ceci ne permet pas toujours d’obtenir des résultats

clairs car:
a) peu de taxonomistes sont disponibles,

b) des espèces très ressemblantes peuvent différer au niveau de quelques caractéristiques facilement

ignorées, et

c) surtout, plusieurs espèces d’essai sont en réalité des complexes d’espèces cryptiques.

Un bon exemple est le ver de compost Eisenia fetida/andrei (utilisé dans l’ISO 11268-1, l’ISO 11268-2 et

l’ISO 17512-1), pour lequel les caractéristiques morphologiques seules peuvent ne pas être suffisantes

[5][36]

pour distinguer les deux espèces . Un autre cas connu est l’acarien prédateur, Hypoaspis (Geolaelaps)

[50]

aculeifer , qu’il est possible de confondre avec H. miles, couramment utilisé dans la lutte biologique

[31]
contre les parasites .

Les erreurs d’identification des espèces, l’utilisation d’une morpho-espèce qui est en réalité un complexe

d’espèces cryptiques, ou encore le mélange d’espèces dans des cultures de laboratoire, peuvent être très

problématiques pour la fiabilité des essais écotoxicologiques. Dans un complexe de morpho-espèces, les

espèces jumelles peuvent présenter des différences écologiques, comportementales et physiologiques

et peuvent également réagir différemment aux substances toxiques (par exemple, Références [2], [17],

[35], [40]). Il semblerait que cela soit également le cas du collembole Folsomia candida (utilisé dans

l’ISO 11267 et l’ISO 17512-2), dans lequel des niveaux de différenciation génétique ont été observés

[9],[19],[41]

parmi les populations naturelles de F. candida et parmi les souches de laboratoire . Même si

différentes souches de laboratoire se sont avérées présenter uniquement des différences mineures en

[12],[9]

termes de sensibilité à certains produits chimiques , d’autres études ont détecté une variation

importante du comportement d’évitement du phenmedipham et des réactions d’adaptation divergentes

[14][30]

à l’exposition au cadmium parmi les souches génétiquement différenciées . De plus, même si deux

espèces présentent des réponses similaires aux substances toxiques, la présence de deux espèces dans

la même culture de laboratoire peut entraîner la production d’hybrides stériles, ce qui faussera le

[36]
résultat des essais de reproduction .

L’identification des espèces par code-barres ADN peut contribuer à pallier ces problèmes, en assurant

que l’espèce ou la souche utilisée pour l’essai est correctement caractérisée. Par conséquent, l’assurance

de la qualité des essais peut être améliorée, et ce faisant, les résultats obtenus par différents laboratoires

d’écotoxicologie sont donc nettement plus fiables et comparables. Pour Eisenia fetida/E. andrei, ce

[36]

travail, y compris un essai interlaboratoires international, a déjà été effectué , voir Annexe A. Les

conclusions de cet essai interlaboratoires peuvent être résumées de la manière suivante:

— Le code-barres ADN est une méthode fiable et pratique pour identifier l’espèce Eisenia.

— Seuls 17 des 28 laboratoires d’écotoxicologie ont réalisé une assignation taxonomique correcte.

La majorité des laboratoires ayant effectué une assignation erronée ou inconnue avaient E. andrei

en stock.

— L’existence d’une paire d’espèces cryptiques au sein d’E. fetida est une hypothèse plausible.

— Il est important que les vers de terre utilisés pour les essais écotoxicologiques soient régulièrement

(ré-)identifiés par code-barres ADN.

Très probablement, des expériences et recommandations similaires peuvent être tirées pour d’autres

espèces d’invertébrés utilisées dans l’écotoxicologie terrestre, ainsi que pour des végétaux. En effet, le

code-barres ADN s’est révélé utile pour l’identification de spécimens et la délimitation d’espèces dans de

[13],[37] [16] [15]

nombreux groupes d’organismes, y compris les vers de terre , les enchytréïdes , les acariens ,

[32] [42] [28] [8]
les collemboles , les mollusques , les nématodes et les plantes terrestres .
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NORME INTERNATIONALE ISO 21286:2019(F)
Qualité du sol — Identification des espèces par codes-
barres ADN dans les essais d'écotoxicologie
1 Domaine d'application

Le présent document spécifie un protocole d’identification de spécimens d’essais écotoxicologiques

(principalement des invertébrés et des végétaux) au niveau de l’espèce, reposant sur la technique du

code-barres ADN. Ce protocole peut être utilisé par les laboratoires effectuant le code-barres ADN

afin de normaliser le plus possible les travaux de laboratoire et les flux d’analyse de données, et de les

mettre en conformité avec les normes et les lignes directrices communautaires.

Le présent document ne prévoit pas de spécifier une souche particulière pour chaque méthode d’essai,

mais de documenter avec exactitude l’espèce/la souche qui a été utilisée.

NOTE 1 Cela ne veut pas dire que le code-barres ADN est effectué parallèlement à chaque cycle d’essai, mais

qu’il est effectué régulièrement (par exemple, une fois par an, notamment pour l’essai mené avec la substance de

référence) et à chaque fois qu’une nouvelle culture est démarrée ou que de nouveaux individus sont ajoutés à une

culture existante.

Le présent document ne vise pas à reproduire ou remplacer les identifications d’espèces reposant

sur des caractéristiques morphologiques. En revanche, le code-barres ADN est proposé comme

outil d’identification complémentaire lorsque l’identification morphologique est incertaine, ou pour

diagnostiquer les espèces cryptiques, afin d’assurer que les résultats obtenus auprès de différents

laboratoires d’écotoxicologie font référence à la même espèce ou souche.

Le présent document est applicable à l’identification de formes immatures n’ayant pas de caractéristiques

morphologiques de diagnostic (œufs, larves, juvéniles) ainsi qu’à l’identification rationalisée des

spécimens prélevés lors d’études de surveillance sur le terrain, où un grand nombre d’organismes de

taxons divers sont classés.

NOTE 2 En principe, toutes les espèces régulièrement utilisées lors des essais écotoxicologiques peuvent être

analysées par code-barres ADN. Outre les vers de terre Eisenia fetida et E. andrei, d’autres exemples d’espèces

terrestres sont Lumbricus terrestris, L. rubellus, Allolobophora chlorotica, Aporrectodea rosea, A. caliginosa,

Dendrodrilus rubidus, Enchytraeus albidus et E. crypticus (Haplotaxida); Folsomia candida, F. fimetaria, Proisotoma

minuta et Sinella curviseta (Collembola); Hypoaspis aculeifer et Oppia nitens (Acari); Aleochara bilineata et Poecilus

cupreus (Coleoptera); Scathophaga stercoraria, Musca autumnalis (Diptera) ou Pardosa sp. (Arachnida). De plus,

les nématodes ou les escargots et même les plantes peuvent être ajoutés à cette liste non exhaustive.

2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online Browsing Platform (OBP): disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
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3.1
amplicon

fragment d’ADN spécifique généré par PCR (3.5) à l’aide d’une paire d’amorces PCR (3.6)

3.2
code-barres ADN
motif unique de séquence ADN qui identifie chaque espèce
3.3
électrophérogramme
électrophoregramme d’ADN

ensemble constitué d’une représentation graphique de la séquence ADN composée de pics de couleur,

chaque couleur correspondant à un nucléotide

Note 1 à l'article: Il est automatiquement fourni par les programmes de séquençage d’ADN.

3.4
score de qualité Phred
score Q

mesure de qualité utilisée pour évaluer l’exactitude d’une réaction de séquençage

Note 1 à l'article: Cette mesure de qualité indique la probabilité pour qu’une base donnée soit dénommée à tort

par le séquenceur. Les scores Phred utilisent une échelle logarithmique. Par conséquent, si le programme Phred

assigne un score Q de 30 (Q30) à une base, cela correspond à une probabilité de dénomination de base incorrecte

de 1 sur 1 000. Une exactitude de dénomination de base moins élevée de 99 % (Q20) donnera une probabilité de

dénomination de base incorrecte de 1 sur 100, soit un risque d’erreur de séquençage toutes les 100 paires de base.

3.5
réaction de polymérisation en chaînes
PCR

technique de biologie moléculaire permettant de synthétiser rapidement plusieurs copies d’un segment

d’ADN donné en utilisant l’enzyme ADN polymérase et une paire d’amorces oligonucléotidiques

3.6
amorce PCR

oligonucléotides courts (généralement d’une longueur de 15 à 30 nucléotides) permettant l’amplification

PCR de l’ADN entre des sites spécifiques

Note 1 à l'article: Les deux amorces (une amorce sens et une amorce antisens) sont appariées au brin supérieur et

au brin inférieur de la matrice d’ADN, et leurs extrémités 3’-OH sont dans une direction convergente.

4 Principe

Le code-barres ADN est une méthode moléculaire qui utilise une région d’ADN courte et normalisée (le

[22)

code-barres ADN) comme marqueur génétique pour l’identification au niveau de l’espèce .

Depuis sa création en 2003 et le lancement du projet Barcode of Life, le code-barres ADN a été

systématiquement appliqué non seulement à la recherche biologique, mais également dans plusieurs

domaines industriels dans lesquels il est essentiel d’identifier correctement le matériel biologique,

notamment dans l’industrie agroalimentaire. Par exemple, il est utile pour détecter les fraudes dans les

[29]

médicaments à base de plantes , et il a été adopté par la Food and Drug Administration (FDA) pour

[21][44]

l’identification des poissons et produits de la mer . En fait, le code-barres ADN devrait devenir

un essai de routine dans de nombreux domaines, en particulier dans le contrôle de la qualité et la

[20]
traçabilité des aliments .
Pour résumer, les objectifs du code-barres ADN sont:

a) d’obtenir la séquence nucléotidique de la région d’ADN ciblée à partir d’un échantillon non identifié

(un spécimen d’essai);
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b) de comparer cette séquence avec les séquences connues dans une base de données de référence en

utilisant des méthodes bioinformatiques, et
c) d’identifier, d’après cette comparaison, l’échantillon au niveau de l’espèce.

Par conséquent, le code-barres ADN ne peut pas être un outil d’identification utile si l’on ne dispose pas

d’une base de données de référence fiable et exhaustive. Il faut donc avoir suffisamment d’échantillons

de chaque espèce de toute sa zone géographique pour tenir compte de la variabilité intraspécifique.

De plus, le code-barres ADN repose sur l’hypothèse selon laquelle que les séquences du code-barres

sont davantage similaires entre les membres d’une espèce qu’à celles d’autres espèces (appelé barcode

gap). Ainsi, avant d’appliquer le code-barres ADN, il convient d’effectuer une étude de délimitation des

espèces du groupe d’organismes cible pour évaluer son efficacité de différenciation des espèces.

Il est essentiel que la méthode de code-barres ADN soit effectuée par un personnel qualifié. De plus, il

est nécessaire que les techniciens de laboratoire soient formés pour appliquer de manière optimale les

protocoles de travaux de laboratoire pour chaque groupe d’organismes. Par ailleurs, le déroulement des

travaux de laboratoire doit être supervisé par des scientifiques ayant une formation en génomique et en

systématique. Il convient également que ces scientifiques effectuent l’analyse des électrophorégrammes

et/ou du fichier de séquences ADN brutes ainsi que l’assignation des espèces.
5 Réactifs et matériel
5.1 Matériel biologique

Il est essentiel de conserver correctement les spécimens pour obtenir des échantillons d’ADN de bonne

qualité. Si cela est possible, il convient de prélever des échantillons de spécimens pour le code-barres

ADN sur un tissu fraîchement recueilli ou un tissu frais congelé. Il convient d’éviter toute exposition à

des agents conservateurs tels que l’acétate d’éthyle ou le formaldéhyde, car ils détruisent l’ADN.

Privilégier la congélation à –80 °C ou dans l’azote liquide (–196 °C) pour le stockage à long terme des

échantillons de tissu. L’ADN des spécimens séchés reste généralement stable pendant au moins un an,

[23]
mais la dégradation devient de plus en plus problématique au fil du temps .

Le matériel conservé dans l’éthanol est facilement analysé quand il est frais, mais l’ADN va lentement

s’acidifier et se dégrader, sauf si l’éthanol est régulièrement changé ou tamponné. Pour conserver

correctement le tissu, utiliser une concentration en éthanol de 95 % à 99 % et vérifier que le volume

d’éthanol est au moins trois fois plus élevé que le volume de tissu. Pour maintenir la concentration en

éthanol à 95 % minimum, il est nécessaire de remplacer la solution d’éthanol pendant les premiers jours

(au moins trois jours) suivant l’échantillonnage, et de fermer hermétiquement le flacon pour éviter toute

[23]

évaporation . La combinaison de faibles températures (–20 °C) et d’éthanol permettra de conserver

les échantillons pendant longtemps et d’éviter toute dégradation pendant les cycles de décongélation et

recongélation.

En règle générale, il convient d’effectuer l’analyse par code-barres ADN dès que possible après le

prélèvement du tissu. Toutefois, des spécimens correctement conservés et stockés pendant plusieurs

[21][23]
mois seront parfaitement exploitables pour l’extraction d’ADN .
5.2 Enzyme

La Taq Polymérase de Thermus aquaticus est l’enzyme de référence pour la PCR. Les Taq Polymérases

« hot start » et/ou les ADN polymérases haute-fidélité offrent une haute performance pour le code-

barres ADN, permettant d’obtenir une meilleure sensibilité d’amplification et une plus grande facilité

de préparation de la réaction PCR que les polymérases classiques (http:// ccdb .ca/ resources/ ).

Les mélanges prêts à l’emploi disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés. Ils

comprennent une solution pré-mélangée contenant de la Taq ADN polymérase, des dNTP, du MgCl et

des tampons de réaction à des concentrations optimales pour amplifier efficacement les matrices d’ADN

lors de la PCR de routine.
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5.3 Amorces oligonucléotidiques de PCR
Pour les amorces oligonucléotidiques de PCR, voir 8.3.2 et 8.3.3.
5.4 Réactifs
5.4.1 Eau de qualité biologie moléculaire exempte de nucléase (dd H O).
5.4.2 Tampon TE (tampon Tris-EDTA), 1x, pH 8,0.

Dissoudre 1 ml de base Tris 1 mol/l (pH 8,0) et 0,2 ml d’EDTA (0,5 mol/l) dans 98,8 ml d’eau de qualité

biologie moléculaire. Ajuster le pH à 8,0 avec du HCl concentré.
5.4.3 Désoxynucléoside triphosphates (dNTP).

5.4.4 Tampon de PCR, sans Mg (KCl 500 mmol/l, Tris-HCl 100 mmol/l, pH 8,3 à 25 °C).

Le tampon est généralement fourni avec chaque enzyme sous la forme d’un concentré 10x ou 5x. Utiliser

uniquement le tampon fourni avec chaque enzyme spécifique.
5.4.5 Chlorure de magnésium, MgCl .

5.4.6 Additifs de PCR (en option): tréhalose dihydraté, sérumalbumine bovine (BSA), formamide,

diméthylsulfoxyde (DMSO).
5.4.7 Agarose (de qualité analytique, température de fusion standard).
5.4.8 TAE (tampon d’électrophorèse), solution mère concentrée 50x, pH 8,3.

Dissoudre 242 g de base Tris [tris(hydroxyméthyl)aminométhane], 57,1 ml d’acide acétique glacial

(17,4 mol/l), 100 ml de solution d’EDTA 500 mmol/l (pH 8,0) dans 842,9 ml d’eau de qualité biologie

moléculaire.

5.4.9 Échelle d’ADN de 100 paires de base (pb) de taille standard, un marqueur de poids

moléculaire disponible dans le commerce pour déterminer la taille des fragments d’ADN double brin de

100 à 1 000 paires de base pendant l’électrophorèse sur gel.

5.4.10 Tampon de charge 6x, 3 ml de glycérol 100 %, 0,025 g de base bromophénol, 0,025 g de xylène

cyanol FF dans 7 ml d’eau de qualité biologie moléculaire.

5.4.11 Solution de bromure d’éthidium (0,5 μg/ml) ou tout autre colorant d’acide nucléique plus sûr.

5.4.12 Kit de purification pour PCR, en utilisant des réactions enzymatiques et des billes magnétiques

ou la purification sur membrane de silice.
5.4.13 Tampon de séquençage 5x (400 nm de Tris-HCl, pH 9,0, MgCl 10 mmol/l).
5.4.14 Kit de séquençage de cycle BigDye® Terminator v3.1 .

1) Ce protocole a été validé en utilisant le système d’électrophorèse capillaire de l’analyseur d’ADN 3730 et la

chimie du BigDye Terminator. Ils sont des marques déposées d’Applied Biosystems. Cette information est donnée

par souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement

de l'ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux

...

Questions, Comments and Discussion

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