SIST ISO 14669:2010
Water quality - Determination of acute lethal toxicity to marine copepods (Copepoda, Crustacea)
Water quality - Determination of acute lethal toxicity to marine copepods (Copepoda, Crustacea)
This International Standard describes a method for the determination of the acute toxicity to one of three specified
species of marine copepod (Copepoda, Crustacea) of
a) chemical substances which are soluble, or can be maintained as a stable suspension or dispersion, under the
conditions of the test;
b) industrial or sewage effluents, treated or untreated, after decantation, filtration or centrifugation if necessary;
c) marine or estuarine waters.
Qualité de l'eau - Détermination de la toxicité létale aiguë vis-à-vis de copépodes marins (Copepoda, Crustacea)
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la toxicité aiguë vis-à-vis l'une
quelconque de trois espèces spécifiées de copépodes marins (Copepoda, Crustacea)
a) de substances chimiques solubles, ou pouvant être maintenues en suspension stable ou en dispersion stable
dans les conditions de l'essai;
b) d'effluents industriels et urbains, épurés ou non, s'il y a lieu, après décantation, filtration ou centrifugation;
c) des eaux de mer ou d'estuaires.
Kakovost vode - Določevanje akutne letalne strupenosti z morskimi kopepodnimi raki (Copepoda, Crustacea)
Opisuje metodo določevanja akutne strupenosti z eno od treh določenih vrst morskih kopepodnih rakov (Copepoda, Crustacea) a) kemičnih snovi, ki so topne, ali se lahko ohranjajo kot stabilne suspenzije ali disperzije pod pogoji preskusa; b)industrijskih ali komunalnih odplak, obdelanih ali neobdelanih, po dekantiranju, filtriranju ali centrifugiranju, če je to potrebno; c) morske vode ali vode rečnih ustij.
General Information
Standards Content (Sample)
SLOVENSKI STANDARD
01-september-2010
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHDNXWQHOHWDOQHVWUXSHQRVWL]PRUVNLPLNRSHSRGQLPL
UDNL &RSHSRGD&UXVWDFHD
Water quality - Determination of acute lethal toxicity to marine copepods (Copepoda,
Crustacea)
Qualité de l'eau - Détermination de la toxicité létale aiguë vis-à-vis de copépodes marins
(Copepoda, Crustacea)
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 14669:1999
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14669
First edition
1999-04-01
Water quality — Determination of acute
lethal toxicity to marine copepods
(Copepoda, Crustacea)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité létale aiguë vis-à-vis de
copépodes marins (Copepoda, Crustacea)
A
Reference number
Contents
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Principle.1
4 Test environment.2
5 Reagents and materials.2
6 Apparatus .3
7 Sampling, treatment and preparation of samples .3
8 Procedure .4
9 Calculation and validity of the results.5
10 Precision.6
11 Test report .6
Annex A (informative) Example of determination of acute lethal toxicity of a chemical substance to
a marine copepod .7
Annex B (informative) Culture methods for marine copepods Acartia tonsa, Tisbe battagliai and
Nitocra spinipes.10
Annex C (informative) Precision data.15
Bibliography.16
© ISO 1999
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Switzerland
Internet iso@iso.ch
Printed in Switzerland
ii
© ISO
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 14669 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee
SC 5, Biological methods.
Annexes A, B and C of this International Standard are for information only.
iii
INTERNATIONAL STANDARD © ISO ISO 14669:1999(E)
Water quality — Determination of acute lethal toxicity to
(Copepoda, Crustacea)
marine copepods
1 Scope
This International Standard describes a method for the determination of the acute toxicity to one of three specified
species of marine copepod (Copepoda, Crustacea) of
a) chemical substances which are soluble, or can be maintained as a stable suspension or dispersion, under the
conditions of the test;
b) industrial or sewage effluents, treated or untreated, after decantation, filtration or centrifugation if necessary;
c) marine or estuarine waters.
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 5667-2, Water Quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques.
ISO 5667-16, Water Quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples.
3 Principle
Copepods are exposed to a range of concentrations in seawater of a chemical substance, effluent or water sample.
Mortality of the copepods is recorded after 24 h and 48 h.
The concentration which, in 48 h, kills 50% of exposed copepods under the conditions defined in this International
Standard is determined. This concentration, known as the median lethal concentration, is designated 48 h LC50.
NOTE If possible, the concentration which kills 50% of the exposed copepods in 24 h is also determined. This concentration is
designated 24 h LC50. It may be appropriate for certain purposes to extend the exposure period to 96 h and to determine the
96 h LC50.
An indication of the lowest concentration tested which kills all the copepods and the highest concentration tested
which does not kill any of the copepods is desirable and provides useful information in cases where the 48 h LC50
cannot be determined.
The test is carried out in one or two stages:
a preliminary test which determines the range of concentrations to be tested in the definitive test and gives an
approximate value of the 48 h LC50 (and where appropriate, the 24 h LC50).
© ISO
a definitive test, conducted when the approximate value given by the preliminary test is not sufficient, which
permits calculation of the 48 h LC50 (and where appropriate, the 24 h LC50) and determines concentrations
corresponding to 0 and 100% mortality.
If the method described in this International Standard is used for chemical substances, a limit test can be performed
at 100 mg/l or at a lower concentration which is the maximum at which the substance is soluble or is in stable
dispersion under the conditions of the test.
4 Test environment
The procedure described in this International Standard shall be carried out in a room, incubator or water-bath
controlled at 20 °C ± 2 °C and under a 16 h/8 h light/dark photoperiod. The atmosphere shall be free from vapours
or dusts toxic to copepods.
5 Reagents and materials
5.1 Test organism, one of the following species of marine copepod:
a) Acartia tonsa Dana;
b) Tisbe battagliai Volkmann-Rocco;
c) Nitocra spinipes Boeck.
Obtain the test organisms from laboratory cultures. Guidance on identification and culture methods for each species
are given in Annex B. After hatching of eggs, the lifecycle of copepods consists of naupliar, copepodid and adult
stages. The age and lifestage at the start of the test shall be indicated in the test report and are as follows:
Acartia tonsa: large copepodids (Stage 5) or adults;
Tisbe battagliai: copepodids 6 ± 2 days old;
Nitocra spinipes: adults 3 to 4 weeks old.
5.2 Dilution water.
A natural or a synthetic seawater may be used as the dilution water. If natural seawater is used, it shall be collected
from a location as distant as possible from known sources of pollution and filtered to remove indigenous organisms.
If synthetic seawater is used, it shall be prepared by dissolving reagents of recognized analytical grade, or a
commercially available formulation, in distilled or deionized water. However, for these copepod species, there is
insufficient information on the use of synthetic seawater to allow a particular example to be recommended.
–3 –3
The salinity of the dilution water shall be between 29 3 10 and 36 3 10 . The use of a lower salinity, which may
be more appropriate for tests concerning estuarine or brackish water situations, shall be justified in the test report.
–3
Nitocra spinipes can be used at salinities down to 1 3 10 and Tisbe battagliai can be used at salinities down to
–3
20 3 10 . Whichever salinity is employed, the test organisms shall be cultured or maintained at the same salinity
–3
(± 3 3 10 ) for at least 7 days before the start of the test. The dilution water shall have a dissolved oxygen
concentration above 80 % of the air saturation value, and a pH of 8,0 ± 0,3 before being used to prepare the test
solutions.
The dilution water shall permit survival of the copepods for at least 48 h and should be from the same source as
water that has been found to support culture of the organisms through at least two generations.
5.3 Reference chemical toxicant, e.g. 3,5-dichlorophenol or a suitable alternative (8.5), of recognized analytical
grade.
© ISO
6 Apparatus
Ordinary laboratory apparatus, and in particular:
6.1 Apparatus for measuring dissolved oxygen, salinity and pH.
6.2 Low-power stereo microscope, preferably with darkfield illumination.
6.3 Ultrasonic device or other apparatus for the preparation of stock solutions of poorly soluble substances
(7.2.1).
6.4 Test containers, of chemically inert material and of sufficient capacity (for example glass beakers or
disposable rigid plastic tissue-culture well-plates). Loose-fitting lids or covers are recommended to minimize
evaporation of the test solutions. Containers which are suitable for low-power microscopical observation may be
necessary for nauplii or copepodid stages.
Before use, the test containers shall be carefully washed then rinsed, first with water and then with the dilution
water (5.2).
7 Sampling, treatment and preparation of samples
7.1 Special precautions for sampling and transportation of samples of water or effluent
Sampling of water or effluent shall be carried out in accordance with the general procedure specified in ISO 5667-2.
Bottles shall be completely filled to exclude air.
The preservation and storage of water or effluent samples shall be carried out in accordance with ISO 5667-16; the
following is only a summary. The toxicity test should be carried out as soon as possible, ideally within 12 h of
collection. If this time interval cannot be observed, cool the sample (0 °C to 4 °C) and test the sample within 48 h. If
testing cannot be carried out within 48 h, the sample may be frozen (below 218 °C) for testing within 2 months of
collection.
7.2 Preparation of solutions of substances to be tested
7.2.1 Preparation of stock solutions
Prepare stock solutions of the substance to be tested by dissolving or diluting a known quantity of the substance in
a known volume of dilution water, deionized water or distilled water in a glass container. They shall be prepared at
the moment of use unless the substance is known to be stable in solution, in which case the stock solution may be
prepared up to two days in advance.
For substances which are poorly soluble in water, ultrasonic or other suitable devices may be used in the
preparation of the stock solutions to aid solubilization or dispersion of the substance. Organic solvents of low toxicity
to copepods (for example acetone) may be used provided that the concentration of the solvent in the final test
solution does not exceed 0,1 ml/l and two series of control tests, one with no solvent, the other with the maximum
concentration of solvent, are carried out at the same time as the test.
No single procedure for the preparation of stock solutions of poorly soluble substances can be recommended due to
the differing nature of chemicals.
7.2.2 Preparation of test solutions
Prepare the test solutions by adding the stock solutions (7.2.1) or effluent (7.1) to the dilution water (5.2) in specified
quantities so as to obtain the concentrations selected (8.1, 8.2) for the test.
If the stock solutions are prepared in deionized or distilled water, all the solutions, including the control, shall receive
the same quantity of distilled or deionized water and the final salinity shall be within the range specified for the test
(5.2).
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14669
First edition
1999-04-01
Water quality — Determination of acute
lethal toxicity to marine copepods
(Copepoda, Crustacea)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité létale aiguë vis-à-vis de
copépodes marins (Copepoda, Crustacea)
A
Reference number
Contents
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Principle.1
4 Test environment.2
5 Reagents and materials.2
6 Apparatus .3
7 Sampling, treatment and preparation of samples .3
8 Procedure .4
9 Calculation and validity of the results.5
10 Precision.6
11 Test report .6
Annex A (informative) Example of determination of acute lethal toxicity of a chemical substance to
a marine copepod .7
Annex B (informative) Culture methods for marine copepods Acartia tonsa, Tisbe battagliai and
Nitocra spinipes.10
Annex C (informative) Precision data.15
Bibliography.16
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All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
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the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 14669 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee
SC 5, Biological methods.
Annexes A, B and C of this International Standard are for information only.
iii
INTERNATIONAL STANDARD © ISO ISO 14669:1999(E)
Water quality — Determination of acute lethal toxicity to
(Copepoda, Crustacea)
marine copepods
1 Scope
This International Standard describes a method for the determination of the acute toxicity to one of three specified
species of marine copepod (Copepoda, Crustacea) of
a) chemical substances which are soluble, or can be maintained as a stable suspension or dispersion, under the
conditions of the test;
b) industrial or sewage effluents, treated or untreated, after decantation, filtration or centrifugation if necessary;
c) marine or estuarine waters.
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 5667-2, Water Quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques.
ISO 5667-16, Water Quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples.
3 Principle
Copepods are exposed to a range of concentrations in seawater of a chemical substance, effluent or water sample.
Mortality of the copepods is recorded after 24 h and 48 h.
The concentration which, in 48 h, kills 50% of exposed copepods under the conditions defined in this International
Standard is determined. This concentration, known as the median lethal concentration, is designated 48 h LC50.
NOTE If possible, the concentration which kills 50% of the exposed copepods in 24 h is also determined. This concentration is
designated 24 h LC50. It may be appropriate for certain purposes to extend the exposure period to 96 h and to determine the
96 h LC50.
An indication of the lowest concentration tested which kills all the copepods and the highest concentration tested
which does not kill any of the copepods is desirable and provides useful information in cases where the 48 h LC50
cannot be determined.
The test is carried out in one or two stages:
a preliminary test which determines the range of concentrations to be tested in the definitive test and gives an
approximate value of the 48 h LC50 (and where appropriate, the 24 h LC50).
© ISO
a definitive test, conducted when the approximate value given by the preliminary test is not sufficient, which
permits calculation of the 48 h LC50 (and where appropriate, the 24 h LC50) and determines concentrations
corresponding to 0 and 100% mortality.
If the method described in this International Standard is used for chemical substances, a limit test can be performed
at 100 mg/l or at a lower concentration which is the maximum at which the substance is soluble or is in stable
dispersion under the conditions of the test.
4 Test environment
The procedure described in this International Standard shall be carried out in a room, incubator or water-bath
controlled at 20 °C ± 2 °C and under a 16 h/8 h light/dark photoperiod. The atmosphere shall be free from vapours
or dusts toxic to copepods.
5 Reagents and materials
5.1 Test organism, one of the following species of marine copepod:
a) Acartia tonsa Dana;
b) Tisbe battagliai Volkmann-Rocco;
c) Nitocra spinipes Boeck.
Obtain the test organisms from laboratory cultures. Guidance on identification and culture methods for each species
are given in Annex B. After hatching of eggs, the lifecycle of copepods consists of naupliar, copepodid and adult
stages. The age and lifestage at the start of the test shall be indicated in the test report and are as follows:
Acartia tonsa: large copepodids (Stage 5) or adults;
Tisbe battagliai: copepodids 6 ± 2 days old;
Nitocra spinipes: adults 3 to 4 weeks old.
5.2 Dilution water.
A natural or a synthetic seawater may be used as the dilution water. If natural seawater is used, it shall be collected
from a location as distant as possible from known sources of pollution and filtered to remove indigenous organisms.
If synthetic seawater is used, it shall be prepared by dissolving reagents of recognized analytical grade, or a
commercially available formulation, in distilled or deionized water. However, for these copepod species, there is
insufficient information on the use of synthetic seawater to allow a particular example to be recommended.
–3 –3
The salinity of the dilution water shall be between 29 3 10 and 36 3 10 . The use of a lower salinity, which may
be more appropriate for tests concerning estuarine or brackish water situations, shall be justified in the test report.
–3
Nitocra spinipes can be used at salinities down to 1 3 10 and Tisbe battagliai can be used at salinities down to
–3
20 3 10 . Whichever salinity is employed, the test organisms shall be cultured or maintained at the same salinity
–3
(± 3 3 10 ) for at least 7 days before the start of the test. The dilution water shall have a dissolved oxygen
concentration above 80 % of the air saturation value, and a pH of 8,0 ± 0,3 before being used to prepare the test
solutions.
The dilution water shall permit survival of the copepods for at least 48 h and should be from the same source as
water that has been found to support culture of the organisms through at least two generations.
5.3 Reference chemical toxicant, e.g. 3,5-dichlorophenol or a suitable alternative (8.5), of recognized analytical
grade.
© ISO
6 Apparatus
Ordinary laboratory apparatus, and in particular:
6.1 Apparatus for measuring dissolved oxygen, salinity and pH.
6.2 Low-power stereo microscope, preferably with darkfield illumination.
6.3 Ultrasonic device or other apparatus for the preparation of stock solutions of poorly soluble substances
(7.2.1).
6.4 Test containers, of chemically inert material and of sufficient capacity (for example glass beakers or
disposable rigid plastic tissue-culture well-plates). Loose-fitting lids or covers are recommended to minimize
evaporation of the test solutions. Containers which are suitable for low-power microscopical observation may be
necessary for nauplii or copepodid stages.
Before use, the test containers shall be carefully washed then rinsed, first with water and then with the dilution
water (5.2).
7 Sampling, treatment and preparation of samples
7.1 Special precautions for sampling and transportation of samples of water or effluent
Sampling of water or effluent shall be carried out in accordance with the general procedure specified in ISO 5667-2.
Bottles shall be completely filled to exclude air.
The preservation and storage of water or effluent samples shall be carried out in accordance with ISO 5667-16; the
following is only a summary. The toxicity test should be carried out as soon as possible, ideally within 12 h of
collection. If this time interval cannot be observed, cool the sample (0 °C to 4 °C) and test the sample within 48 h. If
testing cannot be carried out within 48 h, the sample may be frozen (below 218 °C) for testing within 2 months of
collection.
7.2 Preparation of solutions of substances to be tested
7.2.1 Preparation of stock solutions
Prepare stock solutions of the substance to be tested by dissolving or diluting a known quantity of the substance in
a known volume of dilution water, deionized water or distilled water in a glass container. They shall be prepared at
the moment of use unless the substance is known to be stable in solution, in which case the stock solution may be
prepared up to two days in advance.
For substances which are poorly soluble in water, ultrasonic or other suitable devices may be used in the
preparation of the stock solutions to aid solubilization or dispersion of the substance. Organic solvents of low toxicity
to copepods (for example acetone) may be used provided that the concentration of the solvent in the final test
solution does not exceed 0,1 ml/l and two series of control tests, one with no solvent, the other with the maximum
concentration of solvent, are carried out at the same time as the test.
No single procedure for the preparation of stock solutions of poorly soluble substances can be recommended due to
the differing nature of chemicals.
7.2.2 Preparation of test solutions
Prepare the test solutions by adding the stock solutions (7.2.1) or effluent (7.1) to the dilution water (5.2) in specified
quantities so as to obtain the concentrations selected (8.1, 8.2) for the test.
If the stock solutions are prepared in deionized or distilled water, all the solutions, including the control, shall receive
the same quantity of distilled or deionized water and the final salinity shall be within the range specified for the test
(5.2).
© ISO
It is recommended that the volume of test solution prepared be sufficient to allow determination of the dissolved
oxygen concentration and pH at the start of the test (8.3) using the excess remaining after filling the test containers.
8 Procedure
8.1 Preliminary test
This test provides an approximate value of the 48 h LC50 and enables, if necessary, a range of concentrations to
be selected for use in the definitive test. For this purpose, a wide range of concentrations (generally chosen in
geometric progression) of the chemical substance, effluent or water sample is tested. Typically, a factor of 10 or 3,2
between concentrations and a minimum of five animals per concentration, without replication, is appropriate.
An example is given in annex A.
8.2 Definitive test
This test enables determination of the percentages of copepods which are killed by different concentrations and
determination of the 24 h and 48 h LC50. Select a range of concentrations,
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14669
Première édition
1999-04-01
Qualité de l'eau — Détermination de la
toxicité létale aiguë vis-à-vis de copépodes
marins (Copepoda, Crustacea)
Water quality — Determination of acute lethal toxicity to marine copepods
(Copepoda, Crustacea)
A
Numéro de référence
Sommaire
1 Domaine d’application .1
2 Références normatives .1
3 Principe.1
4 Environnement de l'essai.2
5 Réactifs et matériaux.2
6 Appareillage .3
7 Échantillonnage, traitement et préparation des échantillons .3
8 Mode opératoire.4
9 Calcul et validité des résultats .6
10 Fidélité .6
11 Rapport d'essai .7
Annexe A (informative) Exemple de détermination de la toxicité létale aiguë d'une substance chimique
vis-à-vis d'un copépode marin .8
Annexe B (informative) Méthodes de culture des copépodes marins Acartia tonsa, Tisbe battagliai et
Nitocra spinipes.11
Annexe C (informative) Données de fidélité .16
Bibliographie.17
© ISO 1999
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet iso@iso.ch
Imprimé en Suisse
ii
© ISO
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 14669 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-
comité SC 5, Méthodes biologiques.
Les annexes A à C de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d'information.
iii
NORME INTERNATIONALE © ISO ISO 14669:1999(F)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité létale aiguë vis-à-vis
de copépodes marins (Copepoda, Crustacea)
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la toxicité aiguë vis-à-vis l'une
quelconque de trois espèces spécifiées de copépodes marins (Copepoda, Crustacea)
a) de substances chimiques solubles, ou pouvant être maintenues en suspension stable ou en dispersion stable
dans les conditions de l'essai;
b) d'effluents industriels et urbains, épurés ou non, s'il y a lieu, après décantation, filtration ou centrifugation;
c) des eaux de mer ou d'estuaires.
2 Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s'appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s'applique. Les membres de l’ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 5667-2, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 2: Guide général sur les techniques d'échantillonnage.
ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des
échantillons.
3 Principe
Les copépodes sont exposés à un échantillon de substance chimique, d'effluent ou d'eau, à différentes
concentrations, dans de l'eau de mer. La mortalité des copépodes est enregistrée au bout de 24 h et de 48 h.
La concentration qui, en 48 h, provoque la mortalité de 50 % des copépodes exposés dans les conditions de l'essai
définies dans la présente Norme internationale, est déterminée. Cette concentration, dite concentration létale
médiane, est désignée par CL50 - 48 h.
NOTE Si possible, la concentration provoquant la mortalité de 50 % des copépodes en 24 h est également déterminée.
Cette concentration est désignée par CL50 - 24 h. Dans certains cas, il peut s'avérer utile de prolonger la période d'exposition
à 96 h et de déterminer la CL50 - 96 h.
Dans les cas où il est impossible de déterminer la CL50 - 48h, il est souhaitable d'indiquer la plus faible
concentration d'essai provoquant la mortalité de la totalité des copépodes, ainsi que la plus forte concentration
d'essai ne provoquant la mort d'aucun copépode, qui constituent des informations utiles.
© ISO
L'essai est conduit en une ou deux étapes:
un essai préliminaire, qui sert à déterminer la gamme des concentrations à soumettre à l'essai définitif et qui
donne une indication approximative de la CL50 - 48 h (et, le cas échéant, de la CL50 - 24 h);
un essai définitif, effectué lorsque la valeur approximative résultant de l'essai préliminaire est insuffisante, ce
qui permet de calculer la CL50 - 48 h (et, le cas échéant, la CL50 - 24 h) et de déterminer les concentrations
correspondant à une mortalité de 0 % et de 100 %.
Lorsque la méthode décrite dans la présente Norme internationale est appliquée aux substances chimiques, un
essai aux limites peut être effectué à 100 mg/l, ou à une concentration inférieure correspondant à la concentration
maximale à laquelle la substance reste soluble ou en suspension stable dans les conditions de l'essai.
4 Environnement de l'essai
Le mode opératoire décrit dans la présente Norme internationale doit être effectué à l'intérieur d'une pièce, d'un
incubateur ou d'un bain-marie dont la température est maintenue à 20 °C ± 2 °C et selon un cycle jour/nuit de
16 h/8 h. L'atmosphère doit être exempte de vapeurs ou de poussières toxiques vis-à-vis des copépodes.
5 Réactifs et matériaux
5.1 Organisme pour essai: l'une des espèces de copépodes marins suivantes:
a) Acartia tonsa Dana;
b) Tisbe battagliai Volkmann-Rocco;
c) Nitocra spinipes Boeck.
Se procurer les organismes pour essai à partir de cultures de laboratoire. Les méthodes de culture selon les
différentes espèces sont indiquées à l'annexe B ainsi que des lignes directrices permettant leur identification. Après
éclosion des œufs, le cycle de vie des copépodes est constitué des stades de nauplie, de copépodide et du stade
adulte. L'âge et le stade de développement au début de l'essai devant figurer dans le rapport d'essai sont les
suivants:
Acartia tonsa: copépodides de grande taille (stade 5) ou adultes;
Tisbe battagliai: copépodides âgés de 6 jours ± 2 jours;
Nitocra spinipes: adultes âgés de 3 semaines à 4 semaines.
5.2 Eau de dilution.
Comme eau de dilution, utiliser de l'eau de mer naturelle ou synthétique. Si de l'eau de mer naturelle est utilisée,
elle doit être prélevée à la plus grande distance possible de sources de pollution connues et être filtrée afin
d'éliminer les organismes indigènes. Si de l'eau de mer synthétique est utilisée, elle doit être préparée par
dissolution, dans de l'eau distillée ou déionisée, de réactifs de qualité analytique reconnue, ou bien d’une
formulation vendue dans le commerce. Cependant, les informations dont on dispose lorsque ces espèces de
copépodes sont utilisées avec une eau de mer synthétique ne sont pas suffisantes pour permettre de recommander
un exemple particulier.
–3 –3
La salinité de l'eau de dilution doit être comprise entre 29 ´ 10 et 36 ´ 10 . Le choix d'une salinité plus faible,
mieux adaptée aux essais sur des eaux d'estuaire ou des eaux saumâtres, doit être justifié dans le rapport d'essai.
–3
Les peuvent être utilisés à des salinités aussi faibles que 1 ´ 10 ; quant aux , ils
Nitocra spinipes Tisbe battagliai
–3
peuvent être utilisés à des salinités aussi faibles que 20 ´ 10 . Quelle que soit la salinité retenue, la culture des
–3
organismes pour essai impose qu'elle reste constante (à ± 3 ´ 10 près) au moins pendant les 7 jours précédant
l'essai. Avant d'être utilisée pour préparer les solutions d'essai, l'eau de dilution doit avoir une concentration en
oxygène dissous supérieure à 80 % de la valeur de saturation dans l'air et un pH de 8,0 ± 0,3.
© ISO
L'eau de dilution doit permettre la survie des copépodes pendant au moins 48 h, et doit généralement provenir de la
même source que l'eau ayant permis la culture des organismes sur deux générations au moins.
5.3 Substance chimique toxique de référence, par exemple 3,5-dichlorophénol ou toute autre substance
chimique appropriée (8.5), de qualité analytique reconnue.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareil de mesurage de l'oxygène dissous, de la salinité et du pH.
6.2 Stéréomicroscope à faible grossissement, muni de préférence d'un système d'illumination à fond noir.
6.3 Dispositif à ultrasons ou tout autre appareillage pour la préparation des solutions mères de substances
faiblement solubles (7.2.1)
6.4 Récipients pour essais, en matériau chimiquement inerte et de capacité suffisante (par exemple béchers en
verre ou plaques à puits jetables en matière plastique rigide pour culture de tissus). Pour réduire au maximum
l'évaporation des solutions d'essai, il est recommandé d'utiliser des couvercles ou des systèmes de fermeture non
hermétiques. Des récipients adaptés à l'observation au microscope à faible grossissement peuvent être
nécessaires pour l'observation des stades nauplie et copépodide.
Avant d'être utilisés, les récipients pour essais doivent être soigneusement lavés, puis rincés d'abord à l'eau puis à
l'eau de dilution (5.2).
7 Échantillonnage, traitement et préparation des échantillons
7.1 Précautions particulières concernant le prélèvement et le transport des échantillons d'eaux
ou d'effluents
Le prélèvement des échantillons d'eaux ou d'effluents doit être effectué selon la procédure générale définie dans
l'ISO 5667-2. Les flacons doivent être remplis à ras bord pour ne plus contenir d'air.
La conservation et le stockage des échantillons d'eau ou d'effluents doivent être effectués conformément à
l'ISO 5667-16, ce qui suit n'étant qu'un simple résumé. Il convient d'effectuer l'essai de toxicité aussi tôt que
possible, de préférence dans les 12 h qui suivent le prélèvement. Si ce délai ne peut pas être respecté, refroidir
l'échantillon (entre 0 °C et +4 °C) et réaliser l’essai dans les 48 h. Si l'essai ne peut pas être réalisé dans les 48 h,
l'échantillon peut être congelé (au-dessous de –18 °C) pour être expérimenté dans les deux mois qui suivent le
prélèvement.
7.2 Préparation des solutions de substances à expérimenter
7.2.1 Préparation des solutions mères
Préparer les solutions mères des substances à expérimenter par dilution ou dissolution dans un récipient en verre,
d'une quantité connue de la substance dans un volume défini d'eau de dilution, d'eau déionisée ou d'eau distillée.
Elles doivent être préparées extemporanément, à moins que la stabilité de la substance en solution soit reconnue,
auquel cas la solution mère peut être préparée jusqu'à deux jours avant l'essai.
Pour faciliter la mise en solution ou la dispersion des substances peu solubles dans l'eau, il est possible d'utiliser,
pour la préparation des solutions mères, des dispositifs à ultrasons ou d'autres dispositifs appropriés. Il est possible
d'utiliser des solvants organiques peu toxiques vis-à-vis des copépodes (par exemple l'acétone), à condition que la
concentration du solvant dans la solution d'essai finale soit inférieure ou égale à 0,1 ml/l et que deux séries d'essais
témoins, l'une sans solvant et l'autre avec la concentration maximale en solvant, soient effectuées en parallèle à
l'essai.
© ISO
Il n'est pas possible de recommander un seul mode opératoi
...
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