SIST ISO 16191:2013
Water quality - Determination of the toxic effect of sediment on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum
Water quality - Determination of the toxic effect of sediment on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum
This International Standard specifies a method for determining the toxicity of environmental samples on the growth of Myriophyllum aquaticum. The method described is applicable to natural fresh water sediment and artificial sediment.
Qualité de l'eau - Détermination de l'effet toxique des sédiments sur la croissance de Myriophyllum aquaticum
L'ISO16191:2013 sp�cifie une m�thode permettant de d�terminer la toxicit� d'�chantillons environnementaux sur la croissance de Myriophyllum aquaticum. La m�thode d�crite s'applique aux s�diments d'eau douce naturels et aux s�diments artificiels.
Kakovost vode - Določevanje učinkov strupenosti sedimenta na rast Myriophyllum aquaticum
Ta mednarodni standard določa metodo za določanje strupenosti okoljskih vzorcev na podlagi rasti Myriophyllum aquaticum. Opisana metoda se uporablja za naravne sladkovodne sedimente in umetne sedimente.
General Information
Buy Standard
Standards Content (Sample)
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 16191:2013
01-december-2013
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHXþLQNRYVWUXSHQRVWLVHGLPHQWDQDUDVW0\ULRSK\OOXP
DTXDWLFXP
Water quality - Determination of the toxic effect of sediment on the growth behaviour of
Myriophyllum aquaticum
Qualité de l'eau - Détermination de l'effet toxique des sédiments sur la croissance de
Myriophyllum aquaticum
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 16191:2013
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 16191:2013 en,fr
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
---------------------- Page: 1 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
---------------------- Page: 2 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16191
First edition
2013-05-01
Water quality — Determination of the
toxic effect of sediment on the growth
behaviour of Myriophyllum aquaticum
Qualité de l’eau — Détermination de l’effet toxique des sédiments sur
la croissance de Myriophyllum aquaticum
Reference number
ISO 16191:2013(E)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 3 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Interferences . 3
6 Reagents . 3
7 Apparatus . 5
8 Test with reference substance . 6
9 Test organism . 6
10 Procedure. 6
10.1 Pre-culturing of Myriophyllum aquaticum for the contact test. 6
10.2 Preparation of the control sample . 6
10.3 Sampling, storage, and preparation of the test samples . 7
10.4 Test procedure . 7
10.5 Exposure conditions . 7
10.6 Measurements . 8
11 Evaluation . 9
11.1 Growth rate r . 9
11.2 Means per test and control vessel (r , r ) . 9
V,T V,C
11.3 Means per test and control sample (r , r ) . 9
S,T S,C
11.4 Inhibition I . 9
11.5 Estimation of E C values . 9
r x
11.6 Expression of results .10
12 Validity criteria .11
13 Test report .11
Annex A (informative) Figures .12
Annex B (normative) Preparation of nutrient solution (Steinberg medium, following ISO 20079).
14
Annex C (informative) Suppliers .16
Annex D (normative) Preparation of spiked artificial sediments .18
Annex E (informative) Performance data .20
Bibliography .21
© ISO 2013 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 5 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2, www.iso.org/directives.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received, www.iso.org/patents.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
Introduction
The contact test with Myriophyllum aquaticum described in this International Standard allows the
measurement of responses of the plant to dissolved and particle-bound substances present in sediment
samples within 10 d (References [3][4][5][6][7][8]).
The test plant, Myriophyllum aquaticum (Vellosco) Verdcourt (parrot feather), is a dicotyledonous
macrophyte. It is a native of the Amazon River in South America, but it has naturalized worldwide,
especially in warmer climates. It has been introduced worldwide for use in indoor and outdoor aquaria.
For its use as test organism, its capability for emersed growth (no additional liquid as supernatant is
needed), its strong regeneration potential, and its vegetative growth are harnessed in the contact test.
Furthermore, Myriophyllum aquaticum grows without generating side shoots during the test period,
which facilitates handling in the laboratory. However, it should be ensured that no live plant material is
lost from the laboratory.
Myriophyllum aquaticum can be affected by phytotoxic substances present in sediments (e.g. dredged
material). The subsequent inhibition of growth is calculated from the parameter (fresh mass) by a
number of defined calculation methods.
© ISO 2013 – All rights reserved v
---------------------- Page: 7 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
---------------------- Page: 8 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16191:2013(E)
Water quality — Determination of the toxic effect of sediment
on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if
any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions. It shall be
ensured that no plant material can elude the laboratory.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International
Standard be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for determining the toxicity of environmental samples
on the growth of Myriophyllum aquaticum. The method described is applicable to natural fresh water
sediment and artificial sediment.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-15, Water quality — Sampling — Part 15: Guidance on the preservation and handling of sludge
and sediment samples
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 10523, Water quality — Determination of pH
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric method
ISO 20079, Water quality — Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on
duckweed (Lemna minor) — Duckweed growth inhibition test
OECD 218, OECD Guidelines for the testing of chemicals — Sediment-water Chironomid toxicity test using
spiked sediment
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
artificial sediment
defined artificial sediment
2
[SOURCE: ISO 10872:2010, definition 3.3, modified]
Note 1 to entry: See 6.9.
© ISO 2013 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 9 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
3.2
chlorosis
loss of pigments (yellowing of plant tissue)
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.3, modified]
3.3
control sample
artificial sediment pre-treated according to the need of this test that serves as negative control to which
the effect in the respective test material is compared
2
[SOURCE: ISO 10872:2010, definition 3.6, modified]
3.4
effective concentration
E C
r x
concentration of a substance in a test sample (EC ) at which an effect of x % is measured, if compared
x
to the control
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.9, modified]
Note 1 to entry: To unambiguously denote an EC value deriving from growth rate, it is proposed to use the
symbol “E C ”.
r x
3.5
emersed growth
morphological habitus of aquatic macrophytes, growing above the water surface
3.6
head-whorl
apical part of a Myriophyllum plant
Note 1 to entry: See Figure A.1.
3.7
necrosis
localized dead plant tissue (i.e. brown or white)
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.16, modified]
3.8
nutrient solution
solution of nutrients and micronutrients in water which are essential for the growth of Myriophyllum
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.17, modified]
3.9
pre-culture
culture of Myriophyllum aquaticum used for acclimatization of test plants to the test conditions and for
the growing of the plants to be used as whorls at test start
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.19, modified]
Note 1 to entry: See Figure A.2.
3.10
replicate
one of a selected number of test vessels (containing sample material from one sample and test organisms)
Note 1 to entry: Each vessel is tested.
Note 2 to entry: The replicates mentioned in this International Standard contain sample material (e.g. natural
sediment) and three whorls of Myriophyllum aquaticum.
2 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
3.11
test sample
discrete portion of a sample (e.g. sediment or artificial sediment)
2
[SOURCE: ISO 10872:2010, definition 3.14, modified]
3.12
whorl
arrangement of leaves that radiate from a single point and surround the stem
Note 1 to entry: See Figure A.1.
4 Principle
Myriophyllum aquaticum whorls are exposed to test samples over a period of 10 d. The growth of
Myriophyllum aquaticum in a test sample is compared with its growth in the control sample. Phytotoxic
effects are quantified as growth inhibition (%) relative to the control growth.
5 Interferences
In case of problems with Myriophyllum control growth using artificial sediment, the respective
components should be checked, first to exclude contamination with, for example, heavy metals (kaolin)
or suitability of peat (if the recommended peat is not used).
6 Reagents
Use, as far as possible, reagents of recognized analytical grade.
6.1 Water, distilled or deionized water or water of equivalent purity, conductivity < 10 µS/cm.
6.2 Kaolin clay, kaolin powder (CAS RN 1332-58-7).
6.3 Calcium carbonate, CaCO powder (CAS RN 471-34-1).
3
6.4 Quartz sand, average grain size 170 µm (see Annex C).
6.5 Reference substance, 3,5-dichlorophenol [C H OCl (purity ≥ 99 %), CAS RN 591-35-5].
6 4 2
6.6 Nutrient solution, use Steinberg medium as specified in Annex B.
6.7 Peat, Sphagnum peat (e.g. Lithuania peat), H2-H5, fine (grain size ≤5 mm) (see Annex C).
6.8 Peat powder, dry peat (6.7) for 7 d at room temperature.
Spread the peat on shallow trays, and turn the peat every 2 d to 3 d. Then grind the peat and sieve it
through a 0,5 mm sieve. Determine dry mass of the peat powder by drying a small sub-sample at 60 °C
for 3 h in four aliquots, and determine the dry mass by re-weighing until constant mass (see ISO 11465).
Store the peat powder in airtight vessels until use. Note down the dry mass on the vessel.
6.9 Artificial sediment, see Table 1
© ISO 2013 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 11 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
Table 1 — Dry constituents for composition of the artificial sediment
Constituents % of sediment dry mass Characteristics
Peat powder 5 see 6.8
Quartz sand 74 average grain size 170 µm
Kaolin clay 20 powder
CaCO 1 pro analysis
3
powder
6.9.1 Artificial sediment as control sample.
Preparation of the artificial sediment as control sediment is described below (6.9.1.1 to 6.9.1.3). The
dry constituents for preparation of the artificial sediment may be stored separately in closed, airtight
vessels in a dry and dark place at room temperature for at least 6 months.
NOTE These requirements (6.9.1.1 to 6.9.1.3) are carried out for establishing stable ambient conditions in the
sediment and avoiding separation of the sediment components during the test.
6.9.1.1 Preparation of peat suspension.
Take the required amount of peat powder (6.8, Table 1) and CaCO powder (see Table 1) and add nutrient
3
solution (6.6) until the suspension can be stirred easily (at maximum 50 % of total sediment dry mass).
Stir carefully. Keep the peat suspension for 3 d to 4 d with continuous gentle stirring at room temperature
to stabilize pH. Afterwards, measure pH of the suspension and adjust if necessary to 6,7 ± 0,5 by adding
CaCO powder.
3
NOTE Experience has shown that the pH is at 6,7 ± 0,5; therefore, no further addition of CaCO is usually necessary.
3
6.9.1.2 Addition and blending of sediment components.
Mix the peat suspension with the other constituents (quartz sand and kaolin clay, see Table 1) to obtain
a homogeneous sediment. Measure the pH of the final mixture again and adjust it to 7,0 ± 0,5 by adding
CaCO powder if necessary.
3
NOTE Experience has shown that the pH is at 7,0 ± 0,5; therefore, no further addition of CaCO is usually necessary.
3
6.9.1.3 Conditioning of the mixed sediment suspension.
Add nutrient solution (6.6) as supernatant to the mixed sediment (6.9.1.2) in the ratio: 1 part (mass)
mixed sediment plus maximum 0,5 parts (volume) nutrient solution. Condition this mixture for 7 d to 9 d
under exposure conditions (see 10.5) to establish a stable microbial component and to avoid separation
of the sediment components during the test. Remove the supernatant of nutrient solution carefully after
7 d to 9 d. The sediment is ready for instant use.
NOTE Experience has shown that the artificial sediment can be stored at 4 °C to 8 °C in the darkness for 14 d.
6.9.2 Artificial sediment for pre-culturing.
Mix the dry sediment constituents (see Table 1) and shake the dry mixture for 2 h to 3 h in a rotary
shaker at room temperature. The dry sediment powder mixture can be maintained without restraint in
an airtight vessel in a dark and dry place at room temperature.
Measure 125 g dry sediment powder mixture into a 1 000 ml pre-culture vessel, add (65 ± 5) ml nutrient
solution (6.6), and stir carefully until it is homogeneous. The sediment suspension should be muddy.
4 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 12 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
Condense the sediment by knocking the vessels on the table to eliminate air bubbles and cavities within
the sediment matrix.
NOTE Growing of the pre-cultures (see 10.1) in artificial sediment for control samples (6.9.1) or in artificial
sediment for pre-culturing (6.9.2) has no significant influence on the results of a subsequent test; therefore, both
artificial sediments (6.9.1 and 6.9.2) are suitable as pre-culturing sediment.
7 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following:
7.1 Autoclave.
7.2 Cylindrical or conical vessels, plastic or glass beakers, crystallizing dishes [e.g. for the pre-culture:
diameter bottom 10 cm, diameter top 13 cm, height 11 cm; for the test: 250 ml glass beakers, low form;
see Figures A.2 b) and A.3 b)].
7.3 Drying oven, approximately 105 °C.
7.4 Temperature-controlled incubator with constant illumination, e.g. climate chamber.
7.5 Light meter, to measure photosynthetically active radiation (PAR), within the photosynthetic range
400 nm to 700 nm with a spherical quantum sensor.
7.6 pH meter.
7.7 Precision balance, required accuracy of 0,1 mg.
7.8 Rotary shaker.
7.9 Scalpel or scissors.
7.10 Sieve, stainless steel, mesh size 0,5 mm.
7.11 Translucent lids, glass or plastic, with openings (e.g. holes) to allow air and humidity exchange
[see Figures A.2 b) and A.3 b)].
7.12 Tweezers.
7.13 Stirrer.
7.14 Glass electrode, to measure pH values of aqueous solutions and sediments.
7.15 Grinder, to pulverize peat after drying (e.g. blender).
7.16 Mortar, to homogenize sediments after drying (see Annex D).
7.18 Fume hood (see Annex D).
© ISO 2013 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 13 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
8 Test with reference substance
To ensure that the laboratory test conditions (including the condition and sensitivity of the test organisms)
are adequate and have not changed significantly, a reference substance has to be tested regularly, at least
every 6 months, using one concentration near its EC for growth rate. A suitable reference substance is
50
3,5-dichlorophenol (DCP), which has been shown to affect the growth of Myriophyllum aquaticum.
DCP is tested in artificial sediment according to instructions for spiking (see Annex D) and testing
(see Clause 10). The inhibition of growth at a concentration of 90 mg/kg dry mass of artificial sediment
compared to the control growth should be in the range of 20 % to 50 %.
NOTE The range of inhibitory effects for 3,5-dichlorophenol is based on the data of the international
interlaboratory test of this International Standard (see Annex E).
9 Test organism
Myriophyllum aquaticum (Vellosco) Verdcourt (source of supply, see Annex C) is used as test species
in this International Standard. Documentation of its origin is needed. Plants obtained from a wild
population need a confirmation of their taxonomy.
10 Procedure
10.1 Pre-culturing of Myriophyllum aquaticum for the contact test
Use artificial sediment for pre-culturing (6.9.2). Plant the fresh-cut head-whorls from 5- to 7-week
old cultures into the pre-culturing sediment. Close the vessels with translucent lids with openings
for aeration and humidity exchange. Incubate the plants in a climate chamber at (24 ± 1) °C at a light
-2 -1 -2 -1
intensity of 60 µmol m s to 75 µmol m s or 4 100 lx to 5 550 lx (neutral white) with constant light
regime. Add nutrient solution (6.6) diluted with equal volumes of water (6.1) to avoid desiccation, and
randomize the cultures at least every 3 d to 4 d. After one week, remove the lids to allow the plants to
grow without hindrance.
Planting of seven to nine head-whorls per pre-culture vessel (7.2, conical, Ø bottom 10 cm, Ø top 13 cm,
height 11 cm) and many pre-culture vessels per test are recommended. The length and the thickness of
the stem have influence on the mass of the whorl. To have mostly homogeneous whorls for the test, it is
important to have much plant material to select whorls from for the test.
When irrigating, take care that new planted head-whorls do not float out of the sediment. Nutrient
solution diluted with water is carefully added until obtaining a thin layer of liquid at the sediment
surface. After a few days, when the head-whorls are rooted, more liquid (e.g. 0,5 cm height) can be added.
NOTE Any other pre-culture method is possible as long as pre-cultures are growing emersed, using
growth conditions comparable to test conditions and the validity criteria (growth rate ≥ 0,09, variation in the
control ≤ 15 %) is met.
10.2 Preparation of the control sample
Use artificial sediment (6.9.1) as control sample. Measure and record the pH. Fill at least three replicate
vessels with 80 g of freshly prepared control sample each. Before using the replicates, condense the
sediment by knocking the vessels on the table.
6 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 14 ----------------------
SIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
10.3 Sampling, storage, and preparation of the test samples
10.3.1 Sampling and storage of the test sample
Examine the material to be tested as soon as possible after sampling. Collect samples as specified in
ISO 5667-16 and ISO 5667-15, and store them in the dark at a temperature of 2 °C to 5 °C for not more
than two weeks.
Determine the pH of the test material and control sample in accordance with ISO 10523 (aqueous test
material, sediments).
[1]
NOTE Determination of pH according to ISO 10390 is also possible.
10.3.2 Preparation of the test sample
Use natural or artificial sediment as the test sample. The sediments can be used in their original state, or
artificial sediments can be spiked with chemicals (spiking procedure is specified in Annex D). Stir each
sample thoroughly and record the pH. Fill at least three replicate vessels per test sample with 80 g (wet
mass) of test sample each. Further addition of nutrient solution (6.6) to test samples is only necessary
for samples where there is no supernatant (1 mm to 2 mm) after packing of the sample.
NOTE The nutrient supply in natural sediments usually is sufficient for plant growth.
10.4 Test procedure
At the start of the test, mark the positions of the three whorls on each test vessel. Use plants from
(21 ± 3) d old pre-cultures and cut them into the whorls needed for testing (2 to 4 maximum per shoot,
each whorl with five to six leaves; see Figure A.1). The whorls used for the test shall show no signs of
side shoots. Collect the cut whorls in a glass vessel in nutrient solution (6.6) for randomization. Before
transferring three whorls into the replicate, handle each whorl step by step as follows: Dry the whorl
carefully (bottom side up) on tissue paper in a way that ensures the reduction of surplus water without
damaging the whorls. Weigh it immediately on a precision balance and record the mass. The mass of
each whorl should be (25 ± 6) mg. Transfer this whorl (top side up) immediately to one of the pre-marked
positions (1 to 3) of the replicate (see Figure A.3).
This allows a comparison of the fresh mass of the test plants reached at the end of the exposure time
to the initial mass of the whorls at the beginning of the test. Once the whorls are introduced into the
replicates, close the vessels with translucent lids with openings for aeration and humidity exchange.
During the exposure period, irrigate and randomize the control and test samples every 24 h to 72 h. Use
nutrient solution (6.6) diluted with equal volumes of water (6.1) for irrigation.
When irrigating, take care that newly planted whorls do not float out of the sediment. Nutrient solution
diluted with water is carefully added until obtaining a thin layer of liquid at the sediment surface. Daily
randomization is recommended.
NOTE The range of (25 ± 6) mg as whorl mass is recommended.
10.5 Exposure conditions
The test vessels shall be sufficiently covered by translucent lids to reduce water evaporation, but they
shall not be airtight in order to allow air exchange into the vessels. Incubate the test vessels under
controlled standardized conditions at (24 ± 1) °C, under continuous lighting (neutral white), for 10 d.
Measure photosynthetically active radiation (PAR) with a spherical quantum sensor. Light intensity at
−2 −1
the sample level in and among the test vessels shall be homogeneous within the range of 60 µmol m s
−2 −1
to 75 µmol m s (400 nm to 700 nm) or 4 100 lx to 5 550 lx.
© ISO 2013 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 15 ----------------------
SIST IS
...
SLOVENSKI STANDARD
oSIST ISO 16191:2013
01-september-2013
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHXþLQNRYVWUXSHQRVWLVHGLPHQWDQDUDVW0\ULRSK\OOXP
DTXDWLFXP
Water quality - Determination of the toxic effect of sediment on the growth behaviour of
Myriophyllum aquaticum
Qualité de l'eau - Détermination de l'effet toxique des sédiments sur la croissance de
Myriophyllum aquaticum
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 16191:2013
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
oSIST ISO 16191:2013 en,fr
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
---------------------- Page: 1 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
---------------------- Page: 2 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16191
First edition
2013-05-01
Water quality — Determination of the
toxic effect of sediment on the growth
behaviour of Myriophyllum aquaticum
Qualité de l’eau — Détermination de l’effet toxique des sédiments sur
la croissance de Myriophyllum aquaticum
Reference number
ISO 16191:2013(E)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 3 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Interferences . 3
6 Reagents . 3
7 Apparatus . 5
8 Test with reference substance . 6
9 Test organism . 6
10 Procedure. 6
10.1 Pre-culturing of Myriophyllum aquaticum for the contact test. 6
10.2 Preparation of the control sample . 6
10.3 Sampling, storage, and preparation of the test samples . 7
10.4 Test procedure . 7
10.5 Exposure conditions . 7
10.6 Measurements . 8
11 Evaluation . 9
11.1 Growth rate r . 9
11.2 Means per test and control vessel (r , r ) . 9
V,T V,C
11.3 Means per test and control sample (r , r ) . 9
S,T S,C
11.4 Inhibition I . 9
11.5 Estimation of E C values . 9
r x
11.6 Expression of results .10
12 Validity criteria .11
13 Test report .11
Annex A (informative) Figures .12
Annex B (normative) Preparation of nutrient solution (Steinberg medium, following ISO 20079).
14
Annex C (informative) Suppliers .16
Annex D (normative) Preparation of spiked artificial sediments .18
Annex E (informative) Performance data .20
Bibliography .21
© ISO 2013 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 5 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2, www.iso.org/directives.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received, www.iso.org/patents.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
Introduction
The contact test with Myriophyllum aquaticum described in this International Standard allows the
measurement of responses of the plant to dissolved and particle-bound substances present in sediment
samples within 10 d (References [3][4][5][6][7][8]).
The test plant, Myriophyllum aquaticum (Vellosco) Verdcourt (parrot feather), is a dicotyledonous
macrophyte. It is a native of the Amazon River in South America, but it has naturalized worldwide,
especially in warmer climates. It has been introduced worldwide for use in indoor and outdoor aquaria.
For its use as test organism, its capability for emersed growth (no additional liquid as supernatant is
needed), its strong regeneration potential, and its vegetative growth are harnessed in the contact test.
Furthermore, Myriophyllum aquaticum grows without generating side shoots during the test period,
which facilitates handling in the laboratory. However, it should be ensured that no live plant material is
lost from the laboratory.
Myriophyllum aquaticum can be affected by phytotoxic substances present in sediments (e.g. dredged
material). The subsequent inhibition of growth is calculated from the parameter (fresh mass) by a
number of defined calculation methods.
© ISO 2013 – All rights reserved v
---------------------- Page: 7 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
---------------------- Page: 8 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16191:2013(E)
Water quality — Determination of the toxic effect of sediment
on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if
any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions. It shall be
ensured that no plant material can elude the laboratory.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International
Standard be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for determining the toxicity of environmental samples
on the growth of Myriophyllum aquaticum. The method described is applicable to natural fresh water
sediment and artificial sediment.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-15, Water quality — Sampling — Part 15: Guidance on the preservation and handling of sludge
and sediment samples
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 10523, Water quality — Determination of pH
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric method
ISO 20079, Water quality — Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on
duckweed (Lemna minor) — Duckweed growth inhibition test
OECD 218, OECD Guidelines for the testing of chemicals — Sediment-water Chironomid toxicity test using
spiked sediment
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
artificial sediment
defined artificial sediment
2
[SOURCE: ISO 10872:2010, definition 3.3, modified]
Note 1 to entry: See 6.9.
© ISO 2013 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 9 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
3.2
chlorosis
loss of pigments (yellowing of plant tissue)
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.3, modified]
3.3
control sample
artificial sediment pre-treated according to the need of this test that serves as negative control to which
the effect in the respective test material is compared
2
[SOURCE: ISO 10872:2010, definition 3.6, modified]
3.4
effective concentration
E C
r x
concentration of a substance in a test sample (EC ) at which an effect of x % is measured, if compared
x
to the control
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.9, modified]
Note 1 to entry: To unambiguously denote an EC value deriving from growth rate, it is proposed to use the
symbol “E C ”.
r x
3.5
emersed growth
morphological habitus of aquatic macrophytes, growing above the water surface
3.6
head-whorl
apical part of a Myriophyllum plant
Note 1 to entry: See Figure A.1.
3.7
necrosis
localized dead plant tissue (i.e. brown or white)
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.16, modified]
3.8
nutrient solution
solution of nutrients and micronutrients in water which are essential for the growth of Myriophyllum
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.17, modified]
3.9
pre-culture
culture of Myriophyllum aquaticum used for acclimatization of test plants to the test conditions and for
the growing of the plants to be used as whorls at test start
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.19, modified]
Note 1 to entry: See Figure A.2.
3.10
replicate
one of a selected number of test vessels (containing sample material from one sample and test organisms)
Note 1 to entry: Each vessel is tested.
Note 2 to entry: The replicates mentioned in this International Standard contain sample material (e.g. natural
sediment) and three whorls of Myriophyllum aquaticum.
2 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
3.11
test sample
discrete portion of a sample (e.g. sediment or artificial sediment)
2
[SOURCE: ISO 10872:2010, definition 3.14, modified]
3.12
whorl
arrangement of leaves that radiate from a single point and surround the stem
Note 1 to entry: See Figure A.1.
4 Principle
Myriophyllum aquaticum whorls are exposed to test samples over a period of 10 d. The growth of
Myriophyllum aquaticum in a test sample is compared with its growth in the control sample. Phytotoxic
effects are quantified as growth inhibition (%) relative to the control growth.
5 Interferences
In case of problems with Myriophyllum control growth using artificial sediment, the respective
components should be checked, first to exclude contamination with, for example, heavy metals (kaolin)
or suitability of peat (if the recommended peat is not used).
6 Reagents
Use, as far as possible, reagents of recognized analytical grade.
6.1 Water, distilled or deionized water or water of equivalent purity, conductivity < 10 µS/cm.
6.2 Kaolin clay, kaolin powder (CAS RN 1332-58-7).
6.3 Calcium carbonate, CaCO powder (CAS RN 471-34-1).
3
6.4 Quartz sand, average grain size 170 µm (see Annex C).
6.5 Reference substance, 3,5-dichlorophenol [C H OCl (purity ≥ 99 %), CAS RN 591-35-5].
6 4 2
6.6 Nutrient solution, use Steinberg medium as specified in Annex B.
6.7 Peat, Sphagnum peat (e.g. Lithuania peat), H2-H5, fine (grain size ≤5 mm) (see Annex C).
6.8 Peat powder, dry peat (6.7) for 7 d at room temperature.
Spread the peat on shallow trays, and turn the peat every 2 d to 3 d. Then grind the peat and sieve it
through a 0,5 mm sieve. Determine dry mass of the peat powder by drying a small sub-sample at 60 °C
for 3 h in four aliquots, and determine the dry mass by re-weighing until constant mass (see ISO 11465).
Store the peat powder in airtight vessels until use. Note down the dry mass on the vessel.
6.9 Artificial sediment, see Table 1
© ISO 2013 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 11 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
Table 1 — Dry constituents for composition of the artificial sediment
Constituents % of sediment dry mass Characteristics
Peat powder 5 see 6.8
Quartz sand 74 average grain size 170 µm
Kaolin clay 20 powder
CaCO 1 pro analysis
3
powder
6.9.1 Artificial sediment as control sample.
Preparation of the artificial sediment as control sediment is described below (6.9.1.1 to 6.9.1.3). The
dry constituents for preparation of the artificial sediment may be stored separately in closed, airtight
vessels in a dry and dark place at room temperature for at least 6 months.
NOTE These requirements (6.9.1.1 to 6.9.1.3) are carried out for establishing stable ambient conditions in the
sediment and avoiding separation of the sediment components during the test.
6.9.1.1 Preparation of peat suspension.
Take the required amount of peat powder (6.8, Table 1) and CaCO powder (see Table 1) and add nutrient
3
solution (6.6) until the suspension can be stirred easily (at maximum 50 % of total sediment dry mass).
Stir carefully. Keep the peat suspension for 3 d to 4 d with continuous gentle stirring at room temperature
to stabilize pH. Afterwards, measure pH of the suspension and adjust if necessary to 6,7 ± 0,5 by adding
CaCO powder.
3
NOTE Experience has shown that the pH is at 6,7 ± 0,5; therefore, no further addition of CaCO is usually necessary.
3
6.9.1.2 Addition and blending of sediment components.
Mix the peat suspension with the other constituents (quartz sand and kaolin clay, see Table 1) to obtain
a homogeneous sediment. Measure the pH of the final mixture again and adjust it to 7,0 ± 0,5 by adding
CaCO powder if necessary.
3
NOTE Experience has shown that the pH is at 7,0 ± 0,5; therefore, no further addition of CaCO is usually necessary.
3
6.9.1.3 Conditioning of the mixed sediment suspension.
Add nutrient solution (6.6) as supernatant to the mixed sediment (6.9.1.2) in the ratio: 1 part (mass)
mixed sediment plus maximum 0,5 parts (volume) nutrient solution. Condition this mixture for 7 d to 9 d
under exposure conditions (see 10.5) to establish a stable microbial component and to avoid separation
of the sediment components during the test. Remove the supernatant of nutrient solution carefully after
7 d to 9 d. The sediment is ready for instant use.
NOTE Experience has shown that the artificial sediment can be stored at 4 °C to 8 °C in the darkness for 14 d.
6.9.2 Artificial sediment for pre-culturing.
Mix the dry sediment constituents (see Table 1) and shake the dry mixture for 2 h to 3 h in a rotary
shaker at room temperature. The dry sediment powder mixture can be maintained without restraint in
an airtight vessel in a dark and dry place at room temperature.
Measure 125 g dry sediment powder mixture into a 1 000 ml pre-culture vessel, add (65 ± 5) ml nutrient
solution (6.6), and stir carefully until it is homogeneous. The sediment suspension should be muddy.
4 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 12 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
Condense the sediment by knocking the vessels on the table to eliminate air bubbles and cavities within
the sediment matrix.
NOTE Growing of the pre-cultures (see 10.1) in artificial sediment for control samples (6.9.1) or in artificial
sediment for pre-culturing (6.9.2) has no significant influence on the results of a subsequent test; therefore, both
artificial sediments (6.9.1 and 6.9.2) are suitable as pre-culturing sediment.
7 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following:
7.1 Autoclave.
7.2 Cylindrical or conical vessels, plastic or glass beakers, crystallizing dishes [e.g. for the pre-culture:
diameter bottom 10 cm, diameter top 13 cm, height 11 cm; for the test: 250 ml glass beakers, low form;
see Figures A.2 b) and A.3 b)].
7.3 Drying oven, approximately 105 °C.
7.4 Temperature-controlled incubator with constant illumination, e.g. climate chamber.
7.5 Light meter, to measure photosynthetically active radiation (PAR), within the photosynthetic range
400 nm to 700 nm with a spherical quantum sensor.
7.6 pH meter.
7.7 Precision balance, required accuracy of 0,1 mg.
7.8 Rotary shaker.
7.9 Scalpel or scissors.
7.10 Sieve, stainless steel, mesh size 0,5 mm.
7.11 Translucent lids, glass or plastic, with openings (e.g. holes) to allow air and humidity exchange
[see Figures A.2 b) and A.3 b)].
7.12 Tweezers.
7.13 Stirrer.
7.14 Glass electrode, to measure pH values of aqueous solutions and sediments.
7.15 Grinder, to pulverize peat after drying (e.g. blender).
7.16 Mortar, to homogenize sediments after drying (see Annex D).
7.18 Fume hood (see Annex D).
© ISO 2013 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 13 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
8 Test with reference substance
To ensure that the laboratory test conditions (including the condition and sensitivity of the test organisms)
are adequate and have not changed significantly, a reference substance has to be tested regularly, at least
every 6 months, using one concentration near its EC for growth rate. A suitable reference substance is
50
3,5-dichlorophenol (DCP), which has been shown to affect the growth of Myriophyllum aquaticum.
DCP is tested in artificial sediment according to instructions for spiking (see Annex D) and testing
(see Clause 10). The inhibition of growth at a concentration of 90 mg/kg dry mass of artificial sediment
compared to the control growth should be in the range of 20 % to 50 %.
NOTE The range of inhibitory effects for 3,5-dichlorophenol is based on the data of the international
interlaboratory test of this International Standard (see Annex E).
9 Test organism
Myriophyllum aquaticum (Vellosco) Verdcourt (source of supply, see Annex C) is used as test species
in this International Standard. Documentation of its origin is needed. Plants obtained from a wild
population need a confirmation of their taxonomy.
10 Procedure
10.1 Pre-culturing of Myriophyllum aquaticum for the contact test
Use artificial sediment for pre-culturing (6.9.2). Plant the fresh-cut head-whorls from 5- to 7-week
old cultures into the pre-culturing sediment. Close the vessels with translucent lids with openings
for aeration and humidity exchange. Incubate the plants in a climate chamber at (24 ± 1) °C at a light
-2 -1 -2 -1
intensity of 60 µmol m s to 75 µmol m s or 4 100 lx to 5 550 lx (neutral white) with constant light
regime. Add nutrient solution (6.6) diluted with equal volumes of water (6.1) to avoid desiccation, and
randomize the cultures at least every 3 d to 4 d. After one week, remove the lids to allow the plants to
grow without hindrance.
Planting of seven to nine head-whorls per pre-culture vessel (7.2, conical, Ø bottom 10 cm, Ø top 13 cm,
height 11 cm) and many pre-culture vessels per test are recommended. The length and the thickness of
the stem have influence on the mass of the whorl. To have mostly homogeneous whorls for the test, it is
important to have much plant material to select whorls from for the test.
When irrigating, take care that new planted head-whorls do not float out of the sediment. Nutrient
solution diluted with water is carefully added until obtaining a thin layer of liquid at the sediment
surface. After a few days, when the head-whorls are rooted, more liquid (e.g. 0,5 cm height) can be added.
NOTE Any other pre-culture method is possible as long as pre-cultures are growing emersed, using
growth conditions comparable to test conditions and the validity criteria (growth rate ≥ 0,09, variation in the
control ≤ 15 %) is met.
10.2 Preparation of the control sample
Use artificial sediment (6.9.1) as control sample. Measure and record the pH. Fill at least three replicate
vessels with 80 g of freshly prepared control sample each. Before using the replicates, condense the
sediment by knocking the vessels on the table.
6 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 14 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
ISO 16191:2013(E)
10.3 Sampling, storage, and preparation of the test samples
10.3.1 Sampling and storage of the test sample
Examine the material to be tested as soon as possible after sampling. Collect samples as specified in
ISO 5667-16 and ISO 5667-15, and store them in the dark at a temperature of 2 °C to 5 °C for not more
than two weeks.
Determine the pH of the test material and control sample in accordance with ISO 10523 (aqueous test
material, sediments).
[1]
NOTE Determination of pH according to ISO 10390 is also possible.
10.3.2 Preparation of the test sample
Use natural or artificial sediment as the test sample. The sediments can be used in their original state, or
artificial sediments can be spiked with chemicals (spiking procedure is specified in Annex D). Stir each
sample thoroughly and record the pH. Fill at least three replicate vessels per test sample with 80 g (wet
mass) of test sample each. Further addition of nutrient solution (6.6) to test samples is only necessary
for samples where there is no supernatant (1 mm to 2 mm) after packing of the sample.
NOTE The nutrient supply in natural sediments usually is sufficient for plant growth.
10.4 Test procedure
At the start of the test, mark the positions of the three whorls on each test vessel. Use plants from
(21 ± 3) d old pre-cultures and cut them into the whorls needed for testing (2 to 4 maximum per shoot,
each whorl with five to six leaves; see Figure A.1). The whorls used for the test shall show no signs of
side shoots. Collect the cut whorls in a glass vessel in nutrient solution (6.6) for randomization. Before
transferring three whorls into the replicate, handle each whorl step by step as follows: Dry the whorl
carefully (bottom side up) on tissue paper in a way that ensures the reduction of surplus water without
damaging the whorls. Weigh it immediately on a precision balance and record the mass. The mass of
each whorl should be (25 ± 6) mg. Transfer this whorl (top side up) immediately to one of the pre-marked
positions (1 to 3) of the replicate (see Figure A.3).
This allows a comparison of the fresh mass of the test plants reached at the end of the exposure time
to the initial mass of the whorls at the beginning of the test. Once the whorls are introduced into the
replicates, close the vessels with translucent lids with openings for aeration and humidity exchange.
During the exposure period, irrigate and randomize the control and test samples every 24 h to 72 h. Use
nutrient solution (6.6) diluted with equal volumes of water (6.1) for irrigation.
When irrigating, take care that newly planted whorls do not float out of the sediment. Nutrient solution
diluted with water is carefully added until obtaining a thin layer of liquid at the sediment surface. Daily
randomization is recommended.
NOTE The range of (25 ± 6) mg as whorl mass is recommended.
10.5 Exposure conditions
The test vessels shall be sufficiently covered by translucent lids to reduce water evaporation, but they
shall not be airtight in order to allow air exchange into the vessels. Incubate the test vessels under
controlled standardized conditions at (24 ± 1) °C, under continuous lighting (neutral white), for 10 d.
Measure photosynthetically active radiation (PAR) with a spherical quantum sensor. Light intensity at
−2 −1
the sample level in and among the test vessels shall be homogeneous within the range of 60 µmol m s
−2 −1
to 75 µmol m s (400 nm to 700 nm) or 4 100 lx to 5 550 lx.
© ISO 2013 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 15 ----------------------
oSIST ISO 16191:2013
...
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 16191
Первое издание
2013-05-01
Качество воды. Определение
токсического воздействия осадка на
рост Myriophyllum aquaticum
Water quality — Determination of the toxic effect of sediment on the
growth behavior of Myriophyllum aquaticum
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава
Ссылочный номер
ISO 16191:2013(R)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16191:2013(R)
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2013
Все права сохраняются. Если не задано иначе, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия офиса ISO по адресу, указанному ниже, или членов ISO в стране регистрации
пребывания.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 16191:2013(R)
Содержание Страница
Предисловие. iv
Введение . v
1 Область применения . 1
2 Нормативные ссылки . 1
3 Термины и определения . 2
4 Сущность метода . 3
5 Помехи . 4
6 Реактивы . 4
7 Аппаратура . 5
8 Испытание с контрольным веществом. 6
9 Испытуемый организм . 7
10 Проведение испытания . 7
10.1 Выращивание предкультуры Myriophyllum aquaticum для контактного испытания . 7
10.2 Приготовление контрольной пробы . 7
10.3 Отбор проб, хранение и подготовка проб для испытания . 7
10.4 Проведение испытания . 8
10.5 Условия экспонирования . 8
10.6 Измерения . 9
11 Оценивание . 10
11.1 Скорость роста r . 10
11.2 Среднее значение в испытании и на контрольный сосуд (r , r ) . 10
V,T V,C
11.3 Среднее значение в испытании и контрольной пробе(r , r ) . 10
S,T S,C
11.4 Ингибирование I . 10
11.5 Оценка значений E C . 10
r x
11.6 Обработка результатов . 12
12 Критерии достоверности . 12
13 Протокол испытания . 12
Приложение А (информативное) Рисунки . 14
Приложение В (нормативное) Приготовление питательного раствора (среда Штейнберга, по
ISO 20079) . 16
Приложение С (информативное) Поставщики . 18
Приложение D (нормативное) Приготовление маркированных искусственных осадков . 20
Приложение Е (информативное) Данные по эффективности метода . 22
Библиография . 23
© ISO 2013 – Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16191:2013(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) всемирная федерация национальных органов
по стандартизации (комитеты-члены ISO). Работа по подготовке международных стандартов обычно
ведется через технические комитеты ISO. Каждый комитет-член ISO, проявляющий интерес к
тематике, по которой учрежден технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные организации, государственные и негосударственные, имеющие связи с ISO,
также принимают участие в работе. ISO тесно сотрудничает с Международной электротехнической
комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области электротехники.
Процедуры, используемые для разработки данного документа, и процедуры, предусмотренные для его
дальнейшего ведения, описаны в Директивах ISO/IEC Directives, Part 1. В частности, следует отметить
различные критерии утверждения, требуемые для различных типов документов ISO. Проект данного
документа был разработан в соответствии с редакционными правилами Директив ISO/IEC Directives,
Part 2. www.iso.org/directives .
Необходимо обратить внимание на возможность того, что ряд элементов данного документа могут
быть предметом патентных прав. Международная организация ISO не должна нести ответственность
за идентификацию таких прав, частично или полностью. Сведения о патентных правах,
идентифицированных при разработке документа, будут указаны во Введении и/или в перечне
полученных ISO объявлениях о патентном праве. www.iso.org/patents .
Любое торговое название, использованное в данном документе, является информацией,
предоставляемой для удобства пользователей, а не свидетельством в пользу того или иного товара
или той или иной компании.
Технический комитет, несущий ответственность за данный документ, ISO/TC 147, Качество воды,
Подкомитет SC 5, Биологические методы.
iv © ISO 2013– Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 16191:2013(R)
Введение
Контактное испытание с растением Myriophyllum aquaticum, описанное в данном международном
стандарте, позволяет в течение 10 дней выполнить измерение реакции рассматриваемого растения на
растворенные и связанные с твердыми частицами вещества, присутствующие в осадке проб воды
([3] [4] [5] [6] [7] [8]).
Испытуемое растение, перистолистник водный (бразильский) (попугаичье оперение), Myriophyllum
aquaticum (Vellosco) Вердкурта (Verdcurt), является двудольным макрофитом. Родом это растение из
реки Амазонки в Южной Америке, но уже распространилось по всему миру, особенно в районах с
теплым климатом. Оно также повсеместно используется в домашних аквариумах и открытых
океанариумах. Что касается применения перистолистника в качестве испытуемого организма, в
контактном испытании успешно используются его способность к росту в полупогруженном состоянии
(не требуется дополнительной жидкости в качестве надосадочной), сильный потенциал к регенерации
и вегетативный рост. Кроме того, Myriophyllum aquaticum растет без образования боковых побегов во
время испытания, что облегчает работу с ним в лаборатории. В то же время необходимо следить за
тем, чтобы из лаборатории не пропадало живого растительного материала.
На Myriophyllum aquaticum могут повлиять фитотоксичные вещества, присутствующие в осадках
(например, из вынутого грунта). Последующее подавление роста рассчитывают по определенному
параметру (масса в сыром виде) с помощью определенных методов вычисления.
© ISO 2013 – Все права сохраняются v
---------------------- Page: 5 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 16191:2013(R)
Качество воды. Определение токсического воздействия
осадка на рост Myriophyllum aquaticum
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Пользователи данного международного стандарта должны быть знакомы
с обычной лабораторной практикой. Настоящий стандарт не преследует цели рассмотреть все
вопросы, связанные с безопасностью, если они возникают при его использовании.
Пользователь сам несет ответственность за разработку соответствующих правил техники
безопасности и охраны здоровья, а также за обеспечение соответствия условиям
национальных регламентов. Необходимо гарантировать, что растительный материал не будет
пропадать из лаборатории.
ВНИМАНИЕ! – Самое главное, чтобы анализ в соответствии с настоящим международным
стандартом выполнялся обученным персоналом.
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод определения токсичности проб из объектов
окружающей среды в отношении роста перистолистника, Myriophyllum aquaticum. Описанный метод
применим к осадочным отложениям в природной пресной воды и к искусственному осадку.
2 Нормативные ссылки
Нижеследующие нормативные документы являются обязательными для применения настоящего
документа. В отношении датированных ссылок действительными являются только указанные издания.
В отношении недатированных ссылок применимо последнее издание ссылаемого документа, включая
любые изменения к нему.
ISO 5667-15, Качество воды. Отбор проб. Часть 15. Руководство по консервации и работе с
пробами отстоя и осадка
ISO 5667-16, Качество воды. Отбор проб. Часть 16. Руководство по биотестированию проб
ISO 10523, Качество воды. Определение рН
ISO 11465, Качество почвы. Определение сухого вещества и содержания воды на основе массы.
Гравиметрический метод
ISO 20079, Качество воды. Определение токсического воздействия составляющих воды и
отстойных вод на ряску (Lemna minor). Тест на подавление роста ряски
OECD 218, Руководство OECD по испытаниям химических веществ. Тест на токсичность
хирономидов в седиментационной воде с использованием маркированного осадка
© ISO 2013 – Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
3 Термины и определения
В данном документе применяются следующие термины и определения:
3.1
искусственный осадок
artificial sediment
установленный искусственный осадок
2
[ИСТОЧНИК: ISO 10872:2010 определение 3.3, с изменениями]
Примечание 1 к статье: См. 6.9.
3.2
хлороз
chlorosis
потеря пигментов (пожелтение растительных тканей)
[ИСТОЧНИК: ISO 20079:2005, определение 3.3, с изменениями]
3.3
контрольная проба
control sample
искусственный осадок, предварительно обработанный в соответствии с требованиями настоящего
испытания, который служит как отрицательный контроль, с которым сравнивают воздействие в
отношении испытуемого материала
2
[ИСТОЧНИК: ISO 10872:2010 определение 3.6, с изменениями]
3.4
эффективная концентрация
effective concentration
E C
r x
концентрация вещества в испытуемой пробе (EC ), при которой измеряется воздействие x %, если
x
сравнивать с контролем
[ИСТОЧНИК: ISO 20079:2005, определение 3.9, с изменениями]
Примечание 1 к статье: Чтобы однозначно указать значение EC , выведенное из скорости роста, предлагается
использовать обозначение “E C ”.
r x
3.5
надводный рост
emersed growth
морфологическая предрасположенность водных макрофитов, растущих над поверхностью воды
3.6
верхушка (растения)
кольцо (пучок) листьев на конце стебля
head-whorl
верхушечная часть растения Myriophyllum
Примечание 1 к статье: См. Рисунок A.1.
2 © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
3.7
некроз
necrosis
локализованное омертвение растительной ткани (т.e. ткань коричневого или белого цвета)
[ИСТОЧНИК: ISO 20079:2005, определение 3.16, с изменениями]
3.8
питательный раствор
nutrient solution
раствор питательных веществ и микроэлементов в воде, которые важны для роста перистолистника
Myriophyllum
[ИСТОЧНИК: ISO 20079:2005, определение 3.17, с изменениями]
3.9
предкультура
pre-culture
культура Myriophyllum aquaticum, используемая для акклиматизации испытуемых растений к условиям
испытания и для выращивания растений, верхушечная часть которых будет использоваться для
испытания
[ИСТОЧНИК: ISO 20079:2005, определение 3.19, с изменениями]
Примечание 1 к статье: См. Рисунок A.2.
3.10
параллельный опыт
replicate
один из выбранного ряда испытуемых сосудов (содержащий материал одной пробы и испытуемые
организмы)
Примечание 1 к статье: Испытывают каждый сосуд.
Примечание 2 к статье: Параллельные опыты, описанные в данном международном стандарте, включают
материал пробы (например, натуральный осадок) и три кольца листьев перистолистника Myriophyllum aquaticum.
3.11
проба для испытания
test sample
отдельная часть пробы (например, осадок или искусственный осадок)
2
[ИСТОЧНИК: ISO 10872:2010, определение 3.14, с изменениями]
3.12
кольцо (листьев)
мутовка
whorl
листья, расположенные по радиусу из отдельных точек и окружающие стебель
Примечание 1 к статье: См. Рисунок A.1.
4 Сущность метода
Кольца листьев Myriophyllum aquaticum подвергают воздействию со стороны испытуемых проб в
течение 10 дней. Рост перистолистника Myriophyllum aquaticum в испытуемой пробе сравнивают с его
ростом в контрольной пробе. Количественно определяют фитотоксические воздействия как
подавление роста (%) относительно роста в контрольной пробе.
© ISO 2013 – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
5 Помехи
В случае проблем с ростом перистолистника Myriophyllum control при использовании искусственного
осадка, следует проверить соответствующие компоненты, в первую очередь, исключить загрязнение,
например, тяжелыми металлами (каолин) или пригодность торфа (если используется не
рекомендованный торф).
6 Реактивы
Используют, по мере возможности, реактивы признанной аналитической чистоты.
6.1 Вода, дистиллированная или деионизованная вода или вода равноценной чистоты,
проводимость < 10 мкСм/см.
6.2 Каолиновая глина, каолиновый порошок (CAS RN 1332-58-7).
6.3 Карбонат кальция, CaCO в порошке (CAS RN 471-34-1).
3
6.4 Кварцевый песок, средний размер зерна 170 мкм (см. Приложение C).
6.5 Контрольное вещество, 3,5-дихлорфенол [C H OCl (чистота ≥ 99 %), CAS RN 591-35-5].
6 4 2
6.6 Питательный раствор, с использованием среды Штейнберга (Steinberg), описанной в
Приложении B.
6.7 Торф, сфагновый (Sphagnum) торф (например, литовский торф), H2-H5, мелкозернистый
(размер зерна ≤5 мм) (см. Приложение C).
6.8 Торфяной порошок, сухой торф (6.7) в течение 7 дней при комнатной температуре.
Распределяют торф по плоским подносам и переворачивают каждые 2 дня – 3 дня. Затем измельчают
торф и просеивают через сито с размером отверстий 0,5 мм. Определяют сухую массу торфяного
порошка просушиванием небольшой порции при температуре 60 °C в течение 3 ч четырьмя
аликвотами, и определяют сухую массу посредством взвешивания до достижения постоянной массы
(см. ISO 11465). Хранят торфяной порошок в герметичных сосудах до использования. Отмечают массу
сухого вещества на сосуде.
6.9 Искусственный осадок, см. Таблицу 1.
Таблица 1 — Сухие ингредиенты в составе искусственного осадка
Ингредиенты % сухой массы осадка Характеристики
Торфяной порошок 5 см. 6.8
Кварцевый песок 74 средний размер зерна 170 мкм
Каолиновая глина 20 порошок
CaCO порошок 1 прогнозный анализ
3
6.9.1 Искусственный осадок как контрольная проба.
Приготовление искусственного осадка в качестве контрольного, описано ниже (6.9.1.1 – 6.9.1.3). Сухие
составляющие для приготовления искусственного осадка можно хранить по отдельности в закрытых
воздухонепроницаемых емкостях в сухом темном месте при комнатной температуре в течение не
менее 6 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ Такие требования (6.9.1.1 – 6.9.1.3) выполняются для создания стабильных условий
окружающей среды для осадка и чтобы избежать отделения компонентов осадка в процессе испытания.
4 © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
6.9.1.1 Приготовление торфяной суспензии.
Берут требуемое количество торфяного порошка (6.8, Таблицу 1) и порошка CaCO (см. Таблицу 1) и
3
добавляют питательный раствор (6.6) до такой консистенции, чтобы суспензию было легко
перемешивать (максимум 50 % от общей сухой массы осадка). Тщательно перемешивают.
Выдерживают торфяную суспензию в течение от 3 дней до 4 дней при постоянном помешивании при
комнатной температуре, чтобы стабилизировать pH. После этого измеряют pH суспензии и регулируют,
если необходимо, до уровня 6,7 ± 0,5 добавлением порошка CaCO .
3
ПРИМЕЧАНИЕ Опыт показывает, что pH обычно составляет 6,7 ± 0,5; поэтому нет необходимости в
дополнительном добавлении CaCO .
3
6.9.1.2 Добавление и смешивание компонентов осадка.
Смешивают торфяную суспензию с другими компонентами (кварцевый песок и коалиновая глина,
(см. Таблицу 1), чтобы получить гомогенный осадок. Снова измеряют pH конечной смеси и регулируют
на уровне 7,0 ± 0,5 добавлением порошка CaCO , если необходимо.
3
ПРИМЕЧАНИЕ Опыт показывает, что pH обычно составляет 7,0 ± 0,5; поэтому нет необходимости в
дополнительном добавлении CaCO3.
6.9.1.3 Кондиционирование смешанной суспензии осадка.
Добавляют питательный раствор (6.6) в качестве надосадочной жидкостью в перемешанный осадок
(6.9.1.2) в отношении: 1 часть (по массе) перемешанного осадка плюс максимум 0,5 части (по объему)
питательного раствора. Кондиционируют эту смесь в течение от 7 дней до 9 дней в условиях
воздействия (см. 10.5), чтобы создать устойчивый микробный компонент и избежать отделения
компонентов осадка в процессе испытания. Осторожно сливают надосадочный питательный раствор
через 7 дней – 9 дней. Осадок готов к немедленному использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ Опыт показывает, что искусственный осадок можно хранить при температуре от 4 °C до 8 °C в
темноте в течение 14 дней.
6.9.2 Искусственный осадок для предкультуры.
Смешивают сухие компоненты осадка (см. Таблицу 1) и встряхивают сухую смесь в течение от 2 ч до
3 ч в роторном шейкере при комнатной температуре. Сухую порошкообразную смесь осадка можно
держать без ограничений в воздухонепроницаемой емкости в сухом и темном месте при комнатной
температуре.
Отмеряют 125 г смеси сухого порошкообразного осадка в емкости для предкультуры вместимостью
1 000 мл, добавляют (65 ± 5) мл питательного раствора (6.6), и тщательно перемешивают до
однородности. Суспензия осадка должна быть непрозрачной. Уплотняют осадок, постукивая сосудом
по столу, чтобы удалить пузырьки воздуха и полости в пределах матрицы осадка.
ПРИМЕЧАНИЕ Выращивание предкультур (см. 10.1) в искусственном осадке для контрольных проб (6.9.1) или
в искусственном осадке для предкультур (6.9.2) не имеет большого влияния на результаты последующего
испытания; поэтому оба искусственных осадка (6.9.1 и 6.9.2) подойдут в качестве осадка для выращивания
предкультуры.
7 Аппаратура
Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее:
7.1 Автоклав.
© ISO 2013 – Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
7.2 Емкости цилиндрические или конусообразные, химические стаканы из стекла или
пластмассы, чашки для кристаллизации [например, для предкультуры: диаметр дна 10 см, диаметр
верхней части 13 см, высота 11 см; для испытания: стеклянные химические стаканы вместимостью
250 мл, низкой формы; см. Рисунки A.2 b) и А.3 b )].
7.3 Сушильная печь, приблизительно 105 °C.
7.4 Инкубатор с температурным контролем (термостат) с постоянным освещением, например,
климатическая камера.
7.5 Фотометр, для измерения фотосинтетической активной радиации (ФАР = PAR), в
фотосинтетическом диапазоне от 400 нм до 700 нм со сферическим квантовым датчиком.
7.6 pH метр.
7.7 Прецизионные весы, требуемая точность 0,1 мг.
7.8 Роторный встряхиватель (шейкер).
7.9 Скальпель или ножницы.
7.10 Сито, из нержавеющей стали, размер ячеек 0,5 мм.
7.11 Прозрачные крышки, стеклянные или пластмассовые, с отверстиями (например, с
перфорацией), чтобы позволить осуществление вохдухо- и влагообмена [см. Рисунки A.2 b) и А.3 b)].
7.12 Пинцет.
7.13 Мешалка.
7.14 Стеклянный электрод, для измерения значений pH водных растворов и осадков.
7.15 Измельчитель, для превращения торфа в порошок после сушки (например, блендер).
7.16 Ступка, для гомогенизации осадков после сушки after drying (см. Приложение D).
7.18 Вытяжной шкаф (см. Приложение D).
8 Испытание с контрольным веществом
Чтобы обеспечить адекватность и практическую неизменность испытательных условий в лаборатории
(включая состояние и чувствительность испытуемых организмов), необходимо регулярно испытывать
контрольное вещество, не реже одного раза в 6 месяцев, используя одну и ту же концентрацию вблизи
его EC для нормы роста. Подходящим контрольным веществом является 3,5-дихлорфенол (DCP),
50
влияние которого на рост Myriophyllum aquaticum подтверждено.
DCP испытывают в искусственном осадке в соответствии с инструкциями по маркированию осадка (см.
Приложение D) и испытаниям (см. Раздел 10 ). Подавление роста при концентрации 90 мг/кг сухой
массы искусственного осадка по сравнению с контрольным ростом должно попасть в диапазон
от 20 % до 50 %.
ПРИМЕЧАНИЕ Диапазон ингибирующих воздействий для 3,5-дихлорфенола основан на данных
международного межлабораторного исследования данного международного стандарта (см. Приложение E).
6 © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
9 Испытуемый организм
Myriophyllum aquaticum (Vellosco) Вердкурта (источник поставки см. Приложение C) используют как
испытуемый вид в данном международном стандарте. Необходимо документальное подтверждение
его происхождения. Для растений, полученных из дикой природы, необходимо подтверждение
таксономии.
10 Проведение испытания
10.1 Выращивание предкультуры Myriophyllum aquaticum для контактного испытания
Используют искусственный осадок для выращивания предкультуры (6.9.2). Высаживают
свежесрезанные пучки верхней части стебля культур в возрасте от 5 недель до 7 недель в осадок для
выращивания предкультуры. Закрывают емкости прозрачными крышками с отверстиями для аэрации и
влагообмена. Инкубируют растения в климатической камере при температуре (24 ± 1) °C при
-2 -1 -2 -1
интенсивности света от 60 мкмоль м с до 75 мкмоль м с или от 4 100 люкс до 5 550 люкс
(нейтральный белый) в режиме постоянного освещения. Добавляют питательный раствор (6.6),
разбавленный равными объемами воды (6.1), чтобы избежать обезвоживания, и перемещают, чтобы
расположить культуры в случайном порядке не реже чем раз в 3 дня – 4 дня. Спустя одну неделю
снимают крышки, чтобы растения росли без помех.
Рекомендуется выращивать от семи до девяти верхушек в каждом сосуде для предкультуры
(7.2, конический, Ø дна 10 см, Ø верхней части 13 см, высота 11 см) и как можно больше сосудов с
предкультурами в одном испытании. Длина и толщина стебля влияет на массу верхушки. Чтобы для
испытания получить максимально однородные верхушки, важно иметь много растительного материала,
из которого выбирают верхушки для выращивания.
При поливе необходимо следить, чтобы вновь посаженные верхушки растений не всплывали из осадка.
Питательный раствор, разбавленный водой, осторожно добавляют до получения тонкого слоя на
поверхности осадка. Через несколько дней, когда верхушки укоренятся, можно добавить больше
жидкости (например, до толщины слоя 0,5 см).
ПРИМЕЧАНИЕ Можно использовать любой другой метод выращивания предкультуры, постольку поскольку они
растут как надводные, используя условия роста, сопоставимые с условиями испытания, и поскольку выполняются
критерии достоверности (скорость роста ≥ 0,09, выполняется изменчивость контроля ≤ 15 %).
10.2 Приготовление контрольной пробы
В качестве контрольной пробы используют искусственный осадок (6.9.1). Измеряют и регистрируют pH.
Помещают в каждый из не менее трех сосудов для параллельных опытов 80 г свежеприготовленной
контрольной пробы. До использования параллельных сосудов уплотняют осадок постукиванием
сосудов по поверхности стола.
10.3 Отбор проб, хранение и подготовка проб для испытания
10.3.1 Отбор проб и хранение проб для испытания
Исследуют подлежащий анализу материал максимально быстро после отбора проб. Пробы отбирают в
соответствии ISO 5667-16 и ISO 5667-15, и хранят их в темном месте при температуре от 2 °C до 5 °C в
течение не более двух недель.
Определяют pH испытуемого материала и контрольной пробы в соответствии с ISO 10523 (водный и
осадочный материал для анализа).
[1]
ПРИМЕЧАНИЕ Также допускается определение pH по ISO 10390 .
© ISO 2013 – Все права сохраняются 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 14189:2013(R)
10.3.2 Подготовка пробы для испытания
В качестве испытуемой пробы используют натуральный или искусственный осадок. Осадки можно
использовать в их первоначальном состоянии, а в искусственные осадки можно ввести определенные
химические вещества (процедура маркировки химическими веществами описана в Приложение D).
Тщательно перемешивают каждую пробу и записывают pH. Помещают пробу как минимум в три сосуда
для параллельного опыта по 80 г (мокрая масса) пробы в каждый. Последующее добавление
питательного раствора (6.6) в испытуемые пробы необходимо только для проб, если отсутствует
надосадочная жидкость (слой от 1 мм до 2 мм) после загрузки пробы.
ПРИМЕЧАНИЕ Для роста растения обычно достаточно добавления питательных веществ в натуральные
осадки.
10.4 Проведение испытания
В начале испытания отмечают положение каждого из трех верхушек в каждом испытательном сосуде.
Используют растения от предкультур в возрасте (21 ± 3) дня и разрезают их на кольца листьев
(мутовки), требующиеся для испытаний (максимум от 2 до 4 на побег, каждое кольцо с пятью-шестью
листьями, см. Рисунок A.1). Используемые в испытаниях кольца не должны иметь признаков боковых
побегов. Собирают отрезанные кольца в стеклянном сосуде в питательном растворе (6.6) для
случайного отбора. Прежде чем перенести три кольца в сосуд для параллельного опыта, каждое
кольцо готовят пошагово следующим образом: осторожно подсушивают кольцо (нижней частью вверх)
на бумажной салфетке, так чтобы удалить избыток воды, не повредив кольца. Затем сразу
взвешивают на прецизионных весах и записывают массу. Масса каждого кольца должна составлять
порядка (25 ± 6) мг. Переносят это кольцо (верхней стороной вверх) немедленно в одно из заранее
отмеченных положений (1 - 3) сосуда для параллельного опыта (см. Рисунок A.3).
Это позволяет осуществить сравнение массы свежих испытуемых растений, полученной в конце
периода воздействия с первоначальной массой колец листьев в начале испытания. После помещения
колец в сосуды для параллельного опыта закрывают сосуды прозрачными крышками с отверстиями
для аэрации и влагообмена. В течение периода экспонирования, поливают и рандомизируют
контрольные и испытуемые пробы каждые 24 ч – 72 ч. Для полива используют питательный раствор
(6.6), разбавленный равными объемами воды (6.1).
При поливе необходимо следить, чтобы вновь посаженные кольца не всплывали из осадка.
Питательный раствор, разбавленный водой, осторожно добавляют до получения тонкого слоя
жидкости на поверхности осадка. Рекомендуется рандомизация проводить ежедневно.
ПРИМЕЧАНИЕ Рекомендуемая масса кольца листьев (25 ± 6) мг.
10.5 Условия экспонирования
Испытуемые сосуды должны быть закрыты прозрачными крышками для снижения испарения воды, но
не герметично, чтобы происходил воздухообмен в сосудах. Сосуды инкубируют в контролируемых
стандартизованных условиях при температуре (24 ± 1) °C, при постоянном освещении (нейтральный
белый свет), в течение 10 дней. Измеряют фотосинтетически активную радиацию (ФАР) с помощью
сферического квантового датчика. Интенсивность света на уровне пробы внутри сосуда и самих
−2 −1 −2 −1
сосудов должна быть однородной в диапазоне от 60 мкмоль м с до 75 мкмоль м с
(от 400 нм до 700 нм) или от 4 100 люкс до 5 550 люкс.
Рекомендуется случайное расположение испытательных сосудов в инкубаторе с повторной
рандомизацией, но без компенсации значительных отклонений интенсивности света и температуры в
различ
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16191
First edition
2013-05-01
Water quality — Determination of the
toxic effect of sediment on the growth
behaviour of Myriophyllum aquaticum
Qualité de l’eau — Détermination de l’effet toxique des sédiments sur
la croissance de Myriophyllum aquaticum
Reference number
ISO 16191:2013(E)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16191:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 16191:2013(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Interferences . 3
6 Reagents . 3
7 Apparatus . 5
8 Test with reference substance . 6
9 Test organism . 6
10 Procedure. 6
10.1 Pre-culturing of Myriophyllum aquaticum for the contact test. 6
10.2 Preparation of the control sample . 6
10.3 Sampling, storage, and preparation of the test samples . 7
10.4 Test procedure . 7
10.5 Exposure conditions . 7
10.6 Measurements . 8
11 Evaluation . 9
11.1 Growth rate r . 9
11.2 Means per test and control vessel (r , r ) . 9
V,T V,C
11.3 Means per test and control sample (r , r ) . 9
S,T S,C
11.4 Inhibition I . 9
11.5 Estimation of E C values . 9
r x
11.6 Expression of results .10
12 Validity criteria .11
13 Test report .11
Annex A (informative) Figures .12
Annex B (normative) Preparation of nutrient solution (Steinberg medium, following ISO 20079).
14
Annex C (informative) Suppliers .16
Annex D (normative) Preparation of spiked artificial sediments .18
Annex E (informative) Performance data .20
Bibliography .21
© ISO 2013 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16191:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2, www.iso.org/directives.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received, www.iso.org/patents.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 16191:2013(E)
Introduction
The contact test with Myriophyllum aquaticum described in this International Standard allows the
measurement of responses of the plant to dissolved and particle-bound substances present in sediment
samples within 10 d (References [3][4][5][6][7][8]).
The test plant, Myriophyllum aquaticum (Vellosco) Verdcourt (parrot feather), is a dicotyledonous
macrophyte. It is a native of the Amazon River in South America, but it has naturalized worldwide,
especially in warmer climates. It has been introduced worldwide for use in indoor and outdoor aquaria.
For its use as test organism, its capability for emersed growth (no additional liquid as supernatant is
needed), its strong regeneration potential, and its vegetative growth are harnessed in the contact test.
Furthermore, Myriophyllum aquaticum grows without generating side shoots during the test period,
which facilitates handling in the laboratory. However, it should be ensured that no live plant material is
lost from the laboratory.
Myriophyllum aquaticum can be affected by phytotoxic substances present in sediments (e.g. dredged
material). The subsequent inhibition of growth is calculated from the parameter (fresh mass) by a
number of defined calculation methods.
© ISO 2013 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16191:2013(E)
Water quality — Determination of the toxic effect of sediment
on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if
any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions. It shall be
ensured that no plant material can elude the laboratory.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International
Standard be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for determining the toxicity of environmental samples
on the growth of Myriophyllum aquaticum. The method described is applicable to natural fresh water
sediment and artificial sediment.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-15, Water quality — Sampling — Part 15: Guidance on the preservation and handling of sludge
and sediment samples
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 10523, Water quality — Determination of pH
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric method
ISO 20079, Water quality — Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on
duckweed (Lemna minor) — Duckweed growth inhibition test
OECD 218, OECD Guidelines for the testing of chemicals — Sediment-water Chironomid toxicity test using
spiked sediment
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
artificial sediment
defined artificial sediment
2
[SOURCE: ISO 10872:2010, definition 3.3, modified]
Note 1 to entry: See 6.9.
© ISO 2013 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 16191:2013(E)
3.2
chlorosis
loss of pigments (yellowing of plant tissue)
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.3, modified]
3.3
control sample
artificial sediment pre-treated according to the need of this test that serves as negative control to which
the effect in the respective test material is compared
2
[SOURCE: ISO 10872:2010, definition 3.6, modified]
3.4
effective concentration
E C
r x
concentration of a substance in a test sample (EC ) at which an effect of x % is measured, if compared
x
to the control
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.9, modified]
Note 1 to entry: To unambiguously denote an EC value deriving from growth rate, it is proposed to use the
symbol “E C ”.
r x
3.5
emersed growth
morphological habitus of aquatic macrophytes, growing above the water surface
3.6
head-whorl
apical part of a Myriophyllum plant
Note 1 to entry: See Figure A.1.
3.7
necrosis
localized dead plant tissue (i.e. brown or white)
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.16, modified]
3.8
nutrient solution
solution of nutrients and micronutrients in water which are essential for the growth of Myriophyllum
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.17, modified]
3.9
pre-culture
culture of Myriophyllum aquaticum used for acclimatization of test plants to the test conditions and for
the growing of the plants to be used as whorls at test start
[SOURCE: ISO 20079:2005, definition 3.19, modified]
Note 1 to entry: See Figure A.2.
3.10
replicate
one of a selected number of test vessels (containing sample material from one sample and test organisms)
Note 1 to entry: Each vessel is tested.
Note 2 to entry: The replicates mentioned in this International Standard contain sample material (e.g. natural
sediment) and three whorls of Myriophyllum aquaticum.
2 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 16191:2013(E)
3.11
test sample
discrete portion of a sample (e.g. sediment or artificial sediment)
2
[SOURCE: ISO 10872:2010, definition 3.14, modified]
3.12
whorl
arrangement of leaves that radiate from a single point and surround the stem
Note 1 to entry: See Figure A.1.
4 Principle
Myriophyllum aquaticum whorls are exposed to test samples over a period of 10 d. The growth of
Myriophyllum aquaticum in a test sample is compared with its growth in the control sample. Phytotoxic
effects are quantified as growth inhibition (%) relative to the control growth.
5 Interferences
In case of problems with Myriophyllum control growth using artificial sediment, the respective
components should be checked, first to exclude contamination with, for example, heavy metals (kaolin)
or suitability of peat (if the recommended peat is not used).
6 Reagents
Use, as far as possible, reagents of recognized analytical grade.
6.1 Water, distilled or deionized water or water of equivalent purity, conductivity < 10 µS/cm.
6.2 Kaolin clay, kaolin powder (CAS RN 1332-58-7).
6.3 Calcium carbonate, CaCO powder (CAS RN 471-34-1).
3
6.4 Quartz sand, average grain size 170 µm (see Annex C).
6.5 Reference substance, 3,5-dichlorophenol [C H OCl (purity ≥ 99 %), CAS RN 591-35-5].
6 4 2
6.6 Nutrient solution, use Steinberg medium as specified in Annex B.
6.7 Peat, Sphagnum peat (e.g. Lithuania peat), H2-H5, fine (grain size ≤5 mm) (see Annex C).
6.8 Peat powder, dry peat (6.7) for 7 d at room temperature.
Spread the peat on shallow trays, and turn the peat every 2 d to 3 d. Then grind the peat and sieve it
through a 0,5 mm sieve. Determine dry mass of the peat powder by drying a small sub-sample at 60 °C
for 3 h in four aliquots, and determine the dry mass by re-weighing until constant mass (see ISO 11465).
Store the peat powder in airtight vessels until use. Note down the dry mass on the vessel.
6.9 Artificial sediment, see Table 1
© ISO 2013 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 16191:2013(E)
Table 1 — Dry constituents for composition of the artificial sediment
Constituents % of sediment dry mass Characteristics
Peat powder 5 see 6.8
Quartz sand 74 average grain size 170 µm
Kaolin clay 20 powder
CaCO 1 pro analysis
3
powder
6.9.1 Artificial sediment as control sample.
Preparation of the artificial sediment as control sediment is described below (6.9.1.1 to 6.9.1.3). The
dry constituents for preparation of the artificial sediment may be stored separately in closed, airtight
vessels in a dry and dark place at room temperature for at least 6 months.
NOTE These requirements (6.9.1.1 to 6.9.1.3) are carried out for establishing stable ambient conditions in the
sediment and avoiding separation of the sediment components during the test.
6.9.1.1 Preparation of peat suspension.
Take the required amount of peat powder (6.8, Table 1) and CaCO powder (see Table 1) and add nutrient
3
solution (6.6) until the suspension can be stirred easily (at maximum 50 % of total sediment dry mass).
Stir carefully. Keep the peat suspension for 3 d to 4 d with continuous gentle stirring at room temperature
to stabilize pH. Afterwards, measure pH of the suspension and adjust if necessary to 6,7 ± 0,5 by adding
CaCO powder.
3
NOTE Experience has shown that the pH is at 6,7 ± 0,5; therefore, no further addition of CaCO is usually necessary.
3
6.9.1.2 Addition and blending of sediment components.
Mix the peat suspension with the other constituents (quartz sand and kaolin clay, see Table 1) to obtain
a homogeneous sediment. Measure the pH of the final mixture again and adjust it to 7,0 ± 0,5 by adding
CaCO powder if necessary.
3
NOTE Experience has shown that the pH is at 7,0 ± 0,5; therefore, no further addition of CaCO is usually necessary.
3
6.9.1.3 Conditioning of the mixed sediment suspension.
Add nutrient solution (6.6) as supernatant to the mixed sediment (6.9.1.2) in the ratio: 1 part (mass)
mixed sediment plus maximum 0,5 parts (volume) nutrient solution. Condition this mixture for 7 d to 9 d
under exposure conditions (see 10.5) to establish a stable microbial component and to avoid separation
of the sediment components during the test. Remove the supernatant of nutrient solution carefully after
7 d to 9 d. The sediment is ready for instant use.
NOTE Experience has shown that the artificial sediment can be stored at 4 °C to 8 °C in the darkness for 14 d.
6.9.2 Artificial sediment for pre-culturing.
Mix the dry sediment constituents (see Table 1) and shake the dry mixture for 2 h to 3 h in a rotary
shaker at room temperature. The dry sediment powder mixture can be maintained without restraint in
an airtight vessel in a dark and dry place at room temperature.
Measure 125 g dry sediment powder mixture into a 1 000 ml pre-culture vessel, add (65 ± 5) ml nutrient
solution (6.6), and stir carefully until it is homogeneous. The sediment suspension should be muddy.
4 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 16191:2013(E)
Condense the sediment by knocking the vessels on the table to eliminate air bubbles and cavities within
the sediment matrix.
NOTE Growing of the pre-cultures (see 10.1) in artificial sediment for control samples (6.9.1) or in artificial
sediment for pre-culturing (6.9.2) has no significant influence on the results of a subsequent test; therefore, both
artificial sediments (6.9.1 and 6.9.2) are suitable as pre-culturing sediment.
7 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following:
7.1 Autoclave.
7.2 Cylindrical or conical vessels, plastic or glass beakers, crystallizing dishes [e.g. for the pre-culture:
diameter bottom 10 cm, diameter top 13 cm, height 11 cm; for the test: 250 ml glass beakers, low form;
see Figures A.2 b) and A.3 b)].
7.3 Drying oven, approximately 105 °C.
7.4 Temperature-controlled incubator with constant illumination, e.g. climate chamber.
7.5 Light meter, to measure photosynthetically active radiation (PAR), within the photosynthetic range
400 nm to 700 nm with a spherical quantum sensor.
7.6 pH meter.
7.7 Precision balance, required accuracy of 0,1 mg.
7.8 Rotary shaker.
7.9 Scalpel or scissors.
7.10 Sieve, stainless steel, mesh size 0,5 mm.
7.11 Translucent lids, glass or plastic, with openings (e.g. holes) to allow air and humidity exchange
[see Figures A.2 b) and A.3 b)].
7.12 Tweezers.
7.13 Stirrer.
7.14 Glass electrode, to measure pH values of aqueous solutions and sediments.
7.15 Grinder, to pulverize peat after drying (e.g. blender).
7.16 Mortar, to homogenize sediments after drying (see Annex D).
7.18 Fume hood (see Annex D).
© ISO 2013 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 16191:2013(E)
8 Test with reference substance
To ensure that the laboratory test conditions (including the condition and sensitivity of the test organisms)
are adequate and have not changed significantly, a reference substance has to be tested regularly, at least
every 6 months, using one concentration near its EC for growth rate. A suitable reference substance is
50
3,5-dichlorophenol (DCP), which has been shown to affect the growth of Myriophyllum aquaticum.
DCP is tested in artificial sediment according to instructions for spiking (see Annex D) and testing
(see Clause 10). The inhibition of growth at a concentration of 90 mg/kg dry mass of artificial sediment
compared to the control growth should be in the range of 20 % to 50 %.
NOTE The range of inhibitory effects for 3,5-dichlorophenol is based on the data of the international
interlaboratory test of this International Standard (see Annex E).
9 Test organism
Myriophyllum aquaticum (Vellosco) Verdcourt (source of supply, see Annex C) is used as test species
in this International Standard. Documentation of its origin is needed. Plants obtained from a wild
population need a confirmation of their taxonomy.
10 Procedure
10.1 Pre-culturing of Myriophyllum aquaticum for the contact test
Use artificial sediment for pre-culturing (6.9.2). Plant the fresh-cut head-whorls from 5- to 7-week
old cultures into the pre-culturing sediment. Close the vessels with translucent lids with openings
for aeration and humidity exchange. Incubate the plants in a climate chamber at (24 ± 1) °C at a light
-2 -1 -2 -1
intensity of 60 µmol m s to 75 µmol m s or 4 100 lx to 5 550 lx (neutral white) with constant light
regime. Add nutrient solution (6.6) diluted with equal volumes of water (6.1) to avoid desiccation, and
randomize the cultures at least every 3 d to 4 d. After one week, remove the lids to allow the plants to
grow without hindrance.
Planting of seven to nine head-whorls per pre-culture vessel (7.2, conical, Ø bottom 10 cm, Ø top 13 cm,
height 11 cm) and many pre-culture vessels per test are recommended. The length and the thickness of
the stem have influence on the mass of the whorl. To have mostly homogeneous whorls for the test, it is
important to have much plant material to select whorls from for the test.
When irrigating, take care that new planted head-whorls do not float out of the sediment. Nutrient
solution diluted with water is carefully added until obtaining a thin layer of liquid at the sediment
surface. After a few days, when the head-whorls are rooted, more liquid (e.g. 0,5 cm height) can be added.
NOTE Any other pre-culture method is possible as long as pre-cultures are growing emersed, using
growth conditions comparable to test conditions and the validity criteria (growth rate ≥ 0,09, variation in the
control ≤ 15 %) is met.
10.2 Preparation of the control sample
Use artificial sediment (6.9.1) as control sample. Measure and record the pH. Fill at least three replicate
vessels with 80 g of freshly prepared control sample each. Before using the replicates, condense the
sediment by knocking the vessels on the table.
6 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 16191:2013(E)
10.3 Sampling, storage, and preparation of the test samples
10.3.1 Sampling and storage of the test sample
Examine the material to be tested as soon as possible after sampling. Collect samples as specified in
ISO 5667-16 and ISO 5667-15, and store them in the dark at a temperature of 2 °C to 5 °C for not more
than two weeks.
Determine the pH of the test material and control sample in accordance with ISO 10523 (aqueous test
material, sediments).
[1]
NOTE Determination of pH according to ISO 10390 is also possible.
10.3.2 Preparation of the test sample
Use natural or artificial sediment as the test sample. The sediments can be used in their original state, or
artificial sediments can be spiked with chemicals (spiking procedure is specified in Annex D). Stir each
sample thoroughly and record the pH. Fill at least three replicate vessels per test sample with 80 g (wet
mass) of test sample each. Further addition of nutrient solution (6.6) to test samples is only necessary
for samples where there is no supernatant (1 mm to 2 mm) after packing of the sample.
NOTE The nutrient supply in natural sediments usually is sufficient for plant growth.
10.4 Test procedure
At the start of the test, mark the positions of the three whorls on each test vessel. Use plants from
(21 ± 3) d old pre-cultures and cut them into the whorls needed for testing (2 to 4 maximum per shoot,
each whorl with five to six leaves; see Figure A.1). The whorls used for the test shall show no signs of
side shoots. Collect the cut whorls in a glass vessel in nutrient solution (6.6) for randomization. Before
transferring three whorls into the replicate, handle each whorl step by step as follows: Dry the whorl
carefully (bottom side up) on tissue paper in a way that ensures the reduction of surplus water without
damaging the whorls. Weigh it immediately on a precision balance and record the mass. The mass of
each whorl should be (25 ± 6) mg. Transfer this whorl (top side up) immediately to one of the pre-marked
positions (1 to 3) of the replicate (see Figure A.3).
This allows a comparison of the fresh mass of the test plants reached at the end of the exposure time
to the initial mass of the whorls at the beginning of the test. Once the whorls are introduced into the
replicates, close the vessels with translucent lids with openings for aeration and humidity exchange.
During the exposure period, irrigate and randomize the control and test samples every 24 h to 72 h. Use
nutrient solution (6.6) diluted with equal volumes of water (6.1) for irrigation.
When irrigating, take care that newly planted whorls do not float out of the sediment. Nutrient solution
diluted with water is carefully added until obtaining a thin layer of liquid at the sediment surface. Daily
randomization is recommended.
NOTE The range of (25 ± 6) mg as whorl mass is recommended.
10.5 Exposure conditions
The test vessels shall be sufficiently covered by translucent lids to reduce water evaporation, but they
shall not be airtight in order to allow air exchange into the vessels. Incubate the test vessels under
controlled standardized conditions at (24 ± 1) °C, under continuous lighting (neutral white), for 10 d.
Measure photosynthetically active radiation (PAR) with a spherical quantum sensor. Light intensity at
−2 −1
the sample level in and among the test vessels shall be homogeneous within the range of 60 µmol m s
−2 −1
to 75 µmol m s (400 nm to 700 nm) or 4 100 lx to 5 550 lx.
© ISO 2013 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 16191:2013(E)
Random positioning of test vessels within the incubator with re-randomization is recommended, but
does not compensate for high deviations of light intensity and temperature between different places of
the test area.
NOTE Randomization can be achieved by using a turntable (1 turn/min).
10.6 Measurements
10.6.1 Visual observation of the plants and pH control
Determine and record physiological adverse effects, such as necrosis or chlorosis, and morphological
changes for each plant per replicate at the end of the test. Determine and record the pH of the samples
at the end of the test.
10.6.2 Fresh mass of the whole plant
Determine and record fresh mass of each plant at the beginning (whorls, 10.4) and the end (whole plant,
including roots) of the test. To measure the final fresh mass of the test plants, pick them carefully from
the test samples with tweezers. Wash the plants cautiously, dry them carefully on tissue paper without
damaging the whorls, and weigh them immediately to ensure that the results are not impaired by drying
of the plant material.
10.6.3 Inactivation of the test plants
After finishing
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16191
Première édition
2013-05-01
Qualité de l’eau — Détermination de
l’effet toxique des sédiments sur la
croissance de Myriophyllum aquaticum
Water quality — Determination of the toxic effect of sediment on the
growth behaviour of Myriophyllum aquaticum
Numéro de référence
ISO 16191:2013(F)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16191:2013(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2013
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 16191:2013(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 3
5 Interférences . 3
6 Réactifs . 3
7 Appareillage . 5
8 Essai avec la substance de référence . 6
9 Organisme d’essai . 6
10 Mode opératoire. 6
10.1 Préculture de Myriophyllum aquaticum pour l’essai contact . 6
10.2 Préparation de l’échantillon témoin . 6
10.3 Prélèvement, conservation et préparation des échantillons pour essai . 7
10.4 Mode opératoire d’essai . 7
10.5 Conditions d’exposition . 7
10.6 Mesurages . 8
11 Évaluation . 9
11.1 Taux de croissance r . 9
11.2 Moyennes par récipient d’essai et récipient témoin (r , r ) . 9
V,T V,C
11.3 Moyennes par échantillon pour essai et récipient témoin (r , r ). 9
S,T S,C
11.4 Inhibition I . 9
11.5 Estimation des valeurs de CE(r)x . 9
11.6 Expression des résultats .11
12 Critères de validité .11
13 Rapport d’essai .11
Annexe A (informative) Figures .13
Annexe B (normative) Préparation d’une solution nutritive(milieu de Steinberg, selon
l’ISO 20079) .15
Annexe C (informative) Fournisseurs .17
Annexe D (normative) Préparation de sédiments artificiels dopés .19
Annexe E (informative) Données de performances .21
Bibliographie .23
© ISO 2013 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16191:2013(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/CEI, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou sur la liste ISO des déclarations de brevets reçues
(voir www.iso.org/brevets).
Les éventuelles appellations commerciales utilisées dans le présent document sont données pour
information à l’intention des utilisateurs et ne constituent pas une approbation ou une recommandation.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 5, Méthodes biologiques.
iv © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 16191:2013(F)
Introduction
L’essai contact avec Myriophyllum aquaticum, décrit dans la présente Norme internationale, permet de
mesurer les réponses de la plante à des substances dissoutes et liées à des particules présentes dans des
échantillons de sédiments pendant une durée de 10 jours (Références [3],[4],[5],[6][7],[8]).
La plante d’essai, Myriophyllum aquaticum (Vellosco) Verdcourt (plume de perroquet) est un macrophyte
de la classe des dicotylédones. Elle est originaire du fleuve Amazone en Amérique du Sud, mais s’est
acclimatée dans le monde entier, en particulier dans les climats chauds. Elle a été introduite dans le
monde entier afin d’être utilisée dans les aquariums intérieurs et extérieurs. En ce qui concerne son
utilisation en tant qu’organisme d’essai, sa capacité de croissance émergée (aucun liquide supplémentaire
comme surnageant n’est requis), son fort potentiel de régénération et sa croissance végétative sont
exploités dans l’essai de contact. Par ailleurs, Myriophyllum aquaticum croît sans générer de pousses
latérales pendant la période d’essai, ce qui facilite la manipulation en laboratoire. Il convient néanmoins
de s’assurer qu’aucun matériel végétal vivant n’est perdu par le laboratoire.
Myriophyllum aquaticum peut être affectée par des substances phytotoxiques présentes dans les
sédiments et les matériaux de dragage. L’inhibition de la croissance qui en découle est calculée à partir
du paramètre (masse fraîche) par un certain nombre de méthodes de calcul définies.
© ISO 2013 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 16191:2013(F)
Qualité de l’eau — Détermination de l’effet toxique des
sédiments sur la croissance de Myriophyllum aquaticum
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse
bien les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but
de traiter tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe
à l’utilisateur d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité et de
s’assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur. Il est nécessaire de s’assurer
qu’aucun matériel végétal ne peut sortir du laboratoire.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément à la présente
Norme internationale soient effectués par du personnel ayant suivi une formation appropriée.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode permettant de déterminer la toxicité
d’échantillons environnementaux sur la croissance de Myriophyllum aquaticum. La méthode décrite
s’applique aux sédiments d’eau douce naturels et aux sédiments artificiels.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 5667-15, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 15: Lignes directrices pour la conservation et le
traitement des échantillons de boues et de sédiments
ISO 5667-16, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
ISO 10523, Qualité de l’eau — Détermination du pH
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
ISO 20079, Qualité de l’eau — Détermination de l’effet toxique des constituants de l’eau et des eaux résiduaires
vis-à-vis des lentilles d’eau (Lemna minor) — Essai d’inhibition de la croissance des lentilles d’eau
OCDE 218, Lignes directrices de l’OCDE pour les essais de produits chimiques — Essai de toxicité sur les
chironomes dans un système eau-sédiment chargé
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
sédiment artificiel
sédiment artificiel défini
[SOURCE: ISO 10872:2010, définition 3.3, modifiée]
Note 1 à l’article: Voir 6.9.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 16191:2013(F)
3.2
chlorose
dépigmentation (jaunissement du tissu végétal)
[SOURCE: ISO 20079:2005, définition 3.3, modifiée]
3.3
échantillon témoin
sédiment artificiel prétraité selon les besoins de cet essai et servant de témoin négatif auquel est comparé
l’effet sur le matériau d’essai correspondant
[SOURCE: ISO 10872:2010, définition 3.6, modifiée]
3.4
concentration efficace
CE(r)x
concentration d’une substance dans un échantillon pour essai (CE ) à laquelle un effet de x % est mesuré
x
par rapport au témoin
[SOURCE: ISO 20079:2005, définition 3.9, modifiée]
Note 1 à l’article: Afin d’indiquer sans ambiguïté une valeur de CE dérivée du taux de croissance, il est proposé
d’utiliser le symbole «CE(r)x».
3.5
croissance émergée
aspect morphologique des macrophytes aquatiques, poussant au-dessus de la surface de l’eau
3.6
verticille supérieur
partie apicale de Myriophyllum
Note 1 à l’article: Voir Figure A.1.
3.7
nécrose
mort localisée d’un tissu végétal (c’est-à-dire apparition d’une coloration marron ou blanche)
[SOURCE: ISO 20079:2005, définition 3.16, modifiée]
3.8
solution nutritive
solution aqueuse contenant les nutriments et les micronutriments essentiels pour la croissance de
Myriophyllum[SOURCE: ISO 20079:2005, définition 3.17, modifiée]
3.9
préculture
culture de Myriophyllum aquaticum utilisée pour l’acclimatation des plantes aux conditions d’essai et
pour la croissance des plantes dont les verticilles seront utilisées au début de l’essai
[SOURCE: ISO 20079:2005, définition 3.19, modifiée]
Note 1 à l’article: Voir Figure A.2.
3.10
réplicat
un parmi un nombre sélectionné de récipients d’essai (contenant un prélèvement de matériau provenant
d’un seul échantillon et les organismes d’essai
Note 1 à l’article: Chaque récipient est soumis à essai.
Note 2 à l’article: Les réplicats mentionnés dans la présente Norme internationale contiennent un échantillon de
matériau (par exemple sédiment naturel) et trois verticilles de Myriophyllum aquaticum.
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 16191:2013(F)
3.11
échantillon pour essai
portion discrète d’un échantillon (par exemple, sédiment ou sédiment artificiel)
[SOURCE: ISO 10872:2010, définition 3.14, modifiée]
3.12
verticille
feuilles disposées de façon circulaire autour d’un point central et entourant la tige
Note 1 à l’article: Voir Figure A.1.
4 Principe
Les verticilles de Myriophyllum aquaticum sont exposés aux échantillons pour essai pendant une période
de 10 jours. La croissance de Myriophyllum aquaticum dans un échantillon pour essai est comparée à sa
croissance dans l’échantillon témoin. Les effets phytotoxiques sont quantifiés en tant qu’inhibition de la
croissance (%) par rapport à la croissance dans l’échantillon témoin.
5 Interférences
Si la croissance de l’échantillon en condition témoin de Myriophyllum en utilisant un sédiment artificiel
pose problème, il convient de vérifier les composants respectifs, en premier lieu pour exclure une
contamination par exemple par des métaux lourds (kaolin), ou l’adéquation de la tourbe (si la tourbe
recommandée n’est pas utilisée).
6 Réactifs
Utiliser dans la mesure du possible des réactifs de qualité analytique reconnue.
6.1 Eau, distillée ou déionisée ou eau de pureté équivalente, conductivité < 10 µS/cm.
6.2 Kaolin, kaolin en poudre (n° CAS 1332-58-7).
6.3 Carbonate de calcium, CaCO en poudre (n° CAS 471-34-1).
3
6.4 Sable de quartz, granulométrie moyenne 170 µm (voir Annexe C).
6.5 Substance de référence, 3,5-dichlorophénol [C H OCl (pureté ≥ 99 %), n° CAS 591-35-5].
6 4 2
6.6 Solution nutritive, utiliser le milieu Steinberg modifié tel que spécifié dans l’Annexe B.
6.7 Tourbe, tourbe de sphaignes (par exemple tourbe de Lituanie), H2-H5, fine (granularité ≤ 5 mm)
(voir Annexe C).
6.8 Tourbe en poudre, tourbe séchée (6.7) pendant 7 jours à température ambiante.
Étaler la tourbe sur des plateaux peu profonds et retourner la tourbe tous les 2 à 3 jours. Broyer ensuite
la tourbe et la passer au tamis de 0,5 mm. Déterminer la masse sèche de la poudre de tourbe en faisant
sécher un petit sous-échantillon à 60 °C pendant 3 h en quatre aliquotes et déterminer la masse sèche
en repesant autant de fois que nécessaire jusqu’à obtention d’une masse constante (voir l’ISO 11465).
Conserver la poudre de tourbe dans des récipients hermétiques jusqu’au moment de l’utilisation. Noter
la masse sèche sur le récipient.
6.9 Sédiment artificiel, voir le Tableau 1.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 16191:2013(F)
Tableau 1 — Constituants secs pour la composition du sédiment artificiel
Constituants % de la masse sèche de sédiment Caractéristiques
Tourbe en poudre 5 voir 6.8
Sable de quartz 74 granularité moyenne 170 µm
Kaolin 20 poudre
CaCO en poudre 1 qualité analytique
3
6.9.1 Sédiment artificiel utilisé comme échantillon témoin.
La préparation du sédiment artificiel utilisé comme sédiment témoin est décrite ci-dessous (6.9.1.1
à 6.9.1.3). Les constituants secs pour la préparation du sédiment artificiel peuvent être conservés
séparément dans des récipients fermés hermétiquement dans un endroit sec et à l’abri de la lumière à
température ambiante pendant au moins 6 mois.
NOTE Le respect des exigences suivantes (6.9.1.1 à 6.9.1.3) permet d’établir des conditions ambiantes stables
dans le sédiment et d’éviter la séparation des composants du sédiment pendant l’essai.
6.9.1.1 Préparation d’une suspension de tourbe.
Prélever la quantité requise de tourbe en poudre (6.8, Tableau 1) et de CaCO en poudre (voir Tableau 1) et
3
ajouter la solution nutritive (6.6) jusqu’à ce que la suspension puisse être mélangée aisément (au maximum
50 % due la masse sèche totale de sédiment). Mélanger soigneusement. Laisser la suspension de tourbe
pendant 3 à 4 jours sous agitation modérée continue à température ambiante, pour stabiliser le pH. Ensuite,
mesurer le pH de la suspension et l’ajuster si nécessaire à 6,7 ± 0,5 en ajoutant du CaCO en poudre.
3
NOTE L’expérience ayant montré que le pH se situe à 6,7 ± 0,5, il n’est en général pas nécessaire d’ajouter du CaCO .
3
6.9.1.2 Ajout et mélange des composants du sédiment.
Mélanger la suspension de tourbe avec les autres constituants (sable de quartz et kaolin, voir Tableau 1)
afin d’obtenir un sédiment homogène. Mesurer à nouveau le pH du mélange final et l’ajuster à 7,0 ± 0,5 en
ajoutant du de CaCO en poudre si nécessaire.
3
NOTE L’expérience ayant montré que le pH se situe à 7,0 ± 0,5, il n’est en général pas nécessaire d’ajouter du CaCO .
3
6.9.1.3 Conditionnement de la suspension de sédiment mélangé.
Ajouter la solution nutritive (6.6) comme liquide surnageant au-dessus du sédiment mélangé (6.9.1.2)
selon le rapport suivant: 1 partie (en masse) de sédiment mélangé pour au maximum 0,5 partie (en
volume) de solution nutritive. Conditionner ce mélange pendant 7 à 9 jours dans les conditions
d’exposition (voir 10.5) pour obtenir une flore microbienne stable et pour éviter la séparation des
composants du sédiment durant l’essai. Au bout de 7 à 9 jours, éliminer soigneusement le surnageant de
solution nutritive. Le sédiment est prêt pour une utilisation immédiate.
NOTE L’expérience a montré que le sédiment artificiel peut être conservé à une température comprise entre
4 °C et 8 °C à l’obscurité pendant 14 jours.
6.9.2 Sédiment artificiel pour préculture.
Mélanger les constituants secs du sédiment (voir Tableau 1) et agiter le mélange sec pendant 2 h à 3 h
dans un agitateur rotatif à température ambiante. Le mélange de sédiment sec en poudre peut être
conservé sans restriction dans un récipient hermétique placé à l’abri de la lumière, dans un endroit sec
à température ambiante.
Peser 125 g de mélange de sédiment sec en poudre dans un récipient de préculture de 1 000 ml, ajouter
(65 ± 5) ml de solution nutritive (6.6) et remuer soigneusement jusqu’à ce que le mélange soit homogène.
4 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 16191:2013(F)
Il convient que la suspension de sédiment ait la consistance d’une boue. Tasser le sédiment en tapotant
les récipients sur la table pour éliminer les bulles d’air et les interstices dans la matrice sédimentaire.
NOTE La croissance des précultures (voir 10.1) dans un sédiment artificiel témoin (6.9.1) ou dans un
sédiment artificiel pour préculture (6.9.2) n’a aucune influence notable sur les résultats de l’essai qui suit; les
deux sédiments artificiels (6.9.1 et 6.9.2) peuvent donc servir de sédiment pour la préculture.
7 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, les éléments suivants.
7.1 Autoclave.
7.2 Récipients cylindriques ou coniques, béchers en plastique ou en verre, cristallisoirs [par exemple
pour la préculture: diamètre du fond 10 cm, diamètre de la partie supérieure 13 cm, hauteur 11 cm; pour
l’essai: béchers en verre de 250 ml, forme basse; voir Figure A.2 b) et Figure A.3 b)].
7.3 Étuve, environ 105 °C.
7.4 Incubateur thermostaté à éclairage constant, par exemple enceinte climatique.
7.5 Luxmètre, pour mesurer le rayonnement photosynthétiquement actif (PAR), dans la plage de
longueurs d’ondes, adéquate pour la photosynthèse, comprise entre 400 nm et 700 nm, à l’aide d’un
capteur quantique sphérique.
7.6 pH-mètre.
7.7 Balance de précision, précision requise de 0,1 mg.
7.8 Agitateur rotatif.
7.9 Scalpel ou ciseaux.
7.10 Tamis, en acier inoxydable, taille de maille de 0,5 mm.
7.11 Couvercles translucides, en verre ou en plastique, munis d’orifices (par exemple des trous) pour
permettre l’échange d’air et d’humidité [voir Figure A.2 b) et Figure A.3 b)].
7.12 Pinces.
7.13 Agitateur.
7.14 Électrode en verre, pour mesurer les valeurs de pH des solutions aqueuses et des sédiments.
7.15 Broyeur, pour pulvériser la tourbe après séchage (par exemple mixeur).
7.16 Mortier, pour homogénéiser les sédiments après séchage (voir Annexe D).
7.18 Sorbonne (voir l’Annexe D).
© ISO 2013 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 16191:2013(F)
8 Essai avec la substance de référence
Pour s’assurer que les conditions d’essai en laboratoire (y compris l’état et la sensibilité des organismes
d’essai) sont adéquates et qu’elles n’ont pas varié de façon significative, il est nécessaire de soumettre
à essai régulièrement (au moins une fois tous les 6 mois), une substance de référence, en utilisant une
concentration proche de sa valeur de CE basée sur le taux de croissance. Le 3,5-dichlorophénol (DCP),
50
dont l’effet sur la croissance de Myriophyllum aquaticum a été démontré, constitue une substance de
référence appropriée.
Le DCP est soumis à essai dans le sédiment artificiel conformément aux instructions relatives au
dopage (voir Annexe D) et aux essais (voir Article 10). Il convient que l’inhibition de la croissance, à
une concentration de 90 mg/kg en masse sèche de sédiment artificiel par rapport à la croissance dans
l’échantillon témoin, se situe dans la gamme comprise entre 20 % et 50 %.
NOTE La plage des effets inhibiteurs pour le 3,5-dichlorophénol est basée sur les données de l’essai
international interlaboratoires de la présente Norme internationale (voir l’Annexe E).
9 Organisme d’essai
Myriophyllum aquaticum (Vellosco) Verdcourt (pour la source d’approvisionnement, voir l’Annexe C) est
utilisé comme espèce test dans la présente Norme internationale. Les documents relatifs à son origine sont
nécessaires. Les plantes provenant d’une population sauvage nécessitent une confirmation de leur taxonomie.
10 Mode opératoire
10.1 Préculture de Myriophyllum aquaticum pour l’essai contact
Utiliser le sédiment artificiel pour préculture (6.9.2). Planter les verticilles supérieurs fraîchement
coupés à partir de cultures âgées de 5 semaines à 7 semaines dans le sédiment de préculture. Utiliser
les couvercles translucides munis d’orifices pour l’échange d’air et d’humidité pour fermer les récipients.
Incuber les plantes dans une enceinte climatique à (24 ± 1) °C à une intensité lumineuse comprise
−2 −1 −2 −1
entre 60 µmol m s et 75 µmol m s ou entre 4 100 lx et 5 550 lx (blanc neutre), avec un régime
lumineux constant. Ajouter la solution nutritive (6.6) diluée à volume égal avec de l’eau (6.1) pour éviter
la dessiccation et répartir les cultures de façon aléatoire tous les 3 à 4 jours. Au bout d’une semaine,
retirer les couvercles pour permettre aux plantes de pousser sans entrave.
Il est recommandé de planter 7 à 9 verticilles supérieurs par récipient de préculture (7.2, conique,
diamètre du fond 10 cm, diamètre du haut 13 cm, hauteur 11 cm) et d’utiliser de nombreux récipients
de préculture par essai. La longueur et l’épaisseur de la tige ont une influence sur la masse du verticille.
Pour obtenir les verticilles les plus homogènes possibles pour l’essai, il est important de disposer de
beaucoup de matériel végétal afin de choisir les verticilles qui conviennent pour l’essai.
Lors de l’hydratation, veiller à ce que les verticilles nouvellement plantés ne flottent pas au-dessus du
sédiment. La solution nutritive diluée avec de l’eau est soigneusement ajoutée jusqu’à l’obtention d’une
mince couche de liquide à la surface du sédiment. Au bout de quelques jours, lorsque les racines des
verticilles ont poussé, il est possible d’ajouter plus de liquide (par exemple une hauteur de 0,5 cm).
NOTE Toute autre méthode de préculture est possible tant que les précultures ont une croissance émergée,
dans des conditions de croissance comparables aux conditions d’essai, et que la validité des critères (taux de
croissance ≥ 0,09, variation dans l’échantillon témoin ≤ 15 %) est assurée.
10.2 Préparation de l’échantillon témoin
Utiliser le sédiment artificiel (6.9.1) comme échantillon témoin. Mesurer et enregistrer le pH. Remplir
au moins trois récipients identiques avec chacun 80 g d’échantillon témoin fraîchement préparé. Avant
d’utiliser les réplicats, tasser le sédiment en tapotant les récipients sur la table.
6 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 16191:2013(F)
10.3 Prélèvement, conservation et préparation des échantillons pour essai
10.3.1 Prélèvement et conservation de l’échantillon pour essai
Examiner le matériau à soumettre à essai dès que possible après le prélèvement. Prélever les échantillons
comme spécifié dans l’ISO 5667-16 et l’ISO 5667-15 et les conserver à l’abri de la lumière à une température
comprise entre 2 °C et 5 °C pendant deux semaines au maximum.
Déterminer le pH du matériau d’essai et de l’échantillon témoin conformément à l’ISO 10523 (matériau
d’essai aqueux, sédiments).
[1]
NOTE Il est également possible de déterminer le pH conformément à l’ISO 10390 .
10.3.2 Préparation de l’échantillon pour essai
Utiliser un sédiment naturel ou artificiel comme échantillon pour essai. Les sédiments peuvent être
utilisés dans leur état initial ou des sédiments artificiels peuvent être dopés par des produits chimiques
(un mode opératoire de dopage est spécifié dans l’Annexe D). Remuer soigneusement chaque échantillon
et enregistrer le pH. Pour chaque échantillon pour essai, remplir au moins trois récipients identiques avec
chacun 80 g (masse humide) d’échantillon pour essai. L’ajout de solution nutritive (6.6) aux échantillons
pour essai est uniquement nécessaire pour les échantillons ne présentant pas de liquide surnageant
(1 mm à 2 mm) après tassement de l’échantillon.
NOTE L’apport nutritif des sédim
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.