SIST ISO 16303:2014
Water quality - Determination of toxicity of fresh water sediments using Hyalella azteca
Water quality - Determination of toxicity of fresh water sediments using Hyalella azteca
This International Standard specifies a method for the determination of toxicity to young Hyalella azteca in whole sediment based on survival and growth inhibition after 14 d and/or 28 d. The method is applicable to: a) samples of contaminated whole fresh water sediment; b) chemical, industrial, or municipal sludge, or other solid wastes that may combine with fresh water sediments; or c) chemicals or preparations spiked into clean sediment. This International Standard is applicable to the testing of sediment samples from the fresh water environment. Hyalella azteca can be used in the testing of brackish waters up to a maximum of 15 ‰, with careful acclimation. This International Standard is not applicable to the testing of sediment samples from the marine and estuarine environment with a salinity of > 15 ‰. This method is a 14 d and/or 28 d survival and growth test applicable to the sediment sample types described above.
Qualité de l'eau - Détermination de la toxicité des sédiments d'eau douce vis-à-vis de Hyalella azteca
L'ISO 16303:2013 d�finit une m�thode de d�termination de la toxicit� d'un s�diment entier vis-�-vis de jeunes amphipodes Hyalella azteca, fond�e sur la survie et l'inhibition de la croissance apr�s 14 jours et/ou 28 jours.
La m�thode s'applique
a) aux �chantillons de s�diments d'eau douce contamin�s,
b) aux boues chimiques, industrielles, urbaines, ou autres d�chets solides pouvant se combiner � des s�diments d'eau douce, ou
c) � des produits chimiques ou des pr�parations ajout�(e)s � un s�diment propre.
L'ISO 16303:2013 est applicable aux �chantillons de s�diments d'eau douce. L'amphipode Hyalella azteca peut �tre utilis� pour soumettre � essai les eaux saum�tres d'une salinit� maximale de 15 ?, avec une acclimatation ad�quate. Elle n'est pas applicable aux essais sur des �chantillons de s�diments marins et estuariens pr�sentant une salinit� sup�rieure � 15 ?.
La pr�sente m�thode consiste en un essai de survie et de croissance d'une dur�e de 14 jours et/ou 28 jours, applicable aux types d'�chantillons de s�diments d�crits ci-dessus.
Kakovost vode - Določevanje strupenosti sedimenta celinskih vod s Hyalella azteca (Crustacea)
General Information
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 16303
Первое издание
2013-12-01
Качество воды. Определение
токсичности осаждений пресной воды
с использованием Hyalella azteca
Water quality —Determination of toxicity of fresh water sediments using
Hyalella azteca
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 16303:2013(R)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16303:2013(R)
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2013
Все права сохраняются. Если не задано иначе, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия офиса ISO по адресу, указанному ниже, или членов ISO в стране регистрации
пребывания.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 16303:2013(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .2
4 Сущность метода.3
5 Испытательная среда.3
5.1 Оборудование .3
5.2 Освещение.3
6 Реактивы, испытательные организмы и материалы.3
6.1 Испытательный организм.3
6.2 Контрольный осадок .4
6.3 Вышележащая вода.5
6.4 Кормление .6
6.5 Стандартное вещество.7
7 Оборудование .7
8 Обработка и подготовка проб.8
8.1 Общие вопросы.8
8.2 Испытательный осадок.8
8.3 Подготовка проб осадков .9
9 Процедура испытания .10
9.1 Приготовление испытательных емкостей.10
9.2 Введение организмов .10
9.3 Условия испытания.11
9.4 Обновление вышележащей воды .11
9.5 Тестовые наблюдения и измерения.11
10 Выражение результатов .12
10.1 Выживание.12
10.2 Рост .12
10.3 Валидность теста.12
11 Анализ и интерпретация результатов.12
11.1 Анализ данных .12
11.2 Факторы, не относящиеся к загрязнению .13
12 Стандартное вещество.13
12.1 Тест только с водой .14
12.2 Испытание цельного осадка .14
13 Протокол испытания.14
Приложение А (информативное) Описание Hyalella azteca.16
Приложение В (информативное) Культивирование Hyalella azteca.18
Приложение С (информативное) Источники Hyalella azteca .20
Приложение D (нормативное) Процедура для приготовления комбинированных кормов YCT.22
Приложение Е (информативное) 42-дневное испытание осадка на размножение .23
Приложение F (информативное) 14-дневный тест только с водой на выживание и рост .24
Приложение G (информативное) Рабочие результаты .25
Библиография.26
© ISO 2013 – Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16303:2013(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является Всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, ISO
работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Процедуры, используемые для разработки настоящего документа, и процедуры, предназначенные для
его дальнейшего ведения, описаны в Директивах ISO/IEC, Часть 1. В частности, следует отметить
различные критерии одобрения для различных типов документов ISO. Проект данного документа был
разработан по правилам, указанным в Директивах ISO/IEC, Часть 2 (см. www.iso.org/directives).
Обращается внимание на то, что некоторые элементы данного документа могут быть объектом
патентных прав. ISO не несет ответственности за идентификацию какого-либо одного или всех таких
патентных прав. Детали любых патентных прав, установленные в процессе подготовки этого
документа, будут указаны во Введении и/или в списке патентных заявок, полученных ISO (см.
www.iso.org/patents).
Любое фирменное название, используемое в этом документе, указывается только как информация для
удобства пользователей и не является рекомендацией.
Для объяснения специфических терминов ISO и выражений, относящихся к оценке соответствия, а
также информации о соблюдении ISO принципов WTO относительно Технических барьеров в торговле
(TBT) см. следующую гиперссылку URL: Предисловие – Дополнительная информация
Настоящий документ разработан Техническим комитетом ISO/TC 147, Качество воды, Подкомитетом
SC 5, Биологические методы.
iv © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 16303:2013(R)
Введение
Осаждение в водной среде служит резервуаром-отстойником для сельскохозяйственных,
промышленных и городских загрязнений. Загрязненные отложения оказывают непосредственное
вредное воздействие на донное сообщество и действуют как источник загрязнения для вышележащей
воды, часто также отрицательно влияя на пелагические сообщества. Испытания отложений на
токсичность проводятся в мировом масштабе для определения и мониторинга токсических
воздействий отдельных веществ или сложных смесей, которые могут быть вредными для
существования местных сообществ в водных или донных средах. В настоящем международном
стандарте описываются процедуры для проведения 14-дневных и/или 28-дневных
испытаний осаждений на токсичность с использованием бокоплавов отряда амфиподов Hyalella azteca.
Биологические конечные точки для испытаний включают смертность и рост.
© ISO 2013 – Все права сохраняются v
---------------------- Page: 5 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 16303:2013(R)
Качество воды. Определение токсичности осаждений
пресной воды с использованием Hyalella azteca
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Лица, использующие этот международный стандарт, должны быть
знакомы с нормальной лабораторной практикой. В настоящем международном стандарте не
предусматривается рассмотрение всех проблем безопасности, если таковые имеются,
связанных с его использованием. Пользователь сам должен установить надлежащие
нормативы по технике безопасности и защите здоровья и обеспечить их соответствие
условиям национального регулирования.
ВАЖНО — Абсолютно необходимо, чтобы испытания согласно этой части ISO 13165
проводились соответственно обученным персоналом.
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод определения токсичности для молодых
бокоплавов Hyalella azteca в цельном осадке на основе их выживания и замедления роста через
14 дней и/или 28 дней.
Метод применим
a) для проб загрязненного цельного отложения в пресной воде,
b) для химических, промышленных или городских шламов либо других твердых отходов, которые
можно объединить с пресноводными отложениями, и
c) для химикатов или препаратов, введенных в чистое отложение.
Настоящий международный стандарт применяется для испытания проб отложений в пресноводной
среде. Hyalella azteca можно использовать для тестирования в солоноватых водах вплоть до
максимальной солености 15 ‰ при тщательной акклимации. данный международный стандарт не
распространяется на испытания проб отложения в морской и речной устьевой среде с
соленостью > 15 %.
Этот метод представляет 14-дневное и/или 28-дневное испытание на выживание и рост, применяемое
для проб отложений, типы которых описаны выше.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы целиком или частично являются обязательными при
применении данного документа. Для жестких ссылок применяется только цитированное издание
документа. Для плавающих ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного
ссылочного документа (включая любые изменения).
ISO 5814, Качество воды. Определение растворенного кислорода. Электрохимический метод с
применением зонда
ISO 6059, Качество воды. Определение суммарного содержания кальция и магния.
Титриметрический метод с применением ЭДТА
ISO 10523, Качество воды. Определение pH
© ISO 2013 – Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 16303:2013(R)
3 Термины и определения
Применительно к настоящему документу используются условные обозначения, определения, единицы
и сокращения, определенные в ISO 80000-10, ISO/IEC Guide 98-3, и нижеследующие.
3.1
искусственный осадок
artificial sediment
смесь материалов, которые имитируют физические компоненты естественного отложения
Примечание 1 к статье: См. 6.2.1.
3.2
контрольный осадок
control sediment
проба отложения (естественного или искусственного), которая используется для оценки свойств
тестируемых организмов и приемлемости испытания (т.е. чистый осадок)
Примечание 1 к статье: Результаты испытаний контрольного осадка используются для сравнения с реакцией
организмов в загрязненных испытательных осадках и для оценивания валидности испытания.
Примечание 2 к статье: Контрольный осадок используется повседневно для оценки приемлемости испытания (6.2).
3.3
испытательный осадок
test sediment
отдельная порция отложения (собранного в естественных условиях или обогащенного), подлежащая
тестированию для оценки возможных воздействий на бокоплавы, обусловленных загрязнением
3.4
обогащенный осадок
spiked sediment
проба отложения, в которую для тестирования вводится какой-либо материал
3.5
стандартный осадок
reference sediment
проба отложения, собранная в естественных условиях в заданном участке, свойства которого
достаточно соответствуют свойствам проб(ы) испытательного осадка, кроме степени загрязнения
Примечание 1 к статье: Эту пробу часто отбирают на участке, который не подвержен источнику(ам) загрязнения,
но в непосредственной близости от участков, где отбирается испытательная проба. Поэтому результаты
испытания для определения токсичности являются специфичными для участка.
3.6
периодическое обновление
intermittent renewal
испытания, в ходе которых испытательные растворы или вышележащая вода обновляются из-за
ухудшения качества воды
3.7
вышележащая вода
overlying water
вода, расположенная над осадком в испытательной емкости
Примечание 1 к статье: Если необходимо, вышележащая вода также используется для различных процедур с
осадком (например, для приготовления заданного состава или смесей обогащенного осадка).
2 © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 16303:2013(R)
3.8
рост
growth
увеличение сухого веса тестируемых организмов в ходе эксперимента, выраженное как средний сухой
вес в расчете на выжившего бокоплава
4 Сущность метода
Молодые пресноводные бокоплавы, Hyalella azteca, в возрасте от 2 до 9 дней и с варьированием в
пределах от 1 до 2 дней, в группах по 10 организмов подвергаются воздействию загрязненного осадка
.[1] [2] [3
или испытательного осадка с введенной химической добавкой в течение 14 дней и/или 28 дней ] Конечными
точками тестирования являются процент смертности и замедление роста, которые оцениваются
относительно организмов, одновременно подвергаемых воздействию контрольного осадка. Испытание
проводят в стеклянных емкостях при отношении осадка к воде (объем:объем) 1:1,75 или 1:4 (например,.
100 мл осадка и 175 мл вышележащей воды или 100 мл осадка и 400 мл вышележащей воды).
Сравнительные испытания двух рекомендованных пропорций осадок-вода не показали никакой
[ ]
4
значительной разницы в результатах испытания с использованием Hyalella azteca. Единственное
преимущество соотношения осадка и воды 1:4 состоит в увеличении объема вышележащей воды для
химического анализа. Тестирующее воздействие в основном статическое, если только не применяется
обновление из-за ухудшения качества вышележащей воды контрольного осадка (например, смещение
pH, влияющее на форму фонового аммиака).
Долгосрочный вариант тестирования (т.е. 42 дня) для испытания на токсичность цельного осадка с
использованием Hyalella azteca описан в Приложении E. Конечные точки этого долгосрочного
тестирования включают выживание (28, 35 и 42 дня), рост (28 и 42 дня) и воспроизведение (число
молоди в расчете на женскую особь, полученное за период от 28 до 42 дней).
Метод с использованием только воздействия воды на Hyalella azteca также описан в Приложении F.
Этот метод представляет 14-дневное тестирование выживания и роста молодых бокоплавов,
подвергаемых воздействию проб промышленных или очищенных сточных вод, пресной воды
(например, из водоприемника), водных вытяжек или химических веществ, которые растворимы или
могут поддерживаться как устойчивые суспензии или дисперсии в условиях испытания.
5 Испытательная среда
5.1 Оборудование
Испытательное оборудование должно быть хорошо провентилировано, изолировано от физических
помех и очищено от пыли и газов. Тестирование проводится в термостатированном помещении или
камере, где поддерживается температура (23 ± 2) °C в испытательных емкостях.
5.2 Освещение
Все испытательные емкости должны получать прямое верхнее освещение, которое обеспечивает
нормальную освещенность лаборатории (т.е. 100 лк до 1 000 лк) на границе раздела воздух/вода.
Освещение должно быть равномерным и иметь цикл день/ночь (световой период), составляющий 16 ч
дневного света и 8 ч темноты.
6 Реактивы, испытательные организмы и материалы
Используются только реактивы признанной аналитической чистоты, если нет других установок.
6.1 Испытательный организм
Бокоплавы Hyalella azteca являются эпибентическими детритоядными организмами, которые зарываются в
пресноводное отложение и живут в тесном контакте с его поверхностным слоем на глубине 1 см или 2 см. Они
© ISO 2013 – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 16303:2013(R)
обитают в озерах, прудах и ручьях зон умеренного климата и широко распространены в Северной и Южной
.[1] [2] [3]
Америке Молодь Hyalella azteca получают из лабораторных культур, которые содержатся при
температурных условиях, световом периоде и кормлении, идентичных для условий испытания. Видовая
идентификация должна быть подтверждена квалифицированным персоналом, имеющим опыт в идентификации
пресноводных бокоплавов на основе различительных таксономических характеристик, описанных в Приложении A
.[2] [5]
и в предыдущих публикациях
.
6.1.1 Возраст и размер
Возраст бокоплавов, используемых для тестирования, должен быть от 2 до 9 дней и не различаться
более чем на 2 дня. Метод для культивирования Hyalella azteca и для получения испытательных
организмов известного возраста представлен в Приложении B. Если рост выражается как средний
размер в конце испытания, среднюю длину организмов следует определять в начале испытания.
6.1.2 Источник
Все бокоплавы, используемые для тестирования, должны быть получены из одной и той же популяции
и одного и того же источника. Источниками животных, которые используются для создания культур,
являются государственные или частные лаборатории, культивирующие Hyalella azteca для испытания
[] [] [ ]
1 2 3
токсичности отложений, или авторитетная биологическая компания-поставщик. Перечень
возможных источников Hyalella azteca приведен в Приложении C.
6.2 Контрольный осадок
Каждый тест токсичности отложения должен включать контроль с использованием как минимум пяти
дублированных испытательных емкостей, содержащих контрольный осадок. Отклики организмов на
воздействие контрольного осадка во время теста обеспечивают измерения для определения
валидности испытания (см. 10.3), подтверждение здоровья и нормального поведения испытательных
организмов и основание для интерпретации данных, полученных при испытании осадков. Контрольный
осадок может быть естественным или искусственным (т.е. приготовленным химическим способом)
отложением.
6.2.1 Естественный осадок
Естественный осадок, взятый из пресной воды или из слегка солоноватого (< 15 ‰) пробоотборного
участка, который удален от известных источников загрязнений и для которого известна процедура
контроля с использованием Hyalella azteca, может быть использован как контрольный осадок для теста
или как чистый материал для введения испытательного химиката. Если поровая вода с осадком имеет
измеримую соленость, испытательная лаборатория должна применять подходящую процедуру
акклимации, чтобы подготовить взрослых Hyalella azteca для использования в качестве организмов-
производителей и обеспечить использование молодых бокоплавов, адаптированных к солености, в
ходе испытания.
6.2.2 Искусственный осадок
Нижеприведенный искусственный осадок может быть использован в качестве контроля для испытаний
отложений пресной воды или как чистый материал для введения испытательного химиката. Этот
рецепт основан на искусственном осадке, рекомендованном в ISO 10872.
Следующие компоненты тщательно перемешивают в заданных пропорциях.
Al O : 20 %
2 3
CaCO : 1 %
3
Доломит (глина): 0,5 %
Fe O : 4,5 %
2 3
4 © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 16303:2013(R)
Кварцевый песок (средний размер частиц 0,063 мм): 30 %
Кварцевый песок (0,1 мм до 0,4 мм): 40 %
Торф (разложившийся торф из верхового болота, необработанный; мелкоразмолотый 4 %
и просеянный через сито < 1 мм):
Существует несколько приемлемых подходов к приготовлению и кондиционированию искусственного
осадка. В общем, при выборе состава для контроля или испытательного осадка должны
рассматриваться следующие атрибуты:
a) поддерживание выживания, роста или воспроизведения разновидностей донных организмов;
b) обеспечение соответствующих приемлемых биологических конечных точек для разнообразных
видов;
c) включение стандартных составляющих, которые легко доступны для испытательных лабораторий;
d) отсутствие концентраций загрязнителей, которые могут оказывать вредное воздействие на
испытательные организмы.
Приемлемые варианты искусственных осадков описаны в руководящем документе по данному вопросу
Министерства окружающей среды Канады, где указаны методы для введения испытательных
[6]
химикатов в осадок.
.
6.3 Вышележащая вода
6.3.1 Естественная пресная вода
Естественная пресная вода включает подачу незагрязненной грунтовой или поверхностной воды. Если
целью испытания является имитация участка в полевых условиях, естественную воду можно
разбавлять дистиллированной или деионизированной водой высокой чистоты, пока не будет
достигнута требуемая жесткость. Вода, взятая с участка, где отбирают отложение, также может быть
использована. Поверхностную воду следует отфильтровать через мелкое сито (например, 30 мкм) для
удаления возможных хищников или конкурентов. Дехлорированная вода не рекомендуется, потому что
ее качество часто бывает весьма изменчивым и она может содержать недопустимо высокие
концентрации хлора, хлораминов, фторида, меди, свинца, цинка или других загрязняющих веществ.
6.3.2 Реконструированная вода
Если реконструированная пресная вода используется как вышележащая вода в тестировании Hyalella
[ ]
7
azteca, следующая искусственная среда должна быть приготовлена в деионизироованной воде:
CaCl 110,98 мл/л
2
NaHCO 84,01 мл/л
3
MgSO 30,09 мл/л
4
KCl 3,728 мл/л
NaBr 1,029 мл/л
Перед использованием смесь аэрируют в течение 24 ч, чтобы отрегулировать содержание
растворенного кислорода (DO) и стабилизировать pH. Концентрации солей можно отрегулировать
аналогично составу в заданном водоприемнике. Однако соотношение Ca:Br должно поддерживаться
постоянным, потому что эти ионы являются весьма важными для Hyalella azteca и должны
[ ] + −
8
присутствовать вместе. Ионы Na и HCO наиболее существенны для выживания Hyalella azteca, а
3
2+ + [ ] [ ]
7 9
Mg и K необходимы для оптимального роста и размножения. Диапазоны для щелочности и
жесткости не определяются ввиду отсутствия подтвержденных данных об их влиянии. Стандартное
использование вышеприведенного рецепта реконструированной воды в культивировании и в качестве
испытательной воды подтвердило приемлемые уровни щелочности и жесткости для Hyalella azteca.
Проводимость, pH, жесткость, DO и щелочность измеряются в каждой партии реконструированной
воды. Данная партия реконструированной воды не должна использоваться дольше 4 недель.
© ISO 2013 – Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 16303:2013(R)
6.3.3 Растворенный кислород
Содержание растворенного кислорода (DO) в воде, расположенной над осадком, идеально должно
составлять от 90 % до 100 % величины насыщения воздухом в начале и на протяжении всего
испытания. Этот уровень DO поддерживается путем мягкой аэрации с использованием
отфильтрованного безмасляного сжатого воздуха. Скорость аэрации не должна приводить к
суспендированию осадка (например, 2 пузырька).
6.4 Кормление
Есть два варианта кормов, которые можно использовать в испытании Hyalella azteca. Доступный для
1
приобретения готовый рыбный корм, а также инокулят смеси дрожжей, Cerophyll™ и кормов для
форели (YCT), являются подходящими для Hyalella azteca при определенных испытательных
.[1] [2] [3] [10] [11] [12]
условиях
.
Также есть два варианта для частоты кормления. Испытательные организмы кормят или один раз в
день ежедневно, или три раза в неделю еженедельно (не каждый день подряд) на протяжении
испытания. Идентичный пищевой рацион добавляется в каждую испытательную камеру при каждом
[11]
кормлении. Предоставляемый рацион питания должен быть адекватным, чтобы обеспечивать
приемлемые выживание и рост Hyalella azteca в период испытания, но не должен быть избыточным.
6.4.1 Вариант 1: Рыбный корм
Имеющиеся в продаже готовые рыбные корма в виде хлопьев (например, Tetrafin™, Tetramin™ или
2
Nutrafin™) могут быть использованы как источник пищи для испытательных организмов во время
тестирования. Корм можно измельчать и просеивать через сито, чтобы хлопья были равномерными,
или приготовлять в виде суспензии, смешивая хлопья с чистой водой. Хлопьевидный рыбный корм
следует хранить при комнатной температуре в запечатанной емкости.
Если выбрано ежедневное кормление, то 2,7 мг хлопьев рыбного корма (сухой вес) добавляют в
каждую испытательную емкость в первый день испытания (в день, когда бокоплавов помещают в эти
испытательные емкости) и затем по одному разу каждый день до последнего дня испытания
включительно. Если выбрано трехразовое кормление в неделю, то 6,3 мг хлопьев рыбного корма
(сухой вес) добавляют три раза в неделю (начиная с первого дня испытания) в каждую испытательную
камеру не каждый день подряд (например, по воскресеньям, средам и пятницам) до последнего дня
испытания включительно. Оба рациона обеспечивают примерно одинаковую общую норму кормления;
однако ежедневное кормление, возможно, предпочтительнее, потому что в этом случае пища всегда в
[6]
наличии.
3
6.4.2 Вариант 2: Дрожжи, Cerophyll™ и корм для форелей (YCT)
В качестве второго варианта рекомендуется также кормовая смесь, основанная на методах испытания
Агентства США по защите окружающей среды (U.S. EPA) и Министерства окружающей среды Канады.
[ ] [ ]
1 2
.
Состав для приготовления YCT приведен в Приложении D. Если выбрано ежедневное кормление, то
3)
1,5 мл инокулята (эквивалент 2,7 мг рыбного корма, сухой вес) смеси дрожжей, Cerophyll™ и
форелевый корм добавляют в каждую испытательную емкость в первый день испытания (в день, когда
1
Cerophyll™ может быть получен от Ward's Scientific как "Cereal Grass Media - Cerophyll" (питательная среда из
зерновых культур). Эта информация дается только для удобства пользователей данного документа и не является
рекомендацией этого продукта от ISO.
2
Tetrafin™, Tetramin™ и Nutrafin™ являются примерами рыбных кормов в виде хлопьев, доступных для
приобретения. Эта информация дается только для удобства пользователей данного документа и не является
рекомендацией этого продукта от ISO.
3
Cerophyll™ может быть получен из Ward's Scientific как "Cereal Grass Media - Cerophyll" (питательная среда из
зерновых культур). Эта информация дается только для удобства пользователей данного документа и не является
рекомендацией этого продукта от ISO.
6 © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 16303:2013(R)
бокоплавов помещают в эти испытательные емкости) и затем по одному разу каждый день до
последнего дня испытания включительно. Если выбрано трехразовое кормление в неделю, то 3,5 мл
YCT (эквивалент ~ 6,3 мг рыбного корма, сухой вес) добавляют три раза в неделю (начиная с первого
дня испытания) в каждую испытательную камеру не каждый день подряд (например, по воскресеньям,
средам и пятницам) до последнего дня испытания включительно. Оба рациона обеспечивают
примерно одинаковую общую норму кормления; однако ежедневное кормление, возможно,
предпочтительнее, потому что в этом случае пища всегда в наличии.
YCT можно хранить в замороженном виде. Растаявшие аликвоты неиспользованных YCT можно
хранить в темноте при (4 ± 3) °C, но через 14 дней их следует выбросить.
6.5 Стандартное вещество
Хлорид кадмия (CdCl ), сульфат меди (CuSO ), хлорид натрия (NaCl) и хлорид калия (KCl) - все
2 4
[ ] [ ] [ ] [ ]
1 2 3 10
являю
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16303
First edition
2013-12-01
Water quality — Determination of
toxicity of fresh water sediments using
Hyalella azteca
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité des sédiments d’eau
douce vis-à-vis de Hyalella azteca
Reference number
ISO 16303:2013(E)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16303:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 16303:2013(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test environment . 3
5.1 Facilities . 3
5.2 Lighting . 3
6 Reagents, test organisms, and materials . 3
6.1 Test organism . 3
6.2 Control sediment . 3
6.3 Overlying water . 4
6.4 Food . 5
6.5 Reference substance . 6
7 Apparatus . 6
8 Treatment and preparation of samples . 7
8.1 General . 7
8.2 Test sediment . 7
8.3 Preparation of sediment samples . 8
9 Test procedure . 8
9.1 Preparing the test containers . 8
9.2 Introducing the organisms . 9
9.3 Test conditions . 9
9.4 Renewal of overlying water.10
9.5 Test observations and measurements .10
10 Expression of results .10
10.1 Survival .10
10.2 Growth .11
10.3 Validity of the test .11
11 Analysis and interpretation of results .11
11.1 Data analysis .11
11.2 Non-contaminant factors .11
12 Reference substance .12
12.1 Water-only test .12
12.2 Whole sediment test.12
13 Test report .13
Annex A (informative) Description of Hyalella azteca.14
Annex B (informative) Culturing Hyalella azteca .18
Annex C (informative) Sources of Hyalella azteca .20
Annex D (normative) Procedure for preparing YCT .22
Annex E (informative) 42-day sediment reproduction test .23
Annex F (informative) 14-day water-only survival-and-growth test.24
Annex G (informative) Performance data .25
Bibliography .26
© ISO 2013 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16303:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 16303:2013(E)
Introduction
Sediment in the aquatic environment serves as a reservoir for agricultural, industrial, and municipal
contaminants. Contaminated sediment adversely affects the benthic community directly and acts as
a source of contamination for the overlying water, often negatively impacting pelagic communities as
well. Sediment toxicity tests are used globally to determine and monitor the toxic effects of discrete
substances or complex mixtures that might be harmful to indigenous life in the aquatic and benthic
environments. This International Standard outlines procedures for conducting 14 d and/or 28 d tests
for sediment toxicity, using the fresh water amphipod Hyalella azteca. The biological end points for the
tests include mortality and growth.
© ISO 2013 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16303:2013(E)
Water quality — Determination of toxicity of fresh water
sediments using Hyalella azteca
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if
any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International
Standard be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of toxicity to young Hyalella azteca
in whole sediment based on survival and growth inhibition after 14 d and/or 28 d.
The method is applicable to
a) samples of contaminated whole fresh water sediment,
b) chemical, industrial, or municipal sludge, or other solid wastes that may combine with fresh water
sediments, and
c) chemicals or preparations spiked into clean sediment.
This International Standard is applicable to the testing of sediment samples from the fresh water
environment. Hyalella azteca can be used in the testing of brackish waters up to a maximum of 15 ‰,
with careful acclimation. This International Standard is not applicable to the testing of sediment samples
from the marine and estuarine environment with a salinity of > 15 ‰.
This method is a 14 d and/or 28 d survival-and-growth test applicable to the sediment sample types
described above.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5814, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Electrochemical probe method
ISO 6059, Water quality — Determination of the sum of calcium and magnesium — EDTA titrimetric method
ISO 10523, Water quality — Determination of pH
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
artificial sediment
mixture of materials that mimic the physical components of natural sediment
Note 1 to entry: See 6.2.1.
© ISO 2013 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 16303:2013(E)
3.2
control sediment
sediment (natural or artificial) that is used to assess the performance of the test organisms and test
acceptability (i.e. clean)
Note 1 to entry: The results of control sediment testing are used for comparison to response of organisms in the
contaminated test sediment(s) and for evaluating test validity.
Note 2 to entry: Used routinely to assess the acceptability of a test (6.2).
3.3
test sediment
discrete portion of sediment (field collected or spiked) to be tested for possible effects on amphipods
due to contamination
3.4
spiked sediment
sediment to which a material has been added for testing
3.5
reference sediment
field collected near an area of concern with properties representing sediment conditions that closely
match those of the sample(s) of the test sediment except for the degree of contamination
Note 1 to entry: It is often selected from a site uninfluenced by the source(s) of contamination but within the
general vicinity of the sites where samples of test sediment are collected. Test results provide a site-specific basis
for evaluating toxicity.
3.6
intermittent renewal
tests in which test solutions or overlying water are renewed during the test, based on deterioration of
water quality
3.7
overlying water
water placed over the layer of sediment in the test container
Note 1 to entry: Also used to manipulate the sediment, if necessary (e.g. for preparing formulated sediment or
mixtures of spiked sediment).
3.8
growth
increase in dry weight of test organisms during the experiment and expressed as mean dry weight per
surviving amphipod
4 Principle
Young fresh water amphipods, Hyalella azteca, aged 2 d to 9 d and ranging in age by 1 d to 2 d, are exposed
in groups of 10 organisms to a contaminated sediment or a test-chemical spiked sediment for 14 d and/or
[1] [2] [3]
28 d. The end points for the test are percent mortality and growth inhibition assessed relative
to organisms exposed concurrently to control sediment. The test is performed in glass containers with
the ratio of sediment to water (volume:volume) being either 1:1,75 or 1:4 (e.g. 100 ml of sediment with
175 ml of overlying water or 100 ml of sediment with 400 ml of overlying water). Comparative testing
of the two recommended sediment-to-water ratios showed no significant difference in test results using
[4]
Hyalella azteca. One advantage of the 1:4 sediment-to-water ratio is greater overlying water volume
for chemical analysis. The exposure is primarily static unless renewal is triggered by deterioration of
water in the control treatment (e.g. shifting pH affecting the form of background ammonia).
2 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 16303:2013(E)
A long-term test option (i.e. 42 d) for whole sediment toxicity testing using Hyalella azteca is described
in Annex E. End points of this long-term test include survival (Days 28, 35, and 42), growth (Days 28 and
42), and reproduction (number of young per female produced from Days 28 to 42).
A water-only method using Hyalella azteca is also described in Annex F. This method is a 14-day test of
survival and growth using young amphipods exposed to samples of industrial or sewage effluents, fresh
waters (e.g. receiving water), aqueous extracts, or chemical substances which are soluble or which can
be maintained as stable suspensions or dispersions under the conditions of the test.
5 Test environment
5.1 Facilities
The test facility shall be well ventilated, isolated from physical disturbances, and free from dust
and fumes. Tests shall be carried out in a temperature-controlled room or chamber that maintains a
temperature of (23 ± 2) °C in the test containers.
5.2 Lighting
All test containers shall receive direct, overhead illumination that provides normal laboratory lighting
(i.e. 100 lx to 1 000 lx) at the air/water interface. Illumination should be uniform and shall have a
day/night cycle (photoperiod) of 16 h of daylight and 8 h of darkness.
6 Reagents, test organisms, and materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
6.1 Test organism
Hyalella azteca is an epibenthic sediment-burrowing detritivore that lives in close contact with the
surficial 1 cm or 2 cm of fresh water sediments. They reside in temperate lakes, ponds, and slow-
[1] [2] [3]
flowing streams and are widely distributed on the North and South American continents. Young
Hyalella azteca are obtained from laboratory cultures maintained under the conditions of temperature,
photoperiod, and food identical to those in the test. The species identification should be confirmed
by qualified personnel experienced in identifying fresh water amphipods using the distinguishing
[2] [5]
taxonomic features described in Annex A and in previous publications.
6.1.1 Life stage and size
Amphipods used for the test shall be between the ages of 2 d and 9 d and shall not vary in age by more
than 2 d. A method for culturing Hyalella azteca and for obtaining known-age test organisms is provided
in Annex B. If growth is expressed as mean size at the end of the test, a mean length of organisms should
be determined at test initiation.
6.1.2 Source
All amphipods used in a test shall be derived from the same population and source. Sources of animals
to be used to establish cultures include government or private laboratories which are culturing Hyalella
[1] [2] [3]
azteca for sediment toxicity tests or a reputable biological supply company. A list of possible
sources of Hyalella azteca is provided in Annex C.
6.2 Control sediment
Each sediment toxicity test shall include a control with a minimum of five replicate test containers
containing control sediment. Responses of organisms exposed to control sediment during a test provide
measurements for determining test validity (see 10.3), evidence of the health and normal behaviour of
© ISO 2013 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 16303:2013(E)
the test organisms, and a basis for interpreting data derived from the test sediments. Control sediment
is either natural sediment or artificial (i.e. formulated) sediment.
6.2.1 Natural sediment
Natural sediment taken from a fresh water or slightly brackish (< 15 ‰) collection site removed from
known sources of contaminants, and for which there is known control performance with Hyalella
azteca, can be used as the control sediment for a test or as a clean material for spiking a test chemical.
If sediment pore water has any measureable salinity, the testing laboratory shall follow a suitable
acclimation procedure to ready adult Hyalella azteca for use as brood organisms and to ensure salinity-
adapted young amphipods are used during testing.
6.2.2 Artificial sediment
The following artificial sediment can be used as a control for fresh water sediment tests or as a clean material
for spiking a test chemical. This recipe is based on the artificial sediment recommended in ISO 10872.
Mix the following components thoroughly in the given proportions.
Al O : 20 %
2 3
CaCO : 1 %
3
Dolomite (clay): 0,5 %
Fe O : 4,5 %
2 3
Silica sand (mean particle size 0,063 mm): 30 %
Silica sand (0,1 mm to 0,4 mm): 40 %
Peat (decomposed peat from a raised bog, untreated; finely ground and < 1 mm sieved): 4 %
There are a number of acceptable approaches to preparing and conditioning artificial sediment. In general,
the following attributes should be considered when selecting a formulation for a control or test sediment.
a) should support the survival, growth, or reproduction of a variety of benthic organisms;
b) should provide consistent acceptable biological end points for a variety of species;
c) should comprise standard constituents that are readily available to test laboratories;
d) should be free from concentrations of contaminants that might cause adverse effects to test organisms.
Acceptable artificial sediment options are outlined in Environment Canada guidance on this subject,
[6]
including techniques for spiking test chemicals into sediment.
6.3 Overlying water
6.3.1 Natural fresh water
Natural fresh water includes an uncontaminated supply of groundwater or surface water. If the objective
of testing is to simulate field site conditions, natural water can be diluted with a high purity distilled
or deionized water until a desired hardness is achieved. Water taken from the site where sediment is
collected can also be used. Surface water should be filtered through a fine-mesh net (e.g. 30 µm) to
remove potential predators or competitors. Dechlorinated water is not recommended as overlying
water because its quality is often quite variable and it could contain unacceptably high concentrations
of chlorine, chloramines, fluoride, copper, lead, zinc, or other contaminants.
4 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 16303:2013(E)
6.3.2 Reconstituted water
If reconstituted fresh water is used as overlying water in Hyalella azteca tests, the following artificial
[7]
medium shall be prepared in deionized water:
CaCl 110,98 mg/l
2
NaHCO 84,01 mg/l
3
MgSO 30,09 mg/l
4
KCl 3,728 mg/l
NaBr 1,029 mg/l
The mixture is aerated for 24 h before use to adjust the dissolved oxygen (DO) and to stabilize pH. The
concentrations of salts can be adjusted to be of similar composition to a receiving water of interest.
However, the Ca:Br ratio shall be kept constant because these ions are essential for Hyalella azteca and
[8] + −
must be present together. Na and HCO are the most essential ions for Hyalella azteca survival, and
3
2+ + [7] [9]
Mg and K are needed for optimal growth and reproduction. Due to lack of confirmed influence,
ranges for alkalinity and hardness have not been defined. Standard use of the above reconstituted
water recipe in culturing and as testing water has confirmed acceptable alkalinity and hardness
levels for Hyalella azteca. Conductivity, pH, hardness, DO, and alkalinity are measured in each batch of
reconstituted water. A given batch of reconstituted water shall not be used for longer than 4 weeks.
6.3.3 Dissolved oxygen
The DO content of the water overlying the sediment is ideally to be 90 % to 100 % of the air-saturation
value at test initiation and throughout the test period. This level of DO is maintained by gentle aeration
using filtered, oil-free compressed air. The rate of aeration should not suspend the sediment (e.g. 2
bubbles/s to 3 bubbles/s).
6.4 Food
There are two food options for use in the Hyalella azteca test. Both commercial fish food and an inoculum
1)
of a mixture of yeast, Cerophyll™ , and trout chow (YCT) have been proven suitable for Hyalella azteca
[1] [2] [3] [10] [11] [12]
under the defined test conditions.
There are also two options for the frequency of feeding. Test organisms are fed either once daily or three
times weekly (on non-consecutive days) throughout the test. An identical food ration is added to each
[11]
test chamber on each feeding occasion. The ration provided shall be adequate to enable acceptable
survival and growth of Hyalella azteca during the test period, but must not be excessive.
6.4.1 Option 1: Fish food
2)
Commercial fish food flakes (e.g. Tetrafin™, Tetramin™, or Nutrafin™) can be used as a food source for
test organisms during the test. Food can be ground and sieved so that flakes are uniform in size or can
be prepared as a slurry by mixing the fish flakes with clean water. Fish food flakes should be stored at
room temperature in a sealed container.
If daily feeding is chosen, 2,7 mg of fish flakes (dry weight) is added to each test container on the first day
of the test (the day the amphipods are placed in the test containers), as well as once per day thereafter
until the day the test ends. If the option of feeding three times per week is chosen, 6,3 mg of fish flakes
1) Cerophyll™ can be obtained from Ward’s Scientific as “Cereal Grass Media - Cerophyll”. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2) Tetrafin™, Tetramin™, and Nutrafin™ are examples of fish food flakes available commercially. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO
of these products.
© ISO 2013 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 16303:2013(E)
(dry weight) is added three times per week (starting on the first day of the test) to each test chamber
on non-consecutive days (e.g. on Mondays, Wednesdays, and Fridays), until the day the test ends. Both
rations provide approximately the same overall feeding rate; however, daily feeding might be preferred
[6]
because food is then always available.
3)
6.4.2 Option 2: Yeast/Cerophyll™ /trout chow (YCT)
A second food combination based on the U.S. Environmental Protection Agency (U.S. EPA) and
[1] [2]
Environment Canada test methods is also recommended.
The formula for preparing YCT is given in Annex D. If daily feeding is chosen, an inoculum of 1,5 ml
3)
(equivalent to 2,7 mg food, dry weight) of a mixture of yeast, Cerophyll™ , and trout chow is added
daily to each test chamber on the first day of the test (i.e. the day the amphipods are placed in the test
containers), as well as once per day thereafter until the day the test ends. If the option of feeding three
times per week is chosen, an inoculum of 3,5 ml YCT (equivalent to ~ 6,3 mg food, dry weight) is added
three times per week (starting on the first day of the test) to each test chamber on non-consecutive
days (e.g. on Mondays, Wednesdays, and Fridays), until the day the test ends. Both rations provide
approximately the same overall feeding rate; however, daily feeding might be preferred because food is
then always available.
YCT can be stored frozen. Thawed aliquots of unused YCT can be stored in darkness at (4 ± 3) °C but shall
be discarded after 14 d.
6.5 Reference substance
Cadmium chloride (CdCl ), copper sulphate (CuSO ), sodium chloride (NaCl), and potassium chloride
2 4
[1] [2] [3] [10]
(KCl) are all acceptab
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 16303:2014
01-marec-2014
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHVWUXSHQRVWLVHGLPHQWDFHOLQVNLKYRGV+\DOHOOD
D]WHFD &UXVWDFHD
Water quality - Determination of toxicity of fresh water sediments using Hyalella azteca
Qualité de l'eau - Détermination de la toxicité des sédiments d'eau douce vis-à-vis de
Hyalella azteca
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 16303:2013
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 16303:2014 en,fr
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
---------------------- Page: 1 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
---------------------- Page: 2 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16303
First edition
2013-12-01
Water quality — Determination of
toxicity of fresh water sediments using
Hyalella azteca
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité des sédiments d’eau
douce vis-à-vis de Hyalella azteca
Reference number
ISO 16303:2013(E)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 3 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
ISO 16303:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
ISO 16303:2013(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test environment . 3
5.1 Facilities . 3
5.2 Lighting . 3
6 Reagents, test organisms, and materials . 3
6.1 Test organism . 3
6.2 Control sediment . 3
6.3 Overlying water . 4
6.4 Food . 5
6.5 Reference substance . 6
7 Apparatus . 6
8 Treatment and preparation of samples . 7
8.1 General . 7
8.2 Test sediment . 7
8.3 Preparation of sediment samples . 8
9 Test procedure . 8
9.1 Preparing the test containers . 8
9.2 Introducing the organisms . 9
9.3 Test conditions . 9
9.4 Renewal of overlying water.10
9.5 Test observations and measurements .10
10 Expression of results .10
10.1 Survival .10
10.2 Growth .11
10.3 Validity of the test .11
11 Analysis and interpretation of results .11
11.1 Data analysis .11
11.2 Non-contaminant factors .11
12 Reference substance .12
12.1 Water-only test .12
12.2 Whole sediment test.12
13 Test report .13
Annex A (informative) Description of Hyalella azteca.14
Annex B (informative) Culturing Hyalella azteca .18
Annex C (informative) Sources of Hyalella azteca .20
Annex D (normative) Procedure for preparing YCT .22
Annex E (informative) 42-day sediment reproduction test .23
Annex F (informative) 14-day water-only survival-and-growth test.24
Annex G (informative) Performance data .25
Bibliography .26
© ISO 2013 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 5 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
ISO 16303:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
ISO 16303:2013(E)
Introduction
Sediment in the aquatic environment serves as a reservoir for agricultural, industrial, and municipal
contaminants. Contaminated sediment adversely affects the benthic community directly and acts as
a source of contamination for the overlying water, often negatively impacting pelagic communities as
well. Sediment toxicity tests are used globally to determine and monitor the toxic effects of discrete
substances or complex mixtures that might be harmful to indigenous life in the aquatic and benthic
environments. This International Standard outlines procedures for conducting 14 d and/or 28 d tests
for sediment toxicity, using the fresh water amphipod Hyalella azteca. The biological end points for the
tests include mortality and growth.
© ISO 2013 – All rights reserved v
---------------------- Page: 7 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
---------------------- Page: 8 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16303:2013(E)
Water quality — Determination of toxicity of fresh water
sediments using Hyalella azteca
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if
any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International
Standard be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of toxicity to young Hyalella azteca
in whole sediment based on survival and growth inhibition after 14 d and/or 28 d.
The method is applicable to
a) samples of contaminated whole fresh water sediment,
b) chemical, industrial, or municipal sludge, or other solid wastes that may combine with fresh water
sediments, and
c) chemicals or preparations spiked into clean sediment.
This International Standard is applicable to the testing of sediment samples from the fresh water
environment. Hyalella azteca can be used in the testing of brackish waters up to a maximum of 15 ‰,
with careful acclimation. This International Standard is not applicable to the testing of sediment samples
from the marine and estuarine environment with a salinity of > 15 ‰.
This method is a 14 d and/or 28 d survival-and-growth test applicable to the sediment sample types
described above.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5814, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Electrochemical probe method
ISO 6059, Water quality — Determination of the sum of calcium and magnesium — EDTA titrimetric method
ISO 10523, Water quality — Determination of pH
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
artificial sediment
mixture of materials that mimic the physical components of natural sediment
Note 1 to entry: See 6.2.1.
© ISO 2013 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 9 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
ISO 16303:2013(E)
3.2
control sediment
sediment (natural or artificial) that is used to assess the performance of the test organisms and test
acceptability (i.e. clean)
Note 1 to entry: The results of control sediment testing are used for comparison to response of organisms in the
contaminated test sediment(s) and for evaluating test validity.
Note 2 to entry: Used routinely to assess the acceptability of a test (6.2).
3.3
test sediment
discrete portion of sediment (field collected or spiked) to be tested for possible effects on amphipods
due to contamination
3.4
spiked sediment
sediment to which a material has been added for testing
3.5
reference sediment
field collected near an area of concern with properties representing sediment conditions that closely
match those of the sample(s) of the test sediment except for the degree of contamination
Note 1 to entry: It is often selected from a site uninfluenced by the source(s) of contamination but within the
general vicinity of the sites where samples of test sediment are collected. Test results provide a site-specific basis
for evaluating toxicity.
3.6
intermittent renewal
tests in which test solutions or overlying water are renewed during the test, based on deterioration of
water quality
3.7
overlying water
water placed over the layer of sediment in the test container
Note 1 to entry: Also used to manipulate the sediment, if necessary (e.g. for preparing formulated sediment or
mixtures of spiked sediment).
3.8
growth
increase in dry weight of test organisms during the experiment and expressed as mean dry weight per
surviving amphipod
4 Principle
Young fresh water amphipods, Hyalella azteca, aged 2 d to 9 d and ranging in age by 1 d to 2 d, are exposed
in groups of 10 organisms to a contaminated sediment or a test-chemical spiked sediment for 14 d and/or
[1] [2] [3]
28 d. The end points for the test are percent mortality and growth inhibition assessed relative
to organisms exposed concurrently to control sediment. The test is performed in glass containers with
the ratio of sediment to water (volume:volume) being either 1:1,75 or 1:4 (e.g. 100 ml of sediment with
175 ml of overlying water or 100 ml of sediment with 400 ml of overlying water). Comparative testing
of the two recommended sediment-to-water ratios showed no significant difference in test results using
[4]
Hyalella azteca. One advantage of the 1:4 sediment-to-water ratio is greater overlying water volume
for chemical analysis. The exposure is primarily static unless renewal is triggered by deterioration of
water in the control treatment (e.g. shifting pH affecting the form of background ammonia).
2 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
ISO 16303:2013(E)
A long-term test option (i.e. 42 d) for whole sediment toxicity testing using Hyalella azteca is described
in Annex E. End points of this long-term test include survival (Days 28, 35, and 42), growth (Days 28 and
42), and reproduction (number of young per female produced from Days 28 to 42).
A water-only method using Hyalella azteca is also described in Annex F. This method is a 14-day test of
survival and growth using young amphipods exposed to samples of industrial or sewage effluents, fresh
waters (e.g. receiving water), aqueous extracts, or chemical substances which are soluble or which can
be maintained as stable suspensions or dispersions under the conditions of the test.
5 Test environment
5.1 Facilities
The test facility shall be well ventilated, isolated from physical disturbances, and free from dust
and fumes. Tests shall be carried out in a temperature-controlled room or chamber that maintains a
temperature of (23 ± 2) °C in the test containers.
5.2 Lighting
All test containers shall receive direct, overhead illumination that provides normal laboratory lighting
(i.e. 100 lx to 1 000 lx) at the air/water interface. Illumination should be uniform and shall have a
day/night cycle (photoperiod) of 16 h of daylight and 8 h of darkness.
6 Reagents, test organisms, and materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
6.1 Test organism
Hyalella azteca is an epibenthic sediment-burrowing detritivore that lives in close contact with the
surficial 1 cm or 2 cm of fresh water sediments. They reside in temperate lakes, ponds, and slow-
[1] [2] [3]
flowing streams and are widely distributed on the North and South American continents. Young
Hyalella azteca are obtained from laboratory cultures maintained under the conditions of temperature,
photoperiod, and food identical to those in the test. The species identification should be confirmed
by qualified personnel experienced in identifying fresh water amphipods using the distinguishing
[2] [5]
taxonomic features described in Annex A and in previous publications.
6.1.1 Life stage and size
Amphipods used for the test shall be between the ages of 2 d and 9 d and shall not vary in age by more
than 2 d. A method for culturing Hyalella azteca and for obtaining known-age test organisms is provided
in Annex B. If growth is expressed as mean size at the end of the test, a mean length of organisms should
be determined at test initiation.
6.1.2 Source
All amphipods used in a test shall be derived from the same population and source. Sources of animals
to be used to establish cultures include government or private laboratories which are culturing Hyalella
[1] [2] [3]
azteca for sediment toxicity tests or a reputable biological supply company. A list of possible
sources of Hyalella azteca is provided in Annex C.
6.2 Control sediment
Each sediment toxicity test shall include a control with a minimum of five replicate test containers
containing control sediment. Responses of organisms exposed to control sediment during a test provide
measurements for determining test validity (see 10.3), evidence of the health and normal behaviour of
© ISO 2013 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 11 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
ISO 16303:2013(E)
the test organisms, and a basis for interpreting data derived from the test sediments. Control sediment
is either natural sediment or artificial (i.e. formulated) sediment.
6.2.1 Natural sediment
Natural sediment taken from a fresh water or slightly brackish (< 15 ‰) collection site removed from
known sources of contaminants, and for which there is known control performance with Hyalella
azteca, can be used as the control sediment for a test or as a clean material for spiking a test chemical.
If sediment pore water has any measureable salinity, the testing laboratory shall follow a suitable
acclimation procedure to ready adult Hyalella azteca for use as brood organisms and to ensure salinity-
adapted young amphipods are used during testing.
6.2.2 Artificial sediment
The following artificial sediment can be used as a control for fresh water sediment tests or as a clean material
for spiking a test chemical. This recipe is based on the artificial sediment recommended in ISO 10872.
Mix the following components thoroughly in the given proportions.
Al O : 20 %
2 3
CaCO : 1 %
3
Dolomite (clay): 0,5 %
Fe O : 4,5 %
2 3
Silica sand (mean particle size 0,063 mm): 30 %
Silica sand (0,1 mm to 0,4 mm): 40 %
Peat (decomposed peat from a raised bog, untreated; finely ground and < 1 mm sieved): 4 %
There are a number of acceptable approaches to preparing and conditioning artificial sediment. In general,
the following attributes should be considered when selecting a formulation for a control or test sediment.
a) should support the survival, growth, or reproduction of a variety of benthic organisms;
b) should provide consistent acceptable biological end points for a variety of species;
c) should comprise standard constituents that are readily available to test laboratories;
d) should be free from concentrations of contaminants that might cause adverse effects to test organisms.
Acceptable artificial sediment options are outlined in Environment Canada guidance on this subject,
[6]
including techniques for spiking test chemicals into sediment.
6.3 Overlying water
6.3.1 Natural fresh water
Natural fresh water includes an uncontaminated supply of groundwater or surface water. If the objective
of testing is to simulate field site conditions, natural water can be diluted with a high purity distilled
or deionized water until a desired hardness is achieved. Water taken from the site where sediment is
collected can also be used. Surface water should be filtered through a fine-mesh net (e.g. 30 µm) to
remove potential predators or competitors. Dechlorinated water is not recommended as overlying
water because its quality is often quite variable and it could contain unacceptably high concentrations
of chlorine, chloramines, fluoride, copper, lead, zinc, or other contaminants.
4 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 12 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
ISO 16303:2013(E)
6.3.2 Reconstituted water
If reconstituted fresh water is used as overlying water in Hyalella azteca tests, the following artificial
[7]
medium shall be prepared in deionized water:
CaCl 110,98 mg/l
2
NaHCO 84,01 mg/l
3
MgSO 30,09 mg/l
4
KCl 3,728 mg/l
NaBr 1,029 mg/l
The mixture is aerated for 24 h before use to adjust the dissolved oxygen (DO) and to stabilize pH. The
concentrations of salts can be adjusted to be of similar composition to a receiving water of interest.
However, the Ca:Br ratio shall be kept constant because these ions are essential for Hyalella azteca and
[8] + −
must be present together. Na and HCO are the most essential ions for Hyalella azteca survival, and
3
2+ + [7] [9]
Mg and K are needed for optimal growth and reproduction. Due to lack of confirmed influence,
ranges for alkalinity and hardness have not been defined. Standard use of the above reconstituted
water recipe in culturing and as testing water has confirmed acceptable alkalinity and hardness
levels for Hyalella azteca. Conductivity, pH, hardness, DO, and alkalinity are measured in each batch of
reconstituted water. A given batch of reconstituted water shall not be used for longer than 4 weeks.
6.3.3 Dissolved oxygen
The DO content of the water overlying the sediment is ideally to be 90 % to 100 % of the air-saturation
value at test initiation and throughout the test period. This level of DO is maintained by gentle aeration
using filtered, oil-free compressed air. The rate of aeration should not suspend the sediment (e.g. 2
bubbles/s to 3 bubbles/s).
6.4 Food
There are two food options for use in the Hyalella azteca test. Both commercial fish food and an inoculum
1)
of a mixture of yeast, Cerophyll™ , and trout chow (YCT) have been proven suitable for Hyalella azteca
[1] [2] [3] [10] [11] [12]
under the defined test conditions.
There are also two options for the frequency of feeding. Test organisms are fed either once daily or three
times weekly (on non-consecutive days) throughout the test. An identical food ration is added to each
[11]
test chamber on each feeding occasion. The ration provided shall be adequate to enable acceptable
survival and growth of Hyalella azteca during the test period, but must not be excessive.
6.4.1 Option 1: Fish food
2)
Commercial fish food flakes (e.g. Tetrafin™, Tetramin™, or Nutrafin™) can be used as a food source for
test organisms during the test. Food can be ground and sieved so that flakes are uniform in size or can
be prepared as a slurry by mixing the fish flakes with clean water. Fish food flakes should be stored at
room temperature in a sealed container.
If daily feeding is chosen, 2,7 mg of fish flakes (dry weight) is added to each test container on the first day
of the test (the day the amphipods are placed in the test containers), as well as once per day thereafter
until the day the test ends. If the option of feeding three times per week is chosen, 6,3 mg of fish flakes
1) Cerophyll™ can be obtained from Ward’s Scientific as “Cereal Grass Media - Cerophyll”. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2) Tetrafin™, Tetramin™, and Nutrafin™ are examples of fish food flakes available commercially. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO
of these products.
© ISO 2013 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 13 ----------------------
SIST ISO 16303:2014
ISO 16303:2013(E)
(dry weight) is added three times per week (starting on the first day of the test) to each test chamber
on non-consecutive days (e.g. on Mondays, Wednesdays, and Fridays), until the day the test ends. Both
rations provide approximately the same overall feeding rate; however, daily feeding might be preferred
[6]
because food is then always available.
3)
6.4.2 Option 2: Yeast/Cerophyll™ /trout chow (YCT)
A second food combination based on the U.S. Environmental Protection Agency (U.S. EPA) and
[1] [2]
Environment Canada test methods is also recommended.
The formula for preparing YCT is given in Annex D. If daily feeding
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16303
Première édition
2013-12-01
Qualité de l’eau — Détermination de
la toxicité des sédiments d’eau douce
vis-à-vis de Hyalella azteca
Water quality — Determination of toxicity of fresh water sediments
using Hyalella azteca
Numéro de référence
ISO 16303:2013(F)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16303:2013(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2013
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 16303:2013(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Environnement d’essai . 3
5.1 Installation d’essai . 3
5.2 Éclairage . 3
6 Réactifs, organismes et matériaux d’essai . 3
6.1 Organisme d’essai . 3
6.2 Sédiment témoin . 4
6.3 Colonne d’eau . 5
6.4 Alimentation des organismes . 6
6.5 Substance de référence . 7
7 Matériel . 7
8 Traitement et préparation des échantillons. 8
8.1 Généralités . 8
8.2 Sédiment d’essai . 8
8.3 Préparation des échantillons de sédiments . 8
9 Mode opératoire. 9
9.1 Préparation des récipients d’essai . 9
9.2 Introduction des organismes .10
9.3 Conditions d’essai .10
9.4 Renouvellement de la colonne d’eau.11
9.5 Mesurages et observations d’essai .11
10 Expression des résultats.12
10.1 Survie .12
10.2 Croissance .12
10.3 Validité de l’essai .12
11 Analyse et interprétation des résultats .12
11.1 Analyse des données .12
11.2 Facteurs autres que les contaminants .13
12 Substance de référence .13
12.1 Essai uniquement en milieu aqueux.13
12.2 Essai sur sédiment entier .14
13 Rapport d’essai .14
Annexe A (informative) Description d’Hyalella azteca .16
Annexe B (informative) Élevage de Hyalella azteca .19
Annexe C (informative) Sources d’Hyalella azteca .21
Annexe D (normative) Préparation de l’aliment LCT .23
Annexe E (informative) Essai de reproduction dans les sédiments d’une durée de 42 jours .25
Annexe F (informative) Essai de survie et de croissance en colonne d’eau d’une durée de 14 jours .
26
Annexe G (informative) Données de performance .27
© ISO 2013 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16303:2013(F)
Bibliographie .29
iv © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 16303:2013(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/CEI, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou sur la liste ISO des déclarations de brevets reçues
(voir www.iso.org/brevets).
Les éventuelles appellations commerciales utilisées dans le présent document sont données pour
information à l’intention des utilisateurs et ne constituent pas une approbation ou une recommandation.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, aussi bien que pour des informations au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de
l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC) voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 5, Méthodes biologiques.
© ISO 2013 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 16303:2013(F)
Introduction
Dans l’environnement aquatique, le sédiment sert de réservoir pour les contaminants agricoles,
industriels et municipaux. Un sédiment contaminé affecte directement les organismes benthiques et agit
comme une source de contamination pour la colonne d’eau, impactant souvent de manière négative les
organismes pélagiques. Les essais de toxicité sur sédiments sont généralement utilisés pour déterminer
et contrôler les effets toxiques de substances distinctes ou de mélanges complexes pouvant s’avérer
nocifs pour la santé des populations indigènes dans les environnements aquatiques et benthiques. La
présente méthode décrit des modes opératoires pour réaliser des essais d’une durée de 14 jours et/ou
28 jours destinés à évaluer la toxicité des sédiments vis-à-vis de l’amphipode d’eau douce, Hyalella azteca.
Pour ces essais, les critères d’effets biologiques comprennent la mortalité et la croissance.
vi © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 16303:2013(F)
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité des
sédiments d’eau douce vis-à-vis de Hyalella azteca
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les problèmes
de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir des
pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité et de s’assurer de la conformité à la
réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément à la présente
Norme internationale soient exécutés par du personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale définit une méthode de détermination de la toxicité d’un sédiment
entier vis-à-vis de jeunes amphipodes Hyalella azteca, fondée sur la survie et l’inhibition de la croissance
après 14 jours et/ou 28 jours.
La méthode s’applique
a) aux échantillons de sédiments d’eau douce contaminés,
b) aux boues chimiques, industrielles, urbaines, ou autres déchets solides pouvant se combiner à des
sédiments d’eau douce, ou
c) à des produits chimiques ou des préparations ajouté(e)s à un sédiment propre.
La présente Norme internationale est applicable aux échantillons de sédiments d’eau douce. L’amphipode
Hyalella azteca peut être utilisé pour soumettre à essai les eaux saumâtres d’une salinité maximale de
15 ‰, avec une acclimatation adéquate. La présente Norme internationale n’est pas applicable aux essais
sur des échantillons de sédiments marins et estuariens présentant une salinité supérieure à 15 ‰.
La présente méthode consiste en un essai de survie et de croissance d’une durée de 14 jours et/ou
28 jours, applicable aux types d’échantillons de sédiments décrits ci-dessus.
2 Références normatives
Les documents suivants, en totalité ou en partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 5814, Qualité de l’eau — Dosage de l’oxygène dissous — Méthode électrochimique à la sonde
ISO 6059, Qualité de l’eau — Dosage de la somme du calcium et du magnésium — Méthode titrimétrique à l’EDTA
ISO 10523, Qualité de l’eau — Détermination du pH
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 16303:2013(F)
3.1
sédiment artificiel
mélange de matériaux simulant les composants physiques d’un sédiment naturel
Note 1 à l’article: voir (6.2.1).
3.2
sédiment témoin
sédiment (naturel ou artificiel) utilisé pour évaluer le comportement des organismes d’essai et
l’acceptabilité des essais (c’est-à-dire, sédiment propre)
Note 1 à l’article: Les résultats des essais sur le sédiment témoin sont utilisés à des fins de comparaison avec les
réponses des organismes dans le(s) sédiment(s) d’essai contaminé(s) et d’évaluation de la validité des essais.
Note 2 à l’article: Les sédiments témoins sont utilisés de façon systématique pour évaluer l’acceptabilité d’un
essai (6.2).
3.3
sédiment pour essai
quantité distincte de sédiment (prélevé sur le terrain ou dopé) devant être soumise à essai dans le but
de déterminer les effets possibles de la contamination sur les amphipodes
3.4
sédiment dopé (enrichi)
sédiment auquel un matériau a été ajouté pour les essais
3.5
sédiment de référence
sédiment prélevé sur le terrain à proximité d’une zone étudiée, choisi pour ses propriétés qui
correspondent étroitement à celles du ou des échantillons du sédiment soumis à essai, à l’exception du
degré de contamination
Note 1 à l’article: Le sédiment de référence est souvent choisi dans un endroit non influencé par la source de
contamination, mais généralement à proximité des endroits où sont prélevés les échantillons de sédiment pour
essai. Les résultats de l’essai fournissent une base site-spécifique pour l’évaluation de la toxicité.
3.6
renouvellement intermittent
essais au cours desquels les solutions d’essai ou l’eau surnageante sont renouvelées en fonction de la
dégradation de la qualité de l’eau
3.7
colonne d’eau
eau recouvrant la couche de sédiment dans le récipient d’essai
Note 1 à l’article: Également utilisée pour traiter, au besoin, le sédiment (par exemple, pour préparer un sédiment
formulé ou des mélanges de sédiment dopé).
3.8
croissance
augmentation du poids sec des organismes d’essai au cours de l’expérience, exprimée en poids sec moyen
par amphipode survivant
4 Principe
Des jeunes amphipodes d’eau douce, Hyalella azteca, âgés de 2 jours à 9 jours, classés par tranche d’âge
(1 jour à 2 jours), sont exposés par groupes de 10 organismes à un sédiment contaminé ou à un sédiment
[1] [2] [3]
dopé par une substance chimique d’essai pendant 14 jours et/ou 28 jours. , , Les critères d’effets de
l’essai sont le taux de mortalité et l’inhibition de la croissance, évalués par rapport à ceux des organismes
exposés en parallèle à un sédiment témoin. L’essai est réalisé dans des récipients en verre, avec un
rapport sédiment/eau (volume à volume) de 1:1,75 ou de 1:4 (par exemple, 100 ml de sédiment avec
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 16303:2013(F)
175 ml d’eau surnageante ou 100 ml de sédiment avec 400 ml d’eau surnageante). Des essais comparatifs
intégrant les deux ratios sédiment/eau recommandés n’ont montré aucune différence notable entre les
[4]
résultats d’essai sur H. azteca. Toutefois, le rapport sédiment/eau de 1:4 permet de disposer d’un plus
grand volume d’eau surnageante pour l’analyse chimique. L’exposition est essentiellement statique,
sauf si le témoin (par exemple variation du pH affectant la forme de l’ammoniaque résiduel) révèle une
dégradation de la qualité de l’eau qui nécessite le renouvellement de cette dernière.
Une option long terme (c’est-à-dire 42 jours) pour cet essai de toxicité vis-à-vis de Hyalella azteca est
décrite dans l’Annexe E. Les critères d’effets de cet essai à long terme comprennent la survie (jours 28,
35 et 42), la croissance (jours 28 et 42), et la reproduction (nombre de jeunes par femelle produits entre
le jour 28 et le jour 42).
L’Annexe F décrit également une méthode d’essai, utilisant Hyalella azteca, uniquement en milieu aqueux.
Cette méthode correspond à un essai d’une durée de 14 jours portant sur la survie et la croissance de jeunes
amphipodes exposés à des échantillons d’effluents industriels, d’effluents de stations d’épuration, d’eaux
douces (par exemple eau réceptrice), d’extraits aqueux ou de substances chimiques solubles ou pouvant
être maintenues sous forme de suspensions ou de dispersions stables dans les conditions de l’essai.
5 Environnement d’essai
5.1 Installation d’essai
L’installation d’essai doit être bien ventilée, protégée contre les perturbations physiques et être exempte
de poussière et de fumées. Les essais doivent être réalisés dans un local ou une enceinte thermostatée
qui maintient une température de (23 ± 2) °C dans les récipients d’essai.
5.2 Éclairage
Tous les récipients d’essai doivent recevoir un éclairage par le dessus correspondant à un éclairage normal
de laboratoire (c’est-à-dire de 100 lx à 1 000 lx) au niveau de l’interface air/eau. Il convient que l’éclairage
soit uniforme et qu’il assure un cycle jour/nuit (photopériode) de 16 h d’éclairement et de 8 h d’obscurité.
6 Réactifs, organismes et matériaux d’essai
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
6.1 Organisme d’essai
Hyalella azteca est un organisme épibenthique détritivore et fouisseur qui vit en contact étroit avec la
surface (1 ou 2 premiers centimètres) des sédiments d’eau douce. Il est largement présent en Amérique
[1] [2] [3]
du Nord et du Sud: dans les lacs, les étangs et les cours d’eau à faible courant en région tempérée. , ,
Les jeunes Hyalella azteca proviennent d’élevages de laboratoire maintenus dans des conditions de
température, de photopériode et d’alimentation identiques à celles de l’essai. Il convient que l’identification
de l’espèce soit confirmée par un personnel qualifié expérimenté dans l’identification des amphipodes
d’eau douce à partir des caractéristiques taxonomiques distinctives décrites dans l’Annexe A et dans des
[2] [5]
publications antérieures. ,
6.1.1 Stade de développement et taille
Les amphipodes utilisés pour l’essai doivent être âgés de 2 jours à 9 jours et leur âge ne doit pas varier
de plus de 2 jours. L’Annexe B décrit une méthode d’élevage de l’amphipode Hyalella azteca et d’obtention
d’organismes d’essai d’âge connu. Si la croissance est exprimée en taille moyenne à la fin de l’essai, il
convient qu’une longueur moyenne des organismes soit déterminée au lancement de l’essai.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 16303:2013(F)
6.1.2 Source
Tous les amphipodes utilisés lors d’un essai doivent provenir de la même population et de la même
source. Les sources d’organismes à utiliser pour constituer des élevages comprennent des laboratoires
publics ou privés qui élèvent Hyalella azteca pour les essais de toxicité sur sédiments, ou un fournisseur
[1] [2] [3]
de réactifs biologiques reconnu. , , L’Annexe C fournit une liste de sources possibles de H. azteca.
6.2 Sédiment témoin
Chaque essai de toxicité sur sédiment doit inclure un témoin comportant un nombre minimal de cinq
récipients d’essai contenant le sédiment témoin. Les réponses des organismes exposés au sédiment
témoin fournissent des mesures permettant de déterminer la validité de l’essai (voir 10.3), des
indications relatives à l’état de santé et au comportement normal des organismes d’essai, ainsi qu’une
base pour l’interprétation des données obtenues sur les sédiments soumis à essai. Le sédiment témoin
est un sédiment naturel ou un sédiment artificiel (c’est-à-dire formulé).
6.2.1 Sédiment naturel
Un sédiment naturel, prélevé sur un site de collecte d’eau douce ou légèrement saumâtre (<15 ‰),
exempt de sources connues de contaminants et pour lequel le comportement des témoins pour H. azteca
est connu, peut être utilisé comme sédiment témoin pour un essai, ou comme matériau « propre » pour
être dopé avec une substance chimique soumise à essai. Si l’eau des pores du sédiment présente une
salinité significative, le laboratoire d’essai doit suivre une procédure d’acclimatation adaptée pour
obtenir des Hyalella adultes pouvant être utilisés comme reproducteurs et ainsi s’assurer que des jeunes
amphipodes, adaptés à la salinité, seront utilisés durant l’essai.
6.2.2 Sédiment artificiel
Le sédiment artificiel suivant peut être utilisé comme un sédiment témoin pour les essais sur sédiments
d’eau douce, ou comme un matériau «propre» pour le doper avec une substance chimique soumise à
essai. Cette préparation est fondée sur le sédiment artificiel recommandé dans l’ISO 10872.
Mélanger soigneusement les composants suivants selon les proportions indiquées:
Al O : 20 %
2 3
CaCO : 1 %
3
Dolomite (Argile): 0,5 %
Fe O : 4,5 %
2 3
Sable siliceux (granulométrie moyenne: 0,063 mm): 30 %
Sable siliceux (0,1 mm à 0,4 mm): 40 %
Tourbe (issue de tourbières hautes, décomposée, non traitée; finement broyée et passée 4 %
au tamis <1 mm):
Il existe plusieurs méthodes acceptables de préparation et de conditionnement du sédiment artificiel. En
règle générale, il convient de prendre en compte les paramètres suivants lors du choix d’une formulation
pour un sédiment témoin ou un sédiment d’essai.
a) assurer la survie, la croissance ou la reproduction d’une grande variété d’organismes benthiques;
b) fournir des résultats biologiques cohérents et acceptables pour une grande variété d’espèces;
c) être composé de constituants standards, facilement disponibles pour les laboratoires d’essai;
4 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 16303:2013(F)
d) être exempts de concentrations en contaminants susceptibles d’avoir des effets néfastes sur les
organismes d’essai.
Des options de sédiments artificiels acceptables sont décrites dans le guide d’Environnement Canada
sur le sujet, comprenant également les techniques pour ajouter des substances chimiques d’essai dans
[6]
un sédiment.
6.3 Colonne d’eau
6.3.1 Eau douce naturelle
Une eau douce naturelle comprend une alimentation non contaminée d’eau souterraine ou une eau de
surface. Si les essais ont pour objectif de simuler les conditions du terrain, l’eau naturelle peut être diluée
avec de l’eau distillée ou déionisée ultrapure jusqu’à obtention de la dureté requise. Il est également
possible d’utiliser de l’eau provenant du site où le sédiment a été recueilli. Il convient de filtrer l’eau
de surface à travers un tamis à maille fine (par exemple 30 µm) pour éliminer des prédateurs ou des
« compétiteurs » potentiels. L’utilisation d’eau déchlorée comme eau destinée à recouvrir le sédiment
n’est pas recommandée car cette eau déchlorée est souvent de qualité très variable et elle peut contenir
des concentrations excessivement élevées en chlore, chloramines, fluorure, cuivre, plomb, zinc ou autres
contaminants.
6.3.2 Eau reconstituée
Si de l’eau douce reconstituée est utilisée pour la colonne d’eau lors des essais sur Hyalella azteca, le
[7]
milieu artificiel suivant doit être préparé dans de l’eau déionisée:
CaCl 110,98 mg/l
2
NaHCO 84,01 mg/l
3
MgSO 30,09 mg/l
4
KCl 3,728 mg/l
NaBr 1,029 mg/l
Avant utilisation, le mélange est aéré pendant 24 h pour ajuster l’oxygène dissous (OD) et stabiliser le
pH. Les concentrations en sels peuvent être ajustées afin d’obtenir une composition similaire à celle
d’une eau réceptrice étudiée. Toutefois le rapport Ca:Br doit être maintenu constant car ces ions sont
[8] + −
indispensables pour H. azteca et doivent être présents simultanément . Na et HCO sont les ions les
3
2+ +
plus importants pour la survie de H. azteca, tandis que les ions Mg et K sont nécessaires pour une
[7][9]
croissance et une reproduction optimales . En raison de leur influence non confirmée, les plages
de valeurs de l’alcalinité et de la dureté n’ont pas été définies. L’utilisation standard de la préparation
d’eau reconstituée mentionnée ci-dessus pour l’élevage des organismes et pour les essais a confirmé
des niveaux acceptables d’alcalinité et de dureté pour Hyalella Azteca. La conductivité, le pH, la dureté,
l’oxygène dissous et l’alcalinité sont mesurés dans chaque lot d’eau reconstituée. Aucun lot d’eau
reconstituée donné ne doit être utilisé pendant plus de 4 semaines.
6.3.3 Oxygène dissous
La teneur en oxygène dissous de l’eau recouvrant le sédiment doit être idéalement comprise entre 90 %
et 100 % de la valeur de saturation de l’air au début de l’essai, et pendant toute la durée de l’essai. Cette
teneur en oxygène dissous est maintenue par une aération modérée à l’aide d’air comprimé filtré et
exempt d’huile. Il convient que le débit d’aération ne provoque pas de mise en suspension du sédiment
(par exemple 2 à 3 bulles/s).
© ISO 2013 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 16303:2013(F)
6.4 Alimentation des organismes
Il existe deux options pour l’apport de nourriture lors de l’essai sur Hyalella. Un aliment pour poissons
1)
du commerce et un mélange de levure, de Cerophyll™ et de granulés pour truites (LCT) se sont avérés
[1] [2] [3] [10] [11] [12]
être adéquats pour Hyalella azteca dans les conditions d’essai définies , , , , , .
Il existe également deux options pour la fréquence d’apport de nourriture. Les organismes d’essai sont
alimentés soit une fois par jour, soit trois fois par semaine (jours non consécutifs) pendant toute la durée
de l’essai. Une ration alimentaire identique est ajoutée à chaque récipient d’essai lors de chaque apport
[11]
de nourriture . La ration fournie doit être adéquate pour permettre une survie et une croissance
acceptables de H. azteca pendant la période d’essai, mais elle ne doit en aucu
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.