SIST ISO 23893-3:2013
Water quality - Biochemical and physiological measurements on fish - Part 3: Determination of vitellogenin
Water quality - Biochemical and physiological measurements on fish - Part 3: Determination of vitellogenin
ISO 23893-3:2013 specifies a method for measuring vitellogenin (Vtg) concentrations in a fish plasma sample employing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method.
It applies to fish that are sampled in the environment (fresh, estuarine or salt water) and to fish exposed to substances or effluents in a laboratory. The method is quantitative when using Vtg antibodies and a Vtg standard well characterized with the species of choice.
Qualité de l'eau - Mesurages biochimiques et physiologiques sur poisson - Partie 3: Dosage de la vitellogénine
L'ISO 23893-3:2013 spécifie une méthode permettant de mesurer les concentrations de vitellogénine (Vtg) dans un échantillon de plasma de poisson en employant une technique ELISA (enzyme‑linked immunosorbent assay).
Elle s'applique à des poissons prélevés dans l'environnement (eau douce, eau d'estuaire ou eau salée) et à des poissons exposés à des substances ou des effluents en laboratoire. La méthode est quantitative lorsqu'elle utilise des anticorps anti-Vtg et un étalon de Vtg bien caractérisé avec l'espèce considérée.
Kakovost vode - Biokemijske in fiziološke meritve v ribah - 3. del: Določevanje vitelogenina
Ta del standarda ISO 23893 določa metodo za merjenje koncentracij vitelogenina (Vtg) v plazemskem vzorcu rib z uporabo encimskoimunske metode (ELISA). Uporablja se za ribe, ki se vzorčijo v okolju (sladka, rečna ali slana voda), in za ribe, ki so v laboratoriju izpostavljene snovem ali iztokom. Ta metoda je kvantitativna, če se uporabljajo protitelesa Vtg in standard Vtg, ki je pri izbranih vrstah zadostno opisan.
General Information
Standards Content (Sample)
SLOVENSKI STANDARD
01-december-2013
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YLWHORJHQLQD
Water quality - Biochemical and physiological measurements on fish - Part 3:
Determination of vitellogenin
Qualité de l'eau - Mesurages biochimiques et physiologiques sur poisson - Partie 3:
Dosage de la vitellogénine
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 23893-3:2013
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23893-3
First edition
2013-04-01
Water quality — Biochemical and
physiological measurements on fish —
Part 3:
Determination of vitellogenin
Qualité de l’eau — Mesurages biochimiques et physiologiques sur
poisson —
Partie 3: Dosage de la vitellogénine
Reference number
©
ISO 2013
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Minimum performance criteria . 2
6 Test environment . 2
7 Reagents . 3
8 Apparatus . 3
9 Sampling procedure . 4
9.1 Sampling of fish . 4
9.2 Sampling of blood plasma . 4
9.3 Storage of blood plasma samples . 5
10 Analytical procedure . 5
10.1 Preparation of the samples . 5
10.2 Determination of vitellogenin . 5
11 Test report .10
Annex A (informative) Examples of results: Fathead minnow sandwich ELISA .12
Bibliography .19
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 23893-3 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
ISO 23893 consists of the following parts, under the general title Water quality — Biochemical and
physiological measurements on fish:
— Part 1: Sampling of fish, handling and preservation of samples
— Part 2: Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) [Technical Specification]
— Part 3: Determination of vitellogenin
iv © ISO 2013 – All rights reserved
Introduction
Vitellogenin (Vtg) is a large phospholipoglycoprotein produced as the yolk protein precursor in the
liver of oviparous vertebrates, such as fish. Vtg is secreted from hepatocytes through the secretory
pathway, enters the circulation and is taken up by the growing oocyte. Plasma Vtg concentrations are
normally an indication of the maturational status of the female fish, for reviews see References [2]
[18]. More than a decade ago, several studies demonstrated that male fish caught in rivers and streams
had high concentrations of plasma Vtg (e.g. References [14][23]), caused by chemicals acting like
oestrogens present in the environment. Since then, numerous studies have shown the fish Vtg to be a
highly responsive biomarker for oestrogenic compounds in both in vitro hepatocyte cell cultures, in vivo
aquaria studies, and field studies, for reviews see References [1][2][10][13][16][20][26]. Hence, Vtg in
fish has become an accepted biomarker of xenooestrogenic and antioestrogenic exposure of chemicals,
effluents, and discharges, and has been proposed in chemical testing, as well as environmental
monitoring programmes, e.g. Reference [13].
However, recent genetic and immunological analyses have demonstrated a general multiplicity of Vtg
forms in fish, References [9][10]. The concentrations of circulating Vtg proteins (or Vtg gene transcripts)
during oogenesis and their degree of induction by oestrogens appear to vary among species and among
different types of Vtg within a species. The kinetics of induction of distinct types of Vtg by oestrogens
in fish appears to depend on environmental factors (e.g. water temperature and photoperiod), life
history stage, sex, and the concentration and type of oestrogenic compound. Based on these findings, it
is important that the Vtg targets in a bioassay for oestrogens in a specific species be demonstrated to
be an oestrogen-responsive form, and that the assay be validated with the species in question before
embarking on a monitoring programme, Reference [10].
The scientific literature contains a multitude of publications on procedures for determining Vtg in fish
samples, using immunoassays. Whereas radioimmunoassays (RIA) were a predominant method in the
1980s and early 1990s, e.g. References [4][29], enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) are the
dominating principle today. Both the sandwich and competitive ELISA principles provide sensitive
results without the use of radioactive isotopes, and have been successfully applied to determine Vtg
levels in several fish species, e.g. References [3][6][8][12][15][17][19][21][22][24][25][27][28][31][32].
This part of ISO 23893 presents a generalized protocol for both the sandwich and competitive ELISA for
use in quantification of Vtg in fish blood plasma samples. The application of standardized methods is
strongly advised within monitoring programmes.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 23893-3:2013(E)
Water quality — Biochemical and physiological
measurements on fish —
Part 3:
Determination of vitellogenin
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This part of ISO 23893 specifies a method for measuring vitellogenin (Vtg) concentrations in a fish
plasma sample employing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method.
It applies to fish that are sampled in the environment (fresh, estuarine or salt water) and to fish exposed
to substances or effluents in a laboratory. The method is quantitative when using Vtg antibodies and a
Vtg standard well characterized with the species of choice.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 23893-1, Water quality — Biochemical and physiological measurements on fish — Part 1: Sampling of
fish, handling and preservation of samples
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
limit of detection
LOD
lowest content that can be measured with reasonable statistical certainty
EXAMPLE The LOD is often expressed as the reagent blank value plus three times its standard deviation.
Note 1 to entry: The method LOD is determined by taking the sample dilution factor into the calculation.
3.2
limit of quantification
LOQ
content equal to or greater than the lowest concentration point in the calibration curve
EXAMPLE The LOQ is often expressed as the reagent blank value plus 10 times its standard deviation
(Reference [11]).
Note 1 to entry: LOQ is also determined by taking the sample dilution factor into the calculation.
3.3
matrix blank
representative sample that does not contain detectable levels of analyte
Note 1 to entry: For the purposes of this part of ISO 23893, the analyte is vitellogenin.
3.4
selectivity
ability to measure accurately the analyte in the presence of components that can be expected to be
present in the matrix
Note 1 to entry: For the purposes of this part of ISO 23893, the analyte is vitellogenin and the matrix is plasma.
Note 2 to entry: Selectivity is demonstrated by using “matrix blanks”.
4 Principle
Samples of fish blood plasma are collected essentially as specified in ISO 23893-1; however, with addition
of a protease inhibitor (see 7.13 and 9.2). Vitellogenin is determined in the sample by an antibody-based
immunoassay, using either of two established variants.
In the first, so-called sandwich ELISA, the blood plasma sample is allowed to react with a capture
antibody specific for Vtg (from the same or a closely related species), in a microtitre plate well coated
with the antibody. An enzyme-labelled detecting Vtg antibody is then used to produce an antibody
“sandwich” that can be detected based on a chromogenic substrate for the enzyme label (e.g. horseradish
peroxidase). A secondary enzyme-label
...
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STANDARD 23893-3
First edition
2013-04-01
Water quality — Biochemical and
physiological measurements on fish —
Part 3:
Determination of vitellogenin
Qualité de l’eau — Mesurages biochimiques et physiologiques sur
poisson —
Partie 3: Dosage de la vitellogénine
Reference number
©
ISO 2013
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
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Fax + 41 22 749 09 47
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Minimum performance criteria . 2
6 Test environment . 2
7 Reagents . 3
8 Apparatus . 3
9 Sampling procedure . 4
9.1 Sampling of fish . 4
9.2 Sampling of blood plasma . 4
9.3 Storage of blood plasma samples . 5
10 Analytical procedure . 5
10.1 Preparation of the samples . 5
10.2 Determination of vitellogenin . 5
11 Test report .10
Annex A (informative) Examples of results: Fathead minnow sandwich ELISA .12
Bibliography .19
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 23893-3 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
ISO 23893 consists of the following parts, under the general title Water quality — Biochemical and
physiological measurements on fish:
— Part 1: Sampling of fish, handling and preservation of samples
— Part 2: Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) [Technical Specification]
— Part 3: Determination of vitellogenin
iv © ISO 2013 – All rights reserved
Introduction
Vitellogenin (Vtg) is a large phospholipoglycoprotein produced as the yolk protein precursor in the
liver of oviparous vertebrates, such as fish. Vtg is secreted from hepatocytes through the secretory
pathway, enters the circulation and is taken up by the growing oocyte. Plasma Vtg concentrations are
normally an indication of the maturational status of the female fish, for reviews see References [2]
[18]. More than a decade ago, several studies demonstrated that male fish caught in rivers and streams
had high concentrations of plasma Vtg (e.g. References [14][23]), caused by chemicals acting like
oestrogens present in the environment. Since then, numerous studies have shown the fish Vtg to be a
highly responsive biomarker for oestrogenic compounds in both in vitro hepatocyte cell cultures, in vivo
aquaria studies, and field studies, for reviews see References [1][2][10][13][16][20][26]. Hence, Vtg in
fish has become an accepted biomarker of xenooestrogenic and antioestrogenic exposure of chemicals,
effluents, and discharges, and has been proposed in chemical testing, as well as environmental
monitoring programmes, e.g. Reference [13].
However, recent genetic and immunological analyses have demonstrated a general multiplicity of Vtg
forms in fish, References [9][10]. The concentrations of circulating Vtg proteins (or Vtg gene transcripts)
during oogenesis and their degree of induction by oestrogens appear to vary among species and among
different types of Vtg within a species. The kinetics of induction of distinct types of Vtg by oestrogens
in fish appears to depend on environmental factors (e.g. water temperature and photoperiod), life
history stage, sex, and the concentration and type of oestrogenic compound. Based on these findings, it
is important that the Vtg targets in a bioassay for oestrogens in a specific species be demonstrated to
be an oestrogen-responsive form, and that the assay be validated with the species in question before
embarking on a monitoring programme, Reference [10].
The scientific literature contains a multitude of publications on procedures for determining Vtg in fish
samples, using immunoassays. Whereas radioimmunoassays (RIA) were a predominant method in the
1980s and early 1990s, e.g. References [4][29], enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) are the
dominating principle today. Both the sandwich and competitive ELISA principles provide sensitive
results without the use of radioactive isotopes, and have been successfully applied to determine Vtg
levels in several fish species, e.g. References [3][6][8][12][15][17][19][21][22][24][25][27][28][31][32].
This part of ISO 23893 presents a generalized protocol for both the sandwich and competitive ELISA for
use in quantification of Vtg in fish blood plasma samples. The application of standardized methods is
strongly advised within monitoring programmes.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 23893-3:2013(E)
Water quality — Biochemical and physiological
measurements on fish —
Part 3:
Determination of vitellogenin
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This part of ISO 23893 specifies a method for measuring vitellogenin (Vtg) concentrations in a fish
plasma sample employing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method.
It applies to fish that are sampled in the environment (fresh, estuarine or salt water) and to fish exposed
to substances or effluents in a laboratory. The method is quantitative when using Vtg antibodies and a
Vtg standard well characterized with the species of choice.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 23893-1, Water quality — Biochemical and physiological measurements on fish — Part 1: Sampling of
fish, handling and preservation of samples
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
limit of detection
LOD
lowest content that can be measured with reasonable statistical certainty
EXAMPLE The LOD is often expressed as the reagent blank value plus three times its standard deviation.
Note 1 to entry: The method LOD is determined by taking the sample dilution factor into the calculation.
3.2
limit of quantification
LOQ
content equal to or greater than the lowest concentration point in the calibration curve
EXAMPLE The LOQ is often expressed as the reagent blank value plus 10 times its standard deviation
(Reference [11]).
Note 1 to entry: LOQ is also determined by taking the sample dilution factor into the calculation.
3.3
matrix blank
representative sample that does not contain detectable levels of analyte
Note 1 to entry: For the purposes of this part of ISO 23893, the analyte is vitellogenin.
3.4
selectivity
ability to measure accurately the analyte in the presence of components that can be expected to be
present in the matrix
Note 1 to entry: For the purposes of this part of ISO 23893, the analyte is vitellogenin and the matrix is plasma.
Note 2 to entry: Selectivity is demonstrated by using “matrix blanks”.
4 Principle
Samples of fish blood plasma are collected essentially as specified in ISO 23893-1; however, with addition
of a protease inhibitor (see 7.13 and 9.2). Vitellogenin is determined in the sample by an antibody-based
immunoassay, using either of two established variants.
In the first, so-called sandwich ELISA, the blood plasma sample is allowed to react with a capture
antibody specific for Vtg (from the same or a closely related species), in a microtitre plate well coated
with the antibody. An enzyme-labelled detecting Vtg antibody is then used to produce an antibody
“sandwich” that can be detected based on a chromogenic substrate for the enzyme label (e.g. horseradish
peroxidase). A secondary enzyme-labelled antibody can also be used to develop the assay, if the detecting
antibody is unlabelled. A standard series based on a purified reference material (Vtg protein from the
same or closely related species) is used to develop a quantitative relationship between sample signal
and standard amount.
The second variant is the competitive ELISA technique, where sample Vtg competes with purified Vtg
coated to the microtitre plate walls for binding to a (labelled or unlabelled) Vtg antibody in solution.
Development of assay signal follows the same principle as in the sandwich variant, although the standard
series produces an inverse relationship with signal intensity.
Only Vtg antibodies or assays that have been demonstrated to perform according to specified
performance criteria with the fish species studied should be used in this protocol.
5 Minimum performance criteria
The criteria listed below should be regarded as the minimal acceptable performance as defined from a user
standpoint on the purpose of performing Vtg analysis. Specifi
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 23893-3
Première édition
2013-04-01
Qualité de l’eau — Mesurages
biochimiques et physiologiques sur
poisson —
Partie 3:
Dosage de la vitellogénine
Water quality — Biochemical and physiological measurements on fish —
Part 3: Determination of vitellogenin
Numéro de référence
©
ISO 2013
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
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Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
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Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Critères minimaux de performance . 2
6 Environnement d’essai . 3
7 Réactifs . 3
8 Appareillage . 4
9 Mode opératoire d’échantillonnage . 4
9.1 Échantillonnage des poissons . 4
9.2 Échantillonnage du plasma sanguin . 5
9.3 Conservation des échantillons de plasma sanguin . 5
10 Mode opératoire d’analyse . 5
10.1 Préparation des échantillons . 5
10.2 Dosage de la vitellogénine . 5
11 Rapport d’essai .11
Annexe A (informative) Exemples de résultats: technique ELISA en sandwich sur vairon
à tête-de-boule .13
Bibliographie .20
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 23893-3 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
L’ISO 23893 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l’eau — Mesurages
biochimiques et physiologiques sur poisson:
— Partie 1: Échantillonnage des poissons, manipulation et conservation des échantillons
— Partie 2: Dosage de l’éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD) [Spécification technique]
— Partie 3: Dosage de la vitellogénine
iv © ISO 2013 – Tous droits réservés
Introduction
La vitellogénine (Vtg) est une phospho-lipo-glyco-protéine de grande taille produite en tant que
précurseur des protéines du jaune d’œuf dans le foie des vertébrés ovipares, tels que les poissons. La
Vtg est sécrétée par les hépatocytes par la voie sécrétoire, pénètre dans la circulation sanguine d’où
elle est captée par l’ovocyte en croissance. Les concentrations de Vtg plasmatique sont normalement
une indication de l’état de maturité des poissons femelles; se reporter aux Références [2] [18]. Il y a plus
de dix ans, plusieurs études ont démontré que les poissons mâles péchés dans les rivières et les cours
d’eau présentaient des concentrations élevées de Vtg plasmatique (voir par exemple les Références [14]
[23]), provoquées par des produits chimiques présents dans l’environnement, agissant comme des
œstrogènes. Depuis, de nombreuses études ont montré que la Vtg chez le poisson était un biomarqueur
extrêmement sensible pour les composés œstrogéniques aussi bien dans des cultures d’hépatocytes in
vitro que dans des études in vivo en aquarium et des études sur le terrain; se reporter aux Références [1]
[2] [10] [13] [16] [20] [26]. Par conséquent, la Vtg chez le poisson est devenue un biomarqueur accepté
de l’exposition aux xéno-œstrogènes et anti-œstrogènes des produits chimiques, des effluents et des
rejets, et a été proposée dans les essais des produits chimiques et les programmes de surveillance de
l’environnement; voir par exemple la Référence [13].
Toutefois, de récentes analyses génétiques et immunologiques ont démontré une multiplicité générale
des formes de Vtg chez le poisson, Références [9] [10]. Les concentrations circulantes de protéines Vtg
(ou des produits de transcription du gène Vtg) pendant l’ovogénèse et leur degré d’induction par les
œstrogènes semblent varier entre les espèces et entre les différents types de Vtg au sein d’une espèce.
La cinétique d’induction des différents types de Vtg par les œstrogènes chez le poisson semble dépendre
de facteurs environnementaux (par exemple la température de l’eau et la photopériode), de l’étape du
cycle biologique, du sexe et de la concentration et du type de composé œstrogénique. Sur la base de ces
découvertes, il est important de démontrer que les Vtg cibles utilisées dans une analyse biologique des
œstrogènes dans une espèce spécifique sont une forme sensible aux œstrogènes et que l’analyse est
validée avec les espèces considérées avant de lancer un programme de surveillance (Référence [10]).
La littérature scientifique contient une multitude de publications sur les procédures permettant de
doser la Vtg dans des échantillons de poisson, à l’aide de dosages immunologiques. Alors que les dosages
radio-immunologiques (RIA) constituaient la méthode prédominante dans les années 1980 et au début des
années 1990 (voir par exemple les Références [4] [29]), les tests ELISA (enzyme-linked immunosorbent
assays) sont aujourd’hui majoritaires. Les techniques ELISA en sandwich et par compétition fournissent
toutes les deux des résultats sensibles sans utiliser d’isotopes radioactifs et ont été appliquées avec
succès à la détermination des concentrations de Vtg chez plusieurs espèces de poisson, par exemple voir
Références [3] [6] [8] [12] [15] [17] [19] [21] [22] [24] [25] [27] [28] [31] [32].
La présente partie de l’ISO 23893 présente un protocole général pour les deux techniques ELISA, en
sandwich et par compétition, en vue de leur utilisation pour quantifier la Vtg dans des échantillons de
plasma sanguin de poisson. L’application de méthodes normalisées est fortement recommandée dans les
programmes de surveillance.
NORME INTERNATIONALE ISO 23893-3:2013(F)
Qualité de l’eau — Mesurages biochimiques et
physiologiques sur poisson —
Partie 3:
Dosage de la vitellogénine
AVERTISSEMENT — Il convient que les utilisateurs du présent document soient familiers des
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour objectif de traiter tous les
éventuels problèmes de sécurité associés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur du présent
document d’établir des pratiques appropriées en matière de sécurité et d’hygiène et de s’assurer
de leur conformité à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent
document soient effectués par un personnel ayant une qualification adéquate.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 23893 spécifie une méthode permettant de mesurer les concentrations
de vitellogénine (Vtg) dans un échantillon de plasma de poisson en employant une technique ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay).
Elle s’applique à des poissons prélevés dans l’environnement (eau douce, eau d’estuaire ou eau salée) et
à des poissons exposés à des substances ou des effluents en laboratoire. La méthode est quantitative
lorsqu’elle utilise des anticorps anti-Vtg et un étalon de Vtg bien caractérisé avec l’espèce considérée.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 23893-1, Qualité de l’eau — Mesurages biochimiques et physiologiques sur poisson — Partie 1:
Échantillonnage des poissons, manipulation et conservation des échantillons
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
limite de détection
LD
plus faible teneur pouvant être mesurée avec une certitude statistique raisonnable
EXEMPLE La LD est souvent exprimée comme la valeur du blanc réactif plus trois fois l’écart-type du
blanc de réactifs.
Note 1 à l’article: La LD est également déterminée en tenant compte du facteur de dilution de l’échantillon dans le calcul.
3.2
limite de quantification
LQ
teneur supérieure ou égale au point de plus faible concentration de la courbe d’étalonnage
EXEMPLE La LQ est souvent exprimée comme le blanc réactif plus dix fois l’écart-type du blanc de réactifs
(Référence [11]).
Note 1 à l’article: La LQ est également déterminée en tenant compte du facteur de dilution de l’échantillon dans le calcul.
3.3
blanc de matrice
échantillon représentatif ne contenant pas de niveaux détectables d’analyte
Note 1 à l’article: Pour les besoins de la présente partie de l’ISO 23893, l’analyte est la vitellogénine.
3.4
sélectivité
aptitude à mesurer avec exactitude l’analyte en présence de composants pouvant être attendus dans la
matrice
Note 1 à l’article: Pour les besoins de la présente partie de l’ISO 23893, l’analyte est la vitellogénine et la matrice
est le plasma.
Note 2 à l’article: La sélectivité est démontrée en utilisant des «blancs matrice».
4 Principe
Des échantillons de plasma sanguin de poisson sont prélevés essentiellement comme spécifié dans
l’ISO 23893-1, mais en ajoutant toutefois un inhibiteur de protéase (voir 7.13 et 9.2). La vitellogénine est dosée
par une technique immunologique fondée sur les anticorps, en utilisant l’une des deux variantes ét
...
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