SIST ISO 23893-3:2013
Water quality - Biochemical and physiological measurements on fish - Part 3: Determination of vitellogenin
Water quality - Biochemical and physiological measurements on fish - Part 3: Determination of vitellogenin
This part of ISO 23893 specifies a method for measuring vitellogenin (Vtg) concentrations in a fish plasma sample employing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. It applies to fish that are sampled in the environment (fresh, estuarine or salt water) and to fish exposed to substances or effluents in a laboratory. The method is quantitative when using Vtg antibodies and a Vtg standard well characterized with the species of choice.
Qualité de l'eau - Mesurages biochimiques et physiologiques sur poisson - Partie 3: Dosage de la vitellogénine
L'ISO 23893-3:2013 sp�cifie une m�thode permettant de mesurer les concentrations de vitellog�nine (Vtg) dans un �chantillon de plasma de poisson en employant une technique ELISA (enzyme‑linked immunosorbent assay).
Elle s'applique � des poissons pr�lev�s dans l'environnement (eau douce, eau d'estuaire ou eau sal�e) et � des poissons expos�s � des substances ou des effluents en laboratoire. La m�thode est quantitative lorsqu'elle utilise des anticorps anti-Vtg et un �talon de Vtg bien caract�ris� avec l'esp�ce consid�r�e.
Kakovost vode - Biokemijske in fiziološke meritve v ribah - 3. del: Določevanje vitelogenina
Ta del standarda ISO 23893 določa metodo za merjenje koncentracij vitelogenina (Vtg) v plazemskem vzorcu rib z uporabo encimskoimunske metode (ELISA). Uporablja se za ribe, ki se vzorčijo v okolju (sladka, rečna ali slana voda), in za ribe, ki so v laboratoriju izpostavljene snovem ali iztokom. Ta metoda je kvantitativna, če se uporabljajo protitelesa Vtg in standard Vtg, ki je pri izbranih vrstah zadostno opisan.
General Information
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23893-3
First edition
2013-04-01
Water quality — Biochemical and
physiological measurements on fish —
Part 3:
Determination of vitellogenin
Qualité de l’eau — Mesurages biochimiques et physiologiques sur
poisson —
Partie 3: Dosage de la vitellogénine
Reference number
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ISO 2013
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Published in Switzerland
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ISO 23893-3:2013(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Minimum performance criteria . 2
6 Test environment . 2
7 Reagents . 3
8 Apparatus . 3
9 Sampling procedure . 4
9.1 Sampling of fish . 4
9.2 Sampling of blood plasma . 4
9.3 Storage of blood plasma samples . 5
10 Analytical procedure . 5
10.1 Preparation of the samples . 5
10.2 Determination of vitellogenin . 5
11 Test report .10
Annex A (informative) Examples of results: Fathead minnow sandwich ELISA .12
Bibliography .19
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ISO 23893-3:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 23893-3 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
ISO 23893 consists of the following parts, under the general title Water quality — Biochemical and
physiological measurements on fish:
— Part 1: Sampling of fish, handling and preservation of samples
— Part 2: Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) [Technical Specification]
— Part 3: Determination of vitellogenin
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ISO 23893-3:2013(E)
Introduction
Vitellogenin (Vtg) is a large phospholipoglycoprotein produced as the yolk protein precursor in the
liver of oviparous vertebrates, such as fish. Vtg is secreted from hepatocytes through the secretory
pathway, enters the circulation and is taken up by the growing oocyte. Plasma Vtg concentrations are
normally an indication of the maturational status of the female fish, for reviews see References [2]
[18]. More than a decade ago, several studies demonstrated that male fish caught in rivers and streams
had high concentrations of plasma Vtg (e.g. References [14][23]), caused by chemicals acting like
oestrogens present in the environment. Since then, numerous studies have shown the fish Vtg to be a
highly responsive biomarker for oestrogenic compounds in both in vitro hepatocyte cell cultures, in vivo
aquaria studies, and field studies, for reviews see References [1][2][10][13][16][20][26]. Hence, Vtg in
fish has become an accepted biomarker of xenooestrogenic and antioestrogenic exposure of chemicals,
effluents, and discharges, and has been proposed in chemical testing, as well as environmental
monitoring programmes, e.g. Reference [13].
However, recent genetic and immunological analyses have demonstrated a general multiplicity of Vtg
forms in fish, References [9][10]. The concentrations of circulating Vtg proteins (or Vtg gene transcripts)
during oogenesis and their degree of induction by oestrogens appear to vary among species and among
different types of Vtg within a species. The kinetics of induction of distinct types of Vtg by oestrogens
in fish appears to depend on environmental factors (e.g. water temperature and photoperiod), life
history stage, sex, and the concentration and type of oestrogenic compound. Based on these findings, it
is important that the Vtg targets in a bioassay for oestrogens in a specific species be demonstrated to
be an oestrogen-responsive form, and that the assay be validated with the species in question before
embarking on a monitoring programme, Reference [10].
The scientific literature contains a multitude of publications on procedures for determining Vtg in fish
samples, using immunoassays. Whereas radioimmunoassays (RIA) were a predominant method in the
1980s and early 1990s, e.g. References [4][29], enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) are the
dominating principle today. Both the sandwich and competitive ELISA principles provide sensitive
results without the use of radioactive isotopes, and have been successfully applied to determine Vtg
levels in several fish species, e.g. References [3][6][8][12][15][17][19][21][22][24][25][27][28][31][32].
This part of ISO 23893 presents a generalized protocol for both the sandwich and competitive ELISA for
use in quantification of Vtg in fish blood plasma samples. The application of standardized methods is
strongly advised within monitoring programmes.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23893-3:2013(E)
Water quality — Biochemical and physiological
measurements on fish —
Part 3:
Determination of vitellogenin
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This part of ISO 23893 specifies a method for measuring vitellogenin (Vtg) concentrations in a fish
plasma sample employing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method.
It applies to fish that are sampled in the environment (fresh, estuarine or salt water) and to fish exposed
to substances or effluents in a laboratory. The method is quantitative when using Vtg antibodies and a
Vtg standard well characterized with the species of choice.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 23893-1, Water quality — Biochemical and physiological measurements on fish — Part 1: Sampling of
fish, handling and preservation of samples
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
limit of detection
LOD
lowest content that can be measured with reasonable statistical certainty
EXAMPLE The LOD is often expressed as the reagent blank value plus three times its standard deviation.
Note 1 to entry: The method LOD is determined by taking the sample dilution factor into the calculation.
3.2
limit of quantification
LOQ
content equal to or greater than the lowest concentration point in the calibration curve
EXAMPLE The LOQ is often expressed as the reagent blank value plus 10 times its standard deviation
(Reference [11]).
Note 1 to entry: LOQ is also determined by taking the sample dilution factor into the calculation.
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ISO 23893-3:2013(E)
3.3
matrix blank
representative sample that does not contain detectable levels of analyte
Note 1 to entry: For the purposes of this part of ISO 23893, the analyte is vitellogenin.
3.4
selectivity
ability to measure accurately the analyte in the presence of components that can be expected to be
present in the matrix
Note 1 to entry: For the purposes of this part of ISO 23893, the analyte is vitellogenin and the matrix is plasma.
Note 2 to entry: Selectivity is demonstrated by using “matrix blanks”.
4 Principle
Samples of fish blood plasma are collected essentially as specified in ISO 23893-1; however, with addition
of a protease inhibitor (see 7.13 and 9.2). Vitellogenin is determined in the sample by an antibody-based
immunoassay, using either of two established variants.
In the first, so-called sandwich ELISA, the blood plasma sample is allowed to react with a capture
antibody specific for Vtg (from the same or a closely related species), in a microtitre plate well coated
with the antibody. An enzyme-labelled detecting Vtg antibody is then used to produce an antibody
“sandwich” that can be detected based on a chromogenic substrate for the enzyme label (e.g. horseradish
peroxidase). A secondary enzyme-labelled antibody can also be used to develop the assay, if the detecting
antibody is unlabelled. A standard series based on a purified reference material (Vtg protein from the
same or closely related species) is used to develop a quantitative relationship between sample signal
and standard amount.
The second variant is the competitive ELISA technique, where sample Vtg competes with purified Vtg
coated to the microtitre plate walls for binding to a (labelled or unlabelled) Vtg antibody in solution.
Development of assay signal follows the same principle as in the sandwich variant, although the standard
series produces an inverse relationship with signal intensity.
Only Vtg antibodies or assays that have been demonstrated to perform according to specified
performance criteria with the fish species studied should be used in this protocol.
5 Minimum performance criteria
The criteria listed below should be regarded as the minimal acceptable performance as defined from a user
standpoint on the purpose of performing Vtg analysis. Specific performance criteria need to be established
for each specific assay to be used in the study based on in-house (within laboratory) performance.
Selectivity: Matrix blank
Calibration: Standard curve working range >10-fold, preferably 50-fold to 100-fold to be practi-
cal with the dynamic range found in Vtg concentrations
Recovery: >50 %
NOTE The characterization of the “matrix effect” is an important challenge in this regard. It can be difficult
to ensure that a “matrix blank” sample is really devoid of any Vtg.
6 Test environment
All handling operations of plasma samples and standards including the measurement shall be carried
out at a temperature of (4 ± 2) °C or on crushed ice, except where indicated in the test procedure.
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7 Reagents
Unless otherwise specified, use only reagents of recognized analytical grade.
7.1 Sulfuric acid, 0,3 mol/l or 1,5 mol/l, stop solution.
7.2 Crushed ice.
7.3 Coating buffer, 50 mmol/l carbonate–bicarbonate, pH 9,6.
7.4 Washing buffer, phosphate-buffered saline (PBS), pH 7,3, containing 0,5 g/l polysorbate 20 detergent.
7.5 Blocking buffer, washing buffer containing 10 g/l bovine serum albumin (BSA).
7.6 Dilution buffer, 10 g/l BSA in PBS.
7.7 Substrate buffer, phosphate–citric acid buffer, pH 5,0.
1)
7.8 Vtg reference sample.
1)
7.9 Capture antibody, monoclonal or polyclonal anti-Vtg.
1)
7.10 Detecting antibody, monoclonal or polyclonal anti-Vtg, unconjugated or conjugated to horseradish
peroxidase, HRP. In the alternative where the detecting antibody is not conjugated, the detecting antibody
shall be harvested from a different species than the capture antibody.
2)
7.11 Secondary antibody, antibody to Fc (Fragment crystallizable) part of detecting antibody,
conjugated to HRP.
7.12 Peroxidase substrate, tetramethylbenzidine (TMB), or ortho-phenylenediamine (OPD) + H O .
2 2
7.13 Protease inhibitor, such as aprotinin.
8 Apparatus
8.1 96-Well microtitre plates, clear, flat-bottomed, absorbing.
8.2 96-Well microtitre plates, clear, flat-bottomed, non-absorbing, for the competitive ELISA variant.
8.3 Microplate sealing film.
8.4 Microplate reader, wavelength 450 nm or 490 nm, depending on substrate used.
8.5 Pipettes, with disposable tips 5 µl to 1 000 µl.
8.6 Multi-channel pipette and reagent reservoir. Alternatively, a stepper pipette with disposable
tips (100 µl) can be used.
1) Vtg reference samples, monoclonal or polyclonal antibodies to fish Vtgs, and complete assay kits (Vtg ELISA
kits) are available commercially.
2) Enzyme-labelled secondary antibodies are available commercially.
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ISO 23893-3:2013(E)
8.7 Test tubes, 1 ml to 50 ml.
8.8 Microplate washing device. An automatic or manual plate washer is recommended, but a squeeze
bottle or a multichannel/stepper pipette can also be used.
8.9 Vortexer.
9 Sampling procedure
9.1 Sampling of fish
Sampling should be carried out in the natural environment by fishing or in a laboratory on fish exposed
to substances or effluents as specified in ISO 23893−1. Sample a minimum of 10 fish of the same species
and sex and of uniform size from each group to be examined for Vtg concentrations. Do not take samples
during the spawning season because the behaviour and the physiological activities of the fish can be
modified by sexual activity (unless these aspects are part of the study design).
Taking into account the factors likely to influence Vtg concentrations, the following conditions shall be
determined and recorded in the test report:
a) water temperature;
b) date;
c) time of day;
d) a general description of the health condition of each fish (sex, length, body mass, presence of
external and internal injuries) — this is usually reported in connection with sampling as described
in ISO 23893−1.
Depending on the objectives of the study, ensure that the control fish (from the reference location or
laboratory group) are taken from an environment of good ecological quality. Handle the control fish and
their samples in the same manner as those from the examined or experimentally treated groups, except
for exposure to the substance(s) of concern.
9.2 Sampling of blood plasma
After fishing or on completion of exposure, the fish are killed and the blood sampled one by one on
removal from the water, essentially as specified in ISO 23893−1. A volume of approximately 20 μl to
100 μl or more of blood should be sampled from each fish, as soon as possible after it has been killed.
The blood sample is taken using a heparinized syringe ideally from the caudal vessels or by cardiac
puncture. Blood samples shall be processed directly to produce blood plasma by centrifugation of vials
at 3 000 × g for 10 min at 4 °C (or 7 000 × g for 3 min), and the resulting supernatant (plasma) collected
and aliquoted. The plasma sample is immediately transferred to vials which have been coated with a
protease inhibitor (e.g. aprotinin at 2 trypsin inhibitor units [TIU]/ml).
Alternative whole body homogenate (WBH) procedure (see note): Homogenize the liver or whole body
in cold sample buffer (1 + 2 mass + volume; PBS, 10 g/l BSA with aprotinin at 2 TIU/ml) until the tissue
is finely processed, e.g. using a glass hand-held homogenizer, volume 7 ml.
NOTE When using small fish species (e.g. medaka, zebrafish), or larvae or fry from larger fish, it can be
impossible to obtain a sufficient volume of plasma to determine Vtg. In these cases, a liver or WBH can be prepared
and used instead (see References [9][10]).
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ISO 23893-3:2013(E)
9.3 Storage of blood plasma samples
If the Vtg determination cannot take place on the day of sampling, the plasma samples shall be frozen
immediately to below −70 °C, e.g. by using liquid nitrogen or dry ice. The samples can thereafter be
stored for up to 12 months in liquid nitrogen or at a temperature below −70 °C.
If measurements of Vtg are to be initiated on the day of sampling, then the preparatory step shall be
started within 1 h and the plasma samples shall be stored at or below 4 °C.
10 Analytical procedure
10.1 Preparation of the samples
Vtg is an unstable molecule, and all sample and standard dilutions should be prepared and kept on ice.
Prior to conducting the determination, a dilution series of the samples need to be made. After thawing of
samples and the Vtg standard on ice, at least three different dilutions of each sample and a twofold serial
dilution of the standard in blocking/dilution buffer are prepared. The level of dilution of the samples
should range from approximately 1→50 to 1→500 000, and the serial dilution of the standard should
include 9 to 11 dilution steps.
10.2 Determination of vitellogenin
10.2.1 Calibration
Carry out a calibration using a purified Vtg reference sample. The reference sample is used to prepare
a calibration curve against which the unknown samples are quantified. Vtg is an unstable molecule,
and all sample and standard dilutions should be prepared and kept on ice. Reconstituted Vtg cannot be
frozen and reused quantitatively at a later date. A dilution series (e.g. 2 ng/ml to 1 000 ng/ml) prepared
from freshly reconstituted Vtg standard should be run in every assay.
10.2.2 Assay procedure 1 — sandwich ELISA
The described assay procedures 1 and 2 reflect the general principles of the ELISA method. According
to the species and the origin of antibodies or standard used, the experimental conditions can vary, with
special regard to incubation time, buffer composition, and dilution of samples and standard.
In the sandwich ELISA method,the wells of the microplates are precoated with a specific capture
antibody that binds to Vtg in standard and samples added to the wells. A different Vtg-specific detecting
antibody is added to create a sandwich of Vtg and antibody. The whole procedure takes 2 d to complete.
This procedure does not apply to kits. If commercially available kits are used, follow the manufacturer’s
instructions.
10.2.2.1 Precoating of absorbing plates
Unless plates precoated with appropriate Vtg antibody are purchased from a vendor, precoating shall be
carried out prior to the day of the assay.
Dilute capture antibody in coating buffer to 10 µg/ml (12 ml required per plate).
Add 100 µl of this to all wells of all plates to be used.
Seal the plates with microplate sealing film to prevent evaporation and incubate at 4 °C overnight.
After the overnight incubation, wash the wells three times with 200 µl washing buffer per well.
Block non-specific binding-sites by adding 200 µl of dilution buffer to each well and leave for 1 h at 4 °C.
Empty the wells and place the plate upside down on tissue paper.
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10.2.2.2 Incubation with standard and diluted samples
When more than one plate is run in the assay, complete the addition of both standard and sample
dilutions on one plate before proceeding to the next plate.
See suggested plate layout in Figure 1.
Add 100 µl dilution buffer to each of the two non-specific binding (NSB) wells. NSB wells should be included
on every plate. These wells are used to determine non-specific binding (unspecific background signal).
Add in duplicate 100 µl of each Vtg standard dilution (S1 to S11).
Add in duplicate 100 µl of each sample dilution (P1 to P36).
Seal the plates and incubate at a room temperature of 20 °C to 25 °C for 1,5 h.
Ensure equal incubation times when running more than one plate, as the addition of standards and
samples often take several minutes. If there is a substantial time difference between plates, they can
be synchronized at this point: after 1,5 h incubation, wash the plate (step 8 below), seal it and leave at
room temperature until all plates have been washed. Then proceed with addition of detecting antibody.
Key
NSB non-specific binding wells S1 to S11 standards 1 to 11 P1 to P36 samples
Figure 1 — Recommended plate layout for sandwich ELISA protocol
10.2.2.3 Incubation with detecting antibody
Dilute the detecting antibody to appropriate dilution in 12 ml dilution buffer for each plate to be used
in the assay run.
Wash the plates three times with 300 µl washing buffer per well.
Add 100 µl of the diluted detecting antibody to all wells.
Seal the plates and incubate at a room temperature of 20 °C to 25 °C for 0,5 h.
10.2.2.4 Development
Wash the plates five times with 300 µl washing buffer per well.
Add 100 µl room temperated TMB substrate solution to all wells (TMB is light sensitive, and once
prepared should be kept in the dark).
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ISO 23893-3:2013(E)
Incubate in the dark (cover the plates, e.g. with aluminium foil) at a room temperature of 20 °C to
25 °C for 20 min.
Stop the reaction by adding 100 µl 0,3 mol/l H SO to all wells.
2 4
Read the absorbance at 450 nm with a microplate reader.
10.2.3 Assay procedure 2 — competitive ELISA
In the competitive ELISA, both plate coating and sample incubation shall be performed overnight. The
whole procedure therefore takes 2 d to complete.
10.2.3.1 Precoating of plates
See suggested plate layout in Figure 2.
Prepare a solution of reference Vtg (or Vtg purified for coating purpose only) by diluting stock Vtg to
100 ng/ml in coating buffer. Approximately 10 ml should be prepared for each plate to be used in the assay.
3)
Add 100 µl of this coating solution to each well of an absorbing microtitre plate. Leave two wells for
addition of 100 µl coating buffer alone to serve as NSB wells on each plate.
Seal the coating plates with a microtitre plate sealing film to prevent evaporation, and incubate
overnight at 4 °C.
10.2.3.2 Preparation of samples and standard
Dilute samples and standard (reference Vtg) in blocking buffer to concentrations appropriate to be
measured in the assay.
Add 60 µl of each dilution in duplicate to the wells of a non-coated, non-absorbing microtitre plate.
Add 60 µl blocking buffer only to two wells for NSB, and two wells for maximum binding control.
Add 60 µl of an appropriate dilution of the detecting antibody in blocking buffer to all wells on the plate.
Mix plates gently on a plate shaker, cover with a sealing film, and incubate overnight at 4 °C.
10.2.3.3 Blocking of plates
After overnight incubation, wash the coating plates three times with washing buffer.
Without allowing the plates to dry out, add 150 µl of blocking buffer to each well and reseal the plates.
Incubate the plates at 37 °C for 30 min.
Wash the coating plates again three times in washing buffer.
10.2.3.4 Sample incubation
After overnight incubation at 4 °C, incubate the sample plates for 30 min at 37 °C.
Transfer 100 µl of samples and standards to the emptied wells of the blocked coating plates. Ensure that
NSB samples are transferred to the correct corresponding wells of the coating plates.
Reseal and incubate the plates at 37 °C for 1 h.
Wash the plates three times with washing buffer.
3) Nunc Maxisorp is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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ISO 23893-3:2013(E)
If unlabelled detecting antibody is used, add 125 µl of an appropriate dilution of labelled secondary
antibody (e.g. goat anti-rabbit IgG-HRP) to each well.
Reseal the plates and incubate at 37 °C for 2 h.
Key
NSB non-specific binding wells S1 to S12 standards 1 to 12
Max maximum binding wells P1 to P34 samples
Figure 2 — Recommended plate layout for competitive ELISA protocol
10.2.3.5 Development
Wash plates three times with washing buffer.
Add 125 µl substrate buffer containing OPD and H O , prepared immediately prior to use, to each well.
2 2
Substrate buffer is light sensitive and once prepared shall be kept in the dark (alternatively, add 125 µl
TMB substrate solution, which is a non-carcinogenic alternative to OPD).
Incubate the plates at room temperature in the dark until colour has developed (generally between
5 min and 15 min).
Stop the colour reaction by adding 30 µl 1,5mol/l H SO to each well.
2 4
Read the absorbance of each well on a plate reader using a wavelength of 490 nm (450 nm for TMB).
10.2.4 Calculation of results — sandwich ELISA
10.2.4.1 Subtraction of NSB absorbance values
On each plate, calculate the mean of the absorbance values of the two NSB wells and subtract this value from
the absorbance values of all other wells on the same plate. This gives the NSB-cor
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 23893-3:2013
01-december-2013
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YLWHORJHQLQD
Water quality - Biochemical and physiological measurements on fish - Part 3:
Determination of vitellogenin
Qualité de l'eau - Mesurages biochimiques et physiologiques sur poisson - Partie 3:
Dosage de la vitellogénine
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 23893-3:2013
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 23893-3:2013 en,fr
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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Water quality — Biochemical and
physiological measurements on fish —
Part 3:
Determination of vitellogenin
Qualité de l’eau — Mesurages biochimiques et physiologiques sur
poisson —
Partie 3: Dosage de la vitellogénine
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written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
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Published in Switzerland
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SIST ISO 23893-3:2013
ISO 23893-3:2013(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Minimum performance criteria . 2
6 Test environment . 2
7 Reagents . 3
8 Apparatus . 3
9 Sampling procedure . 4
9.1 Sampling of fish . 4
9.2 Sampling of blood plasma . 4
9.3 Storage of blood plasma samples . 5
10 Analytical procedure . 5
10.1 Preparation of the samples . 5
10.2 Determination of vitellogenin . 5
11 Test report .10
Annex A (informative) Examples of results: Fathead minnow sandwich ELISA .12
Bibliography .19
© ISO 2013 – All rights reserved iii
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SIST ISO 23893-3:2013
ISO 23893-3:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 23893-3 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
ISO 23893 consists of the following parts, under the general title Water quality — Biochemical and
physiological measurements on fish:
— Part 1: Sampling of fish, handling and preservation of samples
— Part 2: Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) [Technical Specification]
— Part 3: Determination of vitellogenin
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ISO 23893-3:2013(E)
Introduction
Vitellogenin (Vtg) is a large phospholipoglycoprotein produced as the yolk protein precursor in the
liver of oviparous vertebrates, such as fish. Vtg is secreted from hepatocytes through the secretory
pathway, enters the circulation and is taken up by the growing oocyte. Plasma Vtg concentrations are
normally an indication of the maturational status of the female fish, for reviews see References [2]
[18]. More than a decade ago, several studies demonstrated that male fish caught in rivers and streams
had high concentrations of plasma Vtg (e.g. References [14][23]), caused by chemicals acting like
oestrogens present in the environment. Since then, numerous studies have shown the fish Vtg to be a
highly responsive biomarker for oestrogenic compounds in both in vitro hepatocyte cell cultures, in vivo
aquaria studies, and field studies, for reviews see References [1][2][10][13][16][20][26]. Hence, Vtg in
fish has become an accepted biomarker of xenooestrogenic and antioestrogenic exposure of chemicals,
effluents, and discharges, and has been proposed in chemical testing, as well as environmental
monitoring programmes, e.g. Reference [13].
However, recent genetic and immunological analyses have demonstrated a general multiplicity of Vtg
forms in fish, References [9][10]. The concentrations of circulating Vtg proteins (or Vtg gene transcripts)
during oogenesis and their degree of induction by oestrogens appear to vary among species and among
different types of Vtg within a species. The kinetics of induction of distinct types of Vtg by oestrogens
in fish appears to depend on environmental factors (e.g. water temperature and photoperiod), life
history stage, sex, and the concentration and type of oestrogenic compound. Based on these findings, it
is important that the Vtg targets in a bioassay for oestrogens in a specific species be demonstrated to
be an oestrogen-responsive form, and that the assay be validated with the species in question before
embarking on a monitoring programme, Reference [10].
The scientific literature contains a multitude of publications on procedures for determining Vtg in fish
samples, using immunoassays. Whereas radioimmunoassays (RIA) were a predominant method in the
1980s and early 1990s, e.g. References [4][29], enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) are the
dominating principle today. Both the sandwich and competitive ELISA principles provide sensitive
results without the use of radioactive isotopes, and have been successfully applied to determine Vtg
levels in several fish species, e.g. References [3][6][8][12][15][17][19][21][22][24][25][27][28][31][32].
This part of ISO 23893 presents a generalized protocol for both the sandwich and competitive ELISA for
use in quantification of Vtg in fish blood plasma samples. The application of standardized methods is
strongly advised within monitoring programmes.
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SIST ISO 23893-3:2013
INTERNATIONAL STANDARD ISO 23893-3:2013(E)
Water quality — Biochemical and physiological
measurements on fish —
Part 3:
Determination of vitellogenin
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This part of ISO 23893 specifies a method for measuring vitellogenin (Vtg) concentrations in a fish
plasma sample employing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method.
It applies to fish that are sampled in the environment (fresh, estuarine or salt water) and to fish exposed
to substances or effluents in a laboratory. The method is quantitative when using Vtg antibodies and a
Vtg standard well characterized with the species of choice.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 23893-1, Water quality — Biochemical and physiological measurements on fish — Part 1: Sampling of
fish, handling and preservation of samples
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
limit of detection
LOD
lowest content that can be measured with reasonable statistical certainty
EXAMPLE The LOD is often expressed as the reagent blank value plus three times its standard deviation.
Note 1 to entry: The method LOD is determined by taking the sample dilution factor into the calculation.
3.2
limit of quantification
LOQ
content equal to or greater than the lowest concentration point in the calibration curve
EXAMPLE The LOQ is often expressed as the reagent blank value plus 10 times its standard deviation
(Reference [11]).
Note 1 to entry: LOQ is also determined by taking the sample dilution factor into the calculation.
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SIST ISO 23893-3:2013
ISO 23893-3:2013(E)
3.3
matrix blank
representative sample that does not contain detectable levels of analyte
Note 1 to entry: For the purposes of this part of ISO 23893, the analyte is vitellogenin.
3.4
selectivity
ability to measure accurately the analyte in the presence of components that can be expected to be
present in the matrix
Note 1 to entry: For the purposes of this part of ISO 23893, the analyte is vitellogenin and the matrix is plasma.
Note 2 to entry: Selectivity is demonstrated by using “matrix blanks”.
4 Principle
Samples of fish blood plasma are collected essentially as specified in ISO 23893-1; however, with addition
of a protease inhibitor (see 7.13 and 9.2). Vitellogenin is determined in the sample by an antibody-based
immunoassay, using either of two established variants.
In the first, so-called sandwich ELISA, the blood plasma sample is allowed to react with a capture
antibody specific for Vtg (from the same or a closely related species), in a microtitre plate well coated
with the antibody. An enzyme-labelled detecting Vtg antibody is then used to produce an antibody
“sandwich” that can be detected based on a chromogenic substrate for the enzyme label (e.g. horseradish
peroxidase). A secondary enzyme-labelled antibody can also be used to develop the assay, if the detecting
antibody is unlabelled. A standard series based on a purified reference material (Vtg protein from the
same or closely related species) is used to develop a quantitative relationship between sample signal
and standard amount.
The second variant is the competitive ELISA technique, where sample Vtg competes with purified Vtg
coated to the microtitre plate walls for binding to a (labelled or unlabelled) Vtg antibody in solution.
Development of assay signal follows the same principle as in the sandwich variant, although the standard
series produces an inverse relationship with signal intensity.
Only Vtg antibodies or assays that have been demonstrated to perform according to specified
performance criteria with the fish species studied should be used in this protocol.
5 Minimum performance criteria
The criteria listed below should be regarded as the minimal acceptable performance as defined from a user
standpoint on the purpose of performing Vtg analysis. Specific performance criteria need to be established
for each specific assay to be used in the study based on in-house (within laboratory) performance.
Selectivity: Matrix blank
Calibration: Standard curve working range >10-fold, preferably 50-fold to 100-fold to be practi-
cal with the dynamic range found in Vtg concentrations
Recovery: >50 %
NOTE The characterization of the “matrix effect” is an important challenge in this regard. It can be difficult
to ensure that a “matrix blank” sample is really devoid of any Vtg.
6 Test environment
All handling operations of plasma samples and standards including the measurement shall be carried
out at a temperature of (4 ± 2) °C or on crushed ice, except where indicated in the test procedure.
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ISO 23893-3:2013(E)
7 Reagents
Unless otherwise specified, use only reagents of recognized analytical grade.
7.1 Sulfuric acid, 0,3 mol/l or 1,5 mol/l, stop solution.
7.2 Crushed ice.
7.3 Coating buffer, 50 mmol/l carbonate–bicarbonate, pH 9,6.
7.4 Washing buffer, phosphate-buffered saline (PBS), pH 7,3, containing 0,5 g/l polysorbate 20 detergent.
7.5 Blocking buffer, washing buffer containing 10 g/l bovine serum albumin (BSA).
7.6 Dilution buffer, 10 g/l BSA in PBS.
7.7 Substrate buffer, phosphate–citric acid buffer, pH 5,0.
1)
7.8 Vtg reference sample.
1)
7.9 Capture antibody, monoclonal or polyclonal anti-Vtg.
1)
7.10 Detecting antibody, monoclonal or polyclonal anti-Vtg, unconjugated or conjugated to horseradish
peroxidase, HRP. In the alternative where the detecting antibody is not conjugated, the detecting antibody
shall be harvested from a different species than the capture antibody.
2)
7.11 Secondary antibody, antibody to Fc (Fragment crystallizable) part of detecting antibody,
conjugated to HRP.
7.12 Peroxidase substrate, tetramethylbenzidine (TMB), or ortho-phenylenediamine (OPD) + H O .
2 2
7.13 Protease inhibitor, such as aprotinin.
8 Apparatus
8.1 96-Well microtitre plates, clear, flat-bottomed, absorbing.
8.2 96-Well microtitre plates, clear, flat-bottomed, non-absorbing, for the competitive ELISA variant.
8.3 Microplate sealing film.
8.4 Microplate reader, wavelength 450 nm or 490 nm, depending on substrate used.
8.5 Pipettes, with disposable tips 5 µl to 1 000 µl.
8.6 Multi-channel pipette and reagent reservoir. Alternatively, a stepper pipette with disposable
tips (100 µl) can be used.
1) Vtg reference samples, monoclonal or polyclonal antibodies to fish Vtgs, and complete assay kits (Vtg ELISA
kits) are available commercially.
2) Enzyme-labelled secondary antibodies are available commercially.
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SIST ISO 23893-3:2013
ISO 23893-3:2013(E)
8.7 Test tubes, 1 ml to 50 ml.
8.8 Microplate washing device. An automatic or manual plate washer is recommended, but a squeeze
bottle or a multichannel/stepper pipette can also be used.
8.9 Vortexer.
9 Sampling procedure
9.1 Sampling of fish
Sampling should be carried out in the natural environment by fishing or in a laboratory on fish exposed
to substances or effluents as specified in ISO 23893−1. Sample a minimum of 10 fish of the same species
and sex and of uniform size from each group to be examined for Vtg concentrations. Do not take samples
during the spawning season because the behaviour and the physiological activities of the fish can be
modified by sexual activity (unless these aspects are part of the study design).
Taking into account the factors likely to influence Vtg concentrations, the following conditions shall be
determined and recorded in the test report:
a) water temperature;
b) date;
c) time of day;
d) a general description of the health condition of each fish (sex, length, body mass, presence of
external and internal injuries) — this is usually reported in connection with sampling as described
in ISO 23893−1.
Depending on the objectives of the study, ensure that the control fish (from the reference location or
laboratory group) are taken from an environment of good ecological quality. Handle the control fish and
their samples in the same manner as those from the examined or experimentally treated groups, except
for exposure to the substance(s) of concern.
9.2 Sampling of blood plasma
After fishing or on completion of exposure, the fish are killed and the blood sampled one by one on
removal from the water, essentially as specified in ISO 23893−1. A volume of approximately 20 μl to
100 μl or more of blood should be sampled from each fish, as soon as possible after it has been killed.
The blood sample is taken using a heparinized syringe ideally from the caudal vessels or by cardiac
puncture. Blood samples shall be processed directly to produce blood plasma by centrifugation of vials
at 3 000 × g for 10 min at 4 °C (or 7 000 × g for 3 min), and the resulting supernatant (plasma) collected
and aliquoted. The plasma sample is immediately transferred to vials which have been coated with a
protease inhibitor (e.g. aprotinin at 2 trypsin inhibitor units [TIU]/ml).
Alternative whole body homogenate (WBH) procedure (see note): Homogenize the liver or whole body
in cold sample buffer (1 + 2 mass + volume; PBS, 10 g/l BSA with aprotinin at 2 TIU/ml) until the tissue
is finely processed, e.g. using a glass hand-held homogenizer, volume 7 ml.
NOTE When using small fish species (e.g. medaka, zebrafish), or larvae or fry from larger fish, it can be
impossible to obtain a sufficient volume of plasma to determine Vtg. In these cases, a liver or WBH can be prepared
and used instead (see References [9][10]).
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SIST ISO 23893-3:2013
ISO 23893-3:2013(E)
9.3 Storage of blood plasma samples
If the Vtg determination cannot take place on the day of sampling, the plasma samples shall be frozen
immediately to below −70 °C, e.g. by using liquid nitrogen or dry ice. The samples can thereafter be
stored for up to 12 months in liquid nitrogen or at a temperature below −70 °C.
If measurements of Vtg are to be initiated on the day of sampling, then the preparatory step shall be
started within 1 h and the plasma samples shall be stored at or below 4 °C.
10 Analytical procedure
10.1 Preparation of the samples
Vtg is an unstable molecule, and all sample and standard dilutions should be prepared and kept on ice.
Prior to conducting the determination, a dilution series of the samples need to be made. After thawing of
samples and the Vtg standard on ice, at least three different dilutions of each sample and a twofold serial
dilution of the standard in blocking/dilution buffer are prepared. The level of dilution of the samples
should range from approximately 1→50 to 1→500 000, and the serial dilution of the standard should
include 9 to 11 dilution steps.
10.2 Determination of vitellogenin
10.2.1 Calibration
Carry out a calibration using a purified Vtg reference sample. The reference sample is used to prepare
a calibration curve against which the unknown samples are quantified. Vtg is an unstable molecule,
and all sample and standard dilutions should be prepared and kept on ice. Reconstituted Vtg cannot be
frozen and reused quantitatively at a later date. A dilution series (e.g. 2 ng/ml to 1 000 ng/ml) prepared
from freshly reconstituted Vtg standard should be run in every assay.
10.2.2 Assay procedure 1 — sandwich ELISA
The described assay procedures 1 and 2 reflect the general principles of the ELISA method. According
to the species and the origin of antibodies or standard used, the experimental conditions can vary, with
special regard to incubation time, buffer composition, and dilution of samples and standard.
In the sandwich ELISA method,the wells of the microplates are precoated with a specific capture
antibody that binds to Vtg in standard and samples added to the wells. A different Vtg-specific detecting
antibody is added to create a sandwich of Vtg and antibody. The whole procedure takes 2 d to complete.
This procedure does not apply to kits. If commercially available kits are used, follow the manufacturer’s
instructions.
10.2.2.1 Precoating of absorbing plates
Unless plates precoated with appropriate Vtg antibody are purchased from a vendor, precoating shall be
carried out prior to the day of the assay.
Dilute capture antibody in coating buffer to 10 µg/ml (12 ml required per plate).
Add 100 µl of this to all wells of all plates to be used.
Seal the plates with microplate sealing film to prevent evaporation and incubate at 4 °C overnight.
After the overnight incubation, wash the wells three times with 200 µl washing buffer per well.
Block non-specific binding-sites by adding 200 µl of dilution buffer to each well and leave for 1 h at 4 °C.
Empty the wells and place the plate upside down on tissue paper.
© ISO 2013 – All rights reserved 5
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SIST ISO 23893-3:2013
ISO 23893-3:2013(E)
10.2.2.2 Incubation with standard and diluted samples
When more than one plate is run in the assay, complete the addition of both standard and sample
dilutions on one plate before proceeding to the next plate.
See suggested plate layout in Figure 1.
Add 100 µl dilution buffer to each of the two non-specific binding (NSB) wells. NSB wells should be included
on every plate. These wells are used to determine non-specific binding (unspecific background signal).
Add in duplicate 100 µl of each Vtg standard dilution (S1 to S11).
Add in duplicate 100 µl of each sample dilution (P1 to P36).
Seal the plates and incubate at a room temperature of 20 °C to 25 °C for 1,5 h.
Ensure equal incubation times when running more than one plate, as the addition of standards and
samples often take several minutes. If there is a substantial time difference between plates, they can
be synchronized at this point: after 1,5 h incubation, wash the plate (step 8 below), seal it and leave at
room temperature until all plates have been washed. Then proceed with addition of detecting antibody.
Key
NSB non-specific binding wells S1 to S11 standards 1 to 11 P1 to P36 samples
Figure 1 — Recommended plate layout for sandwich ELISA protocol
10.2.2.3 Incubation with detecting antibody
Dilute the detecting antibody to appropriate dilution in 12 ml dilution buffer for each plate to be used
in the assay run.
Wash the plates three times with 300 µl washing buffer per well.
Add 100 µl of the diluted detecting antibody to all wells.
Seal the plates and incubate at a room temperature of 20 °C to 25 °C for 0,5 h.
10.2.2.4 Development
Wash the plates five times with 300 µl washing buffer per well.
Add 100 µl room temperated TMB substrate solution to all wells (TMB is light sensitive, and once
prepared should be kept in the dark).
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ISO 23893-3:2013(E)
Incubate in the dark (cover the plates, e.g. with aluminium foil) at a room temperature of 20 °C to
25 °C for 20 min.
Stop the reaction by adding 100 µl 0,3 mol/l H SO to all wells.
2 4
Read the absorbance at 450 nm with a microplate reader.
10.2.3 Assay procedure 2 — competitive ELISA
In the competitive ELISA, both plate coating and sample incubation shall be performed overnight. The
whole procedure therefore takes 2 d to complete.
10.2.3.1 Precoating of plates
See suggested plate layout in Figure 2.
Prepare a solution of reference Vtg (or Vtg purified for coating purpose only) by diluting stock Vtg to
100 ng/ml in coating buffer. Approximately 10 ml should be prepared for each plate to be used in the assay.
3)
Add 100 µl of this coating solution to each well of an absorbing microtitre plate. Leave two wells for
addition of 100 µl coating buffer alone to serve as NSB wells on each plate.
Seal the coating plates with a microtitre plate sealing film to prevent evaporation, and incubate
overnight at 4 °C.
10.2.3.2 Preparation of samples and standard
Dilute samples and standard (reference Vtg) in blocking buffer to concentrations appropriate to be
measured in the assay.
Add 60 µl of each dilution in duplicate to the wells of a non-coated, non-absorbing microtitre plate.
Add 60 µl blocking buffer only to two wells for NSB, and two wells for maximum binding control.
Add 60 µl of an appropriate dilution of the detecting antibody in blocking buffer to all wells on the plate.
Mix plates gently on a plate shaker, cover with a sealing film, and incubate overnight at 4 °C.
10.2.3.3 Blocking of plates
After overnight incubation, wash the coating plates three times with washing buffer.
Without allowing the plates to dry out, add 150 µl of blocking buffer to each well and reseal the plates.
Incubate the plates at 37 °C for 30 min.
Wash the coating plates again three times in washing buffer.
10.2.3.4 Sample incubation
After overnight incubation at 4 °C, incubate the sample plates for 30 min at 37 °C.
Transfer 100 µl of samples and standards to the emptied wells of the blocked coating plates. Ensure that
NSB samples are transferred to the correct corresponding wells of the coating plates.
Reseal and incubate the plates at 37 °C for 1 h.
Wash the plates three times with washing buffer.
3) Nunc Maxisorp is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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SIST ISO 23893-3:2013
ISO 23893-3:2013(E)
If unlabelled detecting antibody is used, add 125 µl of an appropriate dilution of labelled secondary
antibody (
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 23893-3
Première édition
2013-04-01
Qualité de l’eau — Mesurages
biochimiques et physiologiques sur
poisson —
Partie 3:
Dosage de la vitellogénine
Water quality — Biochemical and physiological measurements on fish —
Part 3: Determination of vitellogenin
Numéro de référence
ISO 23893-3:2013(F)
©
ISO 2013
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ISO 23893-3:2013(F)
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l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
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ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO 23893-3:2013(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Critères minimaux de performance . 2
6 Environnement d’essai . 3
7 Réactifs . 3
8 Appareillage . 4
9 Mode opératoire d’échantillonnage . 4
9.1 Échantillonnage des poissons . 4
9.2 Échantillonnage du plasma sanguin . 5
9.3 Conservation des échantillons de plasma sanguin . 5
10 Mode opératoire d’analyse . 5
10.1 Préparation des échantillons . 5
10.2 Dosage de la vitellogénine . 5
11 Rapport d’essai .11
Annexe A (informative) Exemples de résultats: technique ELISA en sandwich sur vairon
à tête-de-boule .13
Bibliographie .20
© ISO 2013 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 23893-3:2013(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 23893-3 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
L’ISO 23893 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l’eau — Mesurages
biochimiques et physiologiques sur poisson:
— Partie 1: Échantillonnage des poissons, manipulation et conservation des échantillons
— Partie 2: Dosage de l’éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD) [Spécification technique]
— Partie 3: Dosage de la vitellogénine
iv © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO 23893-3:2013(F)
Introduction
La vitellogénine (Vtg) est une phospho-lipo-glyco-protéine de grande taille produite en tant que
précurseur des protéines du jaune d’œuf dans le foie des vertébrés ovipares, tels que les poissons. La
Vtg est sécrétée par les hépatocytes par la voie sécrétoire, pénètre dans la circulation sanguine d’où
elle est captée par l’ovocyte en croissance. Les concentrations de Vtg plasmatique sont normalement
une indication de l’état de maturité des poissons femelles; se reporter aux Références [2] [18]. Il y a plus
de dix ans, plusieurs études ont démontré que les poissons mâles péchés dans les rivières et les cours
d’eau présentaient des concentrations élevées de Vtg plasmatique (voir par exemple les Références [14]
[23]), provoquées par des produits chimiques présents dans l’environnement, agissant comme des
œstrogènes. Depuis, de nombreuses études ont montré que la Vtg chez le poisson était un biomarqueur
extrêmement sensible pour les composés œstrogéniques aussi bien dans des cultures d’hépatocytes in
vitro que dans des études in vivo en aquarium et des études sur le terrain; se reporter aux Références [1]
[2] [10] [13] [16] [20] [26]. Par conséquent, la Vtg chez le poisson est devenue un biomarqueur accepté
de l’exposition aux xéno-œstrogènes et anti-œstrogènes des produits chimiques, des effluents et des
rejets, et a été proposée dans les essais des produits chimiques et les programmes de surveillance de
l’environnement; voir par exemple la Référence [13].
Toutefois, de récentes analyses génétiques et immunologiques ont démontré une multiplicité générale
des formes de Vtg chez le poisson, Références [9] [10]. Les concentrations circulantes de protéines Vtg
(ou des produits de transcription du gène Vtg) pendant l’ovogénèse et leur degré d’induction par les
œstrogènes semblent varier entre les espèces et entre les différents types de Vtg au sein d’une espèce.
La cinétique d’induction des différents types de Vtg par les œstrogènes chez le poisson semble dépendre
de facteurs environnementaux (par exemple la température de l’eau et la photopériode), de l’étape du
cycle biologique, du sexe et de la concentration et du type de composé œstrogénique. Sur la base de ces
découvertes, il est important de démontrer que les Vtg cibles utilisées dans une analyse biologique des
œstrogènes dans une espèce spécifique sont une forme sensible aux œstrogènes et que l’analyse est
validée avec les espèces considérées avant de lancer un programme de surveillance (Référence [10]).
La littérature scientifique contient une multitude de publications sur les procédures permettant de
doser la Vtg dans des échantillons de poisson, à l’aide de dosages immunologiques. Alors que les dosages
radio-immunologiques (RIA) constituaient la méthode prédominante dans les années 1980 et au début des
années 1990 (voir par exemple les Références [4] [29]), les tests ELISA (enzyme-linked immunosorbent
assays) sont aujourd’hui majoritaires. Les techniques ELISA en sandwich et par compétition fournissent
toutes les deux des résultats sensibles sans utiliser d’isotopes radioactifs et ont été appliquées avec
succès à la détermination des concentrations de Vtg chez plusieurs espèces de poisson, par exemple voir
Références [3] [6] [8] [12] [15] [17] [19] [21] [22] [24] [25] [27] [28] [31] [32].
La présente partie de l’ISO 23893 présente un protocole général pour les deux techniques ELISA, en
sandwich et par compétition, en vue de leur utilisation pour quantifier la Vtg dans des échantillons de
plasma sanguin de poisson. L’application de méthodes normalisées est fortement recommandée dans les
programmes de surveillance.
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NORME INTERNATIONALE ISO 23893-3:2013(F)
Qualité de l’eau — Mesurages biochimiques et
physiologiques sur poisson —
Partie 3:
Dosage de la vitellogénine
AVERTISSEMENT — Il convient que les utilisateurs du présent document soient familiers des
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour objectif de traiter tous les
éventuels problèmes de sécurité associés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur du présent
document d’établir des pratiques appropriées en matière de sécurité et d’hygiène et de s’assurer
de leur conformité à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent
document soient effectués par un personnel ayant une qualification adéquate.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 23893 spécifie une méthode permettant de mesurer les concentrations
de vitellogénine (Vtg) dans un échantillon de plasma de poisson en employant une technique ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay).
Elle s’applique à des poissons prélevés dans l’environnement (eau douce, eau d’estuaire ou eau salée) et
à des poissons exposés à des substances ou des effluents en laboratoire. La méthode est quantitative
lorsqu’elle utilise des anticorps anti-Vtg et un étalon de Vtg bien caractérisé avec l’espèce considérée.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 23893-1, Qualité de l’eau — Mesurages biochimiques et physiologiques sur poisson — Partie 1:
Échantillonnage des poissons, manipulation et conservation des échantillons
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
limite de détection
LD
plus faible teneur pouvant être mesurée avec une certitude statistique raisonnable
EXEMPLE La LD est souvent exprimée comme la valeur du blanc réactif plus trois fois l’écart-type du
blanc de réactifs.
Note 1 à l’article: La LD est également déterminée en tenant compte du facteur de dilution de l’échantillon dans le calcul.
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ISO 23893-3:2013(F)
3.2
limite de quantification
LQ
teneur supérieure ou égale au point de plus faible concentration de la courbe d’étalonnage
EXEMPLE La LQ est souvent exprimée comme le blanc réactif plus dix fois l’écart-type du blanc de réactifs
(Référence [11]).
Note 1 à l’article: La LQ est également déterminée en tenant compte du facteur de dilution de l’échantillon dans le calcul.
3.3
blanc de matrice
échantillon représentatif ne contenant pas de niveaux détectables d’analyte
Note 1 à l’article: Pour les besoins de la présente partie de l’ISO 23893, l’analyte est la vitellogénine.
3.4
sélectivité
aptitude à mesurer avec exactitude l’analyte en présence de composants pouvant être attendus dans la
matrice
Note 1 à l’article: Pour les besoins de la présente partie de l’ISO 23893, l’analyte est la vitellogénine et la matrice
est le plasma.
Note 2 à l’article: La sélectivité est démontrée en utilisant des «blancs matrice».
4 Principe
Des échantillons de plasma sanguin de poisson sont prélevés essentiellement comme spécifié dans
l’ISO 23893-1, mais en ajoutant toutefois un inhibiteur de protéase (voir 7.13 et 9.2). La vitellogénine est dosée
par une technique immunologique fondée sur les anticorps, en utilisant l’une des deux variantes établies.
Dans la première, appelée ELISA en sandwich, on laisse réagir l’échantillon de plasma sanguin avec un
anticorps de capture spécifique de la Vtg (provenant de la même espèce ou d’une espèce étroitement
apparentée) dans une plaque de microtitrage recouverte d’anticorps. Un anticorps anti-Vtg de détection
marqué par une enzyme est ensuite utilisé pour produire un «sandwich» d’anticorps qui peut être
détecté sur la base d’un substrat chromogène du marqueur enzymatique (par exemple peroxydase du
raifort). Un deuxième anticorps marqué par une enzyme peut également être utilisé pour développer
le dosage si l’anticorps de détection n’est pas marqué. Une série d’étalons basée sur un matériau de
référence purifié (protéine Vtg provenant de la même espèce ou d’une espèce étroitement apparentée)
est utilisée pour établir une relation quantitative entre le signal de l’échantillon et la quantité d’étalon.
La deuxième variante est la technique ELISA par compétition, dans laquelle la Vtg de l’échantillon et
la Vtg purifiée appliquée sur les parois de la plaque de microtitrage sont en compétition pour se lier à
un anticorps anti-Vtg (marqué ou non) en solution. Le développement du signal de dosage suit le même
principe que dans la technique en sandwich, bien que la série d’étalons produise une relation inverse
avec l’intensité du signal.
Dans ce protocole, il convient d’utiliser uniquement les anticorps anti-Vtg ou dosages qui se sont avérés
répondre aux critères de performance spécifiés avec les espèces de poisson étudiées.
5 Critères minimaux de performance
Il convient de considérer les critères énumérés ci-dessous comme les performances minimales
acceptables, telles que définies du point de vue de l’utilisateur, dans le but de réaliser un dosage de Vtg.
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ISO 23893-3:2013(F)
Des critères de performance spécifiques doivent être établis pour chaque dosage spécifique devant être
utilisé dans l’étude, sur la base des performances en interne (intralaboratoires).
Sélectivité: Blanc de matrice < LD (avec le facteur de dilution nécessaire pour éviter les
effets de matrice)
Étalonnage: Étendue de mesure de la courbe d’étalonnage > 10 fois, de préférence 50 fois
à 100 fois, pour être pratique avec la gamme dynamique des concentrations
de Vtg observées
Taux de récupération: > 50 %
NOTE La caractérisation de l’«effet de matrice» est un défi important à cet égard. Il peut être difficile de
s’assurer qu’un échantillon de «blanc de matrice» ne contient réellement pas de Vtg.
6 Environnement d’essai
Toutes les opérations de manipulation des échantillons de plasma et des étalons, y compris le mesurage,
doivent être réalisées à une température de (4 ± 2) °C ou sur de la glace pilée, sauf indication contraire
dans le mode opératoire.
7 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
7.1 Acide sulfurique, 0,3 mol/l ou 1,5 mol/l, solution d’arrêt.
7.2 Glace pilée.
7.3 Tampon de revêtement, 50 mmol/l de carbonate-bicarbonate, pH 9,6.
7.4 Tampon de lavage, solution saline tamponnée au tampon phosphate salin (PBS), pH 7,3, contenant
0,5 g/l de détergent polysorbate 20.
7.5 Tampon de blocage, tampon de lavage contenant 10 g/l d’albumine sérique bovine (BSA).
7.6 Tampon de dilution, 10 g/l de BSA dans une PBS.
7.7 Tampon de substrat, tampon phosphate-acide citrique, pH 5,0.
1)
7.8 Échantillon de Vtg de référence .
1)
7.9 Anticorps de capture, anti-Vtg monoclonal ou polyclonal .
1)
7.10 Anticorps de détection, anti-Vtg monoclonal ou polyclonal , non conjugué ou conjugué à une
peroxydase du raifort (HRP). Lorsque l’anticorps de détection n’est pas conjugué, il doit être récolté sur
d’autres espèces que l’anticorps de capture.
2)
7.11 Anticorps secondaire , anticorps du Fc (Fragment cristallisable) de l’anticorps de détection,
conjugué à une HRP.
1) Les échantillons de Vtg de référence, les anticorps monoclonaux ou polyclonaux, et les kits de dosage
complets (kits Vtg ELISA) sont disponibles dans le commerce.
2) Les anticorps secondaires marqués par une enzyme sont disponibles dans le commerce.
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ISO 23893-3:2013(F)
7.12 Substrat peroxydase, tétraméthylbenzidine (TMB), ou ortho-phénylènediamine (OPD) + H O .
2 2
7.13 Inhibiteur de protéase, tel que l’aprotinine.
8 Appareillage
8.1 Plaques de microtitrage à 96 puits, transparentes, à fond plat, absorbantes.
8.2 Plaques de microtitrage à 96 puits, transparentes, à fond plat, non absorbantes, pour la technique
ELISA par compétition.
8.3 Film d’étanchéité pour microplaques.
8.4 Lecteur de microplaque, longueur d’onde de 450 nm ou 490 nm, selon le substrat utilisé.
8.5 Pipettes, avec embouts jetables, 5 µl à 1 000 µl.
8.6 Pipette multicanaux et réservoir de réactif. Une pipette à répétition avec des embouts jetables
(100 µl) peut également être utilisée.
8.7 Tubes à essai, 1 ml à 50 ml.
8.8 Dispositif de lavage de microplaques. Un dispositif de lavage de plaques, automatique ou manuel,
est recommandé, mais une pissette compressible ou une pipette multicanaux/à répétition peut également
être utilisée.
8.9 Agitateur-mélangeur vortex.
9 Mode opératoire d’échantillonnage
9.1 Échantillonnage des poissons
Il convient de réaliser l’échantillonnage dans le milieu naturel par pêche ou dans un laboratoire, sur
des poissons exposés aux substances ou effluents, comme spécifié dans l’ISO 23893−1. Prélever un
échantillon comprenant au moins 10 poissons de la même espèce, du même sexe et de taille homogène
dans chaque groupe à examiner pour les concentrations de Vtg. Ne pas prélever d’échantillons pendant
la période du frai car le comportement et les activités physiologiques des poissons peuvent être modifiés
par l’activité sexuelle (à moins que ces aspects ne fassent partie du plan d’étude).
Compte tenu des facteurs susceptibles d’influencer les concentrations de Vtg, les conditions suivantes
doivent être déterminées et consignées dans le rapport d’essai:
a) température de l’eau;
b) date;
c) heure de la journée;
d) description générale de l’état de santé de chaque poisson (sexe, longueur, masse corporelle, présence
de lésions externes et internes) — ces éléments sont généralement consignés en relation avec
l’échantillonnage, tel que décrit dans l’ISO 23893−1.
Selon les objectifs de l’étude, s’assurer que les poissons témoins (provenant du site de référence ou du
groupe témoin de l’étude) soient prélevés dans un environnement de bonne qualité écologique. Manipuler
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les poissons témoins et leurs échantillons de la même manière que ceux provenant des groupes étudiés
ou traités expérimentalement, excepté pour l’exposition à la (aux) substance(s) étudiée(s).
9.2 Échantillonnage du plasma sanguin
Après la pêche ou à la fin de l’exposition, les poissons sont tués et le sang est prélevé tour à tour sur
chaque poisson dès son retrait de l’eau, essentiellement de la manière spécifiée dans l’ISO 23893−1. Il
convient de prélever un échantillon de sang, d’un volume d’environ 20 μl à 100 μl ou plus, sur chaque
poisson, dès que possible après son sacrifice. L’échantillon de sang est prélevé à l’aide d’une seringue
héparinisée idéalement dans la veine caudale ou par ponction cardiaque. Les échantillons de sang
doivent être traités directement pour obtenir du plasma sanguin en centrifugeant les fioles à 3 000 × g
pendant 10 min à 4 °C (ou 7 000 × g pendant 3 min), et le surnageant obtenu (plasma) est recueilli et
divisé en aliquotes. L’échantillon de plasma est immédiatement transféré dans des fioles enduites d’un
inhibiteur de protéase (par exemple aprotinine à 2 unités d’inhibiteur de trypsine [TIU]/ml).
Mode opératoire alternatif sur homogénat entier (WBH) (voir note): Homogénéiser le foie ou le corps
entier dans un tampon d’échantillon froid [1+2 poids+volume; PBS, 10 g/l BSA avec 2 TIU/ml d’aprotinine]
jusqu’à ce que les tissus soient finement broyés, en utilisant par exemple un homogénéisateur manuel en
verre, volume 7 ml.
NOTE Lorsque l’on utilise des espèces de poisson de petite taille (par exemple medaka, poisson zèbre) ou
des larves ou alevins de plus gros poissons, il peut être impossible d’obtenir un volume de plasma suffisant pour
doser la Vtg. Dans ce cas, le foie ou l’homogénat de corps entier (WBH) peut être préparé et utilisé à la place (voir
les Références [9] [10]).
9.3 Conservation des échantillons de plasma sanguin
Si le dosage de la Vtg ne peut pas avoir lieu le même jour que l’échantillonnage, les échantillons de plasma
doivent être congelés immédiatement à une température inférieure à -70 °C, par exemple en utilisant de
l’azote liquide ou de la glace sèche. Les échantillons peuvent alors être conservés pendant 12 mois dans
l’azote liquide ou à une température inférieure à -70 °C.
Si le dosage de la Vtg doit être commencé le jour de l’échantillonnage, l’étape préparatoire doit alors
débuter dans l’heure qui suit et les échantillons de plasma doivent être conservés à une température
inférieure ou égale à 4 °C.
10 Mode opératoire d’analyse
10.1 Préparation des échantillons
La Vtg est une molécule instable et il convient de préparer et de conserver sur de la glace toutes les
dilutions d’échantillon et d’étalon. Avant de réaliser le dosage, une série de dilutions des échantillons
doit être réalisée. Après décongélation des échantillons et de l’étalon de Vtg sur de la glace, au moins
trois dilutions différentes de chaque échantillon et une série de dilutions au demi de l’étalon dans un
tampon de blocage/dilution sont préparées. Il convient que le niveau de dilution des échantillons couvre
approximativement la gamme de 1→50 à 1→500 000 et que la série de dilutions de l’étalon comprenne 9
à 11 étapes de dilution.
10.2 Dosage de la vitellogénine
10.2.1 Étalonnage
Réaliser un étalonnage en utilisant un échantillon de Vtg de référence purifié. L’échantillon de référence
est utilisé pour établir une courbe d’étalonnage par rapport à laquelle les échantillons inconnus sont
quantifiés. La Vtg est une molécule instable et il convient de préparer et de conserver sur de la glace
toutes les dilutions d’échantillon et d’étalon. Une Vtg reconstituée ne peut pas être congelée et réutilisée
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quantitativement à une date ultérieure. Dans chaque dosage, il convient d’utiliser une série de dilutions
(par exemple 2 ng/ml à 1 000 ng/ml) préparée à partir de l’étalon de Vtg fraîchement reconstitué.
10.2.2 Mode opératoire de dosage 1 – ELISA en sandwich
Les modes opératoires de dosage 1 et 2 décrits reflètent les principes généraux de la méthode ELISA. Selon
les espèces et l’origine des anticorps ou des étalons utilisés, les conditions expérimentales peuvent varier,
notamment le temps d’incubation, la composition du tampon et la dilution des échantillons et de l’étalon.
Dans la technique ELISA en sandwich, les puits des microplaques sont préalablement recouverts d’un
anticorps de capture spécifique qui se lie à la Vtg contenue dans l’étalon et les échantillons introduits
dans les puits. Un anticorps de détection différent et spécifique de la Vtg est ajouté pour créer un
sandwich de Vtg et d’anticorps. La réalisation de l’ensemble du mode opératoire prend 2 jours.
Ce mode opératoire ne s’applique pas aux kits. Si des kits disponibles dans le commerce sont utilisés,
suivre les instructions du fabriquant.
10.2.2.1 Pré-enduction des plaques absorbantes
A moins que des plaques pré-enduites d’un anticorps anti-Vtg approprié ne soient vendues par un
fournisseur, une pré-enduction doit être effectuée avant le jour du dosage.
Diluer l’anticorps de capture dans un tampon de revêtement à 10 µg/ml (12 ml requis par plaque).
Introduire 100 µl de cette solution dans tous les puits de toutes les plaques devant être utilisées.
Recouvrir les plaques d’un film d’étanchéité pour microplaques afin d’empêcher l’évaporation et laisser
incuber à 4 °C pendant une nuit.
Après la nuit d’incubation, laver les puits trois fois avec 200 µl de tampon de lavage par puits.
Bloquer les sites de liaison non spécifiques en introduisant 200 µl de tampon de dilution dans chaque
puits et laisser reposer pendant 1 h à 4 °C.
Vider les puits et retourner la plaque sur un papier absorbant.
10.2.2.2 Incubation avec les échantillons d’étalon et les échantillons dilués
Lorsque plusieurs plaques sont utilisées dans le dosage, ajouter des dilutions d’étalon et des dilutions
d’échantillons sur une plaque avant de passer à la plaque suivante.
Voir le schéma de plaque proposé à la Figure 1.
Introduire 100 µl de tampon de dilution dans chacun des deux puits de liaison non spécifique (NSB).
Il convient d’inclure des puits NSB dans chaque plaque. Ces puits servent à déterminer la liaison non
spécifique (signal de fond non spécifique).
Ajouter en double 100 µl de chaque dilution d’étalon de Vtg (S1 à S11).
Ajouter en double 100 µl de chaque dilution d’échantillon (P1 à P36).
Sceller les plaques et laisser incuber à une température ambiante de 20 °C à 25 °C pendant 1,5 h.
Lorsque plusieurs plaques sont utilisées, veiller à respecter le même temps d’incubation car l’ajout des
étalons et des échantillons prend souvent plusieurs minutes. En cas de différence de temps significative
entre les plaques, elles peuvent être synchronisées à ce stade: après 1,5 h d’incubation, laver la plaque
(étape 8 ci-dessous), la sceller et la laisser reposer à température ambiante jusqu’à ce que toutes les
plaques aient été lavées. Procéder ensuite à l’addition d’anticorps de détection.
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Légende
NSB puits de liaison non spécifique S1 à S11 étalons 1 à 11 P1 à P36 échantillons
Figure 1 — Schéma de plaque recommandé pour un protocole ELISA en sandwich
10.2.2.3 Incubation avec l’anticorps de détection
Diluer l’anticorps de détection au niveau de dilution approprié dans 12 ml de tampon de dilution pour
chaque plaque devant être utilisée pour le dosage.
Laver les plaques trois fois avec 300 µl de tampon de lavage par puits.
Introduire 100 µl de l’anticorps de détection dilué dans tous les puits.
Sceller les plaques et laisser incuber à une température ambiante de 20 °C à 25 °C pendant 0,5 h.
10.2.2.4 Révélation
Laver les plaques cinq fois avec 300 µl de tampon de lavage par puits.
Introduire 100 µl de solution de substrat TMB à température ambiante dans tous les puits (la TMB étant
photosensible, il convient donc de la conserver à l’abri de la lumière après sa préparation).
Laisser incuber à l’abri de la lumière (couvrir les plaques, par exemp
...
Questions, Comments and Discussion
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