SIST ISO 10710:2011
Water quality - Growth inhibition test with the marine and brackish water macroalga Ceramium tenuicorne
Water quality - Growth inhibition test with the marine and brackish water macroalga Ceramium tenuicorne
This International Standard specifies a method for the determination of the inhibition of growth of the macroalga Ceramium tenuicorne by substances and mixtures contained in seawater or by waste water with salinities between 4S and 32S. This method is applicable to substances that are easily soluble in water.
NOTE With modifications as described in ISO 14442[4] and ISO 5667-16[2], the inhibitory effects of poorly soluble organic and inorganic materials, volatile compounds, metals, waste water, marine water samples, and elutriates of sediments can be tested.
Qualité de l'eau - Essai d'inhibition de croissance sur la macro algue d'eaux marine et saumâtre Ceramium tenuicorne
L'ISO 10710:2010 sp�cifie une m�thode de d�termination de l'inhibition de la croissance de la macro algue Ceramium tenuicorne par des substances et des m�langes contenus dans l'eau de mer ou par des eaux us�es dont les salinit�s sont comprises entre 4S et 32S. Cette m�thode est applicable � des substances qui sont facilement hydrosolubles.
Kakovost vode - Preskus zaviranja rasti z morsko in brakično makroalgo Ceramium tenuicorne
Ta mednarodni standard opredeljuje metodo določevanja zaviranja rasti makroalge Ceranium teunicorne s snovmi in zmesmi, vsebovanimi v morski vodi, ali z odpadno vodo s slanostjo med 4S in 32S. Ta metoda velja za snovi, ki so zlahka topne v vodi.
OPOMBA: S spremembami, kot so opisane v ISO 14442[4] in ISO 5667-16[2], se lahko preskušajo zaviralni učinki slabo topnih organskih in anorganskih materialov, hlapnih spojin, kovin, odpadne vode, vzorcev morskih voda in elutriatov in sedimentov.
General Information
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10710
First edition
2010-06-15
Water quality — Growth inhibition test
with the marine and brackish water
macroalga Ceramium tenuicorne
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de croissance sur la macro algue
d'eaux marine et saumâtre Ceramium tenuicorne
Reference number
ISO 10710:2010(E)
©
ISO 2010
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ISO 10710:2010(E)
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electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
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ISO 10710:2010(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction.v
1 Scope.1
2 Terms and definitions .1
3 Principle.2
4 Test organisms, nutrients, media, and materials.2
5 Cultivation.6
6 Apparatus.6
7 Procedure.7
7.1 Algae material.7
7.2 Preparation of dilution water.8
7.3 Choice of test concentrations.8
7.4 Start of test.9
7.5 Incubation.9
7.6 Measurement.9
7.7 Test with reference substances.9
8 Validity criteria.9
9 Evaluation of results .10
9.1 Calculations.10
9.2 Determination of E C .10
r x
9.3 Expression of results.10
9.4 Interpretation of results .11
10 Reproducibility .11
11 Test report.11
Annex A (informative) Growth pattern of Ceramium tenuicorne in 7S and 20S.13
Annex B (informative) Results of ring test with Ceramium tenuicorne at 20 S.16
Bibliography.17
© ISO 2010 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 10710:2010(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 10710 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological
methods.
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ISO 10710:2010(E)
Introduction
The red macroalga Ceramium tenuicorne belongs to Ceramiaceae, Rhodophyta. The species can be used as
a model organism for the near coastal ecosystem. This species is found in temperate marine waters in both
the northern and southern hemispheres and is thus relevant for large areas. As primary producers, they are a
food source for many invertebrates and serve as living habitat for bacteria, invertebrates, and juvenile fish.
They also serve as substrate for many oviparous fish species.
© ISO 2010 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10710:2010(E)
Water quality — Growth inhibition test with the marine and
brackish water macroalga Ceramium tenuicorne
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health
practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard
be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the inhibition of growth of the
macroalga Ceramium tenuicorne by substances and mixtures contained in seawater or by waste water with
salinities between 4S and 32S. This method is applicable to substances that are easily soluble in water.
[4] [2]
NOTE With modifications as described in ISO 14442 and ISO 5667-16 , the inhibitory effects of poorly soluble
organic and inorganic materials, volatile compounds, metals, waste water, marine water samples, and elutriates of
sediments can be tested.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
algal length
length from the first division to the most distant tip of the plant
NOTE The algal length is expressed in millimetres.
See Figure 1.
2.2
control medium
combination of dilution water and/or nutrient medium used in the test
[5]
[ISO 20079:2005 , 3.6]
2.3
control batch
control medium including organisms used for testing
[5]
[ISO 20079:2005 , 3.5]
2.4
effective concentration
E C
r x
concentration of test sample at which an effect of x % is measured, if compared to the control
[5]
[ISO 20079:2005 , 3.9]
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ISO 10710:2010(E)
2.5
growth medium
mixture of natural seawater and nutrients in which algal plants are cultivated, which is used for pre-cultures
[3]
NOTE Adapted from ISO 8692:2004 , 3.3.
2.6
growth rate
µ
〈water quality〉 proportional rate of increase in algal length per day
NOTE See Clause 9.
2.7
salinity
practical salinity
S
〈seawater〉 ratio K of the electrical conductivity of the seawater sample, at the temperature of 15 °C and a
15
pressure of one standard atmosphere, to that of a potassium chloride solutions in which the mass fraction of
−3
KCl is 32,435 6 × 10 , at the same temperature and pressure
NOTE Adapted from Reference [14], p. 12.
2.8
test medium
mixture of seawater, nutrients and test sample
[3]
NOTE Adapted from ISO 8692:2004 , 3.5.
2.9
test sample
〈water quality〉 aqueous sample, e.g. chemical substance, mixture of chemicals or waste water, for which the
inhibitory effects on the growth of algae are determined
[3]
NOTE Adapted from ISO 8692:2004 , 3.4.
3 Principle
Algal tips from monocultures of ceramium female gametophytes are grown in defined test conditions and in a
defined medium containing a range of concentrations of the test sample. The test solutions are incubated for a
period of 7 d after which the increase in length is measured and the growth rate is calculated. The growth
inhibition is determined as a reduction in growth rate, relative to control cultures grown under identical
conditions.
When toxicity of samples is to be compared to the toxicity of other chemicals or waste waters, tests can be
performed in artificial seawater. If the purpose of the testing is to assess and to predict effects in a specific
receiving water body, the tests can be conducted with algae adapted to the salinity in the receiving water body.
In this case, natural seawater from an uncontaminated site of the same properties is used.
4 Test organisms, nutrients, media, and materials
Unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and distilled or demineralized water
or water of equivalent purity.
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ISO 10710:2010(E)
4.1 Test organisms
Use either of the following marine algal clones:
a) Ceramium tenuicorne Kützing Waern (7S clone originating from the Baltic Sea);
b) C. tenuicorne Kützing Waern (20S and 30S clone originating from the Oslo fjord).
This alga is a widely distributed macroalgae species (phylum Rhodophyta) in estuarine and coastal areas. The
1)
strains recommended are available in unialgal, non-axenic cultures .
NOTE 1 This growth inhibition test is based on two clones, which were formerly regarded as two different species.
These species were the marine Ceramium strictum Harvey sensu Kylin and the brackish water species C. tenuicorne
Kützing Waern. Complete interfertility (References [11][12]) and DNA data (Reference [10]) have shown that the two
entities belong to the same species, with C. tenuicorne as the valid name. The marine clone (former C. strictum) used in
this test was isolated in 1973 and originates from the Oslo fjord (20S to 25S). It has been maintained as a laboratory
culture for over 30 years. The brackish water clone was isolated in 1995 and originates from the Baltic Sea, 20 km south
of the Askö laboratory in northern Baltic proper (6S to 7S). Cultures can be maintained in the medium specified in Clause 5.
Regular subculturing is necessary.
NOTE 2 Among the red algae, changes occur between haploid and diploid generations. In the growth inhibition test,
the female gametophytic generation is used since it has an even dichotomous growth pattern and the fastest growth rate.
In nature it is difficult to distinguish between male and female plants. This can be done in the laboratory where
spermatangia are found on the branches of the male plants and trichogynes can be seen on the tips of the claws on the
female plants.
NOTE 3 The Baltic Sea clone can be adapted and used in tests in salinities between 4S and 12S. The marine clone can
be used as test organism in salinities between 12S and 32S.
4.2 Natural and artificial seawater
4.2.1 General
Natural seawater is used for the cultivation of the algae and either natural or artificial seawater should be used
for testing. The type of seawater to be used depends on the objective of the test. When natural seawater is
used, care shall be taken to ensure that it is not polluted. Take special care to avoid contamination of the
water by inorganic or organic substances during preparation and storage. Equipment made of copper shall not
be used.
4.2.2 Artificial seawater
Prepare the stock solutions for artificial seawater according to Table 1.
Start with about one third of the desired volume of water, add the weighed quantities of chemicals in
accordance with Table 1 and make up to volume with water.
This stock solution with a salinity of 100S (equivalent to 10 % mass per volume) has a durability of at least six
months, if stored in darkness at room temperature. Before use, the stock solution should be diluted with water
to the desired salinity. Adjust the pH to 8,0 ± 0,2 with 1 mol/l HCl or 1 mol/l NaOH.
The artificial seawater shall be sterilized by autoclaving or sterile filtration (pore size, 0,2 µm) before use.
Re-check the pH after sterilization, and adjust if necessary to 8,0 ± 0,2 with 1 mol/l HCl or 1 mol/l NaOH,
before use.
1) Suitable suppliers are: a) ITM, Department of Applied Environmental Research of Science, Stockholm University,
S-106 91 Stockholm, Sweden; b) University of Oslo, Department of Biology, P.O. Box 1066 Blindern, N-0316 Oslo,
Norway. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement
by ISO of these suppliers.
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ISO 10710:2010(E)
Table 1 — Artificial seawater with a salinity of 10 % mass per volume or 100S
(adapted from Reference [13])
Quantity per 1 l medium Quantity per 5 l medium Quantity per 10 l medium
Substance
g/l g/5 l g/10 l
NaCl 70,1 351 702
Na SO 11,7 58,7 117
2 4
KCl 2,03 10,2 20,3
KBr 0,293 1,47 2,93
Na B O ⋅10H O 0,113 0,567 1,13
2 4 7 2
MgCl ⋅6H O 31,7 158 317
2 2
6,6 33 66
CaCl ⋅6H O
2 2
0,066 0,334 0,668
SrCl ⋅6H O
2 2
4.2.3 Natural seawater
Natural seawater shall be collected from an uncontaminated site. Filter to remove larger particles. Dilute as
necessary with water. Salinity should be increased by addition of natural seawater of a higher salinity or with
artificial seawater (see Table 1). Check the pH and adjust if necessary to 8,0 ± 0,2 with 1 mol/l HCl or
1 mol/l NaOH.
The natural seawater shall be sterilized by autoclaving or sterile filtration (pore size, 0,2 µm) before use.
Re-check the pH after sterilization, and adjust if necessary to 8,0 ± 0,2 with 1 mol/l HCl or 1 mol/l NaOH,
before use.
NOTE 1 A paper filter of around 30 µm mesh size is sufficient.
NOTE 2 Natural seawater can be stored frozen at temperatures below −18 °C for several years before use.
4.3 Nutrients
Prepare the six nutrient solutions in water, with the compositions given in Table 2.
Solutions 1, 2, 3, 4 and 6 in Table 2 are prepared in 100 ml one-mark volumetric flasks (6.14). A 1 l one-mark
volumetric flask (6.14) is recommended for the preparation of stock solution 5, due to the low masses of the
trace element reagents. Precipitation in the trace element solution is avoided by adjustment with NaOH to
pH 8. The trace element stock solution (solution 5) shall be diluted 10 times before use in the cultivation media
(see Table 3). After this dilution, a freshly prepared iron solution 3 may be added to trace element solution 5 to
increase the durability of the iron.
The iron solution shall not be older than one month.
These stock solutions will eventually be diluted according to Table 3 to obtain the final nutrient concentrations
in the growth and test media. The final concentrations in the media are given in the two rightmost columns of
Table 2.
4.4 Media
Additions of stock solutions to salt water for preparation of media are shown in Table 3. For cultivation, testing
in natural seawater, and testing in artificial seawater, additions shall be made in accordance with columns A, B,
and C, respectively.
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ISO 10710:2010(E)
Table 2 — Nutrient stock solutions (adapted from Reference [9])
Levels in the medium after additions
according to Table 3 as
Compound mass
Reagent
elemental mass elemental amount of
concentration
concentration substance concentration
µg/l µmol/l
1 — Nitrogen solution
KNO 5 000 mg/100 ml 3 462 (N) 247 (N)
3
2 — Phosphorus solution
KH PO 680 mg/100 ml 775 (P) 25 (P)
2 4
3 — Iron solution
FeCl ·6H O
100 mg/100 ml 103 (Fe) 1,9 (Fe)
3 2
4 — Carbon solution
NaHCO 5 760 mg/100 ml 16 480 (C) 1 370 (C)
3
5 — Trace element solution
Na EDTA 6 000 mg/l
2
MnSO ⋅H O 620 mg/l 10 (Mn) 0,18 (Mn)
4 2
250 mg/l 2,84 (Zn) 0,043 (Zn)
ZnSO ⋅7H O
4 2
Na MoO ⋅2H O 130 mg/l 2,58 (Mo) 0,027 (Mo)
2 4 2
CoSO ⋅7H O 4 mg/l 0,042 (Co) 0,000 7 (Co)
4 2
4 mg/l 0,05 (Cu) 0,000 8 (Cu)
CuSO ⋅5H O
4 2
6 — Vitamins
Thiamine (B ) 10 mg/100 ml 50
1
Cyanocobalamin (B ) 0,1 mg/100 ml 0,5
12
Biotin 0,1 mg/100 ml 0,5
Table 3 — Additions of stock nutrient solutions to seawater
for preparation of growth and test medium
A B C
Growth medium Test medium Test medium
Stock solutions
in natural seawater in natural seawater in artificial seawater
for cultivation
ml/l ml/l ml/l
1 — Nitrogen solution 0,5 0,5 0,5
2 — Phosphorus solution 0,5 0,5 0,5
3 — Iron solution 0,5 0,5 0,5
4 — Carbon solution — — 2
5 — Trace element
0,5 — —
solution diluted 10 times
6 — Vitamin solution 0,5 — —
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ISO 10710:2010(E)
Preparation of 1 l of growth medium or test medium is shown in Table 3. For the cultivation of stock cultures,
sterile natural seawater shall be used. For the growth inhibition test, either sterile artificial or natural seawater
may be used depending on the objective (see Clause 4).
5 Cultivation
Stock cultures of female gametophytes of C. tenuicorne are cultivated in natural seawater (see 4.2.3) where
nutrients have been added according to Table 3, column A. The brackish water clone is cultivated at a salinity
of 7S and the marine clone (former C. strictum) at salinities of 20S and 30S.
The maintenance of the cultures is facilitated by working under aseptical conditions. C. tenuicorne should be
grown in sterile plastic or glass Petri dishes (e.g. 90 mm diameter, 15 mm height). The algae are cultured at
−2 −1 −2 −1
22 °C ± 2 °C, at a light intensity of 35 µmol m s ± 7 µmol m s and a light regime of 14 h light and 10 h
darkness. These conditions can be achieved on a laboratory bench with an ordinary time-regulated lamp at
about 350 mm distance.
To maintain actively growing female gametophytes, plants have to be transferred to fresh medium each week.
The procedure is to fill sterile Petri dishes with approximately 25 ml sterile culture medium accordin
...
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.RDOJRQualité de l'eau - Essai d'inhibition de croissance sur la macro algue d'eaux marine et saumâtre Ceramium tenuicorneWater quality - Growth inhibition test with the marine and brackish water macroalga Ceramium tenuicorne13.060.70Preiskava bioloških lastnosti vodeExamination of biological properties of waterICS:Ta slovenski standard je istoveten z:ISO 10710:2010SIST ISO 10710:2011en01-junij-2011SIST ISO 10710:2011SLOVENSKI
STANDARD
SIST ISO 10710:2011
Reference numberISO 10710:2010(E)© ISO 2010
INTERNATIONAL STANDARD ISO10710First edition2010-06-15Water quality — Growth inhibition test with the marine and brackish water macroalga Ceramium tenuicorne Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de croissance sur la macro algue d'eaux marine et saumâtre Ceramium tenuicorne
SIST ISO 10710:2011
ISO 10710:2010(E) PDF disclaimer This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat accepts no liability in this area. Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated. Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
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SIST ISO 10710:2011
ISO 10710:2010(E) © ISO 2010 – All rights reserved iii Contents Page Foreword.iv Introduction.v 1 Scope.1 2 Terms and definitions.1 3 Principle.2 4 Test organisms, nutrients, media, and materials.2 5 Cultivation.6 6 Apparatus.6 7 Procedure.7 7.1 Algae material.7 7.2 Preparation of dilution water.8 7.3 Choice of test concentrations.8 7.4 Start of test.9 7.5 Incubation.9 7.6 Measurement.9 7.7 Test with reference substances.9 8 Validity criteria.9 9 Evaluation of results.10 9.1 Calculations.10 9.2 Determination of ErCx.10 9.3 Expression of results.10 9.4 Interpretation of results.11 10 Reproducibility.11 11 Test report.11 Annex A (informative)
Growth pattern of Ceramium tenuicorne in 7S and 20S.13 Annex B (informative)
Results of ring test with Ceramium tenuicorne at 20 S.16 Bibliography.17
SIST ISO 10710:2011
ISO 10710:2010(E) iv © ISO 2010 – All rights reserved Foreword ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization. International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2. The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote. Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. ISO 10710 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological methods. SIST ISO 10710:2011
ISO 10710:2010(E) © ISO 2010 – All rights reserved v Introduction The red macroalga Ceramium tenuicorne belongs to Ceramiaceae, Rhodophyta. The species can be used as a model organism for the near coastal ecosystem. This species is found in temperate marine waters in both the northern and southern hemispheres and is thus relevant for large areas. As primary producers, they are a food source for many invertebrates and serve as living habitat for bacteria, invertebrates, and juvenile fish. They also serve as substrate for many oviparous fish species.
SIST ISO 10710:2011
SIST ISO 10710:2011
INTERNATIONAL STANDARD ISO 10710:2010(E) © ISO 2010 – All rights reserved 1 Water quality — Growth inhibition test with the marine and brackish water macroalga Ceramium tenuicorne WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions. IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard be carried out by suitably trained staff. 1 Scope This International Standard specifies a method for the determination of the inhibition of growth of the macroalga Ceramium tenuicorne by substances and mixtures contained in seawater or by waste water with salinities between 4S and 32S. This method is applicable to substances that are easily soluble in water. NOTE With modifications as described in ISO 14442[4] and ISO 5667-16[2], the inhibitory effects of poorly soluble organic and inorganic materials, volatile compounds, metals, waste water, marine water samples, and elutriates of sediments can be tested. 2 Terms and definitions For the purposes of this document, the following terms and definitions apply. 2.1 algal length length from the first division to the most distant tip of the plant NOTE The algal length is expressed in millimetres. See Figure 1. 2.2 control medium combination of dilution water and/or nutrient medium used in the test [ISO 20079:2005[5], 3.6] 2.3 control batch control medium including organisms used for testing [ISO 20079:2005[5], 3.5] 2.4 effective concentration ErCx concentration of test sample at which an effect of x % is measured, if compared to the control [ISO 20079:2005[5], 3.9] SIST ISO 10710:2011
ISO 10710:2010(E) 2 © ISO 2010 – All rights reserved 2.5 growth medium mixture of natural seawater and nutrients in which algal plants are cultivated, which is used for pre-cultures NOTE Adapted from ISO 8692:2004[3], 3.3. 2.6 growth rate µ 〈water quality〉 proportional rate of increase in algal length per day NOTE See Clause 9. 2.7 salinity practical salinity S 〈seawater〉 ratio K15 of the electrical conductivity of the seawater sample, at the temperature of 15 °C and a pressure of one standard atmosphere, to that of a potassium chloride solutions in which the mass fraction of KCl is 32,435 6 × 10−3, at the same temperature and pressure NOTE Adapted from Reference [14], p. 12. 2.8 test medium mixture of seawater, nutrients and test sample NOTE Adapted from ISO 8692:2004[3], 3.5. 2.9 test sample 〈water quality〉 aqueous sample, e.g. chemical substance, mixture of chemicals or waste water, for which the inhibitory effects on the growth of algae are determined NOTE Adapted from ISO 8692:2004[3], 3.4. 3 Principle Algal tips from monocultures of ceramium female gametophytes are grown in defined test conditions and in a defined medium containing a range of concentrations of the test sample. The test solutions are incubated for a period of 7 d after which the increase in length is measured and the growth rate is calculated. The growth inhibition is determined as a reduction in growth rate, relative to control cultures grown under identical conditions. When toxicity of samples is to be compared to the toxicity of other chemicals or waste waters, tests can be performed in artificial seawater. If the purpose of the testing is to assess and to predict effects in a specific receiving water body, the tests can be conducted with algae adapted to the salinity in the receiving water body. In this case, natural seawater from an uncontaminated site of the same properties is used. 4 Test organisms, nutrients, media, and materials Unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and distilled or demineralized water or water of equivalent purity. SIST ISO 10710:2011
ISO 10710:2010(E) © ISO 2010 – All rights reserved 3 4.1 Test organisms Use either of the following marine algal clones: a) Ceramium tenuicorne Kützing Waern (7S clone originating from the Baltic Sea); b) C. tenuicorne Kützing Waern (20S and 30S clone originating from the Oslo fjord). This alga is a widely distributed macroalgae species (phylum Rhodophyta) in estuarine and coastal areas. The strains recommended are available in unialgal, non-axenic cultures1). NOTE 1 This growth inhibition test is based on two clones, which were formerly regarded as two different species. These species were the marine Ceramium strictum Harvey sensu Kylin and the brackish water species C. tenuicorne Kützing Waern. Complete interfertility (References [11][12]) and DNA data (Reference [10]) have shown that the two entities belong to the same species, with C. tenuicorne as the valid name. The marine clone (former C. strictum) used in this test was isolated in 1973 and originates from the Oslo fjord (20S to 25S). It has been maintained as a laboratory culture for over 30 years. The brackish water clone was isolated in 1995 and originates from the Baltic Sea, 20 km south of the Askö laboratory in northern Baltic proper (6S to 7S). Cultures can be maintained in the medium specified in Clause 5. Regular subculturing is necessary. NOTE 2 Among the red algae, changes occur between haploid and diploid generations. In the growth inhibition test, the female gametophytic generation is used since it has an even dichotomous growth pattern and the fastest growth rate. In nature it is difficult to distinguish between male and female plants. This can be done in the laboratory where spermatangia are found on the branches of the male plants and trichogynes can be seen on the tips of the claws on the female plants. NOTE 3 The Baltic Sea clone can be adapted and used in tests in salinities between 4S and 12S. The marine clone can be used as test organism in salinities between 12S and 32S. 4.2 Natural and artificial seawater 4.2.1 General Natural seawater is used for the cultivation of the algae and either natural or artificial seawater should be used for testing. The type of seawater to be used depends on the objective of the test. When natural seawater is used, care shall be taken to ensure that it is not polluted. Take special care to avoid contamination of the water by inorganic or organic substances during preparation and storage. Equipment made of copper shall not be used. 4.2.2 Artificial seawater Prepare the stock solutions for artificial seawater according to Table 1. Start with about one third of the desired volume of water, add the weighed quantities of chemicals in accordance with Table 1 and make up to volume with water. This stock solution with a salinity of 100S (equivalent to 10 % mass per volume) has a durability of at least six months, if stored in darkness at room temperature. Before use, the stock solution should be diluted with water to the desired salinity. Adjust the pH to 8,0 ± 0,2 with 1 mol/l HCl or 1 mol/l NaOH. The artificial seawater shall be sterilized by autoclaving or sterile filtration (pore size, 0,2 µm) before use. Re-check the pH after sterilization, and adjust if necessary to 8,0 ± 0,2 with 1 mol/l HCl or 1 mol/l NaOH, before use.
1) Suitable suppliers are: a) ITM, Department of Applied Environmental Research of Science, Stockholm University, S-106 91 Stockholm, Sweden; b) University of Oslo, Department of Biology, P.O. Box 1066 Blindern, N-0316 Oslo, Norway. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these suppliers. SIST ISO 10710:2011
ISO 10710:2010(E) 4 © ISO 2010 – All rights reserved Table 1 — Artificial seawater with a salinity of 10 % mass per volume or 100S (adapted from Reference [13]) Quantity per 1 l medium Quantity per 5 l medium Quantity per 10 l medium Substance g/l g/5 l g/10 l NaCl 70,1 351 702 Na2SO4 11,7 58,7 117 KCl 2,03 10,2 20,3 KBr 0,293 1,47 2,93 Na2B4O7⋅10H2O 0,113 0,567 1,13 MgCl2⋅6H2O 31,7 158 317 CaCl2⋅6H2O 6,6 33 66 SrCl2⋅6H2O 0,066 0,334 0,668 4.2.3 Natural seawater Natural seawater shall be collected from an uncontaminated site. Filter to remove larger particles. Dilute as necessary with water. Salinity should be increased by addition of natural seawater of a higher salinity or with artificial seawater (see Table 1). Check the pH and adjust if necessary to 8,0 ± 0,2 with 1 mol/l HCl or 1 mol/l NaOH. The natural seawater shall be sterilized by autoclaving or sterile filtration (pore size, 0,2 µm) before use. Re-check the pH after sterilization, and adjust if necessary to 8,0 ± 0,2 with 1 mol/l HCl or 1 mol/l NaOH, before use. NOTE 1 A paper filter of around 30 µm mesh size is sufficient. NOTE 2 Natural seawater can be stored frozen at temperatures below −18 °C for several years before use. 4.3 Nutrients Prepare the six nutrient solutions in water, with the compositions given in Table 2. Solutions 1, 2, 3, 4 and 6 in Table 2 are prepared in 100 ml one-mark volumetric flasks (6.14). A 1 l one-mark volumetric flask (6.14) is recommended for the preparation of stock solution 5, due to the low masses of the trace element reagents. Precipitation in the trace element solution is avoided by adjustment with NaOH to pH 8. The trace element stock solution (solution 5) shall be diluted 10 times before use in the cultivation media (see Table 3). After this dilution, a freshly prepared iron solution 3 may be added to trace element solution 5 to increase the durability of the iron. The iron solution shall not be older than one month. These stock solutions will eventually be diluted according to Table 3 to obtain the final nutrient concentrations in the growth and test media. The final concentrations in the media are given in the two rightmost columns of Table 2. 4.4 Media Additions of stock solutions to salt water for preparation of media are shown in Table 3. For cultivation,
testing in natural seawater, and testing in artificial seawater, additions shall be made in accordance with columns A, B, and C, respectively. SIST ISO 10710:2011
ISO 10710:2010(E) © ISO 2010 – All rights reserved 5 Table 2 — Nutrient stock solutions (adapted from Reference [9]) Levels in the medium after additions according to Table 3 as elemental mass concentration elemental amount of substance concentration Reagent Compound mass concentration µg/l µmol/l 1 — Nitrogen solution KNO3 5 000 mg/100 ml 3 462 (N) 247 (N) 2 — Phosphorus solution KH2PO4 680 mg/100 ml 775 (P) 25 (P) 3 — Iron solution
FeCl3·6H2O 100 mg/100 ml 103 (Fe) 1,9 (Fe) 4 — Carbon solution
NaHCO3 5 760 mg/100 ml 16 480 (C) 1 370 (C) 5 — Trace element solution
Na2EDTA 6 000 mg/l
MnSO4⋅H2O 620 mg/l 10 (Mn) 0,18 (Mn) ZnSO4⋅7H2O 250 mg/l 2,84 (Zn) 0,043 (Zn) Na2MoO4⋅2H2O 130 mg/l 2,58 (Mo) 0,027 (Mo) CoSO4⋅7H2O 4 mg/l 0,042 (Co) 0,000 7 (Co) CuSO4⋅5H2O 4 mg/l 0,05 (Cu) 0,000 8 (Cu) 6 — Vitamins Thiamine (B1) 10 mg/100 ml 50
Cyanocobalamin (B12) 0,1 mg/100 ml 0,5
Biotin 0,1 mg/100 ml 0,5
Table 3 — Additions of stock nutrient solutions to seawater for preparation of growth and test medium A B C Growth medium in natural seawater for cultivation Test medium in natural seawater Test medium in artificial seawater Stock solutions ml/l ml/l ml/l 1 — Nitrogen solution 0,5 0,5 0,5 2 — Phosphorus solution 0,5 0,5 0,5 3 — Iron solution 0,5 0,5 0,5 4 — Carbon solution — — 2 5 — Trace element solution diluted 10 times 0,5 — — 6 — Vitamin solution 0,5 — — SIST ISO 10710:2011
ISO 10710:2010(E) 6 © ISO 2010 – All rights reserved Preparation of 1 l of growth medium or test medium is shown in Table 3. For the cultivation of stock cultures, sterile natural seawater shall be used. For the growth inhibition test, either sterile artificial or natural seawater may be used depending on the objective (see Clause 4). 5 Cultivation Stock cultures of female gametophytes of C. tenuicorne are cultivated in natural seawater (see 4.2.3) where nutrients have been added according to Table 3, column A. The brackish water clone is cultivated at a salinity of 7S and the marine clone (former C. strictum) at salinities of 20S and 30S. The maintenance of the cultures is facilitated by working under aseptical conditions. C. tenuicorne should be grown in sterile plastic or glass Petri dishes (e.g. 90 mm diameter, 15 mm height). The algae are cultured at 22 °C
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10710
Première édition
2010-06-15
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de
croissance sur la macro algue d'eaux
marine et saumâtre Ceramium tenuicorne
Water quality — Growth inhibition test with the marine and brackish
water macroalga Ceramium tenuicorne
Numéro de référence
ISO 10710:2010(F)
©
ISO 2010
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ISO 10710:2010(F)
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Publié en Suisse
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ISO 10710:2010(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction.v
1 Domaine d'application .1
2 Termes et définitions .1
3 Principe.2
4 Organismes d'essai, nutriments, milieux et matériaux .3
4.1 Organismes d'essai.3
4.2 Eau de mer naturelle et artificielle .3
4.3 Nutriments.4
4.4 Milieu.5
5 Culture .6
6 Appareillage .7
7 Mode opératoire.7
7.1 Algues.7
7.2 Préparation de l'eau de dilution.8
7.3 Choix des concentrations d'essai .9
7.4 Démarrage de l'essai.9
7.5 Incubation.9
7.6 Mesurage.10
7.7 Essai avec substances de référence.10
8 Critères de validité .10
9 Évaluation des résultats .10
9.1 Calculs.10
9.2 Détermination de la C E .11
x r
9.3 Expression des résultats.11
9.4 Interprétation des résultats .11
10 Reproductibilité .11
11 Rapport d'essai.12
Annexe A (informative) Modèle de croissance de Ceramium tenuicorne aux salinités 7S et 20S .13
Annexe B (informative) Résultats de l'essai interlaboratoires avec Ceramium tenuicorne à la
salinité 20S .16
Bibliographie.17
© ISO 2010 – Tous droits réservés iii
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ISO 10710:2010(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 10710 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
iv © ISO 2010 – Tous droits réservés
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ISO 10710:2010(F)
Introduction
La macro algue rouge Ceramium tenuicorne appartient aux Ceramiaceae, Rhodophyta. L'espèce peut être
utilisée comme organisme modèle pour l'écosystème côtier. Cette espèce existe dans les eaux marines
tempérées des hémisphères nord et sud et elle est donc représentative de grandes zones. En tant que
producteurs primaires, les macro algues sont une source de nourriture pour de nombreux invertébrés et
servent d'habitat aux bactéries, invertébrés et aux juvéniles de poissons. Elles servent aussi de substrat à de
nombreuses espèces de poissons ovipares.
© ISO 2010 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 10710:2010(F)
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de croissance sur la macro
algue d'eaux marine et saumâtre Ceramium tenuicorne
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n'a pas pour but de traiter
tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l'utilisateur
d'établir des pratiques appropriées en matière d'hygiène et de sécurité, et de s'assurer de la
conformité à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément à la présente Norme
internationale soient exécutés par un personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de l'inhibition de la croissance de la
macro algue Ceramium tenuicorne par des substances et des mélanges contenus dans l'eau de mer ou par
des eaux usées dont les salinités sont comprises entre 4S et 32S. Cette méthode est applicable à des
substances qui sont facilement hydrosolubles.
NOTE Les effets inhibiteurs des matériaux organiques et inorganiques faiblement solubles, des composés volatils,
des métaux, des eaux résiduaires, des échantillons d'eau de mer et des élutriats de sédiments peuvent être soumis à
[4] [2]
essai, avec des modifications telles que celles décrites dans l'ISO 14442 et dans l'ISO 5667-16 .
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
longueur de l'algue
longueur depuis la première division jusqu'au bourgeon le plus distant de l'algue
NOTE La longueur de l'algue est exprimée en millimètres.
Voir Figure 1.
2.2
milieu témoin
combinaison de l'eau de dilution et/ou du milieu nutritif utilisée pour l'essai
[5]
[ISO 20079:2005 , 3.6]
2.3
lot témoin
milieu témoin, incluant les organismes utilisés pour l'essai
[5]
[ISO 20079:2005 , 3.5]
© ISO 2010 – Tous droits réservés 1
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ISO 10710:2010(F)
2.4
concentration effective
C E
x r
concentration de l'échantillon pour essai à laquelle un effet de x % est mesuré par rapport au témoin
[5]
[ISO 20079:2005 , 3.9]
2.5
milieu de croissance
mélange d'eau de mer naturelle et de nutriments utilisé pour les précultures des algues, dans lequel les
cellules algales sont incubées
[3]
NOTE Adapté de l'ISO 8692:2004 , 3.3.
2.6
taux de croissance
µ
〈qualité de l'eau〉 taux proportionnel de croissance en longueur de l'algue par jour
NOTE Voir l'Article 9.
2.7
salinité
salinité pratique
S
〈eau de mer〉 rapport K entre la conductivité électrique de l'échantillon d'eau de mer à la température de
15
15 °C et sous une pression d'une atmosphère normale et celle d'une solution de chlorure de potassium dont
−3
la fraction massique de KCl est de 32,435 6 × 10 , à la même température et à la même pression
NOTE Adapté de la Référence [14], p. 28.
2.8
milieu d'essai
mélange d'eau de mer, de nutriments et d'échantillon pour essai
[3]
NOTE Adapté de l'ISO 8692:2004 , 3.5.
2.9
échantillon pour essai
〈qualité de l'eau〉 échantillon aqueux, par exemple substance chimique, mélange de produits chimiques ou
eaux résiduaires, pour lequel les effets inhibiteurs sur la croissance des algues doivent être déterminés
[3]
NOTE Adapté de l'ISO 8692:2004 , 3.4.
3 Principe
Les bourgeons d'algues provenant de monocultures de gamétophytes femelles de Ceramium sont cultivés
dans des conditions d'essai définies et dans un milieu défini contenant une plage de concentrations de
l'échantillon pour essai. Les solutions d'essai sont incubées pendant une période de sept jours après laquelle
l'augmentation de longueur est mesurée et le taux de croissance calculé. L'inhibition de la croissance est
déterminée comme une réduction du taux de croissance par rapport aux cultures témoin cultivées dans des
conditions identiques.
Lorsque la toxicité des échantillons est comparée à celle d'autres produits chimiques ou d'eaux usées, les
essais peuvent être réalisés dans de l'eau de mer artificielle. Si l'essai est destiné à évaluer et à prédire les
effets pour une masse d'eau réceptrice spécifique, les essais peuvent être effectués avec une algue adaptée
à la salinité de la masse d'eau réceptrice. Dans ce cas, de l'eau de mer naturelle provenant d'un site non
contaminé ayant les mêmes propriétés est utilisée.
2 © ISO 2010 – Tous droits réservés
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ISO 10710:2010(F)
4 Organismes d'essai, nutriments, milieux et matériaux
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distillée
ou déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.
4.1 Organismes d'essai
Utiliser l'un des clones d'algues marines suivants:
a) Ceramium tenuicorne Kützing Waern (clone 7S originaire de la mer Baltique);
b) C. tenuicorne Kützing Waern (clone 20S et 30S originaire du fjord d'Oslo).
Ces algues sont des espèces de macro algues largement distribuées (phylum Rhodophyta) dans les zones
estuariennes et côtières. Les souches recommandées sont disponibles en cultures unialgales, non
1)
axéniques .
NOTE 1 Cet essai d'inhibition de croissance est fondé sur deux clones, considérés auparavant comme deux espèces
différentes. Ces espèces étaient la Ceramium strictum Harvey sensu Kylin et l'espèce d'eau saumâtre C. tenuicorne
Kützing Waern. Les données complètes sur le croisement (Références [11] et [12]) et l'ADN (Référence [10]) ont montré
que les deux entités appartiennent à la même espèce, avec C. tenuicorne comme nom valide. Le clone marin
(anciennement C. strictum) utilisé dans cet essai a été isolé en 1973 et est originaire du fjord d'Oslo (salinité 20S à 25S). Il
est maintenu en culture au laboratoire depuis plus de 30 ans. Le clone d'eau saumâtre a été isolé en 1995 et est originaire
de la mer Baltique, à 20 km au sud du laboratoire Äsko dans le nord de la Baltique proprement dite (salinité de 6S à 7S).
Les cultures peuvent être maintenues dans le milieu spécifié à l'Article 5. Un repiquage régulier est nécessaire.
NOTE 2 Parmi les algues rouges, des changements se produisent entre les générations haploïdes et diploïdes. Dans
l'essai d'inhibition de croissance, la génération gamétophyte femelle est utilisée puisqu'elle a un type de croissance
dichotomique régulier et le taux de croissance le plus rapide. Dans la nature, il est difficile de faire la distinction entre les
plants mâles et femelles. Cela peut être fait au laboratoire où les spermatanges sont trouvés sur les branches des thalles
mâles et les trichogynes peuvent être observés sur les extrémités des griffes des thalles femelles.
NOTE 3 Le clone originaire de la mer Baltique peut être adapté et utilisé dans les essais à des salinités comprises
entre 4S et 12S. Le clone marin peut être utilisé comme organisme d'essai à des salinités comprises entre 12S et 32S.
4.2 Eau de mer naturelle et artificielle
4.2.1 Généralités
L'eau de mer naturelle est utilisée pour la culture de l'algue et il convient d'employer soit de l'eau de mer
naturelle soit de l'eau de mer artificielle pour l'essai. Le type d'eau de mer à utiliser dépend des objectifs de
l'essai. Lorsque de l'eau de mer naturelle est utilisée, il faut veiller à ce qu'elle ne soit pas polluée. Il faut
veiller en particulier à éviter la contamination de l'eau par des substances organiques ou inorganiques
pendant la préparation et le stockage. Les équipements en cuivre ne doivent pas être utilisés.
4.2.2 Eau de mer artificielle
Préparer les solutions mères pour l'eau de mer artificielle conformément au Tableau 1.
Démarrer avec environ un tiers du volume d'eau désiré, ajouter les produits chimiques pesés en quantité
requise conformément au Tableau 1 et compléter au volume avec de l'eau.
1) Des fournisseurs appropriés sont: a) ITM, Department of Applied Environmental Research of Science, Stockholm
University, S-106 91 Stockholm, Suède; b) University of Oslo, Department of Biology, P.O. Box 1066 Blindern, N-0316
Oslo, Norvège. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie
nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des fournisseurs ainsi désignés.
© ISO 2010 – Tous droits réservés 3
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ISO 10710:2010(F)
Cette solution mère d’une salinité de 100S (équivalant à 10 % en masse par volume) est stable pendant au
moins six mois si elle est stockée à l'abri de la lumière à température ambiante. Avant utilisation, il convient
de diluer la solution mère avec de l'eau jusqu'à la salinité désirée. Ajuster le pH à 8,0 ± 0,2 avec une solution
de HCl à 1 mol/l ou de NaOH à 1 mol/l.
L'eau de mer artificielle doit être stérilisée en autoclave ou par filtration stérile (porosité de 0,2 µm) avant
utilisation. Procéder à une seconde vérification du pH après stérilisation, puis l'ajuster si nécessaire avant
utilisation au pH 8,0 ± 0,2 avec une solution de HCl à 1 mol/l ou de NaOH à 1 mol/l.
Tableau 1 — Eau de mer artificielle avec une salinité de 10 % en masse par volume ou 100S
(adapté d'après la Référence [13])
Quantité pour 1 l de milieu Quantité pour 5 l de milieu Quantité pour 10 l de milieu
Substance
g/l g/5 l g/10 l
NaCl 70,1 351 702
Na SO 11,7 58,7 117
2 4
KCl 2,03 10,2 20,3
KBr 0,293 1,47 2,93
Na B O , 10H O
0,113 0,567 1,13
2 4 7 2
MgCl , 6H O 31,7 158 317
2 2
CaCl , 6H O 6,6 33 66
2 2
SrCl , 6H O
0,066 0,334 0,668
2 2
4.2.3 Eau de mer naturelle
L'eau de mer naturelle doit provenir d'un site non contaminé. Filtrer pour retirer les particules plus grandes. Si
nécessaire, diluer avec de l'eau. Il convient d'augmenter la salinité avec de l'eau de mer naturelle d'une
salinité plus élevée ou avec de l'eau de mer artificielle (voir Tableau 1). Vérifier le pH et l'ajuster si nécessaire
à 8,0 ± 0,2 avec une solution de HCl à 1 mol/l ou de NaOH à 1 mol/l.
L'eau de mer naturelle doit être stérilisée en autoclave ou par filtration stérile (porosité de 0,2 µm) avant
utilisation. Procéder à une seconde vérification du pH après stérilisation, puis l'ajuster si nécessaire avant
utilisation au pH 8,0 ± 0,2 avec une solution de HCl à 1 mol/l ou de NaOH à 1 mol/l.
NOTE 1 Un filtre en papier d'une porosité d'environ 30 µm est suffisant.
NOTE 2 L'eau de mer naturelle peut être stockée congelée à des températures inférieures à −18 °C pendant plusieurs
années avant emploi.
4.3 Nutriments
Préparer les six solutions de nutriments dans de l'eau, selon les compositions données dans le Tableau 2.
Les solutions 1, 2, 3, 4 et 6 dans le Tableau 2 sont préparées dans des fioles jaugées à un trait (6.14) de
100 ml. Il est recommandé de préparer la solution mère 5 dans une fiole jaugée à un trait (6.14) de 1 l en
raison des faibles masses des éléments à l'état de trace. La précipitation dans la solution des éléments à
l'état de trace est évitée par ajustement au pH 8 avec du NaOH. La solution mère d'éléments à l'état de trace
(solution 5) doit être diluée 10 fois avant utilisation dans le milieu de culture (voir Tableau 3). Après dilution,
une solution 3 de fer fraîchement préparée peut être ajoutée à la solution 5 d'éléments à l'état de trace pour
augmenter la stabilité du fer.
La solution de fer ne doit pas avoir plus d'un mois.
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Ces solutions mères sont enfin diluées conformément au Tableau 3 pour obtenir les concentrations finales de
nutriments dans les milieux de culture et d'essai. Les concentrations finales dans le milieu sont données dans
les deux dernières colonnes du Tableau 2.
4.4 Milieu
Les ajouts de solutions mères à l'eau salée pour la préparation du milieu sont présentés dans le Tableau 3.
Pour la culture, pour les essais dans l'eau de mer naturelle et pour les essais dans l'eau de mer artificielle, les
ajouts doivent être réalisés conformément aux colonnes A, B et C, respectivement.
Tableau 2 — Solutions mères de nutriments (adapté d'après la Référence [9])
Teneurs dans le milieu après ajouts
conformément au Tableau 3
Concentration
concentration concentration en
Réactif
massique du composé
massique de l'élément quantité de matière de
l'élément
µg/l µmol/l
1 — Solution d'azote
KNO 5 000 mg/100 ml 3 462 (N) 247 (N)
3
2 — Solution de phosphore
KH PO 680 mg/100 ml 775 (P) 25 (P)
2 4
3 — Solution de fer
FeCl , 6H O
100 mg/100 ml 103 (Fe) 1,9 (Fe)
3 2
4 — Solution de carbone
NaHCO 5 760 mg/100 ml 16 480 (C) 1 370 (C)
3
5 — Solution d'éléments à l'état de trace
Na EDTA
6 000 mg/l
2
MnSO , H O 620 mg/l 10 (Mn) 0,18 (Mn)
4 2
ZnSO , 7H O 250 mg/l 2,84 (Zn) 0,043 (Zn)
4 2
Na MoO , 2H O 130 mg/l 2,58 (Mo) 0,027 (Mo)
2 4 2
CoSO , 7H O 4 mg/l 0,042 (Co) 0,000 7 (Co)
4 2
CuSO , 5H O 4 mg/l 0,05 (Cu) 0,000 8 (Cu)
4 2
6 — Solution de vitamines
Thiamine (B1) 10 mg/100 ml 50
Cyanocobalamine (B12) 0,1 mg/100 ml 0,5
Biotine 0,1 mg/100 ml 0,5
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Tableau 3 — Ajout de solutions mères de nutriments à l'eau de mer
pour la préparation des milieux de culture et d'essai
A B C
Milieu de culture dans Milieu d'essai dans Milieu d'essai dans
Solutions mères
l'eau de mer naturelle l'eau de mer naturelle l'eau de mer artificielle
ml/l ml/l ml/l
1 — Solution d'azote 0,5 0,5 0,5
2 — Solution de phosphore 0,5 0,5 0,5
3 — Solution de fer 0,5 0,5 0,5
4 — Solution de carbone — — 2
5 — Solution d'éléments à l'état
0,5 — —
de trace diluée 10 fois
6 — Solution de vitamines 0,5 — —
La préparation de 1 l de milieu de culture ou de solution d'essai est indiquée dans le Tableau 3. Pour la
culture des cultures mères, l'eau de mer naturelle stérile doit être utilisée. Pour l'essai d'inhibition de
croissance, l'eau de mer artificielle stérile ou l'eau de mer naturelle stérile peut être utilisée selon l'objectif
recherché (voir Article 4).
5 Culture
Les cultures mères de gamétophytes femelles de C. tenuicorne sont réalisées en eau de mer naturelle
(voir 4.2.3) où des nutriments ont été ajoutés conformément au Tableau 3, colonne A. Le clone d'eau
saumâtre est cultivé à la salinité 7S et le clone marin (anciennement C. strictum) aux salinités 20S et 30S.
La maintenance des cultures est facilitée en travaillant dans des conditions stériles. Il convient de cultiver
C. tenuicorne dans des boîtes de Petri stériles en plastique ou en verre (par exemple de 90 mm de diamètre
et 15 mm de haut). Les algues sont cultivées à 22 °C ± 2 °C, à une intensité lumineuse de
−2 −1 −2 −1
35 µmol m s ± 7 µmol m s et pendant une photopériode de 14 h de lumière et 10 h d'obscurité. Ces
conditions peuvent être obtenues sur une paillasse de laboratoire avec une lampe ordinaire à minuterie
placée à une distance d'environ 350 mm.
Afin de maintenir une croissance active des gamétophytes, les algues doivent être transférées chaque
semaine dans un milieu frais. Le mode opératoire consiste à remplir des boîtes de Petri stériles avec
approximativement 25 ml de milieu de culture stérile, conformément au Tableau 3, colonne A.
Approximativement 20 à 30 boutures de thalle femelles, de 10 mm à 20 mm de long, sont transférées dans
chaque boîte.
Si l'essai est destiné à être réalisé à une salinité différente de 7S, 20S ou 30S, les algues ont besoin d'être
adaptées à la nouvelle salinité avant de démarrer l'essai. L'eau de mer de salinités différentes est préparée
conformément à 4.2.2 et 4.2.3. Il convient d'adapter les algues successivement en les transférant tous les
deux jours dans un milieu frais et en augmentant ou en diminuant la salinité de 3S. Les algues doivent être
cultivées pendant au moins deux semaines à la salinité d'essai finale avant de démarrer l'essai.
NOTE 1 La solution 3 de fer peut être ajoutée à la solution d'éléments à l'état de trace afin d'augmenter la stabilité du
fer.
NOTE 2 Les cultures de substitution peuvent être conservées jusqu'à deux mois sans rafraîchissement ou
renouvellement si elles sont cultivées sous une plus faible intensité lumineuse et à température ambiante. Si la
température est approximativement de 10 °C, les algues peuvent être conservées pendant trois mois.
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6 Appareillage
Tous les équipements en contact avec le milieu d'essai doivent être en verre ou autre matériel chimiquement
inerte.
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Enceinte ou chambre thermostatée, avec une lampe fluorescente à lumière blanche fournissant un
éclairage homogène, conforme aux exigences d'éclairage spécifiées pour l'essai décrit en 7.5.
6.2 Tubes fluorescents, de type lumière du jour ou «lumière blanche», capable de fournir une intensité
−2 −1 −2 −1
lumineuse de (70 ± 7) µmol m s pendant la période d'exposition et d'environ (35 ± 7) µmol m s
pendant la culture.
6.3 Minuterie, pour assurer une photopériode de 14 h de lumière et 10 h d'obscurité.
6.4 Luxmètre, qui mesure les photons ou l'énergie (exprimée en micromoles par mètre carré par seconde),
dans la plage photosynthétique de 400 nm à 700 nm, de préférence.
6.5 pH-mètre, pour le mesurage et l'ajustement du pH pendant la préparation de la culture et des solutions
d'essai et pour mesurer le pH à la fin de l'essai.
6.6 Appareil de mesure de la salinité ou conductimètre, pour mesurer et ajuster la teneur en sel de la
culture et de l'eau de dilution.
6.7 Microscope stéréoscopique, avec un grossissement de 6 fois à 10 fois, pour la découpe des thalles
femelles avant un essai et pour mesurer la longueur des algues.
6.8 Matériel de stérilisation. Il convient que tous les équipements et solutions soient stériles pour éviter la
contamination. Cela peut être réalisé en autoclave. Les solutions peuvent également être stérilisées par
filtration (porosité de 0,2 µm). La verrerie peut aussi être stérilisée dans un four à moufle à 150 °C pendant
3 h.
6.9 Brûleur à gaz ou lampe à alcool. Pour maintenir les algues en monoculture, il convient d'utiliser des
techniques microbiologiques stériles pour tous les travaux concernant les algues. Il convient de passer les
flacons et instruments à la flamme lors des travaux sur les cultures et la préparation des solutions.
6.10 Scalpel, ciseaux et paire de pinces sont des outils utiles pour le découpage et la manipulation des
algues.
6.11 Boîtes de culture. Des boîtes de Petri stériles avec couvercle, en plastique inerte ou en verre, d'un
diamètre de 90 mm et d'une hauteur de 15 mm contenant environ 25 ml de milieu peuvent convenir.
6.12 Boîtes d'exposition. Des boîtes de Petri stériles avec couvercle, en plastique inerte ou en verre, d'un
diamètre de 50 mm et d'une hauteur de 10 mm contenant environ 10 ml de milieu peuvent convenir.
6.13 Plateaux, pour simplifier la manipulation des boîtes de Petri.
[1]
6.14 Fioles jaugées à un trait, de 100 ml et 1 l de capacité, ISO 1042 , classe A.
7 Mode opératoire
7.1 Algues
Les algues (4.1) doivent être cultivées dans de l'eau de mer naturelle enrichie comme spécifié en 4.4 pendant
au moins une semaine avant de démarrer un essai. Pour s'assurer que les algues croissent activement, les
transférer dans un milieu frais 3 jours à 4 jours avant le démarrage d'un essai. Transférer 20 à 30 thalles
femelles, de 10 mm à 15 mm de long environ, dans des boîtes de Petri contenant chacune 25 ml de milieu de
culture. Trois à quatre de ces boîtes produisent suffisamment de matériau pour un essai.
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Au démarrage d'un essai, les extrémités sont prélevées sur les thalles femelles de C. tenuicorne en utilisant
un scalpel (6.10). Les bourgeons de clones marins doivent être coupés comme montré à la Figure 1 a),
c'est-à-dire avec deux niveaux de bifurcation, deux «griffes» initiales, et une longueur depuis la base de la
bifurcation à la partie supérieure de 0,6 mm à 1,2 mm. Pour dé
...
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