SIST ISO 6651:1995
(Main)Animal feeding stuffs -- Determination of aflatoxin B1 content
Animal feeding stuffs -- Determination of aflatoxin B1 content
Describes two methods of determination for different fields of application. Method A is applicable to simple feeding stuffs while method B can be used for mixed feeding stuffs and for feeding stuffs not covered by method A. Contains information on the principle of determination, reagents and apparatus to be used, sampling, procedure, expression of results and the details to be included in the test report.
Aliments des animaux -- Dosage de l'aflatoxine B1
Krma - Določanje vsebnosti aflatoksina B1
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL STANDARD
6651
Second edition
1987-08-U
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
MEXfiYHAPOAHAfl OPTAHM3A~Mf=l n0 CTAH~APTM3A~MM
Determination of aflatoxin B,
Animal feeding stuffs -
content
Aliments des animaux - Dosage de l’aflatoxine B1
Reference number
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Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national standards bodies (IS0 member bodies). The work of preparing International
Standards is normally carried out through IS0 technical committees. Each member
body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for approval before their acceptance as International Standards by
the IS0 Council. They are approved in accordance with IS0 procedures requiring at
least 75 % approval by the member bodies voting.
International Standard IS0 6651 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34,
Agricultural food products.
This second edition cancels and replaces the first edition (IS0 6651 : 1983), subclause
5.14.1 of which has been technically revised.
Users should note that all International Standards undergo revision from time to time
and that any reference made herein to any other International Standard implies its
latest edition, unless otherwise stated.
0 International Organization for Standardization, 1987
Printed in Switzerland
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INTERNATIONAL STANDARD IS0 6651 : 1987 (E)
Determination of aflatoxin B,
Animal feeding stuffs -
content
Evaporation of the eluate and dissolution of the residue in a
1 Scope
specified volume of chloroform or mixture of benzene and
This International Standard specifies two methods for the acetonitrile.
determination of the aflatoxin B1 content of animal feeding
stuffs. Thin-layer chromatography, one-dimensional for method A and
two-dimensional for method B, of an aliquot portion of this
solution.
2 Field of application
Determination of the aflatoxin B, content, either visually or by
fluorodensitometry, by examination of the chromatogram
2.1 Method A is applicable to the following simple feeding
under ultraviolet light and comparison with known quantities of
standard aflatoxin B1 applied to the same plate as the test por-
tion extract.
oilseeds and oilseed residues, and in particular ground-
copra, linseed, soya, sesame, babassu palm;
Confirmation of the identity of aflatoxin B, by formation of the
hemiacetal derivative.
maniac meal;
maize germ expeller;
5 Reagents
cereals and cereal products;
All reagents shall be of recognized analytical quality. The water
pea meal;
used shall be distilled water or water of at least equivalent
purity.
potato pulp and flour.
5.1 Chloroform, stabilized with 0,5 to 1,0 % of 96 % (Vl VI
In the presence of substances interfering with the determina-
ethanol.
tion by method A, it is recommended that the determination be
carried out in accordance with method B.
5.2 n-Hexane.
2.2 Method B is applicable to mixed feeding stuffs and to
simple feeding stuffs not mentioned in 2.1.
5.3 Diethyl ether, anhydrous, free from peroxides.
This method is not applicable to feeding stuffs containing citrus
5.4 Benzene/acetonitrile, (98 + 2) mixture.
Pulp-
Mix 98 volumes of benzene with 2 volumes of acetonitrile.
2.3 The lower limit of detection of aflatoxin B, is 0,Ol mg/kg.
5.5 Chloroform/methanol, (97 + 3) mixture.
3 Reference
Mix 97 volumes of chloroform with 3 volumes of methanol.
IS 0 6498, Animal feeding stuffs - Preparation of test samples.
5.6 ’ Developing solvents.1)
4’ Principle 5.6.1 Chloroform/acetone, (90 + 10) mixture.
Extraction of the test portion with chloroform, filtration, and Mix 90 volumes of chloroform with 10 volumes of acetone, in
an unsaturated tank.
purification of an aliquot portion on a silica gel column.
1) The solvents should be used in covered tanks. When saturated tanks are specified, this is achieved by lining the tanks with absorbent paper and
allowing the interiors to become saturated with solvent vapour.
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IS0 6651 : 1987 (E)
Measure the absorbance (A) at 363 nm in the case of the
5.62 Diethyl ether/methanol/water, (96 + 3 + II mix-
chloroform solution, or at 348 nm in the case of the
ture.
benzene/acetonitrile mixture solution.
Mix 96 volumes of diethyl ether, 3 volumes of methanol and l
Calculate the concentration of aflatoxin B1, in micrograms per
volume of water, in an unsaturated tank.
millilitre of solution, from the formulae :
5.6.3 Diethyl ether/methanol/water, (94 + 4,5 + 1,5)
a) for the chloroform solution :
mixture.
312 x A x 1000
Mix 94 volumes of diethyl ether with 4,5 volumes of methanol
and 1,5 volumes of water, in a saturated tank. 22 300
b) for the solution in the benzene/acetonitrile mixture :
5.6.4 Chloroform/methanol, (94 + 6) mixture.
312 x A x 1000
Mix 94 volumes of chloroform with 6 volumes of methanol, in a
19800
saturated tank.
5.142 Dilution
5.6.5 Chloroform/methanol, (97 + 3) mixture.
5.7 Silica gel, for column chromatography, of particle size
If kept in a refrigerator at 4 OC, this solution is stable for 2
0,05 to 0,20 mm.
weeks.
5.8 Silica gel, G-HR or equivalent, for thin-layer chromatog-
5.14.3 Testing of chromatographic purity of the solution
raphy.
Onto a plate (6.71, apply a spot of 5 pl of the standard aflatoxin
.9 Diatomaceous earth (Hyflosupercel), acid-washed.
B1 solution of concentration 8 to 10 pg/ml (5.14.1). Develop
the chromatogram as indicated in 8.5.1. Under ultraviolet light,
the chromatogram shall show only one spot and no
.I0 Sodium sulfate, anhydrous granules.
fluorescence shall be perceptible in the original deposition
zone.
5.11 Trifluoroacetic acid.
5.15 Aflatoxin B1 and B2 (see the warning in 5.14), solu-
5.12 Inert gas, for example nitrogen.
tions for qualitative testing, containing about 0,l pg of afla-
toxin B1 and B2 per millilitre, in the chloroform (5.1) or in the
benzene/acetonitrile mixture (5.4).
5.13 Sulfuric acid, 50 % (V/v) solution.
These concentrations are given as a guide. They shall be ad-
5.14 Aflatoxin B1, standard solution containing about
justed so as to obtain the same intensity of fluorescence for
0,l pg of aflatoxin B, per millilitre, in the chloroform (5.1) or in
both aflatoxins (see 8.5.1).
the benzene/acetonitrile mixture (5.4).
carcinogenic and
WARNING - Aflatoxins are highly
must be handled with great care.
Prepare and check the solution as follows.
6 Apparatus
Usual laboratory equipment, and in particular :
solution and determination
5.14.1 Preparatio n of stock
of concentration
6.1 Grinder/mixer.
Prepare a solution of aflatoxin B, in the chloroform (5.1) or the
benzene/acetonitrile mixture (5.4) such that the concentration
6.2 Sieve, of aperture size I,0 mm.1)
is between 8 and 10 pg/ml. Determine the absorption spectrum
between 330 and 370 nm by means of the spectrophotometer
(6.9). 63 . Shaking apparatus or magnetic stirrer.
1) See IS0 565, Test sieves - Woven metal wire cloth, perforated plate and electroformed sheet - Nominal sizes of openings.
2
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IS0 6651 : 1987 (E)
6.4 Chromatographic tubes, made of glass (internal national Standard exists, agreement shall be reached between
the parties concerned, taking into account the characteristics
diameter 22 mm, length 300 mm), with a polytetrafluoro-
of the material being sampled.
ethylene tap and a 250 ml reservoir, plugged at the bottom end
with cotton or glass wool.
8 Procedure
6.5 Rotary vacuum evaporator, with a 500 ml round-
bottomed flask.
8.1 Preparation of the test sample
6.6 Apparatus for thin-layer chromatography (TLC), i.e.
that necessary for the preparation of the plates (6.7) and ap-
8.1.1 If the sample contains more than 5 % of fat, it shall be
plication of spots (capillary pipettes or microsyringes), a
defatted with light petroleum before grinding.
developing tank, and spraying apparatus for applying the
sulfuric acid (5.13) to the plates.
In such cases, the analytical results shall be expressed in terms
of the mass of the non-defatted sample.
6.7 Glass TLC plates, 200 mm x 200 mm, prepared as
follows (the quantities indicated are sufficient to cover five
8.1.2 Grind the laboratory sample so that it completely passes
plates).
through the sieve (6.2). Mix thoroughly. (See IS0 6498.)
Place 30 g of the silica gel (5.8) in a conical flask, add 60 ml of
water, stopper and shake for 1 min. Spread the suspension on
8.2 Test portion
the plates so as to obtain a uniform layer 0,25 mm thick. Leave
to dry in the air and then store in a desiccator containing silica
Weigh, to the nearest 0,Ol g, 50 g of the prepared test sample
gel. At the time of use, activate the plates by keeping them in
into the conical flask (6.13).
an oven at 110 OC for 1 h.
Ready-to-use plates are suitable if they give results similar to
8.3 Extraction
those obtained with the plates prepared as indicated above.
Add to the test portion (8.2) 25 g of the diatomaceous earth
(5.9), 25 ml of water, and 250 ml of the chloroform (5.1) ac-
6.8 Long-wavelength (380 nm) ultraviolet lamp.
curately measured from a measuring cylinder. Stopper the
flask, and shake or stir for 30 min using the apparatus (6.3).
The intensity of irradiation shall make it possible for a spot of
Filter through the fluted filter paper (6.11), taking care to
1,O ng of aflatoxin RI to be clearly distinguished on a TLC plate
discard the first 10 ml of the filtrate, and subsequently collect at
at a distance of 10 cm from the lamp.
least 50 ml of the filtrate.
WARNING - Ultraviolet light is dangerous to the eyes.
Protective goggles shall be worn.
8.4 Column clean-up
Spectrophotometer, suitable for making measure-
69 .
8.4.1 Preparation of the column
ments in the ultraviolet region of the spectrum.
Fill two-thirds of the chromatographic tube (6.4) with the
6* 10 Fluorodensitometer (optional).
chloroform (5.1) and add 5 g of the sodium sulfate (5.10).
Check that the upper surface of the sodium sulfate layer is flat,
6.11 Fluted filter paper.
then add 10 g, in small portions, of the silica gel (5.7). Stir
carefully after each addition to eliminate air bubbles. Leave to
stand for 15 min and then carefully add 10 g of the sodium
6.12 Graduated tube, of capacity 10,O ml, with a
sulfate (5.10). Open the tap and allow the liquid to flow until it
polyethylene stopper.
is just above the upper surface of the sodium sulfate layer.
Close the tap.
6.13 . Conical flask, of capacity 500 ml, with a ground glass
stopper.
8.4.2 Purification
6.14 Pipette, of capacity 50 ml.
Transfer, by means of the pipette (6.14), 50 ml of the filtrate
collected in 8.3 to a 250 ml conical flask, and add 100 ml of the
n-hexane (5.2). Mix and quantitatively transfer the mixture to
6.15 Balance.
the column, rinsing the flask with the n-hexane. Open the tap
and allow the liquid to flow at a rate of 8 to 12 ml/min until it is
level with the upper surface of the sodium sulfate layer. Close
7 Sampling
the tap. Discard the liquid collected and pour 100 ml of the
Take the laboratory sample from the material to be sampled in diethyl ether (5.3) into the column. Again open the tap and
allow the liquid to flow until it is level with the upper surface of
accordance with the International Standard for the material
concerned unless sampling for the determination of aflatoxin is the sodium sulfate layer. During these operations, ensure that
the column does not run dry.
excluded from its field of applJcation. If no appropriate Inter-
3
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IS0 6651 : 1987 (E)
8.5.2 imensional thin-layer
Elute with 150 ml of the chloroform/methanol mixture (5.5)
chromatography
and collect the whole of the eluate in the 500 ml flask of the
rotary evaporator (6.5). Evaporate to dryness on the rotary
evaporator, preferably under a stream of inert gas (5.12), at a
8.5.2.1 Application of the solutions (see figure 1)
temperature not exceeding 50 OC, and under reduced pressure.
Trace two straight lines on a plate (6.7) parallel to two con-
NOTE - I f a rota evaporator is not available, add a boiling aid and
v
tiguous sides (50 and 60 mm from each side respectively), to
evaporate almost to dryness on a water bath.
establish the limit of migration of the solvent fronts. Apply the
following solutions on the .plate using capillary pipettes or
Quantitatively transfer the residue, using the chloroform (5.1)
microsyringes :
or the benzene/acetonitrile mixture (5.4), to the 10 ml
graduated tube (6.12). Again evaporate the solution, for exam-
-
at point A : 20 pl of the purified sample extract ob-
ple in a water bath, preferably under a stream of inert gas
tained in 8.4.2;
(5.12), and adjust the volume to 2,0 ml with the chloroform
(5.1) or the benzene/acetonitrile mixture (5.4).
at point B : 20 pl of the standard aflatoxin B, solution
(5.14);
-
at point C : 10 pl of the standard aflatoxin B, solution
8.5 Thin-layer chromatography
(5.14);
-
at point D : 20 PI of the standard aflatoxin B1 solution
(5.14);
thin- layer
8 .5.1 Method A - One-dimensional
C hromatography
-
at point E : 40 ~1 of the standard aflatoxin B, solution
(5.14).
8.5.1.1 Choice of solvent
Dry in a slow stream of air or inert gas (5.12). The spots ob-
tained shall have a diameter of about 5 mm.
The choice of solvent (5.6.1, 5.6.2, 5.6.3, 5.6.4 or 5.6.5) shall
be made beforehand to ensure that aflatoxins B, and B2 are
completely separated when the plate is developed, which
8.5.2.2 Development (see figure 1)
depends on the batch of plates
...
ISO
NORME INTERNATIONALE
6651
Deuxième édition
1987-08- 15
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
=
=
ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
=
1- = I
MEXflYHAPOflHAfl OPI-AHM3A~MR l-l0 CTAH,QAPTM3A~MM
- Dosage de I’aflatoxine B,
Aliments des animaux
Animal feeding stuffs - De termina tion of a fla toxin B1 content
Numéro de référence
ISO 665 1: 1987 (F)
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration
des Normes internationales est normalement confiée aux comités techniques de I’ISO.
Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 6651 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition US0 6651 : 1983), dont
le paragraphe 5.14.1 a fait l’objet d’une révision technique.
L’attention des utilisateurs est attirée sur le fait que toutes les Normes internationales
sont de temps en temps soumises à révision et que toute référence faite à une autre
Norme internationale dans le présent document implique qu’il s’agit, sauf indication
contraire, de la dernière édition.
0 Organisation internationale de normalisation, 1987 0
Imprimé en Suisse
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NORME INTERNATIONALE
ISO6651:1987 (F)
- Dosage de I’aflatoxine B,
Aliments des animaux
Évaporation de I’éluat et dissolution du résidu dans un volume
1 Objet
déterminé de chloroforme ou d’un mélange benzène-
La présente Norme internationale spécifie deux procédés de acétonitrile.
dosage de I’aflatoxine B1 dans les aliments des animaux.
Chromatographie sur couche mince, monodimensionnelle pour
le procédé A et bidimensionnelle pour le procédé B, d’une par-
2 Domaine d’application tie aliquote de cette solution.
Détermination de la teneur en aflatoxine B,, par mesure visuelle
2.1 Procédé A, applicable aux aliments simples suivants:
ou à l’aide d’un fluorodensitométre, de l’intensité de fluores-
cence du chromatogramme examiné à la lumière UV, par com-
- graines oléagineuses et tourteaux, et, en particulier
paraison avec des quantités connues d’un étalon d’aflatoxine
d’arachide, de coprah, de lin, de soja, de sésame, de
B, placé sur la même plaque que l’échantillon.
babassu;
Confirmation de l’identité de I’aflatoxine B1 par formation du
- farine de manioc;
dérivé hémiacétal.
-
tourteaux de germes de maïs;
-
céréales et produits céréaliers;
5 Réactifs
- farine de pois;
Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue et
l’eau utilisée doit être de l’eau distillée ou de l’eau de pureté
- pulpe et fécule de pommes de terre.
équivalente.
En présence de substances interférentes qui entravent les
5.1 Chloroforme, stabilisé par 0,5 à 1,0 % d’éthanol à 96 %
déterminations selon le procédé A, il est recommandé d’effec-
wn.
tuer la détermination selon le procédé B.
5.2 n-Hexane.
2.2 Procédé B, applicable aux aliments composés ainsi
qu’aux aliments simples non mentionnés en 2.1.
5.3 Oxyde dibthylique, anhydre, exempt de peroxydes.
Ce procédé ne s’applique pas aux aliments contenant des
pulpes d’agrumes.
5.4 Benz&ne/acétonitrile, mélange (98 + 2).
2.3 La limite de détection de I’aflatoxine B1 se situe à
Mélanger 98 volumes de benzène avec 2 volumes d’acétonitrile.
0,Ol mg/ kg.
5.5 chloroforme/méthanol, mélange (97 + 3).
3 Référence
Mélanger 97 volumes de chloroforme avec 3 volumes de
méthanol.
ISO 6498, Aliments des animaux - Préparation des échantil-
lons pour essai.
5.6 1 Solvants de développement.1)
4 Principe
5.6.1 Chloroforme/ac&one, mélange (90 + 10).
Mélanger 90 volumes de chloroforme avec 10 volumes d’acé-
Extraction au chloroforme sur une prise d’essai, filtration puis
tone, en cuve non saturée.
purification d’une partie aliquote sur colonne de gel de silice.
1) Les solvants doivent être utilisés dans des cuves couvertes. Lorsque des cuves saturées sont spécifiées, ceci est réalisé en les recouvrant intérieu-
rement avec du papier filtre et en l?issant la cuve se saturer avec les vapeurs de solvant.
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ISO 6651 : 1987 (F)
5.6.2 Oxyde diéthylique/méthanoI/eau, mélange Relever I’absorbance (A) à 363 nm dans le cas d’une solution
chloroformique, ou à 348 nm dans le cas d’une solution dans le
(96 + 3 + 1).
mélange benzène/acétonitrile.
Mélanger 96 volumes d’oxyde diéthylique avec 3 volumes de
méthanol et 1 volume d’eau, en cuve non saturée Calculer la concentration d’aflatoxine B ,, en microgrammes
Par
millilitre de solution, à partir des formules suivantes :
5.6.3 Oxyde diéthylique/méthanol/eau, mélange
a) pour la solution chloroformique :
(94 + 4,5 + 1,5).
312 x A x 1000
94 volumes d’oxyde d iéthylique avec 4,5 volumes de
Mélanger
22300
méthanol et 1,5 volumes d’eau, en cuve saturée.
pour la solution dans le mélange benzène/acétonitrile :
b)
5.6.4 Chloroforme/méthanol, mélange (94 + 6).
312 x A x 1000
Mélanger 94 volumes de chlo lroforme avec 6 volumes de métha-
19 800
nol, en cuve saturée.
5.6.5 Chloroforme/méthanol, mélange (97 + 3).
5.14.2 Dilution
Mélanger 97 volumes de chloroforme avec 3 volumes de métha-
Effectuer à l’abri de la lumière les dilutions convenables de la
nol, en cuve saturée.
solution mère (5.14.1) pour obtenir une solution étalon *dont la
concentration en aflatoxine BI soit d’environ 0,I pg/ml.
5.7 Gel de silice, pour chromatographie sur colonne, granu-
ution
Conservée au réfrigérateu r à 4 OC, cette sol est stable
lométrie : 0,05 à 0,20 mm.
durant 2 semai nes.
5.8 Gel de silice, G-HR ou équivalent, pour chromatogra-
chromatographique
5.14.3 Contrôle de la pureté
phie sur couche mince.
solution
5.9 Terre de diatomées (Hyflosupercel), lavée à l’acide.
Déposer sur une plaque (6.7) une tache de 5 FI de la solution
mère d’aflatoxine BI de concentration 8 à 10 pg/ml (5.14.1).
Développer le chromatogramme comme indiqué en 8.5.1. Sous
5.10 Sulfate de sodium, granulés anhydres.
lumière ultraviolette, la fluorescence ne doit donner lieu qu’à la
perception d’une seule tache et aucune fluorescence ne doit
5.11 Acide trifluoroacétique.
être percue dans la zone du dépôt d’origine.
5.12 Gaz inerte, par exemple azote.
5.15 Aflatoxines B, et B2 (voir l’avertissement en 5.141,
solutions pour l’essai qualitatif, contenant environ 0,I pg
5.13 Acide sulfurique, solution à 50 % (WV).
d’aflatoxines Bt et B2 par millilitre dans le chloroforme (5.1) ou
dans le mélange benzène/acétonitrile (5.4).
5.14 Aflatoxine B,, solution étalon contenant environ
Ces concentrations sont données à titre indicatif. Elles doivent
0,I Fg d’aflatoxine BI par millilitre dans le chloroforme (5.1) ou
dans le mélange benzène/acétonitrile (5.4). être ajustées de manière à obtenir la même intensité de fluores-
cence pour les deux aflatoxines (voir 8.5. IL
6 Appareillage
Préparer et contrôler la solution comme indiqué ci-après.
Matériel courant de laboratoire, et notamment
5.14.1 Préparation de la solution mère et détermination
de sa concentration
6.1 Broyeur.
Préparer une solution d’aflatoxine BI, dans le chloroforme (5.1)
6.2 Tamis, de 1,0 mm d’ouverture de maille.1)
ou dans le mélange benzène/acétonitrile (5.41, de concentra-
tion comprise entre 8 et 10 pg/ml. Déterminer son spectre
d’absorption entre 330 et 370 nm à l’aide du spectrophotomètre
63 . Appareil à secouer ou agitateur magnétique.
(6.9).
Dimensions nominales des ouvertures.
Tissus mé tailiques, tôles perforées et feuilles électro formées -
1) Voir ISO 565, Tamis de contrôle -
2
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lSO6651:1987(F)
produit concerné, sauf si l’échantillonnage en vue de la deter-
8.4 Tube pour chromatographie, en verre (diamètre inté-
mination de I’aflatoxine est exclu de son domaine d’application.
rieur 22 mm, longueur 300 mm), avec robinet en polytétrafluo-
S’il n’existe pas de Norme internationale appropriée, les parties
roethylene (PTFE) et réservoir de 250 ml, muni à son extrémité
concernées doivent se mettre d’accord, en tenant compte des
d’un tampon de coton ou de laine de verre.
caractéristiques du produit à échantillonner.
6.5 Appareil rotatif à évaporation sous vide, avec ballon
à fond rond de 500 ml.
8 Mode opératoire
6.6 Appareillage pour chromatographie sur couche
8.1 Préparation de l’échantillon pour essai
mince, à savoir matériel nécessaire à la préparation des pla-
ques (6.7) et au dépôt des taches (pipettes capillaires ou micro-
8.1.1 Si l’échantillon contient plus de 5 % de matières gras-
seringues), cuve de développement et appareil pour pulvériser
ses, celui-ci doit être dégraissé à l’éther de pétrole avant
l’acide sulfurique (5.13) sur les plaques.
d’effectuer le broyage.
Les résultats devront alors être rapportés à la masse d’échantil-
6.7 Plaques de verre pour chromatographie sur couche
Ion non dégraissé.
mince, 200 mm x 200 mm préparées comme suit (les quanti-
tés indiquées conviennent pour recouvrir cinq plaques).
Broyer l’échantillon pour laboratoire, de facon qu’il
8.1.2
,
passe en totalité au travers du tamis (6.2). Bien homogénéiser.
Introduire 30 g de gel de silice (5.8) dans une fiole conique,
(Voir ISO 6498.)
ajouter 60 ml d’eau, boucher et agiter durant 1 min. Étendre la
suspension sur les plaques, de manière à obtenir une couche
sécher à l’air et con-
uniforme de 0,25 mm d ‘épaisseur. Laisser
82 . Prise d’essai
server ensui te dans un dessiccateur garni de gel de sil ice. Au
moment de l’emploi, activer les plaques en les maintenant
Peser à 0,OI g près, 50 g de l’échantillon pour essai dans la fiole
durant 1 h dans une étuve à 110 OC.
conique (6.13).
Les plaques prêtes à l’emploi conviennent dans la mesure où
8.3 Extraction
elles donnent des résultats semblables à ceux des plaques pré-
parées comme indiqué ci-dessus.
Ajouter à la prise d’essai (8.2) 25 g de terre de diatomées (5.9),
puis 25 ml d’eau et 250 ml de chloroforme (5.1) mesurés avec
6.8 Lampe à ultraviolet à ondes longues (380 nm).
soin à l’aide d’une éprouvette. Boucher la fiole, secouer ou agi-
ter durant 30 min à l’aide de l’appareil (6.3). Filtrer sur papier
L’intensité d’irradiation doit permettre de distinguer encore net-
filtre (6.11) en ayant soin d’éliminer les 10 premiers millilitres de
tement une tache de 1,0 ng d’aflatoxine BI sur une plaque pour
filtrat et de recueillir une quantité de filtrat supérieure à 50 ml.
chromatographie sur couche mince, à une distance de 10 cm de
la lampe.
8.4 Purification
La lumière ultraviolette étant dan-
AVERTISSEMENT -
gereuse pour les yeux, il y a lieu de porter des lunettes
8.4.1 Préparation de la colonne
protectrices.
Remplir les deux tiers du tube pour chromatographie (6.4) avec
du chloroforme (5.1) et ajouter 5 g de sulfate de sodium (5.10).
6.9 Spectrophotomètre, permettant d’effectuer les mesu-
S’assurer que la surface supérieure de la couche de sulfate de
res dans l’ultraviolet.
sodium est plane, puis ajouter par petites fractions 10 g de gel
de silice (5.7). Remuer avec précaution après chaque addition
6.10 Fluorodensitomètre (éventuellement).
pour éliminer les bulles d’air. Laisser décanter durant 15 min et
ajouter ensuite avec précaution 10 g de sulfate de sodium
6.11 Papier filtre à plis. (5.10). Ouvrir le robinet et laisser s’écouler le liquide jusqu’à
proximité immédiate de la surface supérieure de la couche de
sulfate de sodium. Fermer le robinet.
6.12 Tube gradué, de 10,0 ml de capacité, avec bouchon de
polyéthylène.
8.4.2 Purification
6.13 Fiole conique, de 500 ml de capacité, à bouchon rodé.
Prélever à la pipette (6.14) 50 ml du filtrat recueilli en 8.3 dans
une fiole conique de 250 ml, ajouter 100 ml de n-hexane (5.2).
Mélanger et transvaser quantitativement le mélange dans la
6.14 Pipette, de 50 ml de capacité.
colonne en rincant avec du n-hexane. Ouvrir le robinet et laisser
s’écouler le liquide à une vitesse de 8 à 12 ml/min, jusqu’à la
6.15 Balance.
surface supérieure de la couche de sulfate de sodium. Fermer le
robinet. Éliminer le liquide récupéré et ajouter dans la colonne
100 ml d’oxyde diéthylique (5.3). Ouvrir le robinet et éliminer à
7 Échantillonnage
nouveau le liquide jusqu’à la surface supérieure de la couche de
Prélever l’échantillon pour laboratoire sur le produit à échantil- sulfate de sodium. Veiller lors de ces opérations à ce que la
colonne ne soit pas mise à sec.
lonner, en se conformant à la Norme internationale relative au
*
3
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 6651 : 1987 (F)
8.5.2 Procédé B - Chromatographie bidimensionnelle
Verser ensuite 150 ml du mélange chloroformelméthanol (5.5)
et récupérer la totalité de I’éluat dans le ballon de 500 ml de
l’évaporateur rotatif (6.5). Évaporer à sec à l’aide de I’évapora-
8.5.2.1 Application des solutions (voir figure 1)
teur rotatif, de préférence sous un courant de gaz inerte (5.12),
à pression réduite et à une température ne dépassant pas 50 OC.
Tracer sur une plaque (6.7) deux droites parallèles à deux côtés
contigus (à des distances respectives de 50 et 60 mm de ces
NOTE - En l’absence d’un évaporateur rotatif, ajouter un régularisa-
côtés), destinées à délimiter la migration des fronts de solvants.
teur d ‘ébullition et évaporer presque jusqu’à sec sur un bain d’eau.
Déposer sur la plaque à l’aide de pipettes capillaires ou de
microseringues les solutions indiquées ci-après :
Transvaser quantitativement le résidu dans le tube gradué de
10 ml (6.12) à l’aide de chloroforme (5.1) ou du mélange
-
au point A : 20 PI de l’extrait purifié de l’échantillon,
benzène/acétonitrile (5.4). Évaporer à nouveau la solution, par
obtenu en 8.4.2;
exemple dans un bain d’eau, de préférence sous un courant de
gaz inerte (5.12), et amener ensuite le volume à 2,0 ml avec du
- au point B : 20 1-11 de la solution étalon (5.14);
chloroforme (5.1) ou du mélange benzène/acétonitrile (5.4).
-
au point C : 10 PI de la solution étalon (5.14);
- au point D : 20 1-11 de la solution étalon (5.14);
8.5 Chromatographie sur couche mince
- au point E : 40 PI de la solution étalon (5.14).
8.5.1 Procédé A - Chromatographie mono-
dimensionnelle
Sécher à l’aide d’un léger courant d’air ou de gaz inerte (5.12).
Les tache
...
ISO
NORME INTERNATIONALE
6651
Deuxième édition
1987-08- 15
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
=
=
ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
=
1- = I
MEXflYHAPOflHAfl OPI-AHM3A~MR l-l0 CTAH,QAPTM3A~MM
- Dosage de I’aflatoxine B,
Aliments des animaux
Animal feeding stuffs - De termina tion of a fla toxin B1 content
Numéro de référence
ISO 665 1: 1987 (F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration
des Normes internationales est normalement confiée aux comités techniques de I’ISO.
Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 6651 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition US0 6651 : 1983), dont
le paragraphe 5.14.1 a fait l’objet d’une révision technique.
L’attention des utilisateurs est attirée sur le fait que toutes les Normes internationales
sont de temps en temps soumises à révision et que toute référence faite à une autre
Norme internationale dans le présent document implique qu’il s’agit, sauf indication
contraire, de la dernière édition.
0 Organisation internationale de normalisation, 1987 0
Imprimé en Suisse
---------------------- Page: 2 ----------------------
NORME INTERNATIONALE
ISO6651:1987 (F)
- Dosage de I’aflatoxine B,
Aliments des animaux
Évaporation de I’éluat et dissolution du résidu dans un volume
1 Objet
déterminé de chloroforme ou d’un mélange benzène-
La présente Norme internationale spécifie deux procédés de acétonitrile.
dosage de I’aflatoxine B1 dans les aliments des animaux.
Chromatographie sur couche mince, monodimensionnelle pour
le procédé A et bidimensionnelle pour le procédé B, d’une par-
2 Domaine d’application tie aliquote de cette solution.
Détermination de la teneur en aflatoxine B,, par mesure visuelle
2.1 Procédé A, applicable aux aliments simples suivants:
ou à l’aide d’un fluorodensitométre, de l’intensité de fluores-
cence du chromatogramme examiné à la lumière UV, par com-
- graines oléagineuses et tourteaux, et, en particulier
paraison avec des quantités connues d’un étalon d’aflatoxine
d’arachide, de coprah, de lin, de soja, de sésame, de
B, placé sur la même plaque que l’échantillon.
babassu;
Confirmation de l’identité de I’aflatoxine B1 par formation du
- farine de manioc;
dérivé hémiacétal.
-
tourteaux de germes de maïs;
-
céréales et produits céréaliers;
5 Réactifs
- farine de pois;
Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue et
l’eau utilisée doit être de l’eau distillée ou de l’eau de pureté
- pulpe et fécule de pommes de terre.
équivalente.
En présence de substances interférentes qui entravent les
5.1 Chloroforme, stabilisé par 0,5 à 1,0 % d’éthanol à 96 %
déterminations selon le procédé A, il est recommandé d’effec-
wn.
tuer la détermination selon le procédé B.
5.2 n-Hexane.
2.2 Procédé B, applicable aux aliments composés ainsi
qu’aux aliments simples non mentionnés en 2.1.
5.3 Oxyde dibthylique, anhydre, exempt de peroxydes.
Ce procédé ne s’applique pas aux aliments contenant des
pulpes d’agrumes.
5.4 Benz&ne/acétonitrile, mélange (98 + 2).
2.3 La limite de détection de I’aflatoxine B1 se situe à
Mélanger 98 volumes de benzène avec 2 volumes d’acétonitrile.
0,Ol mg/ kg.
5.5 chloroforme/méthanol, mélange (97 + 3).
3 Référence
Mélanger 97 volumes de chloroforme avec 3 volumes de
méthanol.
ISO 6498, Aliments des animaux - Préparation des échantil-
lons pour essai.
5.6 1 Solvants de développement.1)
4 Principe
5.6.1 Chloroforme/ac&one, mélange (90 + 10).
Mélanger 90 volumes de chloroforme avec 10 volumes d’acé-
Extraction au chloroforme sur une prise d’essai, filtration puis
tone, en cuve non saturée.
purification d’une partie aliquote sur colonne de gel de silice.
1) Les solvants doivent être utilisés dans des cuves couvertes. Lorsque des cuves saturées sont spécifiées, ceci est réalisé en les recouvrant intérieu-
rement avec du papier filtre et en l?issant la cuve se saturer avec les vapeurs de solvant.
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 6651 : 1987 (F)
5.6.2 Oxyde diéthylique/méthanoI/eau, mélange Relever I’absorbance (A) à 363 nm dans le cas d’une solution
chloroformique, ou à 348 nm dans le cas d’une solution dans le
(96 + 3 + 1).
mélange benzène/acétonitrile.
Mélanger 96 volumes d’oxyde diéthylique avec 3 volumes de
méthanol et 1 volume d’eau, en cuve non saturée Calculer la concentration d’aflatoxine B ,, en microgrammes
Par
millilitre de solution, à partir des formules suivantes :
5.6.3 Oxyde diéthylique/méthanol/eau, mélange
a) pour la solution chloroformique :
(94 + 4,5 + 1,5).
312 x A x 1000
94 volumes d’oxyde d iéthylique avec 4,5 volumes de
Mélanger
22300
méthanol et 1,5 volumes d’eau, en cuve saturée.
pour la solution dans le mélange benzène/acétonitrile :
b)
5.6.4 Chloroforme/méthanol, mélange (94 + 6).
312 x A x 1000
Mélanger 94 volumes de chlo lroforme avec 6 volumes de métha-
19 800
nol, en cuve saturée.
5.6.5 Chloroforme/méthanol, mélange (97 + 3).
5.14.2 Dilution
Mélanger 97 volumes de chloroforme avec 3 volumes de métha-
Effectuer à l’abri de la lumière les dilutions convenables de la
nol, en cuve saturée.
solution mère (5.14.1) pour obtenir une solution étalon *dont la
concentration en aflatoxine BI soit d’environ 0,I pg/ml.
5.7 Gel de silice, pour chromatographie sur colonne, granu-
ution
Conservée au réfrigérateu r à 4 OC, cette sol est stable
lométrie : 0,05 à 0,20 mm.
durant 2 semai nes.
5.8 Gel de silice, G-HR ou équivalent, pour chromatogra-
chromatographique
5.14.3 Contrôle de la pureté
phie sur couche mince.
solution
5.9 Terre de diatomées (Hyflosupercel), lavée à l’acide.
Déposer sur une plaque (6.7) une tache de 5 FI de la solution
mère d’aflatoxine BI de concentration 8 à 10 pg/ml (5.14.1).
Développer le chromatogramme comme indiqué en 8.5.1. Sous
5.10 Sulfate de sodium, granulés anhydres.
lumière ultraviolette, la fluorescence ne doit donner lieu qu’à la
perception d’une seule tache et aucune fluorescence ne doit
5.11 Acide trifluoroacétique.
être percue dans la zone du dépôt d’origine.
5.12 Gaz inerte, par exemple azote.
5.15 Aflatoxines B, et B2 (voir l’avertissement en 5.141,
solutions pour l’essai qualitatif, contenant environ 0,I pg
5.13 Acide sulfurique, solution à 50 % (WV).
d’aflatoxines Bt et B2 par millilitre dans le chloroforme (5.1) ou
dans le mélange benzène/acétonitrile (5.4).
5.14 Aflatoxine B,, solution étalon contenant environ
Ces concentrations sont données à titre indicatif. Elles doivent
0,I Fg d’aflatoxine BI par millilitre dans le chloroforme (5.1) ou
dans le mélange benzène/acétonitrile (5.4). être ajustées de manière à obtenir la même intensité de fluores-
cence pour les deux aflatoxines (voir 8.5. IL
6 Appareillage
Préparer et contrôler la solution comme indiqué ci-après.
Matériel courant de laboratoire, et notamment
5.14.1 Préparation de la solution mère et détermination
de sa concentration
6.1 Broyeur.
Préparer une solution d’aflatoxine BI, dans le chloroforme (5.1)
6.2 Tamis, de 1,0 mm d’ouverture de maille.1)
ou dans le mélange benzène/acétonitrile (5.41, de concentra-
tion comprise entre 8 et 10 pg/ml. Déterminer son spectre
d’absorption entre 330 et 370 nm à l’aide du spectrophotomètre
63 . Appareil à secouer ou agitateur magnétique.
(6.9).
Dimensions nominales des ouvertures.
Tissus mé tailiques, tôles perforées et feuilles électro formées -
1) Voir ISO 565, Tamis de contrôle -
2
---------------------- Page: 4 ----------------------
lSO6651:1987(F)
produit concerné, sauf si l’échantillonnage en vue de la deter-
8.4 Tube pour chromatographie, en verre (diamètre inté-
mination de I’aflatoxine est exclu de son domaine d’application.
rieur 22 mm, longueur 300 mm), avec robinet en polytétrafluo-
S’il n’existe pas de Norme internationale appropriée, les parties
roethylene (PTFE) et réservoir de 250 ml, muni à son extrémité
concernées doivent se mettre d’accord, en tenant compte des
d’un tampon de coton ou de laine de verre.
caractéristiques du produit à échantillonner.
6.5 Appareil rotatif à évaporation sous vide, avec ballon
à fond rond de 500 ml.
8 Mode opératoire
6.6 Appareillage pour chromatographie sur couche
8.1 Préparation de l’échantillon pour essai
mince, à savoir matériel nécessaire à la préparation des pla-
ques (6.7) et au dépôt des taches (pipettes capillaires ou micro-
8.1.1 Si l’échantillon contient plus de 5 % de matières gras-
seringues), cuve de développement et appareil pour pulvériser
ses, celui-ci doit être dégraissé à l’éther de pétrole avant
l’acide sulfurique (5.13) sur les plaques.
d’effectuer le broyage.
Les résultats devront alors être rapportés à la masse d’échantil-
6.7 Plaques de verre pour chromatographie sur couche
Ion non dégraissé.
mince, 200 mm x 200 mm préparées comme suit (les quanti-
tés indiquées conviennent pour recouvrir cinq plaques).
Broyer l’échantillon pour laboratoire, de facon qu’il
8.1.2
,
passe en totalité au travers du tamis (6.2). Bien homogénéiser.
Introduire 30 g de gel de silice (5.8) dans une fiole conique,
(Voir ISO 6498.)
ajouter 60 ml d’eau, boucher et agiter durant 1 min. Étendre la
suspension sur les plaques, de manière à obtenir une couche
sécher à l’air et con-
uniforme de 0,25 mm d ‘épaisseur. Laisser
82 . Prise d’essai
server ensui te dans un dessiccateur garni de gel de sil ice. Au
moment de l’emploi, activer les plaques en les maintenant
Peser à 0,OI g près, 50 g de l’échantillon pour essai dans la fiole
durant 1 h dans une étuve à 110 OC.
conique (6.13).
Les plaques prêtes à l’emploi conviennent dans la mesure où
8.3 Extraction
elles donnent des résultats semblables à ceux des plaques pré-
parées comme indiqué ci-dessus.
Ajouter à la prise d’essai (8.2) 25 g de terre de diatomées (5.9),
puis 25 ml d’eau et 250 ml de chloroforme (5.1) mesurés avec
6.8 Lampe à ultraviolet à ondes longues (380 nm).
soin à l’aide d’une éprouvette. Boucher la fiole, secouer ou agi-
ter durant 30 min à l’aide de l’appareil (6.3). Filtrer sur papier
L’intensité d’irradiation doit permettre de distinguer encore net-
filtre (6.11) en ayant soin d’éliminer les 10 premiers millilitres de
tement une tache de 1,0 ng d’aflatoxine BI sur une plaque pour
filtrat et de recueillir une quantité de filtrat supérieure à 50 ml.
chromatographie sur couche mince, à une distance de 10 cm de
la lampe.
8.4 Purification
La lumière ultraviolette étant dan-
AVERTISSEMENT -
gereuse pour les yeux, il y a lieu de porter des lunettes
8.4.1 Préparation de la colonne
protectrices.
Remplir les deux tiers du tube pour chromatographie (6.4) avec
du chloroforme (5.1) et ajouter 5 g de sulfate de sodium (5.10).
6.9 Spectrophotomètre, permettant d’effectuer les mesu-
S’assurer que la surface supérieure de la couche de sulfate de
res dans l’ultraviolet.
sodium est plane, puis ajouter par petites fractions 10 g de gel
de silice (5.7). Remuer avec précaution après chaque addition
6.10 Fluorodensitomètre (éventuellement).
pour éliminer les bulles d’air. Laisser décanter durant 15 min et
ajouter ensuite avec précaution 10 g de sulfate de sodium
6.11 Papier filtre à plis. (5.10). Ouvrir le robinet et laisser s’écouler le liquide jusqu’à
proximité immédiate de la surface supérieure de la couche de
sulfate de sodium. Fermer le robinet.
6.12 Tube gradué, de 10,0 ml de capacité, avec bouchon de
polyéthylène.
8.4.2 Purification
6.13 Fiole conique, de 500 ml de capacité, à bouchon rodé.
Prélever à la pipette (6.14) 50 ml du filtrat recueilli en 8.3 dans
une fiole conique de 250 ml, ajouter 100 ml de n-hexane (5.2).
Mélanger et transvaser quantitativement le mélange dans la
6.14 Pipette, de 50 ml de capacité.
colonne en rincant avec du n-hexane. Ouvrir le robinet et laisser
s’écouler le liquide à une vitesse de 8 à 12 ml/min, jusqu’à la
6.15 Balance.
surface supérieure de la couche de sulfate de sodium. Fermer le
robinet. Éliminer le liquide récupéré et ajouter dans la colonne
100 ml d’oxyde diéthylique (5.3). Ouvrir le robinet et éliminer à
7 Échantillonnage
nouveau le liquide jusqu’à la surface supérieure de la couche de
Prélever l’échantillon pour laboratoire sur le produit à échantil- sulfate de sodium. Veiller lors de ces opérations à ce que la
colonne ne soit pas mise à sec.
lonner, en se conformant à la Norme internationale relative au
*
3
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 6651 : 1987 (F)
8.5.2 Procédé B - Chromatographie bidimensionnelle
Verser ensuite 150 ml du mélange chloroformelméthanol (5.5)
et récupérer la totalité de I’éluat dans le ballon de 500 ml de
l’évaporateur rotatif (6.5). Évaporer à sec à l’aide de I’évapora-
8.5.2.1 Application des solutions (voir figure 1)
teur rotatif, de préférence sous un courant de gaz inerte (5.12),
à pression réduite et à une température ne dépassant pas 50 OC.
Tracer sur une plaque (6.7) deux droites parallèles à deux côtés
contigus (à des distances respectives de 50 et 60 mm de ces
NOTE - En l’absence d’un évaporateur rotatif, ajouter un régularisa-
côtés), destinées à délimiter la migration des fronts de solvants.
teur d ‘ébullition et évaporer presque jusqu’à sec sur un bain d’eau.
Déposer sur la plaque à l’aide de pipettes capillaires ou de
microseringues les solutions indiquées ci-après :
Transvaser quantitativement le résidu dans le tube gradué de
10 ml (6.12) à l’aide de chloroforme (5.1) ou du mélange
-
au point A : 20 PI de l’extrait purifié de l’échantillon,
benzène/acétonitrile (5.4). Évaporer à nouveau la solution, par
obtenu en 8.4.2;
exemple dans un bain d’eau, de préférence sous un courant de
gaz inerte (5.12), et amener ensuite le volume à 2,0 ml avec du
- au point B : 20 1-11 de la solution étalon (5.14);
chloroforme (5.1) ou du mélange benzène/acétonitrile (5.4).
-
au point C : 10 PI de la solution étalon (5.14);
- au point D : 20 1-11 de la solution étalon (5.14);
8.5 Chromatographie sur couche mince
- au point E : 40 PI de la solution étalon (5.14).
8.5.1 Procédé A - Chromatographie mono-
dimensionnelle
Sécher à l’aide d’un léger courant d’air ou de gaz inerte (5.12).
Les tache
...
SLOVENSKI SIST ISO 6651
prva izdaja
STANDARD
maj 1995
Krma - Dolo~anje vsebnosti aflatoksina B (prevzet standard
1
ISO 6651:1987 z metodo platnice)
Animal feeding stuffs - Determination of aflatoxin B content
1
Aliments des animaux - Dosage de l’aflatoxine B
1
Deskriptorji: reja `ivali, krmila, kemijska analiza, dolo~anje vsebnosti, aflatoksin
Referen~na {tevilka
ICS 65.120 SIST ISO 6651:1995 (en)
Nadaljevanje na straneh od II do III in 1 do 8
© Standard je zalo`il in izdal Urad Republike Slovenije za standardizacijo in meroslovje pri Ministrstvu za znanost in tehnologijo.
Razmno`evanje ali kopiranje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
---------------------- Page: 1 ----------------------
SIST ISO 6651:1995
SIST ISO 6651 : 1995
UVOD
Standard SIST ISO 6651, Krma - Dolo~anje vsebnosti aflatoksina B , prva izdaja, 1995, ima
1
status slovenskega standarda in je z metodo platnice prevzet mednarodni standard ISO 6651,
Animal feeding stuffs - Determination of aflatoxin B content, second edition, 1987-08-15.
1
PREDGOVOR
Mednarodni standard ISO 6651:1987 je pripravil tehni~ni odbor Mednarodne organizacije za
standardizacijo ISO/TC 34 Kmetijski pridelki in `ivilski proizvodi.
Odlo~itev za prevzem tega standarda po metodi platnice je sprejela delovna skupina WG 10
Analitika krme v okviru tehni~nega odbora USM/TC K@P Kmetijski pridelki in `ivilski proizvodi.
Ta slovenski standard je dne 1995-05-08 odobril direktor USM.
ZVEZA S STANDARDI
S prevzemom tega mednarodnega standarda veljajo naslednje zveze:
SIST ISO 6654:1995 (en) Krma - Dolo~anje vsebnosti se~nine
SIST ISO 6866:1995 (en) Krma - Dolo~anje vsebnosti prostega in skupnega gosipola
SIST ISO 6870:1995 (en) Krma - Dolo~anje vsebnosti zearalenona
SIST ISO 5498:1995 (en) Kmetijski pridelki in `ivilski proizvodi - Dolo~anje vsebnosti
surove vlaknine - Splo{na metoda
SIST ISO 5983:1995 (en) Krma - Dolo~anje vsebnosti du{ika in izra~un vsebnosti surovih
beljakovin
SIST ISO 5984:1995 (en) Krma - Dolo~anje surovega pepela
SIST ISO 5985:1995 (en) Krma - Dolo~anje pepela, netopnega v klorovodikovi kislini
SIST ISO 6490-1:1995 (en) Krma - Dolo~anje vsebnosti kalcija - 1. del: Titrimetri~na metoda
SIST ISO 6490-2:1995 (en) Krma - Dolo~anje vsebnosti kalcija - 2. del: Metoda atomske
absorpcijske spektrometrije
SIST ISO 6491:1995 (en) Krma - Dolo~anje vsebnosti skupnega fosforja - Spektrofoto-
metri~na metoda
SIST ISO 6495:1995 (en) Krma - Dolo~anje vsebnosti v vodi topnih kloridov
SIST ISO 6496:1995 (en) Krma - Dolo~anje vsebnosti vlage
SIST ISO 5506:1995 (en) Sojini proizvodi - Dolo~anje ureazne aktivnosti
SIST ISO 6541:1995 (en) Kmetijski pridelki in `ivilski proizvodi - Dolo~anje vsebnosti
surove vlaknine - Modificirana Scharrerjeva metoda
OSNOVA ZA IZDAJO STANDARDA
- Prevzem standarda ISO 6651:1987
II
---------------------- Page: 2 ----------------------
SIST ISO 6651:1995
SIST ISO 6651 : 1995
OPOMBI
- Povsod, kjer se v besedilu standarda uporablja izraz “mednarodni standard”, to pomeni
v SIST ISO 6651:1995 “slovenski standard”.
- Uvod in predgovor nista sestavni del standarda.
Po mnenju Ministrstva za informiranje Republike Slovenije z dne 18. februarja 1992, {tev. 23/96-92, spada ta publikacija med
proizvode informativne narave iz 13. to~ke tarifne {tevilke 3, za katere se pla~uje 5-odstotni prometni davek.
III
---------------------- Page: 3 ----------------------
SIST ISO 6651:1995
---------------------- Page: 4 ----------------------
SIST ISO 6651:1995
INTERNATIONAL STANDARD
6651
Second edition
1987-08-U
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
MEXfiYHAPOAHAfl OPTAHM3A~Mf=l n0 CTAH~APTM3A~MM
Determination of aflatoxin B,
Animal feeding stuffs -
content
Aliments des animaux - Dosage de l’aflatoxine B1
Reference number
---------------------- Page: 5 ----------------------
SIST ISO 6651:1995
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national standards bodies (IS0 member bodies). The work of preparing International
Standards is normally carried out through IS0 technical committees. Each member
body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for approval before their acceptance as International Standards by
the IS0 Council. They are approved in accordance with IS0 procedures requiring at
least 75 % approval by the member bodies voting.
International Standard IS0 6651 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34,
Agricultural food products.
This second edition cancels and replaces the first edition (IS0 6651 : 1983), subclause
5.14.1 of which has been technically revised.
Users should note that all International Standards undergo revision from time to time
and that any reference made herein to any other International Standard implies its
latest edition, unless otherwise stated.
0 International Organization for Standardization, 1987
Printed in Switzerland
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SIST ISO 6651:1995
INTERNATIONAL STANDARD IS0 6651 : 1987 (E)
Determination of aflatoxin B,
Animal feeding stuffs -
content
Evaporation of the eluate and dissolution of the residue in a
1 Scope
specified volume of chloroform or mixture of benzene and
This International Standard specifies two methods for the acetonitrile.
determination of the aflatoxin B1 content of animal feeding
stuffs. Thin-layer chromatography, one-dimensional for method A and
two-dimensional for method B, of an aliquot portion of this
solution.
2 Field of application
Determination of the aflatoxin B, content, either visually or by
fluorodensitometry, by examination of the chromatogram
2.1 Method A is applicable to the following simple feeding
under ultraviolet light and comparison with known quantities of
standard aflatoxin B1 applied to the same plate as the test por-
tion extract.
oilseeds and oilseed residues, and in particular ground-
copra, linseed, soya, sesame, babassu palm;
Confirmation of the identity of aflatoxin B, by formation of the
hemiacetal derivative.
maniac meal;
maize germ expeller;
5 Reagents
cereals and cereal products;
All reagents shall be of recognized analytical quality. The water
pea meal;
used shall be distilled water or water of at least equivalent
purity.
potato pulp and flour.
5.1 Chloroform, stabilized with 0,5 to 1,0 % of 96 % (Vl VI
In the presence of substances interfering with the determina-
ethanol.
tion by method A, it is recommended that the determination be
carried out in accordance with method B.
5.2 n-Hexane.
2.2 Method B is applicable to mixed feeding stuffs and to
simple feeding stuffs not mentioned in 2.1.
5.3 Diethyl ether, anhydrous, free from peroxides.
This method is not applicable to feeding stuffs containing citrus
5.4 Benzene/acetonitrile, (98 + 2) mixture.
Pulp-
Mix 98 volumes of benzene with 2 volumes of acetonitrile.
2.3 The lower limit of detection of aflatoxin B, is 0,Ol mg/kg.
5.5 Chloroform/methanol, (97 + 3) mixture.
3 Reference
Mix 97 volumes of chloroform with 3 volumes of methanol.
IS 0 6498, Animal feeding stuffs - Preparation of test samples.
5.6 ’ Developing solvents.1)
4’ Principle 5.6.1 Chloroform/acetone, (90 + 10) mixture.
Extraction of the test portion with chloroform, filtration, and Mix 90 volumes of chloroform with 10 volumes of acetone, in
an unsaturated tank.
purification of an aliquot portion on a silica gel column.
1) The solvents should be used in covered tanks. When saturated tanks are specified, this is achieved by lining the tanks with absorbent paper and
allowing the interiors to become saturated with solvent vapour.
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SIST ISO 6651:1995
IS0 6651 : 1987 (E)
Measure the absorbance (A) at 363 nm in the case of the
5.62 Diethyl ether/methanol/water, (96 + 3 + II mix-
chloroform solution, or at 348 nm in the case of the
ture.
benzene/acetonitrile mixture solution.
Mix 96 volumes of diethyl ether, 3 volumes of methanol and l
Calculate the concentration of aflatoxin B1, in micrograms per
volume of water, in an unsaturated tank.
millilitre of solution, from the formulae :
5.6.3 Diethyl ether/methanol/water, (94 + 4,5 + 1,5)
a) for the chloroform solution :
mixture.
312 x A x 1000
Mix 94 volumes of diethyl ether with 4,5 volumes of methanol
and 1,5 volumes of water, in a saturated tank. 22 300
b) for the solution in the benzene/acetonitrile mixture :
5.6.4 Chloroform/methanol, (94 + 6) mixture.
312 x A x 1000
Mix 94 volumes of chloroform with 6 volumes of methanol, in a
19800
saturated tank.
5.142 Dilution
5.6.5 Chloroform/methanol, (97 + 3) mixture.
5.7 Silica gel, for column chromatography, of particle size
If kept in a refrigerator at 4 OC, this solution is stable for 2
0,05 to 0,20 mm.
weeks.
5.8 Silica gel, G-HR or equivalent, for thin-layer chromatog-
5.14.3 Testing of chromatographic purity of the solution
raphy.
Onto a plate (6.71, apply a spot of 5 pl of the standard aflatoxin
.9 Diatomaceous earth (Hyflosupercel), acid-washed.
B1 solution of concentration 8 to 10 pg/ml (5.14.1). Develop
the chromatogram as indicated in 8.5.1. Under ultraviolet light,
the chromatogram shall show only one spot and no
.I0 Sodium sulfate, anhydrous granules.
fluorescence shall be perceptible in the original deposition
zone.
5.11 Trifluoroacetic acid.
5.15 Aflatoxin B1 and B2 (see the warning in 5.14), solu-
5.12 Inert gas, for example nitrogen.
tions for qualitative testing, containing about 0,l pg of afla-
toxin B1 and B2 per millilitre, in the chloroform (5.1) or in the
benzene/acetonitrile mixture (5.4).
5.13 Sulfuric acid, 50 % (V/v) solution.
These concentrations are given as a guide. They shall be ad-
5.14 Aflatoxin B1, standard solution containing about
justed so as to obtain the same intensity of fluorescence for
0,l pg of aflatoxin B, per millilitre, in the chloroform (5.1) or in
both aflatoxins (see 8.5.1).
the benzene/acetonitrile mixture (5.4).
carcinogenic and
WARNING - Aflatoxins are highly
must be handled with great care.
Prepare and check the solution as follows.
6 Apparatus
Usual laboratory equipment, and in particular :
solution and determination
5.14.1 Preparatio n of stock
of concentration
6.1 Grinder/mixer.
Prepare a solution of aflatoxin B, in the chloroform (5.1) or the
benzene/acetonitrile mixture (5.4) such that the concentration
6.2 Sieve, of aperture size I,0 mm.1)
is between 8 and 10 pg/ml. Determine the absorption spectrum
between 330 and 370 nm by means of the spectrophotometer
(6.9). 63 . Shaking apparatus or magnetic stirrer.
1) See IS0 565, Test sieves - Woven metal wire cloth, perforated plate and electroformed sheet - Nominal sizes of openings.
2
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SIST ISO 6651:1995
IS0 6651 : 1987 (E)
6.4 Chromatographic tubes, made of glass (internal national Standard exists, agreement shall be reached between
the parties concerned, taking into account the characteristics
diameter 22 mm, length 300 mm), with a polytetrafluoro-
of the material being sampled.
ethylene tap and a 250 ml reservoir, plugged at the bottom end
with cotton or glass wool.
8 Procedure
6.5 Rotary vacuum evaporator, with a 500 ml round-
bottomed flask.
8.1 Preparation of the test sample
6.6 Apparatus for thin-layer chromatography (TLC), i.e.
that necessary for the preparation of the plates (6.7) and ap-
8.1.1 If the sample contains more than 5 % of fat, it shall be
plication of spots (capillary pipettes or microsyringes), a
defatted with light petroleum before grinding.
developing tank, and spraying apparatus for applying the
sulfuric acid (5.13) to the plates.
In such cases, the analytical results shall be expressed in terms
of the mass of the non-defatted sample.
6.7 Glass TLC plates, 200 mm x 200 mm, prepared as
follows (the quantities indicated are sufficient to cover five
8.1.2 Grind the laboratory sample so that it completely passes
plates).
through the sieve (6.2). Mix thoroughly. (See IS0 6498.)
Place 30 g of the silica gel (5.8) in a conical flask, add 60 ml of
water, stopper and shake for 1 min. Spread the suspension on
8.2 Test portion
the plates so as to obtain a uniform layer 0,25 mm thick. Leave
to dry in the air and then store in a desiccator containing silica
Weigh, to the nearest 0,Ol g, 50 g of the prepared test sample
gel. At the time of use, activate the plates by keeping them in
into the conical flask (6.13).
an oven at 110 OC for 1 h.
Ready-to-use plates are suitable if they give results similar to
8.3 Extraction
those obtained with the plates prepared as indicated above.
Add to the test portion (8.2) 25 g of the diatomaceous earth
(5.9), 25 ml of water, and 250 ml of the chloroform (5.1) ac-
6.8 Long-wavelength (380 nm) ultraviolet lamp.
curately measured from a measuring cylinder. Stopper the
flask, and shake or stir for 30 min using the apparatus (6.3).
The intensity of irradiation shall make it possible for a spot of
Filter through the fluted filter paper (6.11), taking care to
1,O ng of aflatoxin RI to be clearly distinguished on a TLC plate
discard the first 10 ml of the filtrate, and subsequently collect at
at a distance of 10 cm from the lamp.
least 50 ml of the filtrate.
WARNING - Ultraviolet light is dangerous to the eyes.
Protective goggles shall be worn.
8.4 Column clean-up
Spectrophotometer, suitable for making measure-
69 .
8.4.1 Preparation of the column
ments in the ultraviolet region of the spectrum.
Fill two-thirds of the chromatographic tube (6.4) with the
6* 10 Fluorodensitometer (optional).
chloroform (5.1) and add 5 g of the sodium sulfate (5.10).
Check that the upper surface of the sodium sulfate layer is flat,
6.11 Fluted filter paper.
then add 10 g, in small portions, of the silica gel (5.7). Stir
carefully after each addition to eliminate air bubbles. Leave to
stand for 15 min and then carefully add 10 g of the sodium
6.12 Graduated tube, of capacity 10,O ml, with a
sulfate (5.10). Open the tap and allow the liquid to flow until it
polyethylene stopper.
is just above the upper surface of the sodium sulfate layer.
Close the tap.
6.13 . Conical flask, of capacity 500 ml, with a ground glass
stopper.
8.4.2 Purification
6.14 Pipette, of capacity 50 ml.
Transfer, by means of the pipette (6.14), 50 ml of the filtrate
collected in 8.3 to a 250 ml conical flask, and add 100 ml of the
n-hexane (5.2). Mix and quantitatively transfer the mixture to
6.15 Balance.
the column, rinsing the flask with the n-hexane. Open the tap
and allow the liquid to flow at a rate of 8 to 12 ml/min until it is
level with the upper surface of the sodium sulfate layer. Close
7 Sampling
the tap. Discard the liquid collected and pour 100 ml of the
Take the laboratory sample from the material to be sampled in diethyl ether (5.3) into the column. Again open the tap and
allow the liquid to flow until it is level with the upper surface of
accordance with the International Standard for the material
concerned unless sampling for the determination of aflatoxin is the sodium sulfate layer. During these operations, ensure that
the column does not run dry.
excluded from its field of applJcation. If no appropriate Inter-
3
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SIST ISO 6651:1995
IS0 6651 : 1987 (E)
8.5.2 imensional thin-layer
Elute with 150 ml of the chloroform/metha
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.