SIST ISO 21427-1:2010

Water quality - Evaluation of genotoxicity by measurement of the induction of micronuclei - Part 1: Evaluation of genotoxicity using amphibian larvae

This part of ISO 21427 specifies a method for assessing genotoxicity using Amphibia larvae (Xenopus laevis and Pleurodeles waltl). The provisions specific to Pleurodeles are described in Annex A. The method is applicable to:
- aqueous effluents;
- aqueous leachates;
- eluates of soils;
- eluates of industrial waste;
- eluates of sludges from sewage treatment;
- surface and ground water;
- water-soluble substances.

Qualité de l'eau - Évaluation de la génotoxicité par le mesurage de l'induction de micronoyaux - Partie 1: Évaluation de la génotoxicité à l'aide de larves d'amphibiens

L'ISO 21427-1:2006 spécifie une méthode pour évaluer la génotoxicité à l'aide de larves d'amphibiens (Xenopus laevis et Pleurodeles waltl). La méthode décrite s'applique aux effluents aqueux, aux lixiviats aqueux, aux éluats de sols, aux éluats de déchets industriels, aux éluats de boues de traitement des eaux usées, aux eaux de surface et souterraines, aux substances solubles dans l'eau et miscibles à l'eau.

Kakovost vode - Vrednotenje genotoksičnosti z merjenjem indukcije mikronukleusov - 1. del: Vrednotenje genotoksičnosti z uporabo ličink dvoživk

Ta del ISO 21427 določa metodo ocenjevanja genotoksičnosti z uporabo ličink dvoživk (Xenopus laevis and Pleurodeles waltl). Določbe, ustrezne za Pleurodeles, so opisane v dodatku A. Metoda se uporablja za:
- vodne odplake;
- vodne izlužke;
- eluate prsti;
- eluati industrijskih odplak;
- eluate blata iz čiščenja odplak;
- površinske in podtalne vode;
- v vodi topne snovi.

General Information

• Status: Published
• Public Enquiry End Date: 19-Jul-2009
• Publication Date: 01-Jul-2010
• ICS: 13.060.70 - Examination of biological properties of water
• Technical Committee: KAV - Water quality
• Current Stage: 6060 - National Implementation/Publication (Adopted Project)
• Start Date: 12-May-2010
• Due Date: 17-Jul-2010
• Completion Date: 02-Jul-2010
• Ref Project: ISO 21427-1:2006 - Water quality — Evaluation of genotoxicity by measurement of the induction of micronuclei — Part 1: Evaluation of genotoxicity using amphibian larvae

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21427-1
First edition
2006-08-01

Water quality — Evaluation of
genotoxicity by measurement of the
induction of micronuclei —
Part 1:
Evaluation of genotoxicity using
amphibian larvae
Qualité de l'eau — Évaluation de la génotoxicité par le mesurage de
l'induction de micronoyaux —
Partie 1: Évaluation de la génotoxicité à l'aide de larves d'amphibiens





Reference number
ISO 21427-1:2006(E)
©
ISO 2006

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ISO 21427-1:2006(E)
PDF disclaimer
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shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
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the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.


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electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Published in Switzerland

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ISO 21427-1:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 2
4 Principle. 2
5 Test environment. 3
6 Reagents. 3
7 Apparatus . 4
8 Treatment and preparation of samples . 4
8.1 Waters, effluents, leachates and eluates to be tested . 4
8.2 Substances to be tested . 5
9 Procedure . 5
9.1 Selection of concentrations. 5
9.2 Conducting the test . 6
9.3 Reading of the histological preparations. 6
10 Expression of results . 6
10.1 Presentation of results. 6
10.2 Processing of results . 7
10.3 Interpretation of results. 7
11 Validity of the test. 7
12 Test report . 7
Annex A (normative) Data specific to Pleurodeles waltl. 9
Annex B (normative) Breeding . 10
Annex C (informative) Example of a statistical method for processing results . 11
Bibliography . 14

© ISO 2006 – All rights reserved iii

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ISO 21427-1:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 21427-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
ISO 21427 consists of the following parts, under the general title Water quality — Evaluation of genotoxicity by
measurement of the induction of micronuclei:
⎯ Part 1: Evaluation of genotoxicity using amphibian larvae
⎯ Part 2: Mixed population method using the cell line V79
iv © ISO 2006 – All rights reserved

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ISO 21427-1:2006(E)
Introduction
Environmental protection calls for taking into account the genotoxic hazards likely to concern the different
populations making up ecosystems. Since such hazards may emerge within waters, it is essential to assess
them by means of laboratory tests that allow the evaluation, within aqueous environments, of the genotoxicity
of a water, effluent, substance or preparation with respect to organisms living in aquatic environments.
This part of ISO 21427 describes a test method that is likely to provide information in this field. It allows the
highlighting, within aqueous environments, of the genotoxic effects on larvae of the two amphibian species,
Xenopus laevis and Pleurodeles waltl.
The choice of the Xenopus is recommended because of several advantages offered by this species: high
hatching rates, available all year round after hormone treatment of the breeders, rapid larval development,
easy feeding of larvae, widespread distribution within research or breeding centres. However, the described
method is, basically, also applicable to Pleurodeles larvae. The provisions specific to Pleurodeles are
described in Annex A.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21427-1:2006(E)

Water quality — Evaluation of genotoxicity by measurement of
the induction of micronuclei —
Part 1:
Evaluation of genotoxicity using amphibian larvae
WARNING — Persons using this part of ISO 21427 should be familiar with normal laboratory practice.
This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated
with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and
to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this part of ISO 21427 be
carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This part of ISO 21427 specifies a method for assessing genotoxicity using Amphibia larvae (Xenopus laevis
and Pleurodeles waltl). The provisions specific to Pleurodeles are described in Annex A.
The method is applicable to:
⎯ aqueous effluents;
⎯ aqueous leachates;
⎯ eluates of soils;
⎯ eluates of industrial waste;
⎯ eluates of sludges from sewage treatment;
⎯ surface and ground water;
⎯ water-soluble substances.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 7346-1, Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish
[Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Part 1: Static method
© ISO 2006 – All rights reserved 1

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ISO 21427-1:2006(E)
ISO 7346-2, Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish
[Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Part 2: Semi-static method
ISO 7346-3, Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish
[Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Part 3: Flow-through method
EN 12457-2, Characterization of waste — Leaching — Compliance test for leaching of granular waste
materials and sludges — Part 2: One stage batch test at a liquid to solid ratio of 10 l/kg with particle size
below 4 mm (without or with size reduction)
NF T 90-305, Testing water — Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri — Static
and flow through methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
micronuclei
small particles consisting of acentric fragments of chromosomes and/or entire chromosomes which lag behind
at anaphase stage of cell division and form, after telophase, single or multiple micronuclei in the cytoplasm
3.2
sample under test
substance, effluent, surface water, ground water, aqueous effluent, leachate, percolate or eluate submitted to
testing
3.3
test medium
mixture of test water (6.2), the sample under test and food
3.4
test solution
mixture of test water (6.2) and the sample under test
4 Principle
[3]
The test organisms are exposed during 12 d to a range of concentrations of the sample under test. A
control test without a sample (negative control) and a control test with a genotoxic reference substance
(positive control) are carried out in parallel under the same conditions. The positive control allows the quality
of the biological reagent to be checked and the test to be validated.
During cell division, chromatid fragments without centromers do not move to the nuclei of the daughter cells
and stay within the cytoplasma. Some of the chromosomal aberrations induced by the test material are due to
chromatid fragments without centromer and are therefore not incorporated in the nuclei of the daughter cells.
In addition, spindle disorders may lead to chromosomes which are not incorporated into the nucleus. They are
not nuclei and they are formed in the cell cytoplasm not in the plasma. The rate (per thousand ‰) of
erythrocytes with micronuclei is determined for each concentration of the sample under test and for the control
solutions. The rate of erythrocytes with micronuclei for each concentration is compared to that of the negative
control in order to determine the concentrations that induce a positive genotoxic effect.
NOTE The rate of erythrocytes with micronuclei is defined as the level of erythrocytes including one or more
micronuclei scored in a sample of 1 000 erythrocytes observed in one blood smear.
2 © ISO 2006 – All rights reserved

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ISO 21427-1:2006(E)
5 Test environment
All of the tests and handling operations as well as the breeding of the adults and larvae shall be performed in
a room in which the atmosphere is free from toxic dusts and vapours.
The test is conducted under lighting (artificial light or natural light without direct sunshine) according to a
12 h light/12 h dark cycle, in a thermostatically-controlled chamber (7.3) so as to maintain the bottles at a
temperature of 22 °C ± 1 °C.
6 Reagents
1)
6.1 Biological reagent, Xenopus laevis designated hereafter by the common name Xenopus.
[1]
The tests shall start on larvae at stage 50 of the Nieuwkoop and Faber chronological table of development.
At this stage, the animals measure 20 mm to 27 mm in length and present a constriction at the base of the
hind leg.
The larvae shall be kept in vessels (7.2) for a period of at least 8 d before the start of the test under
temperature and lighting conditions identical to those of the test. The larvae shall be free of diseases and
malformations.
For a given test, the batches of treated larvae and control larvae shall stem from the same hatching process.
Each batch is made up of at least 15 test vessels (7.2).
6.2 Test water.
The water used for the test shall meet the criteria described in the first paragraph of Annex B. If water other
than the breeding water is used, the organisms shall be maintained in this water during at least 8 d before
starting the test.
6.3 Food.
2)
The food employed is that usually intended for aquarium fish . It shall be ground to a powder just prior to use.
Freeze-dried watercress powder may also be used.
6.4 Reference substance, Cyclophosphamide monohydrate (C H Cl N O P,HO), of recognized
7 15 2 2 2 2
analytical quality, at a concentration of 20 mg/l.
6.5 Intermediate solvent, dimethyl sulfoxide (DMSO) or any other appropriate water-miscible solvent.
The genotoxicity and general toxicity of the solvent being used shall be established beforehand.
6.6 Anaesthetic, tricaine methane sulfonate.
6.7 Heparin, 200 µg/l solution of powdered heparin in a 7 g/l aqueous solution of sodium chloride.
6.8 Methanol, CH OH, of recognized analytical quality.
3

1) Xenopus can be obtained from the Service d’élevage de Xénopes du C.N.R.S., UPRES A 6026 C.N.R.S., Université
de Rennes I, Avenue du Général Leclerc, 35042 Rennes Cedex, France. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2) Tetraphyll is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
© ISO 2006 – All rights reserved 3

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ISO 21427-1:2006(E)
[16]
6.9 Stains
6.9.1 Masson's haemalum.
Composition
Haematin 2 mg/ml
Potassium alum 10 %
6.9.2 Groat's haematoxylin.
Composition
Ammonium ferric sulfate (Iron alum) 1,0 g
Haematoxylin 0,5 g
Sulfuric acid concentrated 0,8 ml
Ethanol 50 ml
Water 50 ml
7 Apparatus
Ordinary laboratory apparatus in glass or chemically inert material and in particular the following.
7.1 Aquariums, 25 l or 50 l capacity.
7.2 Glass containers, e.g. bottles, 5 l capacity, capable of being hermetically closed.
Conical flasks with ground-glass stoppers or rubber bungs covered with a tetrafluorocarbon film are suitable.
7.3 Thermostatically-controlled chamber, of sufficient capacity to hold all the bottles corresponding to
the different batches of one complete test – test sample, reference substance and negative control – and able
to maintain the bottles (7.2) at a temperature of 22 °C ± 1 °C.
7.4 Binocular magnifying glass.
7.5 Microscope, fitted with an immersion lens (total magnification × 1 500).
7.6 Heparinized micropipettes.
NOTE To be heparinized, the micropipettes are stretched and opened, then the sharp size of the micropipette is filled
with a 200 µg/ml solution of heparin in a 7 g/l NaCl solution.
8 Treatment and preparation of samples
8.1 Waters, effluents, leachates and eluates to be tested
It is recommended to carry out the sampling, transportation and storage of the samples in accordance with the
general procedures as specified in ISO 5667-16.
The interval between the collection of the sample and its receipt by the laboratory shall not exceed 24 h.
4 © ISO 2006 – All rights reserved

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ISO 21427-1:2006(E)
For solid samples (waste, soils, sludge), conduct, within 1 month following the receipt of the sample by the
laboratory, a leaching test according to the protocol specified in EN 12457-2. However, the obtained aqueous
eluates shall not be filtered prior to testing. The obtained eluates shall be kept in the dark at a temperature of
4 °C ± 3 °C until the test is performed. The latter shall be started at the latest 24 h after the leaching stage.
The samples of waters, effluents or leachates, contained in bottles made from chemically inert materials, shall
be kept in the dark at a temperature of 4 °C ± 3 °C until the test is performed. The latter shall be conducted at
the latest 24 h after receipt of the sample by the laboratory.
At the time of testing, homogenize the sample to be analysed. The quantities of sample (3.2) required for the
daily renewals of test medium (3.3) are brought up to the temperature of 22 °C ± 1
...

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 21427-1:2010
01-september-2010
.DNRYRVWYRGH9UHGQRWHQMHJHQRWRNVLþQRVWL]PHUMHQMHPLQGXNFLMH
PLNURQXNOHXVRYGHO9UHGQRWHQMHJHQRWRNVLþQRVWL]XSRUDEROLþLQNGYRåLYN
Water quality - Evaluation of genotoxicity by measurement of the induction of
micronuclei - Part 1: Evaluation of genotoxicity using amphibian larvae
Qualité de l'eau - Évaluation de la génotoxicité par le mesurage de l'induction de
micronoyaux - Partie 1: Évaluation de la génotoxicité à l'aide de larves d'amphibiens
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 21427-1:2006
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 21427-1:2010 en,fr
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 21427-1:2010

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SIST ISO 21427-1:2010


INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21427-1
First edition
2006-08-01

Water quality — Evaluation of
genotoxicity by measurement of the
induction of micronuclei —
Part 1:
Evaluation of genotoxicity using
amphibian larvae
Qualité de l'eau — Évaluation de la génotoxicité par le mesurage de
l'induction de micronoyaux —
Partie 1: Évaluation de la génotoxicité à l'aide de larves d'amphibiens





Reference number
ISO 21427-1:2006(E)
©
ISO 2006

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SIST ISO 21427-1:2010
ISO 21427-1:2006(E)
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ISO 21427-1:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 2
4 Principle. 2
5 Test environment. 3
6 Reagents. 3
7 Apparatus . 4
8 Treatment and preparation of samples . 4
8.1 Waters, effluents, leachates and eluates to be tested . 4
8.2 Substances to be tested . 5
9 Procedure . 5
9.1 Selection of concentrations. 5
9.2 Conducting the test . 6
9.3 Reading of the histological preparations. 6
10 Expression of results . 6
10.1 Presentation of results. 6
10.2 Processing of results . 7
10.3 Interpretation of results. 7
11 Validity of the test. 7
12 Test report . 7
Annex A (normative) Data specific to Pleurodeles waltl. 9
Annex B (normative) Breeding . 10
Annex C (informative) Example of a statistical method for processing results . 11
Bibliography . 14

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SIST ISO 21427-1:2010
ISO 21427-1:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 21427-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
ISO 21427 consists of the following parts, under the general title Water quality — Evaluation of genotoxicity by
measurement of the induction of micronuclei:
⎯ Part 1: Evaluation of genotoxicity using amphibian larvae
⎯ Part 2: Mixed population method using the cell line V79
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SIST ISO 21427-1:2010
ISO 21427-1:2006(E)
Introduction
Environmental protection calls for taking into account the genotoxic hazards likely to concern the different
populations making up ecosystems. Since such hazards may emerge within waters, it is essential to assess
them by means of laboratory tests that allow the evaluation, within aqueous environments, of the genotoxicity
of a water, effluent, substance or preparation with respect to organisms living in aquatic environments.
This part of ISO 21427 describes a test method that is likely to provide information in this field. It allows the
highlighting, within aqueous environments, of the genotoxic effects on larvae of the two amphibian species,
Xenopus laevis and Pleurodeles waltl.
The choice of the Xenopus is recommended because of several advantages offered by this species: high
hatching rates, available all year round after hormone treatment of the breeders, rapid larval development,
easy feeding of larvae, widespread distribution within research or breeding centres. However, the described
method is, basically, also applicable to Pleurodeles larvae. The provisions specific to Pleurodeles are
described in Annex A.
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SIST ISO 21427-1:2010

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SIST ISO 21427-1:2010
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21427-1:2006(E)

Water quality — Evaluation of genotoxicity by measurement of
the induction of micronuclei —
Part 1:
Evaluation of genotoxicity using amphibian larvae
WARNING — Persons using this part of ISO 21427 should be familiar with normal laboratory practice.
This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated
with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and
to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this part of ISO 21427 be
carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This part of ISO 21427 specifies a method for assessing genotoxicity using Amphibia larvae (Xenopus laevis
and Pleurodeles waltl). The provisions specific to Pleurodeles are described in Annex A.
The method is applicable to:
⎯ aqueous effluents;
⎯ aqueous leachates;
⎯ eluates of soils;
⎯ eluates of industrial waste;
⎯ eluates of sludges from sewage treatment;
⎯ surface and ground water;
⎯ water-soluble substances.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 7346-1, Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish
[Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Part 1: Static method
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SIST ISO 21427-1:2010
ISO 21427-1:2006(E)
ISO 7346-2, Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish
[Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Part 2: Semi-static method
ISO 7346-3, Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish
[Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Part 3: Flow-through method
EN 12457-2, Characterization of waste — Leaching — Compliance test for leaching of granular waste
materials and sludges — Part 2: One stage batch test at a liquid to solid ratio of 10 l/kg with particle size
below 4 mm (without or with size reduction)
NF T 90-305, Testing water — Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri — Static
and flow through methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
micronuclei
small particles consisting of acentric fragments of chromosomes and/or entire chromosomes which lag behind
at anaphase stage of cell division and form, after telophase, single or multiple micronuclei in the cytoplasm
3.2
sample under test
substance, effluent, surface water, ground water, aqueous effluent, leachate, percolate or eluate submitted to
testing
3.3
test medium
mixture of test water (6.2), the sample under test and food
3.4
test solution
mixture of test water (6.2) and the sample under test
4 Principle
[3]
The test organisms are exposed during 12 d to a range of concentrations of the sample under test. A
control test without a sample (negative control) and a control test with a genotoxic reference substance
(positive control) are carried out in parallel under the same conditions. The positive control allows the quality
of the biological reagent to be checked and the test to be validated.
During cell division, chromatid fragments without centromers do not move to the nuclei of the daughter cells
and stay within the cytoplasma. Some of the chromosomal aberrations induced by the test material are due to
chromatid fragments without centromer and are therefore not incorporated in the nuclei of the daughter cells.
In addition, spindle disorders may lead to chromosomes which are not incorporated into the nucleus. They are
not nuclei and they are formed in the cell cytoplasm not in the plasma. The rate (per thousand ‰) of
erythrocytes with micronuclei is determined for each concentration of the sample under test and for the control
solutions. The rate of erythrocytes with micronuclei for each concentration is compared to that of the negative
control in order to determine the concentrations that induce a positive genotoxic effect.
NOTE The rate of erythrocytes with micronuclei is defined as the level of erythrocytes including one or more
micronuclei scored in a sample of 1 000 erythrocytes observed in one blood smear.
2 © ISO 2006 – All rights reserved

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SIST ISO 21427-1:2010
ISO 21427-1:2006(E)
5 Test environment
All of the tests and handling operations as well as the breeding of the adults and larvae shall be performed in
a room in which the atmosphere is free from toxic dusts and vapours.
The test is conducted under lighting (artificial light or natural light without direct sunshine) according to a
12 h light/12 h dark cycle, in a thermostatically-controlled chamber (7.3) so as to maintain the bottles at a
temperature of 22 °C ± 1 °C.
6 Reagents
1)
6.1 Biological reagent, Xenopus laevis designated hereafter by the common name Xenopus.
[1]
The tests shall start on larvae at stage 50 of the Nieuwkoop and Faber chronological table of development.
At this stage, the animals measure 20 mm to 27 mm in length and present a constriction at the base of the
hind leg.
The larvae shall be kept in vessels (7.2) for a period of at least 8 d before the start of the test under
temperature and lighting conditions identical to those of the test. The larvae shall be free of diseases and
malformations.
For a given test, the batches of treated larvae and control larvae shall stem from the same hatching process.
Each batch is made up of at least 15 test vessels (7.2).
6.2 Test water.
The water used for the test shall meet the criteria described in the first paragraph of Annex B. If water other
than the breeding water is used, the organisms shall be maintained in this water during at least 8 d before
starting the test.
6.3 Food.
2)
The food employed is that usually intended for aquarium fish . It shall be ground to a powder just prior to use.
Freeze-dried watercress powder may also be used.
6.4 Reference substance, Cyclophosphamide monohydrate (C H Cl N O P,HO), of recognized
7 15 2 2 2 2
analytical quality, at a concentration of 20 mg/l.
6.5 Intermediate solvent, dimethyl sulfoxide (DMSO) or any other appropriate water-miscible solvent.
The genotoxicity and general toxicity of the solvent being used shall be established beforehand.
6.6 Anaesthetic, tricaine methane sulfonate.
6.7 Heparin, 200 µg/l solution of powdered heparin in a 7 g/l aqueous solution of sodium chloride.
6.8 Methanol, CH OH, of recognized analytical quality.
3

1) Xenopus can be obtained from the Service d’élevage de Xénopes du C.N.R.S., UPRES A 6026 C.N.R.S., Université
de Rennes I, Avenue du Général Leclerc, 35042 Rennes Cedex, France. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2) Tetraphyll is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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SIST ISO 21427-1:2010
ISO 21427-1:2006(E)
[16]
6.9 Stains
6.9.1 Masson's haemalum.
Composition
Haematin 2 mg/ml
Potassium alum 10 %
6.9.2 Groat's haematoxylin.
Composition
Ammonium ferric sulfate (Iron alum) 1,0 g
Haematoxylin 0,5 g
Sulfuric acid concentrated 0,8 ml
Ethanol 50 ml
Water 50 ml
7 Apparatus
Ordinary laboratory apparatus in glass or chemically inert material and in particular the following.
7.1 Aquariums, 25 l or 50 l capacity.
7.2 Glass containers, e.g. bottles, 5 l capacity, capable of being hermetically closed.
Conical flasks with ground-glass stoppers or rubber bungs covered with a tetrafluorocarbon film are suitable.
7.3 Thermostatically-controlled chamber, of sufficient capacity to hold all the bottles corresponding to
the different batches of one complete test – test sample, reference substance and negative control – and able
to maintain the bottles (7.2) at a temperature of 22 °C ± 1 °C.
7.4 Binocular magnifying glass.
7.5 Microscope, fitted with an immersion lens (total magnification × 1 500).
7.6 Heparinized micropipettes.
NOTE To be heparinized, the micropipettes are stretched and opened, then the sharp size of the micropipette is filled
with a 200 µg/ml solution of heparin in a 7 g/l NaCl solution.
8 Treatment and preparation of samples
8.1 Waters, effluents, leachates and eluates to be tested
It is recommended to carry out the sampling, transportation and storage of the samples in accordance with the
general procedures as specified in ISO 5667-16.
The interval between the collection of the sample and its receipt by the laboratory shall not exceed 24 h.
4 © ISO 2006 – All rights reserved

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SIST ISO 21427-1:2010
ISO 21427-1:2006(E)
For solid samples (waste, soils, sludge), conduct, within 1 month following the receipt of the sample by the
laboratory, a leaching test according to the protocol specified in EN 12457-2. However, the obtained aqueous
eluates shall not be filtered prior to testing. The obtained eluates shall be kept in the dark at a temperature of
4 °
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21427-1
Première édition
2006-08-01

Qualité de l'eau — Évaluation de la
génotoxicité par le mesurage de
l'induction de micronoyaux —
Partie 1:
Évaluation de la génotoxicité à l'aide de
larves d'amphibiens
Water quality — Evaluation of genotoxicity by measurement of the
induction of micronuclei —
Part 1: Evaluation of genotoxicity using amphibian larvae





Numéro de référence
ISO 21427-1:2006(F)
©
ISO 2006

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ISO 21427-1:2006(F)
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E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Publié en Suisse

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ISO 21427-1:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 2
4 Principe. 2
5 Environnement de l'essai. 3
6 Réactifs . 3
7 Appareillage . 4
8 Traitement et préparation des échantillons . 4
8.1 Eaux, effluents, lixiviats et éluats étudiés. 4
8.2 Substances étudiées . 5
9 Mode opératoire . 5
9.1 Sélection des concentrations. 5
9.2 Réalisation de l'essai. 6
9.3 Interprétation des préparations histologiques . 6
10 Expression des résultats . 7
10.1 Présentation des résultats. 7
10.2 Traitement des résultats . 7
10.3 Interprétation des résultats . 7
11 Validité de l'essai . 7
12 Rapport d'essai . 8
Annexe A (normative) Données spécifiques à Pleurodeles waltl . 9
Annexe B (normative) Élevage .10
Annexe C (informative) Exemple de méthode statistique pour le traitement des résultats . 11
Bibliographie . 14

© ISO 2006 – Tous droits réservés iii

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ISO 21427-1:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 21427-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
L'ISO 21427 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l'eau — Évaluation
de la génotoxicité par le mesurage de l'induction de micronoyaux:
⎯ Partie 1: Évaluation de la génotoxicité à l'aide de larves d'amphibiens
⎯ Partie 2: Méthode de la population mélangée à l'aide de la lignée de cellules V79
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ISO 21427-1:2006(F)
Introduction
La protection de l'environnement exige de prendre en considération les dangers génotoxiques susceptibles de
toucher les différentes populations qui constituent les écosystèmes. Étant donné que ces dangers peuvent
concerner l'eau, il est indispensable de les apprécier au moyen d'essais en laboratoire permettant d'évaluer,
dans les milieux aqueux, la génotoxicité d'une eau, d'un effluent, d'une substance ou d'une préparation
vis-à-vis des organismes vivant en milieu aquatique.
La présente partie de l'ISO 24127 décrit une méthode d'essai susceptible de fournir des informations dans ce
domaine. Elle permet de mettre en évidence, dans les milieux aquatiques, les effets génotoxiques sur les
larves de deux espèces d'amphibiens vivant en milieu aquatique, Xenopus laevis et Pleurodeles waltl.
Il est recommandé de choisir Xenopus du fait des différents avantages que présente cette espèce (taux
d'éclosion élevé, disponibilité tout au long de l'année après un traitement hormonal des reproducteurs,
développement larvaire rapide, alimentation facile des larves, distribution étendue dans les centres de
recherche ou d'élevage). Cependant, la méthode décrite s'applique aussi aux larves de Pleurodèles. Les
dispositions spécifiques à cet organisme sont données dans l'Annexe A.
© ISO 2006 – Tous droits réservés v

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NORME INTERNATIONALE ISO 21427-1:2006(F)

Qualité de l'eau — Évaluation de la génotoxicité par le
mesurage de l'induction de micronoyaux —
Partie 1:
Évaluation de la génotoxicité à l'aide de larves d'amphibiens
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur de la présente partie de l'ISO 21427 connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n'a pas pour but de traiter
tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l'utilisateur
de mettre en place des pratiques appropriées en matière d'hygiène et de sécurité, et de s'assurer de la
conformité à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais menés selon la présente partie de
l'ISO 21427 soient réalisés par un personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 21427 spécifie une méthode pour évaluer la génotoxicité à l'aide de larves
d'amphibiens (Xenopus laevis et Pleurodeles waltl). Les dispositions spécifiques aux Pleurodèles sont
données dans l'Annexe A.
La méthode décrite s'applique:
⎯ aux effluents aqueux,
⎯ aux lixiviats aqueux,
⎯ aux éluats de sols,
⎯ aux éluats de déchets industriels,
⎯ aux éluats de boues de traitement des eaux usées,
⎯ aux eaux de surface ou souterraines,
⎯ aux substances solubles dans l'eau et miscibles à l'eau.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
ISO 7346-1, Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis d'un poisson
d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Partie 1: Méthode statique
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ISO 21427-1:2006(F)
ISO 7346-2, Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis d'un poisson
d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Partie 2: Méthode
semi-statique
ISO 7346-3, Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis d'un poisson
d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Partie 3: Méthode avec
renouvellement continu
EN 12457-2, Caractérisation des déchets — Lixiviation — Essai de conformité pour la lixiviation des déchets
fragmentés et des boues — Partie 2: Essai en bâchée unique avec un rapport liquide-solide de 10 l/kg et une
granularité inférieure à 4 mm (sans ou avec réduction de la granularité)
NF T 90-305, Essais des eaux — Détermination de la toxicité aiguë d'une substance vis-à-vis de Salmo
gairdneri — Méthodes sans renouvellement et avec renouvellement continu du milieu
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
micronoyaux
petites particules formées de fragments acentriques de chromosomes et/ou de chromosomes entiers, qui ne
migrent pas au cours de l'anaphase de la division cellulaire et qui, après la télophase, forment un ou plusieurs
micronoyaux dans le cytoplasme
3.2
échantillon étudié
substance, effluent, eau de surface, eau souterraine, effluent aqueux, lixiviat, eau de percolation ou éluat
soumis à l'essai
3.3
milieu d'essai
mélange constitué par l'eau d'essai (6.2), l'échantillon étudié et les aliments
3.4
solution d'essai
mélange constitué par l'eau d'essai (6.2) et l'échantillon étudié
4 Principe
[3]
Les organismes d'essai sont exposés pendant 12 j à une plage de concentrations de l'échantillon étudié.
Un essai témoin sans échantillon (témoin négatif) et un essai témoin avec une substance génotoxique de
référence (témoin positif) sont réalisés en parallèle dans les mêmes conditions. Le témoin positif permet de
vérifier la qualité du réactif biologique et de valider l'essai.
Au cours de la division cellulaire, des fragments de chromatides dépourvus de centromère ne se déplacent
pas vers les noyaux des cellules filles et restent dans le cytoplasme. Certaines aberrations chromosomiques
induites par l'élément d'essai consiste en des fragments de chromatides dépourvus de centromère et qui ne
sont donc pas incorporés dans les noyaux des cellules filles. De plus, des anomalies du fuseau peuvent
générer des chromosomes qui ne sont pas incorporés dans le noyau. Ce ne sont pas des noyaux et ils se
forment dans le cytoplasme de la cellule, pas dans le plasma. Le taux (pour mille ‰) d'érythrocytes
présentant des micronoyaux est déterminé pour chaque concentration de l'échantillon étudié et pour les
solutions témoins. Le taux d'érythrocytes présentant des micronoyaux est comparé, pour chaque
concentration, à celui du témoin négatif afin de déterminer les concentrations qui induisent un effet
génotoxique positif.
NOTE Le taux d'érythrocytes avec micronoyaux se définit par le niveau d'érythrocytes comportant un ou plus d'un
micronoyau comptabilisé dans un échantillon de 1 000 érythrocytes observés dans un frottis sanguin.
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ISO 21427-1:2006(F)
5 Environnement de l'essai
Tous les essais ainsi que les manipulations, l'élevage des adultes et des larves, doivent être réalisés dans
une pièce dont l'atmosphère est dépourvue de poussières et de vapeurs toxiques.
L'essai est réalisé sous éclairage (lumière artificielle ou lumière naturelle à l'abri des rayons du soleil) selon un
cycle de 12 h de lumière/12 h d'obscurité, dans une chambre thermostatée (7.3) de manière à conserver les
bouteilles à une température de 22 °C ± 1 °C.
6 Réactifs
1)
6.1 Réactif biologique, Xenopus laevis désigné ci-après par le nom commun Xenopus.
Les essais doivent débuter sur des larves au stade 50 de la table chronologique de développement de
[1]
Nieuwkoop et Faber . À ce stade, les animaux mesurent de 20 mm à 27 mm de long et présentent un
étranglement à la base de la patte postérieure.
Les larves doivent être conservées dans des récipients (7.2) pendant au moins 8 j avant le début de l'essai,
dans des conditions de température et d'éclairage identiques à celles de l'essai. Les larves ne doivent pas
présenter de maladies ni de malformations.
Pour un essai donné, les lots de larves traitées et les larves témoins doivent provenir de la même éclosion.
Chaque lot comporte au moins 15 récipients d'essai (7.2).
6.2 Eau d'essai.
L'eau utilisée pour l'essai doit satisfaire aux critères définis dans le premier paragraphe de l'Annexe B. Dans
l'éventualité où l'eau d'essai est différente de l'eau d'élevage, les organismes doivent être maintenus dans
l'eau d'essai pendant 8 j au moins avant de démarrer l'essai.
6.3 Aliments.
2)
Les aliments utilisés sont ceux généralement prévus pour les poissons d'aquarium . Ils doivent être réduits
en poudre juste avant utilisation. De la poudre de cresson lyophilisé peut aussi être utilisée.
6.4 Substance de référence, cyclophosphamide monohydraté (C H Cl N O P,HO) de qualité
7 15 2 2 2 2
analytique reconnue, à une concentration de 20 mg/l.
6.5 Solvant intermédiaire, diméthyl sulfoxide (DMSO) ou tout autre solvant miscible à l'eau adéquat.
La génotoxicité ou tout autre effet toxique du solvant utilisé doivent être établis au préalable.
6.6 Anesthésique, tricaïne méthane sulfonate.
6.7 Héparine, solution de 200 µg/l d'héparine en poudre dans une solution aqueuse de chlorure de sodium
à 7 g/l.
6.8 Méthanol, CH OH, de qualité analytique reconnue.
3

1) Xenopus peut être obtenu auprès du Service d'élevage de Xénopes du C.N.R.S., UPRES A 6026 C.N.R.S., Université
de Rennes I, Avenue du Général Leclerc, 35042 Rennes Cedex, France.
2) «Tetraphyll» est un exemple de produit adapté disponible dans le commerce.
Ces informations sont données à titre pratique aux utilisateurs du présent document et ne signifient nullement
l'approbation de ces produits par l'ISO.
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ISO 21427-1:2006(F)
[16]
6.9 Colorants
6.9.1 Hémalun de Masson.
Composition
Hématine 2 mg/ml
Alun de potassium (sulfate double d'aluminium et de potassium) 10 %
6.9.2 Hématoxyline de Groat.
Composition
Alun de fer et d'ammonium [sulfate de fer(III) et d'ammonium] 1,0 g
Hématoxyline 0,5 g
Acide sulfurique concentré 0,8 ml
Éthanol 50 ml
Eau 50 ml
7 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, en verre ou en matériau chimiquement inerte et, en particulier, ce qui suit.
7.1 Aquariums, capacité de 25 l ou de 50 l.
7.2 Récipients en verre, par exemple bouteilles, capacité de 5 l, pouvant être fermés hermétiquement.
Des fioles coniques avec des bouchons en verre rodé ou en caoutchouc revêtues d'un film en
tétrafluorocarbone conviennent.
7.3 Chambre thermostatée, de capacité suffisante pour contenir toutes les bouteilles correspondant aux
différents lots d'un essai complet (échantillon d'essai, substance de référence et témoin négatif) et permettant
de conserver les bouteilles (7.2) à une température de 22 °C ± 1 °C.
7.4 Loupe binoculaire.
7.5 Microscope, équipé d'un objectif à immersion (grossissement total × 1 500).
7.6 Micropipettes héparinisées.
NOTE Pour hépariniser les micropipettes, elles sont déployées et ouvertes, puis la partie pointue est remplie d'une
solution de 200 µg/ml d'héparine mélangés à une solution de 7 g/l de NaCl.
8 Traitement et préparation des échantillons
8.1 Eaux, effluents, lixiviats et éluats étudiés
Il est recommandé d'échantillonner, transporter et conserver les échantillons selon les modes opératoires
généraux décrits dans l'ISO 5667-16.
Le laps de temps entre la collecte de l'échantillon et sa réception au laboratoire ne doit pas dépasser 24 h.
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ISO 21427-1:2006(F)
Dans le cas d'échantillons solides (déchets, sols, boues), réaliser un essai de lixiviation selon le protocole
décrit dans l'EN 12457-2 dans le mois suivant la réception de l'échantillon par le laboratoire. Toutefois, les
éluats aqueux obtenus ne doivent pas être filtrés avant l'essai. Les éluats obtenus doivent être gardés à
l'obscurité à une température de 4 °C ± 3 °C jusqu'à ce que l'essai soit effectué. Celui-ci doit débuter au plus
tard 24 h après l'étape de lixiviation.
Les échantillons d'eaux, d'effluents ou de lixiviats contenus dans les bouteilles en matériaux chimiquement
inertes doivent être conservés à l'obscurité, à une température de 4 °C ± 3 °C jusqu'à ce que l'essai soit
effectué. Celui-ci doit être réalisé au pl
...