SIST ISO 13829:2010
Water quality - Determination of the genotoxicity of water and waste water using the umu-test
Water quality - Determination of the genotoxicity of water and waste water using the umu-test
This International Standard specifies a procedure which can be used to determine the genotoxicity1) of water and
waste water using the umu-test.
This assay is based on the detection of genotoxicity of a test sample which increases the expression of the SOSrepair
system2) associated with the umuC-gene3).
Qualité de l'eau - Détermination de la génotoxicité des eaux et des eaux résiduaires à l'aide de l'essai umu
La présente Norme internationale spécifie une procédure qui peut être utilisée pour déterminer la génotoxicité1)
des eaux et des eaux résiduaires à l'aide de l'essai umu.
L'essai est basé sur la recherche de la génotoxicité d'un échantillon d'essai qui augmente l'expression du système
réparateur de secours2) associé au gène umuC3).
Kakovost vode - Določevanje genotoksičnosti vode in odpadne vode z umu-preskusom
Ta mednarodni standard opredeljuje postopek, ki se lahko uporablja za določevanje genotoksičnosti vode in odpadne vode z umu-preskusom. Ta določitev kemične sestave snovi je osnovana na detekciji genotoksičnosti preskusnega vzorca, ki povečuje iztiskanje SOS okrevalni sistema, povezanega z umuC-gene3.
General Information
Standards Content (Sample)
SLOVENSKI STANDARD
01-september-2010
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHJHQRWRNVLþQRVWLYRGHLQRGSDGQHYRGH]XPX
SUHVNXVRP
Water quality - Determination of the genotoxicity of water and waste water using the umu
-test
Qualité de l'eau - Détermination de la génotoxicité des eaux et des eaux résiduaires à
l'aide de l'essai umu
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 13829:2000
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13829
First edition
2000-03-15
Water quality — Determination of the
genotoxicity of water and waste water
using the umu-test
Qualité de l'eau — Détermination de la génotoxicité des eaux et des eaux
résiduaires àl'aidedel'essaiumu
Reference number
©
ISO 2000
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in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 � CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 734 10 79
E-mail copyright@iso.ch
Web www.iso.ch
Printed in Switzerland
ii © ISO 2000 – All rights reserved
Contents Page
Foreword.iv
Introduction.v
1 Scope .1
2 Normative reference .1
3 Terms and definitions .1
4 Principle.3
5 Test organism and reagents.3
6 Apparatus .5
7 Sample preparation and preservation .5
8 Interferences .6
9 Test performance.6
10 Measurements.8
11 Calculation and expression of results.9
12 Precision.10
13 Validity criteria .10
14 Test report .10
Annex A (informative) General definitions and terms regarding genotoxicity .11
Annex B (informative) Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 .12
Annex C (informative) Composition of the sample and control wells .13
Annex D (informative) Lowest value of the dilution series .14
Annex E (informative) Checking the genotype.15
Annex F (informative) Precision data from an interlaboratory study .16
Annex G (informative) Final protocol for the umu-test.17
Bibliography.18
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 13829 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 5, Biological methods.
Annexes A to G of this International Standard are for information only.
iv © ISO 2000 – All rights reserved
Introduction
The genetically engineered bacterium Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 serves as a test organism.
The bacteria are exposed under controlled conditions to different concentrations of the samples to be tested. The
test is based on the capability of genotoxic agents to induce the umuC-gene in the Salmonella strain in response to
genotoxic lesions in the DNA.
Due to its capability to respond to different types of genotoxic lesions, only one single strain is necessary to detect
different kinds of genotoxic substances.
The induction of the umuC-gene is thus a measure for the genotoxic potential of the sample. Since the umuC-gene
is fused with the lacZ-gene for �-galactosidase, the induction of the umuC-gene can be easily assessed by
determination of the�-galactosidase activity.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 13829:2000(E)
Water quality — Determination of the genotoxicity of water and
waste water using the umu-test
WARNING — This test involves the use of genetically modified organisms. National or international
licensing may restrict the use of these organisms.
Test conducted according to this International Standard should be carried out by qualified experts or by a
qualified testing laboratory.
When applying this International Standard it is necessary in each case, depending on the range to be
tested, to determine if and to which extent additional criteria should be established.
1 Scope
1)
This International Standard specifies a procedure which can be used to determine the genotoxicity of water and
waste water using the umu-test.
This assay is based on the detection of genotoxicity of a test sample which increases the expression of the SOS-
2) 3)
repair system associated with the umuC-gene .
2 Normative reference
The following normative document contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent edition of the normative document indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples.
3 Terms and definitions
For the purposes of this International Standard, the following terms and definitions apply. Other related terms and
definitions have been included in annex A for information.
3.1
stock culture
culture of a bacterial strain to preserve the original test strain and to prepare the inoculation material for the
overnight culture or the pre-culture
1) Toxicity which specifically affects the genome (genetic material).
2) SOS repair occurs when cells are overwhelmed by genotoxins allowing the cell to survive at the cost of mutagenesis.
3) umuC-gene is the acronym for UV mutagenesis gene C. The induction of the umuC-gene is part of the specific response of
the bacterial cell to DNA-damage.
3.2
overnight culture
culture of test bacteria for the preparation of the pre-culture
3.3
pre-culture
culture for adaptation of the overnight culture to the test conditions and to prepare the inoculum for the assay
3.4
inoculum
inoculation material
aliquot of a bacterial suspension used for inoculation in the assay
3.5
concentration effect relationship
induction of the umuC-gene depending on the concentration of genotoxic agents in the test sample
3.6
culture medium
aqueous solution of nutrients required for bacterial growth
3.7
test sample
the sample to be tested, after finishing all preparations
EXAMPLES Preparations may include centrifugation, filtration, homogenization, pH adjustment and measurement of
conductivity.
3.8
dilution series
mixture of the test sample and dilution water in varying proportions
3.9
test mixture
mixture of culture medium, inoculum and dilution series
3.10
negative control
culture medium
3.10.1
blank
culture medium without bacteria
3.10.2
negative control for test samples
mixture of culture medium, inoculum and distilled water
3.10.3
solvent control
mixture of culture medium, inoculum and dimethyl sulfoxide
3.11
positive control
mixture of culture medium, inoculum and a dissolved genotoxic substance
EXAMPLES Typical genotoxic substances are 4-nitroquinoline-N-oxide or 2-aminoanthracene in the case of metabolic
activation.
2 © ISO 2000 – All rights reserved
3.12
S9 fraction
�metabolic activation system� 9 000 g centrifugation supernatant prepared from the livers of male rats pretreated
with enzyme-inducing agents
NOTE Bacteria are exposed to the test sample both with and without an appropriate metabolic activation system.
4Principle
The test organisms are exposed to the test sample with and without metabolic activation system using microplates.
After 4 h of incubation, the genotoxin-dependent induction of the umuC-gene is compared to the spontaneous
activation of the untreated, control culture.
5 Test organism and reagents
5.1 Test organism and stock culture
5.1.1 Test organism
Salmonella typhimurium is a gram-negative, facultative, anaerobic bacterium from the Enterobacteriaceae family.
Salmonella typhimurium TA1535 is the original strain. The test organism carries the plasmid pSK1002 with the
umuC-lacZ gene and a gene for ampicillin resistance. The designation of this Salmonella strain is "TA1535/
pSK1002" (see annex B). This bacterial strain can be easily selected due to its ampicillin resistance.
5.1.2 Stock culture preparation and preservation
Preserve Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 in 150 μl culture medium with 10 % dimethyl sulfoxide (DMSO)
or 20 % glycerol in 2 ml ampoules at a temperature not above � 80 °C. For the preparation of an overnight culture
only one ampoule is used.
5.2 Reagents
Chemicals shall be of analytical grade. Prepare all solutions with purified deionized water or water of equivalent
purity.
5.2.1 Hydrochloric acid, c(HCl) = 1mol/l.
5.2.2 Sodium hydroxide solution, c(NaOH) = 1 mol/l.
5.2.3 Dimethyl sulfoxide (DMSO),C H SO .
2 6 4
WARNING — DMSO forms mutagenic products over a period of time.
5.2.4 TGA-culture medium, consisting of tryptone, glucose and ampicillin, prepared as follows.
Dissolve 10 g of tryptone, 5 g of sodium chloride (NaCl) and 11,9 g of 4-(2-hy
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13829
First edition
2000-03-15
Water quality — Determination of the
genotoxicity of water and waste water
using the umu-test
Qualité de l'eau — Détermination de la génotoxicité des eaux et des eaux
résiduaires àl'aidedel'essaiumu
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ISO 2000
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Printed in Switzerland
ii © ISO 2000 – All rights reserved
Contents Page
Foreword.iv
Introduction.v
1 Scope .1
2 Normative reference .1
3 Terms and definitions .1
4 Principle.3
5 Test organism and reagents.3
6 Apparatus .5
7 Sample preparation and preservation .5
8 Interferences .6
9 Test performance.6
10 Measurements.8
11 Calculation and expression of results.9
12 Precision.10
13 Validity criteria .10
14 Test report .10
Annex A (informative) General definitions and terms regarding genotoxicity .11
Annex B (informative) Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 .12
Annex C (informative) Composition of the sample and control wells .13
Annex D (informative) Lowest value of the dilution series .14
Annex E (informative) Checking the genotype.15
Annex F (informative) Precision data from an interlaboratory study .16
Annex G (informative) Final protocol for the umu-test.17
Bibliography.18
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 13829 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 5, Biological methods.
Annexes A to G of this International Standard are for information only.
iv © ISO 2000 – All rights reserved
Introduction
The genetically engineered bacterium Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 serves as a test organism.
The bacteria are exposed under controlled conditions to different concentrations of the samples to be tested. The
test is based on the capability of genotoxic agents to induce the umuC-gene in the Salmonella strain in response to
genotoxic lesions in the DNA.
Due to its capability to respond to different types of genotoxic lesions, only one single strain is necessary to detect
different kinds of genotoxic substances.
The induction of the umuC-gene is thus a measure for the genotoxic potential of the sample. Since the umuC-gene
is fused with the lacZ-gene for �-galactosidase, the induction of the umuC-gene can be easily assessed by
determination of the�-galactosidase activity.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 13829:2000(E)
Water quality — Determination of the genotoxicity of water and
waste water using the umu-test
WARNING — This test involves the use of genetically modified organisms. National or international
licensing may restrict the use of these organisms.
Test conducted according to this International Standard should be carried out by qualified experts or by a
qualified testing laboratory.
When applying this International Standard it is necessary in each case, depending on the range to be
tested, to determine if and to which extent additional criteria should be established.
1 Scope
1)
This International Standard specifies a procedure which can be used to determine the genotoxicity of water and
waste water using the umu-test.
This assay is based on the detection of genotoxicity of a test sample which increases the expression of the SOS-
2) 3)
repair system associated with the umuC-gene .
2 Normative reference
The following normative document contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent edition of the normative document indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples.
3 Terms and definitions
For the purposes of this International Standard, the following terms and definitions apply. Other related terms and
definitions have been included in annex A for information.
3.1
stock culture
culture of a bacterial strain to preserve the original test strain and to prepare the inoculation material for the
overnight culture or the pre-culture
1) Toxicity which specifically affects the genome (genetic material).
2) SOS repair occurs when cells are overwhelmed by genotoxins allowing the cell to survive at the cost of mutagenesis.
3) umuC-gene is the acronym for UV mutagenesis gene C. The induction of the umuC-gene is part of the specific response of
the bacterial cell to DNA-damage.
3.2
overnight culture
culture of test bacteria for the preparation of the pre-culture
3.3
pre-culture
culture for adaptation of the overnight culture to the test conditions and to prepare the inoculum for the assay
3.4
inoculum
inoculation material
aliquot of a bacterial suspension used for inoculation in the assay
3.5
concentration effect relationship
induction of the umuC-gene depending on the concentration of genotoxic agents in the test sample
3.6
culture medium
aqueous solution of nutrients required for bacterial growth
3.7
test sample
the sample to be tested, after finishing all preparations
EXAMPLES Preparations may include centrifugation, filtration, homogenization, pH adjustment and measurement of
conductivity.
3.8
dilution series
mixture of the test sample and dilution water in varying proportions
3.9
test mixture
mixture of culture medium, inoculum and dilution series
3.10
negative control
culture medium
3.10.1
blank
culture medium without bacteria
3.10.2
negative control for test samples
mixture of culture medium, inoculum and distilled water
3.10.3
solvent control
mixture of culture medium, inoculum and dimethyl sulfoxide
3.11
positive control
mixture of culture medium, inoculum and a dissolved genotoxic substance
EXAMPLES Typical genotoxic substances are 4-nitroquinoline-N-oxide or 2-aminoanthracene in the case of metabolic
activation.
2 © ISO 2000 – All rights reserved
3.12
S9 fraction
�metabolic activation system� 9 000 g centrifugation supernatant prepared from the livers of male rats pretreated
with enzyme-inducing agents
NOTE Bacteria are exposed to the test sample both with and without an appropriate metabolic activation system.
4Principle
The test organisms are exposed to the test sample with and without metabolic activation system using microplates.
After 4 h of incubation, the genotoxin-dependent induction of the umuC-gene is compared to the spontaneous
activation of the untreated, control culture.
5 Test organism and reagents
5.1 Test organism and stock culture
5.1.1 Test organism
Salmonella typhimurium is a gram-negative, facultative, anaerobic bacterium from the Enterobacteriaceae family.
Salmonella typhimurium TA1535 is the original strain. The test organism carries the plasmid pSK1002 with the
umuC-lacZ gene and a gene for ampicillin resistance. The designation of this Salmonella strain is "TA1535/
pSK1002" (see annex B). This bacterial strain can be easily selected due to its ampicillin resistance.
5.1.2 Stock culture preparation and preservation
Preserve Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 in 150 μl culture medium with 10 % dimethyl sulfoxide (DMSO)
or 20 % glycerol in 2 ml ampoules at a temperature not above � 80 °C. For the preparation of an overnight culture
only one ampoule is used.
5.2 Reagents
Chemicals shall be of analytical grade. Prepare all solutions with purified deionized water or water of equivalent
purity.
5.2.1 Hydrochloric acid, c(HCl) = 1mol/l.
5.2.2 Sodium hydroxide solution, c(NaOH) = 1 mol/l.
5.2.3 Dimethyl sulfoxide (DMSO),C H SO .
2 6 4
WARNING — DMSO forms mutagenic products over a period of time.
5.2.4 TGA-culture medium, consisting of tryptone, glucose and ampicillin, prepared as follows.
Dissolve 10 g of tryptone, 5 g of sodium chloride (NaCl) and 11,9 g of 4-(2-hydroxyethyl)-I-
piperazineethanesulphonic acid (HEPES) in water, adjust the pH-value to 7,0� 0,2, dilute to 980 ml and autoclave
for 20 min at 121 °C. Dissolve 2 g of D(+)-glucose (anhydrous) in 20 ml distilled water and autoclave separately.
After autoclaving, mix the two solutions in equal proportions and add 50 mg of ampicillin to 1 000 ml of cooled TGA
medium under sterile conditions. The solution can be stored in portions at � 20 °C for up to 4 weeks.
5.2.5 Concentrated 10�����TGA-culture medium, consisting of a tenfold concentrated TGA (5.2.4) solution, which
canbestoredfor 14days at4°C.
5.2.5.1 For incubation without S9, prepared as follows.
Dissolve 10 g of tryptone, 5 g of sodium chloride (NaCl) and 11,9 g of HEPES in 80 ml water. Adjust the pH-value
to 7,0� 0,2. Dissolve 2 g of D(+)-glucose (anhydrous) in 20 ml of water. Autoclave the solutions separately for
20 min at 121 °C, mix the solut
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 13829
Première édition
2000-03-15
Qualité de l'eau — Détermination de la
génotoxicité des eaux et des eaux
résiduaires à l'aide de l'essai umu
Water quality — Determination of the genotoxicity of water and waste water
using the umu-test
Numéro de référence
©
ISO 2000
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Tel. + 41 22 749 01 11
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ImpriméenSuisse
ii © ISO 2000 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos.iv
Introduction.v
1 Domaine d'application.1
2 Référence normative .1
3 Termes et définitions.1
4 Principe.3
5 Organisme d’essai et réactifs.3
6 Appareillage .5
7 Préparation et conservation d’échantillon.6
8 Interférences .6
9 Réalisation de l'essai.6
10 Mesurages .9
11 Calcul et expression des résultats.9
12 Fidélité .10
13 Critères de validité.10
14 Rapport d’essai.11
Annexe A (informative) Définitions générales et termes concernant la génotoxicité.12
Annexe B (informative) Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002.13
Annexe C (informative) Composition du contenu des puits-échantillons et des puits-témoins .14
Annexe D (informative) Plus faible valeur de la série de dilutions .15
Annexe E (informative) Vérification du génotype .16
Annexe F (informative) Données de fidélité résultant d'une étude interlaboratoire .17
Annexe G (informative) Protocole final de l'essai umu .18
Bibliographie .19
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente Norme internationale peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 13829 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau,
sous-comité SC 5, Méthodes biologiques.
Les annexes A à G de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d'information.
iv © ISO 2000 – Tous droits réservés
Introduction
L’organisme d’essai est la bactérie génétiquement modifiée Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002.
Les bactéries sont exposées, dans des conditions controlées, à différentes concentrations des échantillons à
expérimenter. L’essai est basé sur la capacité des agents génotoxiques à induire le gène umuC dans la souche
Salmonella en réponse aux liaisons génotoxiques de l’ADN.
Du fait de sa capacité à réagir à différents types de liaisons génotoxiques, une seule souche suffit à déceler
différents types de substances génotoxiques.
L’induction du gène umuC représente ainsi une mesure du potentiel génotoxique de l’échantillon. Dans la mesure
où le gène umuC s’identifie au gène lacZ de la �-galactosidase, l’induction du gène umuC peut être facilement
évaluée par détermination de l’activité de la�-galactosidase.
NORME INTERNATIONALE ISO 13829:2000(F)
Qualité de l'eau — Détermination de la génotoxicité des eaux et
des eaux résiduaires à l'aide de l'essai umu
AVERTISSEMENT — Le présent essai implique l’utilisation d’organismes génétiquement modifiés.
L’utilisation de tels organismes peut être soumise à des autorisations nationales ou internationales.
Il convient que les essais réalisés conformément à la présente Norme internationale soient effectués par
des experts qualifiés ou par un laboratoire d’essai qualifié.
L’application de la présente Norme internationale implique, dans tous les cas, de déterminer, en fonction
du domaine de travail étudié, la nécessité de prendre en compte d’éventuels critères supplémentaires.
1 Domaine d'application
1)
La présente Norme internationale spécifie une procédure qui peut être utilisée pour déterminer la génotoxicité
des eaux et des eaux résiduaires à l'aide de l'essai umu.
L'essai est basé sur la recherche de la génotoxicité d'un échantillon d'essai qui augmente l'expression du système
2) 3)
réparateur de secours associé au gène umuC .
2 Référence normative
Le document normatif suivant contient des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les amendements
ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes aux accords
fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer l’édition la plus
récente du document normatif indiqué ci-après. Pour les références non datées, la dernière édition du document
normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des Normes
internationales en vigueur.
ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Part 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des
échantillons.
3 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les termes et définitions suivants s'appliquent. D’autres
termes et définitions connexes ont été inclus dans l’annexe A pour information.
1) Toxicité qui affecte de manière spécifique le génome (matière génétique).
2) Le réparateur de secours se déclenche quand les cellules sont ensevelies dans les génotoxines qui permettent à la cellule
de survivre au prix d'une mutagénèse.
3) umuC est acronyme de UV mutagenesis gene C (gène C mutagène UV). L'induction du gène umuC fait partie de la
réponse spécifique des cellules bactériennes à la lésion de l'ADN.
3.1
culture mère
culture d'une souche bactérienne pour conserver la souche d'essai initiale et préparer l'inoculum pour la
culture/préculture de toute une nuit
3.2
culture de toute une nuit
culture des bactéries d'essai destinées à être utilisées pour la préparation de la préculture
3.3
préculture
culture utilisée pour adapter la culture de toute une nuit aux conditions d’essai et préparer l'inoculum pour l'essai
3.4
inoculum
substance d'inoculation
partie aliquote d’une suspension de bactéries utilisée pour l'inoculation lors de l’essai
3.5
relation concentration-effet
induction du gène umuC en fonction de la concentration en agents génotoxiques de l'échantillon d'essai
3.6
milieu de culture
solution aqueuse de nutriments nécessaire à la croissance bactérienne
3.7
échantillon d'essai
échantillon à expérimenter à l'issue de toutes les étapes de préparation
EXEMPLES La préparation peut inclure centrifugation, filtration, homogénéisation, ajustement de la valeur du pH, et
mesure de la conductivité.
3.8
série de dilutions
mélange de l’échantillon d’essai et de l'eau de dilution en différentes proportions
3.9
mélange d'essai
mélange du milieu de culture, de l'inoculum et des séries de dilution
3.10
témoins négatifs
milieu de culture
3.10.1
blanc
milieu de culture sans bactéries
3.10.2
témoin négatif pour les échantillons d’essai
mélange de milieu de culture, d’inoculum et d’eau distillée
3.10.3
témoin solvant
mélange de milieu de culture, d’inoculum et de diméthylsulfoxyde
3.11
témoin positif
mélange de milieu de culture, d’inoculum et de substance génotoxique dissoute
2 © ISO 2000 – Tous droits réservés
EXEMPLES Substances génotoxiques types: 4-nitro-quinoline-N-oxyde ou amino-2 anthracène en cas d’activation
métabolique.
3.12
fraction S9
�système d’activation métabolique� surnageant résultant de la centrifugation à 9 000 g de foies de rats mâles
préalablement traités aux agents producteurs d’enzymes
NOTE Les bactéries sont exposées à l’échantillon d’essai à la fois avec et sans système d’activation métabolique
approprié.
4Principe
Les organismes d’essai sont exposés, à l'aide de microplaques, à l’échantillon d’essai avec et sans système
d’activation métabolique. Après 4 h d’incubation, une comparaison est effectuée entre l’induction du gène umuC,
produite par les agents génotoxiques, et l’activation spontanée de la culture témoin, non traitée.
5 Organisme d’essai et réactifs
5.1 Organisme d’essai et culture mère
5.1.1 Organisme d’essai
Salmonella typhimurium est une bactérie anaérobie facultative, Gram négatif, de la famille des entérobactériacées.
La souche d'origine est Salmonella typhimurium TA1535. L'organisme d'essai véhicule le plasmide pSK1002 avec
le gène umuC-lacZ et un gène résistant à l'ampicilline. Cette souche de Salmonella est désignée
«TA1535/pSK1002» (voir annexe B). Du fait de sa résistance à l'ampicilline, cette souche bactérienne peut être
aisément choisie.
5.1.2 Préparation et conservation de la culture mère
Conserver Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 dans des ampoules de 2 ml, contenant 150 μl de milieu de
culture, avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 10 % ou du glycérol à 20 %, maintenues à une température
maximale de � 80 °C. Utiliser une seule ampoule pour la préparation d'une culture de bactéries de toute une nuit.
5.2 Réactifs
Les produits chimiques doivent être de qualité analytique. Préparer toutes les solutions dans de l'eau déionisée
purifiée, ou dans de l’eau d'un degré de pureté équivalent.
5.2.1 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l.
5.2.2 Solution d'hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l.
5.2.3 Diméthylsulfoxyde (DMSO),C H SO .
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AVERTISSEMENT — Le DMSO engendre des produits mutagènes au bout d'un
...
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