ISO 16387:2014
(Main)Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
ISO 16387:2014 specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Enchytraeus sp. by dermal and alimentary uptake in a chronic test. It is applicable to soils and soil materials of unknown quality, e.g. from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites under concern and waste materials. ISO 16387:2014 provides information on how to use this method for testing substances under temperate conditions.
Qualité du sol — Effets des contaminants sur les Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la survie et la reproduction
L'ISO 16387:2014 spécifie l'une des méthodes permettant d'évaluer la fonction d'habitat des sols et de déterminer les effets des contaminants et des substances du sol sur la reproduction d'Enchytraeus sp. par absorption cutanée et ingestion au cours d'un essai chronique. Elle est applicable aux sols et aux matériaux de type sol de qualité inconnue provenant, par exemple, de sites contaminés, de sols amendés, de sols après remédiation, de sols agricoles ou d'autres sites d'intérêt, et de déchets. L'ISO 16387:2014 fournit des informations sur la manière d'utiliser cette méthode pour évaluer des substances en conditions tempérées.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16387
Second edition
2014-01-15
Soil quality — Effects of contaminants
on Enchytraeidae (Enchytraeus
sp.) — Determination of effects on
reproduction
Qualité du sol — Effets des contaminants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la survie et la
reproduction
Reference number
ISO 16387:2014(E)
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ISO 2014
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Published in Switzerland
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ISO 16387:2014(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Reagents and material . 3
6 Apparatus . 6
7 Test environment . 6
8 Procedure. 7
8.1 Experimental design . 7
8.2 Preparation of test mixtures . 8
8.3 Addition of the biological material . 9
8.4 Test conditions and measurements . 9
8.5 Reference substance . 9
9 Calculation and expression of results .10
9.1 Calculation .10
9.2 Expression of results .10
10 Validity of the test .10
11 Statistical analysis .10
11.1 General .10
11.2 Range-finding test .10
11.3 Definitive test .11
12 Test report .11
Annex A (informative) Conditions for culture of Enchytraeus sp .13
Annex B (informative) Test procedure using other Enchytraeus species .15
Annex C (informative) Determination of maximum water-holding capacity .17
Annex D (informative) Detailed description of extraction techniques .18
Annex E (informative) Overview of the statistical assessment of data (NOEC determination) .19
Bibliography .20
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ISO 16387:2014(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any
patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on
the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information.
The committee responsible for this document is ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 16387:2004), which has been technically
revised.
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ISO 16387:2014(E)
Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in
soil and are proposed to complement conventional chemical analysis. ISO 15799 includes a list and
short characterization of recommended and standardized test systems. Aquatic test systems with soil
eluate are applied to obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching the
groundwater by the water path (retention function of soils), whereas terrestrial test systems are used
to assess the habitat function of soils. For the latter, a standardized test system using Enchytraeidae (a
chronic test with end-point reproduction) is proposed.
This International Standard describes a method that is based on the determination of acute and sublethal
effects of contaminated soils to adult Enchytraeidae of the genus Enchytraeus. Optionally, the method
can be used for testing substances added to standard soils (e.g. artificial soil) for their sublethal hazard
potential to Enchytraeidae.
Soil-dwelling annelids of the genus Enchytraeus are ecologically relevant, i.e. they are abundant in
many soils where earthworms are scarce, but can also reach high population densities in soils well
inhabited by earthworms. Enchytraeidae can be used in laboratory tests as well as in semi-field and
field studies. From a practical point of view, many Enchytraeus species are easy to handle and breed,
and their generation time is significantly shorter than that of earthworms [the test duration for a
reproduction test with Enchytraeidae is four weeks to six weeks, compared to eight weeks (12 weeks
including synchronization) with earthworms]. In addition, a much smaller volume of soil is needed in the
enchytraeid test compared to the amount needed in earthworm tests.
This International Standard has been drawn up taking into consideration test procedures recommended
[22] [24]
by the Organization for Economic Cooperation and Development (see , ).
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16387:2014(E)
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on
reproduction
1 Scope
This International Standard specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils
and determining effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Enchytraeus sp. by
dermal and alimentary uptake in a chronic test. It is applicable to soils and soil materials of unknown
quality, e.g. from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites
under concern and waste materials.
Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For
contaminated soils, the effects are determined in the soil to be tested and in a control soil. According to
the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) are
either an uncontaminated soil comparable to the soil to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g.
artificial soil).
This International Standard provides information on how to use this method for testing substances
under temperate conditions.
The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry’s constant) or the
air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at
25 °C.
NOTE No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under
aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level
using barium chloride solution
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
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ISO 16387:2014(E)
3.1
reproduction
mean number of offspring per test vessel after incubation under the specified test conditions
Note 1 to entry: The test period for the determination of the reproduction (definitive test) is six weeks.
Note 2 to entry: offspring = hatched juvenile enchytraeids
3.2
reproduction rate
mean number of offspring produced per a number of adults over the test period
Note 1 to entry: The test period for the determination of the reproduction (definitive test) is six weeks.
Note 2 to entry: offspring = hatched juvenile enchytraeids
3.3
ECx
effect concentration for x % effect
concentration (mass fraction) of a test substance that causes x % of an effect on a given endpoint within
a given exposure period when compared with a control
EXAMPLE An EC50 is a concentration estimated to cause an effect on a test end point in 50 % of an exposed
population over a defined exposure period.
Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).
When substances are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil, in milligrams
per kilogram.
3.4
LOEC
lowest observed effect concentration
lowest test substance concentration that has a statistically significant effect (probability p < 0,05)
Note 1 to entry: In this test the LOEC is expressed as a mass of test substance per dry mass of the soil to be tested.
All test concentrations above the LOEC should usually show an effect that is statistically different from the control.
3.5
NOEC
no observed effect concentration
highest test substance concentration immediately below the LOEC at which no effect is observed
Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect
(p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control.
3.6
test mixture
mixture of contaminated soil or test substance (e.g. chemical, biosolid, waste) with control soil
3.7
test mixture ratio
ratio between the soil to be tested and the control soil in a test mixture
3.8
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.9
reference soil
uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic
carbon content and texture) to the soil being studied
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ISO 16387:2014(E)
3.10
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (pH, texture, organic matter content) are
within a known range
EXAMPLE Euro soils, artificial soil, LUFA Standard soil
Note 1 to entry: The properties of standard soils can differ from the soil to be tested.
3.11
control soil
reference or standard soil used as a control and as a medium for preparing dilution series with soils to
be tested or a reference substance, which fulfils the validity criteria
Note 1 to entry: In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving
the test validity criteria before using the soil in a definitive test.
4 Principle
The effects on survival and reproduction of adult Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) exposed to a dilution
range of contaminated soil or range of concentrations of a test substance are determined. Test mixtures
are prepared at the start of the test and are not renewed within the test period.
The test can be divided into two distinct steps: a short (two weeks) test in which the range of toxic effects
(mainly mortality) is determined, and a long-term (six weeks) definitive test in which the survival of
parental worms and the fecundity (number of juveniles) are measured. The results obtained from the
tests are compared with a control and are used to determine the dilutions or concentrations which
cause no effects on survival and reproduction (NOEC) and the concentration (dilution) resulting in x %
reduction of juveniles hatched from cocoons compared to the control (ECx, 42 d).
All test dilutions/concentrations above the LOEC have a harmful effect equal to, or greater than that
observed at the LOEC. Where there is no prior knowledge of the dilution/concentration of the test
substance likely to have an effect, then it is useful to conduct the test in two steps:
— an acute toxicity test (range-finding test) is carried out, to give an indication of the effect
dilution/concentration, and the dilution/concentration giving no mortality (NOEC).
Dilutions/concentrations to be used in the definitive test can then be selected;
— the definitive test on reproduction to determine sublethal effects of (dilutions of) contaminated
soil or the concentration of a substance which, when evenly mixed into the standard soil, causes
no significant effects on numbers of offsprings hatched from cocoons compared with the control
(NOEC), and the lowest concentration causing effects (LOEC).
NOTE The use of a suitable reference soil is an essential requirement to demonstrate the present status of the
test population, and to avoid misinterpretation of results.
5 Reagents and material
5.1 Biological material, recommended test species is Enchytraeus albidus Henle 1837 (white potworm;
Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). E. albidus is one of the largest enchytraeid species, measuring
[21] [31]
15 mm to 40 mm, and has a world-wide distribution (see e.g. , ). It can be easily recognized by two
characteristics: four setae per bundle ventrally, and the very long seminal duct in the clitellum region
as well as some segments behind it. The species can be found in marine, limnic and terrestrial habitats,
mainly in decaying organic matter (seaweed, compost) and only rarely in meadows. This broad ecological
tolerance and some morphological variations indicate that the species probably consists of several
races (or ecotypes). E. albidus can be obtained commercially, since it is sold as food for fish. It should be
[7] [10] [32]
verified whether such a culture is contaminated by other, usually smaller species (see e.g. , , ). If
contamination of the culture occurs, all worms are washed in water in a Petri dish. With the help of a
stereomicroscope, large adult specimens of E. albidus are selected to start a new culture. All other worms
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ISO 16387:2014(E)
of the original culture are discarded. E. albidus can be bred easily in a wide range of organic materials (see
Annex A) and has a short life cycle, reaching maturity between 33 d (at 18 °C) and 74 d (at 12 °C). Only
cultures which have been kept in the laboratory for at least five weeks (one generation cycle) without
problems shall be used for testing purposes.
Other species of the genus Enchytraeus, especially the true soil-inhabiting but smaller species E. crypticus
Westheide and Graefe 1992 or E. buchholzi Vejdovsky 1879, are also suitable as test organisms (see
Annex B). If other species of Enchytraeus are used, they shall be clearly identified and the rationale for
the selection of the species as well as deviations of the experimental method should be reported in this
case. The worms used in the tests should be adult with eggs (white spots) in the clitellum region and
should have approximately the same size (approximately 15 mm). A synchronisation of the breeding
culture is not necessary. The Enchytraeidae should be acclimatised in untreated artificial soil under test
conditions for at least 24 h prior to testing. During this period, the same food which is used as a food
source in the test should be given in sufficient amount.
For one test, an excess number of adult clitellate worms should be taken from the culture box without
observing them in detail in order to get enough suitable worms. At the end of the acclimatization period,
only worms with eggs and behaving as usual (e.g. not trying to leave the artificial soil) are selected
for the test. This selection is made by placing the worms in a Petri dish filled with a small amount of
water under a stereomicroscope, and discarding the animals without eggs. A freshwater medium (e.g.
[23]
reconstituted water as described in ) should preferably be used, since demineralized water or tap
water (risk of copper contamination) can harm the Enchytraeidae. During this process, other organisms
living in the cultures, such as mites, are also removed from the worms.
NOTE An example of culturing Enchytraeus sp. is given in Annex A.
5.2 Test mixture, which may consist of field-collected soil or control soil amended by the test substance.
5.2.1 Field-collected soil or waste
The sample(s) can be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern, or
waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed
material, or manure) under consideration for possible land disposal.
The fields soils used in the test shall be passed through a sieve of 4 mm square mesh to remove coarse
fragments and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air-dried without heating before sieving.
Storage of soils to be tested should be as short as possible. The soil shall be stored in accordance with
ISO 10381-6 using containers that minimize losses of soil contaminants by volatilisation and sorption to
the container walls. Soil pH should not be corrected as it can influence bioavailability of soil contaminants.
For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled
from a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390;
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) water holding capacity according to Annex C;
e) cation exchange capacity in accordance with ISO 11260;
f) organic carbon in accordance with ISO 10694.
NOTE It is important to measure the water holding capacity of all mixtures used in the test.
5.2.2 Control soil, either a) reference (3.9) or b) standard soil (3.10) that allows the presence of
Enchytraeidae (at least the validity criteria shall be fulfilled). Control soil and soil used for dilution shall
not differ in one test (either a) or b)).
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ISO 16387:2014(E)
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should
be treated and characterized like the soils to be tested. If a toxic contamination or unusual soil
properties cannot be ruled out, standard control soils should be preferred.
b) For testing the effects of substances mixed into soil, standard soils (e.g. artificial soil, LUFA) shall be
used as test substrate. The properties of the field-collected standard soil shall be reported.
The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:
Percentage expressed on
dry mass basis
− Sphagnum peat finely ground and with no visible plant 10 %
remains
− Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
− Industrial quartz sand (dominant fine sand with more 69 %
than 50 % of particle size 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverised, analytical grade) are necessary to
3
get a pH of 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Taking the properties of highly non-polar (log K > 2) or ionizing substances into account, 5 % of peat
ow
[22]
have proven to be sufficient for maintaining the desired structure of the artificial soil.
Prepare the artificial soil at least three days prior to start the test, by mixing the dry constituents
listed above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required
is added while mixing is continued. The amount of calcium carbonate required can vary, depending
on properties of the individual batch of sphagnum peat and should be determined by measuring sub-
samples immediately before the test. Store the mixed artificial soil at room temperature for at least two
days to equilibrate acidity. To determine pH and the maximum water holding capacity, the dry artificial
soil is pre-moistened one or two days before starting the test by adding deionised water to obtain half of
the required final water content of 40 % to 60 % of the maximum water holding capacity.
The total water holding capacity is determined according to Annex C, the pH is determined according to
ISO 10390.
NOTE 2 Allowance should be made for any water that is to be used for introducing the test substance into the
soil.
5.3 Food
Rolled oats, preferably autoclaved (heating is also possible) before use to avoid infection with other
[31]
organisms, were found to be suitable . The first feeding is made by mixing 50 mg of ground rolled
oats per test vessel into the soil (after application of the test substance but before adding the worms);
additional feedings (25 mg per vessel per week except after 28 d) are made only on the surface to avoid
harming the worms. Since the need for food can vary in the different vessels, feeding should be adjusted
to demand (i.e. over-feeding shall be avoided). Some soil particles should be placed on top of the flasks
in order to reduce fungal growth.
5.4 Reagents
5.4.1 Bengal red.
5.4.2 Ethanol.
5.4.3 Boric acid, suitable as reference substance.
© ISO 2014 – All rights reserved 5
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ISO 16387:2014(E)
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and the following.
6.1 Test container, of capacity 0,20 l to 0,25 l, with a diameter (e.g. 5 cm) enabling a depth of 1,5 cm to
2 cm of soil, with lids (e.g. glass or perforated plastic film). The beakers shall be suitable as test vessels,
containing an amount of artificial soil corresponding to 20 g dry mass. The lids shall permit gaseous
exchange between the soil substrate and the atmosphere.
6.2 Drying cabinet.
6.3 Stereomicroscope.
6.4 Balances with a weighing range of 50 g to 32 kg; precision at least 1 g.
6.5 Analytical balance with a weighing range of 10 mg to 200 g; precision at least 1 mg.
6.6 pH-meter.
6.7 Temperature registration (e.g. temperature/humidity recorder).
6.8 Lux meter.
6.9 Mixer.
6.10 Incubator or small room with air-conditioner.
6.11 Jeweller’s tweezers, hooks, loops or a small brush.
6.12 Photo basins with ribbed bottoms.
7 Test environment
Cover the test vessels (6.1) with glass lids to prevent the test substrate from drying, and keep under test
conditions for two weeks (range-finding test) or six weeks (definitive test). The test temperature shall
be (20 ± 2) °C; higher temperatures can affect reproduction. Carry out testing in a controlled light-dark
cycle of long-day conditions, preferably 16 h to 8 h at 400 lx to 800 lx in the area of the test vessels, to
prevent the worms from escaping from the soil.
Weigh the vessels at the beginning of the test and thereafter once a week. Replenish the mass loss with
the appropriate amount of deionized water. This loss can be minimized by maintaining a high humidity
(>80 %) in the test incubator (6.10). Place all test vessels in the test incubator in a random order, which
should be changed every week.
At the beginning and the end of both the range-finding test and the definitive test, the water content and
the pH should be measured. To facilitate checking of the pH and water content of the test substrate, use
of additional containers (replicates) for each concentration and for the control is recommended.
6 © ISO 2014 – All righ
...
DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 16387
ISO/TC 190/SC 4 Secretariat: AFNOR
Voting begins on Voting terminates on
2012-04-26 2012-09-26
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION • МЕЖДУНАРОДНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ • ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Soil quality — Effects of pollutants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
Qualité du sol — Effets des polluants sur les Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur
la survie et la reproduction
[Revision of first edition (ISO 16387:2004)]
ICS 13.080.30
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
This draft has been developed within the International Organization for Standardization (ISO), and
processed under the ISO-lead mode of collaboration as defined in the Vienna Agreement.
This draft is hereby submitted to the ISO member bodies and to the CEN member bodies for a parallel
five-month enquiry.
Should this draft be accepted, a final draft, established on the basis of comments received, will be
submitted to a parallel two-month approval vote in ISO and formal vote in CEN.
Member bodies are strongly encouraged to provide their comments on the draft in time for the
September 2012 ISO/TC 190/SC 4/WG 11 meeting so that the group in charge of the development of
this standard could work on these comments straight away, i.e. be 2012-09-08.
To expedite distribution, this document is circulated as received from the committee
secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text composition will be undertaken at
publication stage.
Pour accélérer la distribution, le présent document est distribué tel qu'il est parvenu du
secrétariat du comité. Le travail de rédaction et de composition de texte sera effectué au
Secrétariat central de l'ISO au stade de publication.
THIS DOCUMENT IS A DRAFT CIRCULATED FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY NOT BE
REFERRED TO AS AN INTERNATIONAL STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES, DRAFT
INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN NATIONAL REGULATIONS.
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPORTING DOCUMENTATION.
© International Organization for Standardization, 2012
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ISO/DIS 16387
Copyright notice
This ISO document is a Draft International Standard and is copyright-protected by ISO. Except as permitted
under the applicable laws of the user’s country, neither this ISO draft nor any extract from it may be
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ISO/DIS 16387
Contents Page
Foreword . iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle. 3
5 Reagents. 4
6 Apparatus . 6
7 Test environment . 6
8 Procedure . 7
8.1 Experimental design . 7
8.1.1 General . 7
8.1.2 Preliminary test . 7
8.1.3 Definitive test . 7
8.2 Preparation of test mixtures . 8
8.2.1 Testing contaminated soil . 8
8.2.2 Testing substances added to the test substrate . 8
8.2.3 Preparation of control container . 9
8.3 Addition of the biological material . 9
8.4 Test conditions and measurements . 9
8.5 Reference substance . 9
9 Calculation and expression of results . 10
9.1 Calculation . 10
9.2 Expression of results . 10
10 Validity of the test . 10
11 Statistical analysis . 10
11.1 Range finding test . 10
11.2 Definitive test . 10
12 Test report . 11
Annex A (informative) Conditions for culture of Enchytraeus sp. . 13
Annex B (informative) Test procedure using other Enchytraeus species . 15
Annex C (informative) Detailed description of extraction techniques . 17
Annex D (informative) Determination of maximum water-holding capacity . 18
Annex E (informative) Overview of the statistical assessment of data (NOEC determination) . 19
Bibliography . 20
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ISO/DIS 16387
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 16387 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
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ISO/DIS 16387
Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in soil and
are proposed to complement conventional chemical analysis. ISO 15799 includes a list and short
characterization of recommended and standardized test systems. Aquatic test systems with soil eluate are
applied to obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching the groundwater by the
water path (retention function of soils), whereas terrestrial test systems are used to assess the habitat function
of soils. For the latter, a standardized test system using Enchytraeidae (a chronic test with endpoint
reproduction) is proposed.
ISO 16387 describes a method that is based on the determination of acute and sublethal effects of
contaminated soils to adult Enchytraeidae of the genus Enchytraeus. Optionally, the method may be used for
testing chemicals added to standard soils (e.g. artificial soil) for their sublethal hazard potential to
Enchytraeidae.
Soil-dwelling annelids of the genus Enchytraeus are ecologically relevant, i.e. they are abundant in many soils
where earthworms are scarce, but can also reach high population densities in soils well inhabited by
earthworms. Enchytraeidae can be used in laboratory tests as well as in semi-field and field studies. From a
practical point of view, many Enchytraeus species are easy to handle and breed, and their generation time is
significantly shorter than that of earthworms [the test duration for a reproduction test with Enchytraeidae is
four weeks to six weeks, compared to eight weeks (12 weeks including synchronization) with earthworms]. In
addition, a much smaller volume of soil is needed in the enchytraeid test compared to the amount needed in
earthworm tests.
This part of ISO 16387 has been drawn up taking into consideration test procedures recommended by the
Organization for Economic Cooperation and Development (see references in the Bibliography).
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DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 16387
Soil quality — Effects of pollutants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
1 Scope
This part of ISO 16387 specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and
determining effects of soil contaminants and chemicals on the reproduction of Enchytraeus sp. by dermal and
alimentary uptake in a chronic test. It is applicable to soils and soil materials of unknown quality e.g. from
contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites under concern and waste
materials.
Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For
contaminated soils, the effects are determined in the test soil and in a control soil. According to the objective
of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) should be either an
uncontaminated soil comparable to the soil sample to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g.
artificial soil).
Information is provided how to use this method for testing chemicals under temperate conditions.
The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry's constant) or the
air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at 25 °C.
NOTE No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.
WARNING — Contaminated soils may contain unknown mixtures of toxic, mutagenic, or otherwise
harmful chemicals or infectious micro-organisms. Occupational health risks may arise from dust or
evaporated chemicals as well as via dermal contact during handling and incubation.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil
under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the
laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level using
barium chloride solution
ISO 11268-1, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms — Part 1: Determination of acute toxicity to
Eisenia fetida/Eisenia andrei
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
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ISO/DIS 16387
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
reproduction
mean number of offspring per test vessel after six weeks incubation under the specified test conditions
3.2
reproduction rate
mean numbers of offspring hatched from the cocoons and surviving until the end of the test period per adult
enchytraeid remaining alive after six weeks
3.3
ECx
effect concentration
concentration of test item or percent dilution of contaminated soil estimated to reduce the reproduction rate at
the end of the test to x % compared to the control within the test period (x is the percentage (10, 20, 25, 50) of
this effect)
3.4
LOEC
Lowest Observed Effect Concentration
lowest tested mixture ratio of a test soil in a reference or a standard control soil at which a statistically significant
effect is observed or lowest tested concentration of a test substance at which a statistically significant effect is
observed compared with the control. All test mixtures above the LOEC have a harmful effect equal or greater
than those observed at the LOEC
3.5
NOEC
No Observed Effect Concentration
soil mixture ratio immediately below the LOEC or highest tested concentration of a test substance which when
compared to the control has no statistically significant lethal or other effect such as weight alteration (p < 0,05)
3.6
test mixture
mixture of the test substance with the standard soil, mixture of contaminated soil with the control soil or
mixture of contaminated soil with an uncontaminated soil comparable to the soil sample to be tested
3.7
test mixture ratio
ratio between the contaminated soil and the control soil in a text mixture
3.8
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
[ISO 15176]
3.9
reference soil
uncontaminated site-specific soil (e.g. collected in the vicinity of a contaminated site) with similar properties
(nutrient concentrations, pH, organic carbon content and texture) as the test soil
3.10
standard soil
field collected soil or artificial soil whose main properties (e.g. pH, texture, organic matter content) are within a
known range, e.g. Euro soils [15], artificial soil [20], LUFA Standard soil
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ISO/DIS 16387
[11268-1]
Note 1 to entry: The properties of standard soils may differ from the test soil.
3.11
control soil
reference or standard soil used as a control and as medium for preparing dilution series with test soils or a
reference substance, that allows the presence of enchytraeids (at least the validity criteria shall be fulfilled).
Note 1 to entry: All effect-concentrations are expressed in milligrams of test substance per kilogram (dry mass) of the
test substrate (5.2). Soil mixtures are given in per cent based on soil dry weight.
4 Principle
The effects on survival and reproduction of adult Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) exposed to a dilution range
of contaminated soil or range of concentrations of a test substance are determined. Test mixtures are
prepared at the start of the test and are not renewed within the test period.
The test can be divided into two distinct steps: a short (two weeks) preliminary test in which the range of toxic
effects (mainly mortality) is determined, and a long-term (six weeks) definitive test in which the survival of
parental worms and the fecundity (number of juveniles) are measured. The results obtained from the tests are
compared with a control and are used to determine the dilutions or concentrations which cause no effects on
survival and reproduction (NOEC) and the concentration (dilution) resulting in x % reduction of juveniles
hatched from cocoons compared to the control (ECx, 42 d).
All test dilutions/concentrations above the LOEC have a harmful effect equal to, or greater than that observed
at the LOEC. Where there is no prior knowledge of the dilution/concentration of the test substance likely to
have an effect, then it is useful to conduct the test in two steps:
a preliminary acute toxicity test is carried out, to give an indication of the effect dilution/concentration, and
the dilution/concentration giving no mortality (NOEC). Dilutions/ concentrations to be used in the final test
can then be selected;
the definitive test on reproduction to determine sublethal effects of (dilutions of) contaminated soil or the
concentration of a chemical which, when evenly mixed into the standard soil, causes no significant effects
on numbers of offsprings hatched from cocoons compared with the control (NOEC), and the lowest
concentration causing effects (LOEC).
NOTE The use of a reference soil is an essential requirement to demonstrate the present status of the test
population, and to avoid misinterpretation of results.
If the soil to be tested has properties that are quite different from the normal standard control soils (e.g. OECD
artificial soil or LUFA 2.2 soil), for instance a rather low or high pH, or very low or high organic matter or clay
contents, it is essential to have a reference soil that has similar properties. In that case, control performance of
the enchytraeids may however, be less good than ‘normal’ and quality control of the test is not possible on the
basis of the reference soil. For assessing toxicity of the test soil, it is important however to have such a
reference soil, which may also be used to prepare dilution series of the test soil. It is therefore essential in
such case to include both a reference and a control soil.
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ISO/DIS 16387
5 Reagents
5.1 Biological material
The recommended test species is Enchytraeus albidus Hence 1837 (white potworm; Enchytraeidae,
Oligochaeta, Annelida). E. albidus is one of the largest enchytraeid species, measuring 15 mm to 40 mm, and
has a world-wide distribution (see Bibliography). It can be easily recognised by two characteristics: four setae
per bundle ventrally, and the very long seminal duct in the clitellum region as well as some segments behind
it. The species can be found in marine, limnic and terrestrial habitats, mainly in decaying organic matter
(seaweed, compost) and only rarely in meadows. This broad ecological tolerance and some morphological
variations indicate that the species may consist of several races (or ecotypes). E. albidus can be obtained
commercially, since it is sold as food for fish. It should be verified whether such a culture is contaminated by
other, usually smaller species (see Bibliography). If contamination of the culture occurs, all worms are washed
in water in a Petri dish. With the help of a stereomicroscope, large adult specimens of E. albidus are selected
to start a new culture. All other worms of the original culture are discarded. E. albidus can be bred easily in a
wide range of organic waste materials (see Annex A) and has a short life cycle, reaching maturity between 33
d (at 18 °C) and 74 d (at 12 °C). Only cultures which have been kept in the laboratory for at least five weeks
(one generation cycle) without problems can be used for testing purposes.
Other species of the genus Enchytraeus, especially the true soil-inhabiting but smaller species E. crypticus
Westheide and Graefe 1992 or E. buchholzi Vejdovsky 1879, are also suitable as test organisms (see
Annex B). If other species of Enchytraeus are used, they shall be clearly identified and the rationale for the
selection of the species as well as deviations of the experimental method should be reported in this case. The
worms used in the tests should be adult with eggs (white spots) in the clitellum region and should have
approximately the same size (approximately 15 mm). A synchronisation of the breeding culture is not
necessary. The Enchytraeidae should be acclimatised in untreated artificial soil under test conditions for at
least 24 h prior to testing. During this period, the same food which is used as a food source in the test should
be given in sufficient amount.
For one test, an excess number of adult clitellate worms should be taken from the culture box without
observing them in detail in order to get enough suitable worms. At the end of the acclimatization period, only
worms with eggs and behaving normally (e.g. not trying to leave the artificial soil) are selected for the test.
This selection is made by placing the worms in a Petri dish filled with a small amount of water under a
stereomicroscope, and discarding the animals without eggs. A freshwater medium (e.g. reconstituted water as
described in OECD Guideline 202) should preferably be used, since demineralized water or tap water (risk of
copper contamination) could harm the Enchytraeidae. During this process, other organisms living in the
cultures, such as mites, are also removed from the worms.
NOTE An example of culturing Enchytraeus sp. is given in Annex A.
5.2 Test soils
5.2.1 Field soil
The sample(s) might be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern, or waste
materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a sewage sludge treatment plant, composed material,
or manure) under consideration for possible land disposal.
The soils used in the test shall be passed through a sieve of 4 mm square mesh to remove coarse fragments
and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air dried without heating before sieving. Storage of test soils
should be as short as possible. The soil shall be stored in accordance with ISO 10381-6 using containers that
minimise losses of soil contaminants by volatilisation and sorption to the container walls. Soil pH should not be
corrected as it may influence bioavailability of soil contaminants.
For interpretation of test results, the following characteristics should be determined for each soil sampled from
a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390;
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ISO/DIS 16387
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) water holding capacity according to Annex D;
e) cation exchange capacity in accordance with ISO 11260;
f) organic carbon in accordance with ISO 10694.
NOTE It is important to measure the water holding capacity of all mixtures used in the test.
5.2.2 Control soil
According to the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil)
should be either a) reference (3.9) or b) standard soil (3.10) that allow the presence of Enchytraeidae (at least
the validity criteria shall be fulfilled).
5.1.1.1 Reference soils
If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should be treated
and characterised like the test soils. If a toxic contamination or unusual soil properties cannot be ruled out,
standard control soils should be preferred.
5.1.1.2 Standard soils
For testing the effects of substances mixed into soil or making dilutions of the test soil, standard soils shall be
used as test substrate. The properties of the field collected standard soil shall be reported.
The substrate called “artificial soil” has the following composition:
Percentage expressed on
dry mass basis
Sphagnum peat finely ground and with no visible plant remains 10 %
Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
Industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 50 % 69%
of particle size 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverised, analytical grade) are necessary to get a
3
pH of 6,0 0,5.
NOTE 1 Taking the properties of highly non-polar (log K W > 2) or ionizing substances into account, 5 % of peat have
ow
proven to be sufficient for maintaining the desired structure of the artificial soil.
The artificial soil is prepared at least three days prior to start the test, by mixing the dry constituents listed
above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required is added while
mixing is continued. The amount of calcium carbonate required can vary, depending on properties of the
individual batch of sphagnum peat and should be determined by measuring sub-samples immediately before
the test. The mixed artificial soil is stored at room temperature for at least two days to equilibrate acidity. To
determine pH and the maximum water holding capacity, the dry artificial soil is pre-moistened one or two days
before starting the test by adding deionised water to obtain half of the required final water content of 40 % to
60 % of the maximum water holding capacity.
The total water holding capacity is determined according to Annex D, the pH is determined according to
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ISO/DIS 16387
NOTE 2 Allowance should be made for any water that is to be used for introducing the test substance into the soil.
5.3 Feeding
Rolled oats, preferably autoclaved (heating is also possible) before use to avoid infection with other
organisms, were found to be suitable. The first feeding is made by mixing 50 mg of ground rolled oats per test
vessel into the soil (after application of the test substance but before adding the worms); additional feedings
(25 mg per vessel per week except after 28 d) are made only on the surface to avoid harming the worms.
Since the need for food may vary in the different vessels, feeding should be adjusted to demand (i.e. over-
feeding shall be avoided). Some soil particles should be placed on top of the flakes in order to reduce fungal
growth.
5.4 Bengal red, ethanol.
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and
6.1 Glass beakers, of capacity 0,20 l to 0,25 l, with a diameter (e.g. 5 cm) enabling a depth of 1,5 cm to
2 cm of soil, with lids (e.g. glass or perforated plastic film). The beakers shall be suitable as test vessels,
containing an amount of artificial soil corresponding to 20 g dry mass. The lids shall permit gaseous exchange
between the soil substrate and the atmosphere.
6.2 Drying cabinet.
6.3 Stereomicroscope.
6.4 Balances with a weighing range of
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16387
Deuxième édition
2014-01-15
Qualité du sol — Effets des
contaminants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination
des effets sur la survie et la
reproduction
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
Numéro de référence
ISO 16387:2014(F)
©
ISO 2014
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Fax + 41 22 749 09 47
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Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO 16387:2014(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Réactifs et matériel . 4
6 Appareillage . 6
7 Environnement d’essai . 7
8 Mode opératoire. 7
8.1 Dispositif expérimental . 7
8.2 Préparation des mélanges d’essai . 8
8.3 Ajout du matériel biologique .10
8.4 Conditions d’essai et mesurages .10
8.5 Substance de référence .10
9 Calcul et expression des résultats .10
9.1 Calcul .10
9.2 Expression des résultats .11
10 Validité de l’essai .11
11 Analyse statistique .11
11.1 Généralités .11
11.2 Essai préliminaire .11
11.3 Essai définitif .11
12 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Conditions de culture d’Enchytraeus sp .14
Annexe B (informative) Mode opératoire d’essais menés avec d’autres espèces du
genre Enchytraeus .16
Annexe C (informative) Détermination de la capacité maximale de rétention d’eau.18
Annexe D (informative) Description détaillée des techniques d’extraction .19
Annexe E (informative) Présentation de l’évaluation statistique des données (détermination de
la CSEO) .20
Bibliographie .21
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ISO 16387:2014(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/CEI, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou sur la liste ISO des déclarations de brevets reçues
(voir www.iso.org/brevets).
Les éventuelles appellations commerciales utilisées dans le présent document sont données pour
information à l’intention des utilisateurs et ne constituent pas une approbation ou une recommandation.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, aussi bien que pour des informations au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de
l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC) voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 16387:2004), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
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ISO 16387:2014(F)
Introduction
Les systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les effets
des contaminants du sol et sont proposés en complément des analyses chimiques conventionnelles.
L’ISO 15799 comporte une liste ainsi qu’une brève caractérisation des systèmes d’essais recommandés
et normalisés. Les systèmes d’essais aquatiques mis en œuvre sur éluat de sol sont utilisés pour obtenir
des informations sur la fraction de contaminants susceptible d’atteindre les eaux souterraines du fait de
la circulation de l’eau (fonction de rétention des sols), tandis que les systèmes d’essais terrestres servent
à évaluer la fonction d’habitat des sols. Concernant les seconds, un système d’essai normalisé utilisant
des Enchytraeidae (un essai chronique prenant la reproduction comme critère d’effet) est proposé.
La présente Norme internationale décrit une méthode basée sur la détermination des effets aigus
et sublétaux des sols contaminés sur les Enchytraeidae adultes du genre Enchytraeus. La méthode
peut éventuellement être utilisée pour évaluer le potentiel toxique sublétal sur les Enchytraeidae de
substances ajoutées à un sol standard (par exemple un sol artificiel).
Les annélides du genre Enchytraeus vivant dans le sol sont pertinents sur le plan écologique, car ils
abondent dans un grand nombre de sols pauvres en vers de terre; cependant, ils peuvent également
atteindre de fortes densités de population dans des sols largement peuplés de vers de terre. Les
Enchytraeidae se prêtent à des essais en laboratoire ainsi qu’à des études en conditions semi-contrôlées
et à des études in situ. D’un point de vue pratique, de nombreuses espèces d’Enchytraeus sont faciles à
manipuler et à élever et leur temps de génération est nettement plus court que celui des vers de terre [la
durée des essais de reproduction des Enchytraeidae est de quatre à six semaines, contre huit semaines
(12 semaines en incluant la synchronisation) pour les vers de terre]. De plus, le volume de sol nécessaire
pour les essais menés sur les Enchytraeidae est nettement inférieur au volume nécessaire pour les essais
sur les vers de terre.
La présente Norme internationale a été rédigée en tenant compte des modes opératoires d’essai
[22] [24]
recommandés par l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) (voir , ).
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NORME INTERNATIONALE ISO 16387:2014(F)
Qualité du sol — Effets des contaminants sur les
Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Détermination des
effets sur la survie et la reproduction
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie l’une des méthodes permettant d’évaluer la fonction d’habitat
des sols et de déterminer les effets des contaminants et des substances du sol sur la reproduction
d’Enchytraeus sp. par absorption cutanée et ingestion au cours d’un essai chronique. Elle est applicable
aux sols et aux matériaux de type sol de qualité inconnue provenant, par exemple, de sites contaminés,
de sols amendés, de sols après remédiation, de sols agricoles ou d’autres sites d’intérêt, et de déchets.
Les effets des substances sont évalués à l’aide d’un sol standard, de préférence un substrat de sol artificiel
défini. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol
témoin. Selon l’objectif de l’étude, il convient que les substrats témoin et de dilution (gamme de dilutions
d’un sol contaminé) soient un sol non contaminé comparable au soumis à essai (sol de référence) ou un
sol standard (par exemple, sol artificiel).
La présente Norme internationale fournit des informations sur la manière d’utiliser cette méthode pour
évaluer des substances en conditions tempérées.
Cette méthode ne s’applique pas aux substances volatiles, c’est-à-dire aux substances pour lesquelles H
(constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression
de vapeur à 25 °C est supérieure à 0,013 3 Pa.
NOTE La méthode d’essai ne contient aucune disposition permettant de surveiller la persistance de la
substance soumise à essai.
2 Références normatives
Les documents suivants, en totalité ou en partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d’échange cationique effective et du taux de
saturation en bases échangeables à l’aide d’une solution de chlorure de baryum
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des
sols — Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
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ISO 16387:2014(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
reproduction
nombre moyen de jeunes produits par récipient d’essai après incubation dans les conditions d’essai
spécifiées
Note 1 à l’article: La période d’essai d’évaluation de la reproduction (essai définitif) est de six semaines.
Note 2 à l’article: Jeunes produits = jeunes Enchytraeidae éclos.
3.2
taux de reproduction
nombre moyen de jeunes produits par un certain nombre d’adultes au cours de la période d’essai
Note 1 à l’article: La période d’essai d’évaluation de la reproduction (essai définitif) est de six semaines.
Note 2 à l’article: Jeunes produits = jeunes Enchytraeidae éclos.
3.3
CEx
concentration efficace à x %
concentration (fraction massique) d’une substance soumise à essai qui, par rapport à un témoin,
engendre x % d’un effet sur un critère d’effet donné pendant une période d’exposition définie
EXEMPLE CE50 est une concentration dont on estime qu’elle provoque un effet sur un critère d’effet faisant
l’objet d’un essai chez 50 % d’une population exposée sur une période d’exposition définie.
Note 1 à l’article: La CEx est exprimée en pourcentage du sol soumis à essai (masse sèche) par mélange de sols
(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CEx est exprimée en masse de la substance
soumise à essai par masse sèche de sol, en milligrammes par kilogramme.
3.4
CMEO
concentration minimale avec effet observé
plus faible concentration de substance soumise à essai ayant un effet statistiquement significatif
(p < 0,05)
Note 1 à l’article: Dans le présent essai, la CMEO est exprimée en masse de substance soumise à essai par
masse sèche du sol soumis à essai. Il convient que toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO aient
généralement un effet statistiquement différent du témoin.
3.5
CSEO
concentration sans effet observé
plus haute concentration de substance soumise à essai immédiatement inférieure à la CMEO, à laquelle
aucun effet n’est observé
Note 1 à l’article: Dans le présent essai, la concentration correspondant à la CSEO n’a pas d’effet statistiquement
significatif (p < 0,05) par rapport au témoin au cours d’une période d’exposition définie.
3.6
mélange d’essai
mélange de sol contaminé ou de substance soumise à essai (par exemple substance chimique, biosolides,
déchets) et de sol témoin
3.7
rapport du mélange d’essai
rapport entre le sol soumis à essai et le sol témoin dans un mélange d’essai
2 © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO 16387:2014(F)
3.8
contaminant
substance ou agent présent dans le sol du fait de l’activité humaine
3.9
sol de référence
sol non contaminé possédant des propriétés pédologiques similaires (concentrations en éléments
nutritifs, pH, teneur en carbone organique et texture) à celles du sol analysé
3.10
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les propriétés principales (pH, texture, teneur en matières
organiques) se situent dans une gamme connue
EXEMPLE Sols Euro, sol artificiel, sol standard LUFA.
Note 1 à l’article: Les propriétés des sols standard peuvent être différentes de celles du sol soumis à essai.
3.11
sol témoin
sol de référence ou sol standard satisfaisant aux critères de validité, et utilisé comme témoin et comme
milieu de préparation des gammes de dilutions avec les sols soumis à essai ou avec une substance de
référence
Note 1 à l’article: Dans le cas d’un sol naturel, il est conseillé de démontrer son aptitude à l’essai et sa capacité à
satisfaire aux critères de validité de l’essai avant de l’utiliser dans un essai définitif.
4 Principe
Les effets sur la survie et la reproduction d’Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) adultes exposés à une
gamme de dilutions d’un sol contaminé ou à une gamme de concentrations d’une substance soumise à
essai sont déterminés. Les mélanges d’essai sont préparés au début de l’essai et ne sont pas renouvelés
au cours de la période d’essai.
L’essai peut être scindé en deux étapes distinctes: un essai de courte durée (deux semaines), au cours
duquel la gamme de concentrations entraînant des effets toxiques (principalement la mortalité) est
déterminée, et un essai définitif à long terme (six semaines), au cours duquel la survie des vers adultes
et la fécondité (nombre de jeunes) sont mesurées. Les résultats obtenus lors des essais sont comparés
à ceux obtenus avec un témoin et utilisés pour déterminer les dilutions ou les concentrations qui ne
provoquent pas d’effet sur la survie et la reproduction (CSEO) et la concentration (dilution) qui entraîne
une réduction de x % du nombre de jeunes éclos des cocons par rapport au témoin (CEx, 42 j).
Toutes les dilutions/concentrations d’essai supérieures à la CMEO ont un effet nocif égal ou supérieur
à celui observé à la CMEO. Lorsque la dilution/concentration à laquelle la substance soumise à essai
est susceptible de produire un effet n’est pas connue au préalable, il est utile de réaliser l’essai en deux
étapes:
— un essai de toxicité aiguë (essai préliminaire), pour obtenir une indication de la dilution/concentration
produisant un effet et de la dilution/concentration n’entraînant pas de mortalité (CSEO). Les
dilutions/concentrations à utiliser pour l’essai définitif peuvent ensuite être choisies;
— l’essai définitif sur la reproduction, pour déterminer les effets sublétaux (des dilutions) du
sol contaminé ou de la concentration d’une substance qui, réparti(e) de façon homogène dans
le sol standard, n’a pas d’effet significatif sur le nombre de jeunes éclos des cocons comparé au
témoin (CSEO), ainsi que la plus faible concentration produisant un effet (CMEO).
NOTE L’utilisation d’un sol de référence approprié est une exigence essentielle pour démontrer l’état actuel
de la population soumise à essai et pour éviter toute erreur d’interprétation des résultats.
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ISO 16387:2014(F)
5 Réactifs et matériel
5.1 Matériel biologique, l’espèce recommandée pour l’essai est Enchytraeus albidus Henle 1837 (ver
blanc; Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). E. albidus, l’une des plus grandes espèces d’Enchytraeidae,
se caractérise par une taille de 15 mm à 40 mm et une répartition géographique mondiale (voir par
[21] [31]
exemple , ). Cette espèce est facilement reconnaissable grâce à deux caractéristiques: quatre soies
par faisceau sur la face ventrale et un très long canal séminal dans la région du clitellum et de quelques
segments postérieurs. On rencontre cette espèce en habitat marin, limnique et terrestre, principalement
dans les matières organiques en décomposition (varech, compost) et seulement rarement dans les
prairies. Cette tolérance écologique très étendue, ainsi que certaines variations morphologiques,
indiquent que cette espèce englobe probablement plusieurs races (ou écotypes). E. albidus peut être
obtenu dans le commerce, puisqu’il est vendu comme nourriture pour poissons. Il convient de vérifier
si ce type de culture n’est pas contaminé par d’autres espèces de taille généralement inférieure (voir par
[7] [10] [32]
exemple , , ). En cas de contamination, tous les vers sont lavés à l’eau dans une boîte de Petri. Les
spécimens adultes d’E. albidus de grande taille sont sélectionnés à l’aide d’une loupe binoculaire pour
démarrer une nouvelle culture. Tous les autres vers issus de la culture initiale sont éliminés. E. albidus
peut être facilement élevé dans un grand nombre de matériaux organiques (voir l’Annexe A) et présente
un cycle de vie court, la maturité étant atteinte entre 33 j (à 18 °C) et 74 j (à 12 °C). Seules les cultures
ayant été conservées au laboratoire pendant au moins cinq semaines (soit un cycle de génération) sans
problème doivent être utilisées pour les essais.
D’autres espèces du genre Enchytraeus, telles que E. crypticus Westheide et Graefe 1992 ou E. buchholzi
Vejdovsky 1879, populations vivant réellement dans le sol, mais plus petites, sont également admises
en tant qu’organismes soumis à essai (voir l’Annexe B). Si d’autres espèces du genre Enchytraeus sont
utilisées, elles doivent être clairement identifiées et il convient de mentionner les raisons pour lesquelles
ces espèces ont été choisies, ainsi que les écarts par rapport à la méthode d’essai. Il convient que les
vers soumis aux essais soient des individus adultes porteurs d’œufs (points blancs) dans la région du
clitellum et qu’ils soient de taille approximativement égale (environ 15 mm). Il n’est pas nécessaire
de synchroniser la culture d’élevage. Il convient d’acclimater les Enchytraeidae dans un sol artificiel
non traité, dans les conditions de l’essai, pendant au moins 24 h avant l’essai. Durant cette période, il
convient de distribuer, en quantité suffisante, la nourriture qui sera également utilisée comme source
d’alimentation durant l’essai.
Il convient, pour un essai, de prélever dans la boîte d’élevage un échantillon surnuméraire de vers adultes
possédant un clitellum, sans les observer en détail, afin de disposer d’une population de vers appropriée
suffisante. Au terme de la période d’acclimatation, seuls les vers porteurs d’œufs et présentant un
comportement habituel (par exemple n’essayant pas de s’échapper du sol artificiel) sont sélectionnés
pour l’essai. La sélection est effectuée en observant à la loupe binoculaire les vers placés dans une boîte
de Petri contenant une faible quantité d’eau et en éliminant les animaux dépourvus d’œufs. Il convient
[23]
d’utiliser, de préférence, un milieu d’eau douce (par exemple, de l’eau reconstituée selon ), car l’eau
déminéralisée ou l’eau du robinet (risque de contamination au cuivre) peut s’avérer nocive pour les
Enchytraeidae. Au cours de ce processus, les autres organismes vivant dans les cultures, tels que les
acariens, sont également séparés des vers.
NOTE Un exemple de culture d’Enchytraeus sp. est donné dans l’Annexe A.
5.2 Mélange d’essai, qui peut être constitué d’un sol prélevé sur le terrain ou d’un sol témoin amendé
par la substance soumise à essai.
5.2.1 Sol prélevé sur le terrain ou déchets
Le (les) échantillon(s) de sol peut (peuvent) être un sol prélevé sur un site industriel, agricole ou un autre
site d’intérêt, ou des déchets (par exemple, matériau de dragage, boue de station d’épuration des eaux
usées urbaines, matériau composite ou fumier) dont une éventuelle mise en décharge est envisagée.
Les sols prélevés sur le terrain et utilisés pour l’essai doivent être tamisés au moyen d’un tamis à mailles
carrées de 4 mm pour éliminer les fragments grossiers, puis soigneusement mélangés. Si nécessaire, le
sol peut être séché à l’air, sans chauffage, avant d’être tamisé. Il convient que la durée de conservation des
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ISO 16387:2014(F)
sols soumis à essai soit la plus courte possible. Le sol doit être conservé conformément à l’ISO 10381-6,
en utilisant des récipients qui réduisent au minimum les pertes de contaminants du sol par volatilisation
et par sorption sur les parois du récipient. Il convient de ne pas corriger le pH du sol car il peut influer
sur la biodisponibilité des contaminants du sol.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées pour
chaque échantillon de sol prélevé sur site:
a) le pH conformément à l’ISO 10390;
b) la texture (sable, limon, vase) conformément à l’ISO 11277;
c) la teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
d) la capacité de rétention d’eau selon l’Annexe C;
e) la capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260;
f) la teneur en carbone organique conformément à l’ISO 10694.
NOTE Il est important de mesurer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai
5.2.2 Sol témoin, soit a) un sol de référence (3.9), soit b) un sol standard (3.10) qui permet la présence
des Enchytraeidae [les critères de validité doivent être satisfaits, au minimum). Le sol témoin et le sol
utilisé pour la dilution doivent être les mêmes dans tous les essais (soit a), soit b)].
a) Si l’on dispose de sols de référence provenant de zones non contaminées proches d’un site contaminé,
il convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les sols soumis à essai. Si
une contamination toxique ou des propriétés pédologiques inhabituelles ne peuvent être exclues, il
convient de privilégier des sols témoins standard.
b) Pour évaluer les effets des substances mélangées au sol, des sols standard (par exemple, sol artificiel,
sol LUFA) doivent être utilisés comme substrat d’essai. Les propriétés du sol standard prélevé sur le
terrain doivent être consignées dans le rapport.
Le substrat appelé «sol artificiel» peut être utilisé comme sol standard et présente la composition
suivante:
Pourcentage exprimé sur
la base de la masse sèche
− Tourbe de sphaigne finement broyée et exempte de tout 10 %
résidu végétal visible
− Argile kaolinite contenant au minimum 30 % de kaoli- 20 %
nite
− Sable de quartz industriel (sable fin dominant, avec plus 69 %
de 50 % des grains présentant une granulométrie de 0,05 mm à
0,2 mm)
Une quantité de 0,3 % à 1,0 % environ de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique)
3
est nécessaire pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Considérant les propriétés des substances fortement apolaires (log K > 2) ou des substances
ow
ionisantes, un pourcentage de 5 % de tourbe s’est avéré suffisant pour maintenir la structure souhaitée du sol
[22]
artificiel.
Préparer le sol artificiel au moins trois jours avant le début de l’essai, en mélangeant soigneusement les
constituants secs énumérés ci-dessus dans un mélangeur de laboratoire de grande capacité. Une partie
de l’eau déionisée nécessaire est ajoutée au cours du mélange. La quantité de carbonate de calcium
requise peut varier en fonction des propriétés du lot de tourbe de sphaigne concerné; il convient par
© ISO 2014 – Tous droits réservés 5
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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 16387
ISO/TC 190/SC 4 Secrétariat: AFNOR
Début de vote Vote clos le
2012-04-26 2012-09-26
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION МЕЖДУНАРОДНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Qualité du sol — Effets des polluants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la survie et
la reproduction
Soil quality — Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Determination of effects on
reproduction
[Révision de la première édition (ISO 16387:2004)]
ICS 13.080.30
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
Le présent projet a été élaboré dans le cadre de l'Organisation internationale de normalisation (ISO) et
soumis selon le mode de collaboration sous la direction de l'ISO, tel que défini dans l'Accord de
Vienne.
Le projet est par conséquent soumis en parallèle aux comités membres de l'ISO et aux comités
membres du CEN pour enquête de cinq mois.
En cas d'acceptation de ce projet, un projet final, établi sur la base des observations reçues, sera
soumis en parallèle à un vote d'approbation de deux mois au sein de l'ISO et à un vote formel au sein
du CEN.
Pour accélérer la distribution, le présent document est distribué tel qu'il est parvenu du
secrétariat du comité. Le travail de rédaction et de composition de texte sera effectué au
Secrétariat central de l'ISO au stade de publication.
To expedite distribution, this document is circulated as received from the committee
secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text composition will be undertaken at
publication stage.
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE
PEUT ETRE CITE COMME NORME INTERNATIONALE AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D'ETRE EXAMINES POUR ETABLIR S'ILS SONT ACCEPTABLES A DES FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ETRE
CONSIDERES DU POINT DE VUE DE LEUR POSSIBILITE DE DEVENIR DES NORMES POUVANT SERVIR DE REFERENCE DANS LA
REGLEMENTATION NATIONALE.
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE.
© Organisation Internationale de Normalisation, 2012
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ISO/DIS 16387
Notice de droit d'auteur
Ce document de l'ISO est un projet de Norme internationale qui est protégé par les droits d'auteur de l'ISO.
Sauf autorisé par les lois en matière de droits d'auteur du pays utilisateur, aucune partie de ce projet ISO ne
peut être reproduite, enregistrée dans un système d'extraction ou transmise sous quelque forme que ce soit
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Toute reproduction est soumise au paiement de droits ou à un contrat de licence.
Les contrevenants pourront être poursuivis.
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ISO/DIS 16387
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction . v
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Réactifs . 4
6 Appareillage . 6
7 Environnement d'essai . 7
8 Mode opératoire . 7
8.1 Dispositif expérimental . 7
8.1.2 Essai préliminaire . 8
8.1.3 Essai définitif . 8
8.2 Préparation des mélanges d'essai . 9
8.2.1 Essais menés avec un sol contaminé . 9
8.2.2 Essais menés avec des substances ajoutées au substrat d’essai . 9
8.2.3 Préparation du récipient témoin . 10
8.3 Ajout du matériel biologique . 10
8.4 Conditions d’essai et mesurages . 10
8.5 Substance de référence . 11
9 Calcul et expression des résultats . 11
9.1 Calcul . 11
9.2 Expression des résultats . 11
10 Validité de l’essai . 11
11 Analyse statistique . 12
11.1 Essai préliminaire . 12
11.2 Essai définitif . 12
12 Rapport d'essai . 13
Annexe A (informative) Conditions de culture de Enchytraeus sp. . 14
Annexe B (informative) Mode opératoire d’essais menés avec d’autres espèces du genre
Enchytraeus . 16
Annexe C (informative) Description détaillée des techniques d'extraction . 18
Annexe D (informative) Détermination de la capacité maximale de rétention d’eau . 20
Annexe E (informative) Présentation de l'évaluation statistique des données (détermination de la
CSEO) . 21
Bibliographie . 22
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ISO/DIS 16387
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 16387 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4, Méthodes
biologiques, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 345, Qualité du sol.
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 16387
Introduction
Les systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les effets des
contaminants du sol et sont proposés en complément des analyses chimiques conventionnelles. L’ISO 15799
comporte une liste ainsi qu’une brève caractérisation des systèmes d’essais recommandés et normalisés. Les
systèmes d’essais aquatiques mis en œuvre sur éluat de sol sont mis en œuvre pour obtenir des informations
sur la fraction de contaminants susceptible d’atteindre les eaux souterraines du fait de la circulation de l'eau
(fonction de rétention des sols), tandis que les systèmes d’essais terrestres servent à évaluer la fonction
d’habitat des sols. Concernant les seconds, un système d’essai normalisé utilisant Enchytraeidae (un essai
chronique prenant la reproduction comme critère d'effet final) est proposé.
L’ISO 16387 décrit une méthode basée sur la détermination des effets aigus et sublétaux des sols contaminés
sur les Enchytraeidae adultes du genre Enchytraeus. La méthode peut éventuellement être utilisée pour
évaluer le potentiel toxique aigu vis-à-vis des Enchytraeidae de substances chimiques ajoutées à un sol
standard (par exemple, un sol artificiel).
Les annélides du genre Enchytraeus vivant dans le sol sont pertinents sur le plan écologique car ils abondent
dans un grand nombre de sols pauvres en vers de terre ; cependant, ils peuvent également atteindre de fortes
densités de population dans des sols abondamment peuplés en vers de terre. Les Enchytraeidae se prêtent à
des essais en laboratoire ainsi qu'à des études en conditions semi-contrôlées et à des études de terrain. D’un
point de vue pratique, de nombreuses espèces d'Enchytraeus sont faciles à manipuler et à élever et leur
temps de génération est nettement plus court que celui des vers de terre [la durée des essais de reproduction
des Enchytraeidae est de quatre à six semaines, contre huit semaines (12 semaines en incluant la
synchronisation) pour les vers de terre]. De plus, le volume de sol nécessaire pour les essais menés sur les
Enchytraeidae est de loin inférieur au volume nécessaire pour les essais sur les vers de terre.
La présente partie de l’ISO 16387 a été rédigée en tenant compte des modes opératoires d’essai
recommandés par l’Organisation de coopération et de développement économiques (voir les références
bibliographiques).
© ISO 2012 – Tous droits réservés v
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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 16387
Qualité du sol — Effets des polluants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la survie et
la reproduction
1 Domaine d'application
La présente partie de l’ISO 16387 spécifie une des méthodes permettant d'évaluer la fonction d’habitat des
sols et de déterminer les effets des contaminants du sol et des substances chimiques sur la reproduction
d’Enchytraeus sp. par absorption cutanée et ingestion dans un essai chronique. Elle est applicable aux sols et
aux matériaux de type sol de qualité inconnue, provenant par exemple, de sites contaminés, de sols
amendés, de sols après remédiation, de sols agricoles ou autres sites d'intérêt, et de déchets.
Les effets des substances sont évalués à l'aide d'un sol standard, de préférence un substrat de sol artificiel
défini. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol témoin.
Selon l'objectif de l'étude, il convient que le substrat témoin et de dilution (gamme de dilutions d'un sol
contaminé) soit un sol non contaminé comparable à l'échantillon de sol à soumettre à essai (sol de référence)
ou un sol standard (par exemple, sol artificiel).
Des informations sont fournies sur la manière d'utiliser cette méthode pour évaluer des substances chimiques
en conditions tempérées.
Cette méthode ne s'applique pas aux substances volatiles, c'est-à-dire aux substances pour lesquelles H
(constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de
vapeur à 25 °C est supérieure à 0,013 3 Pa.
NOTE La méthode d'essai ne contient aucune disposition permettant de surveiller la persistance de la
substance soumise à essai.
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de substances
chimiques toxiques, mutagènes ou nocives d'une autre manière ou des micro-organismes infectieux.
Des risques pour la santé au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l'évaporation de
substances chimiques pendant la manipulation et l’incubation, de même que par contact cutané.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence (y compris les éventuels amendements)
s'applique.
ISO 10381-6, Qualité du sol – Échantillonnage – Partie 6 : Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l'évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens.
ISO 10390, Qualité du sol – Détermination du pH.
ISO 10694, Qualité du sol – Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire).
ISO 11260, Qualité du sol – Détermination de la capacité d'échange cationique effective et du taux de
saturation en bases échangeables à l'aide d'une solution de chlorure de baryum.
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ISO/DIS 16387
ISO 11268-1, Qualité du sol – Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida/Eisenia andrei) –
Partie 1 : Détermination de la toxicité aiguë.
ISO 11465, Qualité du sol – Détermination de la teneur en matière sèche et en eau pondévale – Méthode
gravimétrique.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
reproduction
nombre moyen de jeunes produits par récipient d'essai après six semaines d'incubation dans les conditions
d'essai spécifiées
3.2
taux de reproduction
nombre moyen de jeunes éclos des cocons et ayant survécu jusqu'à la fin de la période d'essai, par ver adulte
encore vivant après six semaines
3.3
ECx
concentration efficace
concentration de la substance d'essai ou pourcentage de dilution du sol contaminé dont on estime qu'elle ou il
réduit le taux de reproduction à la fin de l'essai à x %, par rapport au témoin, pendant la période d'essai (x est
le pourcentage (10, 20, 25, 50) de cet effet)
3.4
CMEO
concentration minimale avec effet observé
plus faible rapport testé du mélange de sols soumis à essai avec un sol de référence ou un sol témoin
standard, pour lequel un effet statistiquement significatif est observé, ou plus faible concentration testée d'une
substance d'essai à laquelle un effet statistiquement significatif par rapport au témoin est observé. Tous les
mélanges d’essai au-dessus de la CMEO ont un effet nocif égal ou supérieur à l’effet observé à la CMEO
3.5
CSEO
concentration sans effet observé
rapport du mélange de sols immédiatement inférieur à la CMEO ou plus forte concentration testée d'une
substance d'essai qui, comparé(e) au témoin, n’a aucun effet létal ou autre effet statistiquement significatif [tel
qu'une modification du poids (p < 0,05)]
3.6
mélange d'essai
mélange de la substance d'essai avec le sol standard, mélange de sol contaminé avec le sol témoin ou
mélange de sol contaminé avec un sol non contaminé comparable à l'échantillon de sol à soumettre à essai
3.7
ratio du mélange d’essai
rapport entre le sol contaminé et le sol témoin dans un mélange d'essai
3.8
contaminant
substance ou agent présent dans le sol du fait de l'activité humaine
[ISO 15176]
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ISO/DIS 16387
3.9
sol de référence
sol non contaminé spécifique du site (par exemple, prélevé aux voisinage d’un site contaminé), ayant des
propriétés similaires (concentrations en éléments nutritifs, pH, teneur en carbone organique et texture) à
celles du sol soumis à essai
3.10
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les propriétés principales (par exemple, pH, texture, teneur en
matières organiques) se situent dans une gamme connue, par exemple sols Euro [15], sol artificiel [20], sol
standard LUFA
[11268-1]
Note 1 à l’article : Les propriétés des sols standards peuvent être différentes de celles du sol soumis à essai.
3.11
sol témoin
sol de référence ou sol standard utilisé comme témoin et comme milieu de préparation des gammes de
dilutions avec les sols soumis à essai ou une substance de référence, qui permet la présence des enchytrées
(les critères de validité doivent être satisfaits)
Note 1 à l’article : Toutes les concentrations efficaces sont exprimées en milligrammes de substance d’essai par
kilogramme de masse sèche du substrat d’essai (5.2). Les mélanges de sols sont indiqués en pourcentage sur la base du
poids sec de sol.
4 Principe
Les effets sur la survie et la reproduction d’Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) adultes exposés à une gamme
de dilutions d’un sol contaminé ou à une gamme de concentrations d’une substance d’essai sont déterminés.
Les mélanges d'essai sont préparés au début de l'essai et ne sont pas renouvelés au cours de la période
d’essai.
L'essai peut être scindé en deux étapes distinctes : un essai préliminaire de courte durée (deux semaines), au
cours duquel la gamme de concentrations entraînant des effets toxiques (principalement la mortalité) est
déterminée, et un essai définitif à long terme (six semaines), au cours duquel la survie des vers adultes et la
fécondité (nombre de jeunes) sont mesurées. Les résultats obtenus lors des essais sont comparés à ceux
obtenus avec un essai témoin et utilisés pour déterminer les dilutions ou les concentrations qui ne provoquent
pas d'effet sur la survie et la reproduction (CSEO) et la concentration (dilution) qui entraîne une réduction de
x % du nombre de jeunes éclos des cocons par rapport au témoin (CEx, 42 j).
Toutes les dilutions/concentrations d'essai supérieures à la CMEO ont un effet dommageable égal ou
supérieur à celui observé à la CMEO. Lorsque la dilution/concentration à laquelle la substance d'essai est
susceptible de produire un effet n’est pas connue au préalable, il est utile de conduire l'essai en deux étapes :
⎯ un essai préliminaire de toxicité aiguë, pour obtenir une indication de la dilution/concentration
produisant un effet et de la dilution/concentration n’entraînant pas de mortalité (CSEO). Les
dilutions/concentrations à utiliser pour l'essai définitif peuvent ensuite être choisies ;
⎯ l’essai définitif sur la reproduction, pour déterminer les effets sublétaux (des dilutions) du sol
contaminé ou de la concentration d'une substance chimique qui, réparti(e) de façon homogène dans
le sol standard, n'a pas d'effet significatif sur le nombre de jeunes éclos des cocons comparé au
témoin (CSEO), ainsi que la plus faible concentration produisant un effet (CMEO).
NOTE L’utilisation d’un sol de référence est une exigence essentielle pour démontrer l'état actuel de la population
soumise à essai et pour éviter toute erreur d’interprétation des résultats.
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ISO/DIS 16387
Si le sol à soumettre à essai a des propriétés très différentes de celles des sols témoins standards normaux
(par exemple, sol artificiel de l’OCDE ou sol LUFA 2.2), par exemple un pH plutôt bas ou plutôt haut ou une
teneur très faible ou très élevée en matières organiques ou en argile, il est essentiel d’avoir un sol de
référence doté des mêmes propriétés. Dans ce cas, les performances de contrôle des enchytrées risquent
toutefois d’être moins bonnes que la « normale » et le sol de référence ne peut servir de base au contrôle
qualité de l’essai. Cependant, pour évaluer la toxicité du sol soumis à essai, il est important de disposer d’un
sol de référence, qui peut également servir à la préparation des gammesde dilutions du sol soumis à essai. Il
est donc essentiel, dans ce cas, d’inclure à la fois un sol de référence et un sol témoin.
5 Réactifs
5.1 Matériel biologique
L'espèce recommandée pour l'essai est Enchytraeus albidus Hence 1837 (ver blanc ; Enchytraeidae,
Oligochaeta, Annelida). E. albidus, l'une des plus grandes espèces d'Enchytraeidae, se caractérise par une
taille de 15 mm à 40 mm et une distribution géographique mondiale (voir la Bibliographie). Cette espèce est
facilement reconnaissable grâce à deux caractéristiques : quatre soies par faisceau sur la face ventrale et un
très long canal séminal dans la région du clitellum et de quelques segments postérieurs. On rencontre cette
espèce en habitat marin, limnique et terrestre, principalement dans les matières organiques en décomposition
(varech, compost) et seulement rarement dans les prairies. Cette tolérance écologique très étendue, ainsi que
certaines variations morphologiques, indiquent que cette espèce peut englober plusieurs races (ou écotypes).
E. albidus peut être obtenu dans le commerce, puisqu'il est vendu comme aliment pour poissons. Il convient
de vérifier si ce type de culture n’est pas contaminé par d’autres espèces de taille généralement inférieure
(voir la Bibliographie). En cas de contamination, tous les vers sont lavés à l'eau dans une boîte de Petri. Les
spécimens adultes de E. albidus de grande taille sont sélectionnés à l'aide d'une loupe binoculaire pour
démarrer une nouvelle culture. Tous les autres vers issus de la culture initiale sont éliminés. E. albidus peut
être facilement élevé dans un grand nombre de déchets organiques (voir l'Annexe A) et présente un cycle de
vie court, la maturité étant atteinte entre 33 j (à 18 °C) et 74 j (à 12 °C). Seules les cultures ayant été
conservées au laboratoire pendant au moins cinq semaines (soit un cycle de génération) sans problèmes sont
utilisables pour les essais.
D'autres espèces du genre Enchytraeus, telles que E. crypticus Westheide et Graefe 1992 ou E. buchholzi
Vejdovsky 1879, populations réellement indigènes mais plus petites, sont également admises en tant
qu'organismes d'essai (voir l'Annexe B). Si d'autres espèces du genre Enchytraeus sont utilisées, elles
doivent être clairement identifiées et il convient de mentionner les raisons pour lesquelles ces espèces ont été
choisies, ainsi que les écarts par rapport à la méthode d'essai. Il convient que les vers soumis aux essais
soient des individus adultes porteurs d'œufs (points blancs) dans la région du clitellum et qu'ils soient de taille
approximativement égale (environ 15 mm). Il n'est pas nécessaire de synchroniser la culture d'élevage. Il
convient d'acclimater les Enchytraeidae dans un sol artificiel non traité, dans les conditions de l'essai, pendant
au minimum les 24 h qui précèdent l'essai. Durant cette période, il convient de distribuer des quantités
suffisantes de la nourriture qui sera également utilisée comme source d'alimentation durant l'essai.
Il convient, pour un essai, de prélever dans la boîte d'élevage un échantillon surnuméraire de vers adultes
possédant un clitellum, sans les observer en détail, afin de disposer d'une population de vers suffisante. Au
terme de la période d'acclimatation, seuls les vers porteurs d'œufs et présentant un comportement normal
(par exemple, n'essayant pas de s'échapper du sol artificiel) sont sélectionnés pour l'essai. La sélection est
effectuée en observant à la loupe binoculaire les vers placés dans une boîte de Petri contenant une faible
quantité d'eau et en éliminant les animaux dépourvus d'œufs. Il convient d'utiliser, de préférence, un milieu
o
d'eau douce (par exemple, de l'eau reconstituée conformément à la ligne directrice n 202 de l'OCDE), car
l'eau déminéralisée ou l'eau du robinet (en cas de contamination au cuivre) risque d'être nocive pour les
Enchytraeidae. Au cours de ce processus, les autres organismes vivant dans les cultures, tels que les mites,
sont également séparés des vers.
NOTE Un exemple de culture d’Enchytraeus sp.est donné dans l’Annexe A.
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ISO/DIS 16387
5.2 Sols soumis à essai
5.2.1 Sol prélevé sur le terrain
Le (les) échantillon(s) de sol peut (peuvent) être un sol prélevé sur un site industriel, agricole ou autre site
d’intérêt, ou des déchets (par exemple, matériau de dragage, boue de station d’épuration des eaux urbaines,
matériau composite ou fumier) dont un éventuel dépôt terrestre est envisagé.
Les sols utilisés dans l’essai doivent être tamisés au moyen d'un tamis à mailles carrées de 4 mm pour
éliminer les fragments grossiers, puis soigneusement mélangés. Si nécessaire, le sol peut être séché à l’air,
sans chauffage, avant d’être tamisé. Il convient que la durée de conservation des sols soumis à essai soit la
plus courte possible. Le sol doit être conservé conformément à l’ISO 10381-6 en utilisant des récipients qui
réduisent au minimum les pertes de contaminants du sol par volatilisation et par sorption sur les parois du
récipient. Il convient de ne pas corriger le pH du sol car il peut avoir une influence sur la biodisponibilité des
contaminants du sol.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, il convient de déterminer les caractéristiques suivantes pour chaque
échantillon de sol prélevé sur site :
a) le pH conformément à l'ISO 10390 ;
b) la texture (sable, limon, vase) conformément à l’ISO 11277 ;
c) la teneur en eau conformément à l'ISO 11465 ;
d) la capacité de rétention d’eau selon l'Annexe D ;
e) la capacité d'échange cationique conformément à l'ISO 11260 ;
f) la teneur en carbone organique conformément à l’ISO 10694.
NOTE Il est important de mesurer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai.
5.2.2 Sol témoin
Selon l'objectif de l'étude, il convient que le substrat utilisé pour le témoin et pour les dilutions (gamme de
dilutions de sol contaminé) soit a) un sol de référence (3.9) ou b) un sol standard (3.10) qui permet la
présence des enchytrées (les critères de validité doivent être satisfaits).
5.1.1.1 Sols de référence
Si l’on dispose de sols de référence provenant de zones non contaminées proches d’un site contaminé, il
convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les sols soumis à essai. Si une
contamination toxique ou des propriétés pédologiques inhabituelles ne peuvent être exclues, il convient de
privilégier des sols témoins standards.
5.1.1.2 Sols standards
Pour évaluer les effets des substances mélangées au sol ou pour réaliser des dilutions du sol soumis à essai,
des sols standards doivent être utilisés comme substrat d’essai. Les propriétés du sol standard prélevé sur le
terrain doivent être consignées dans le rappor
...
Questions, Comments and Discussion
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