Soil and water quality — Guidance and requirements for designing an interlaboratory trial for validation of biotests

This document aims to assist in designing and organizing trials for validation of biotests. The validation activities during the different steps of the standardization process are described. This document comprises the overall data evaluation and subsequent validation study conclusion. This document is intended for the validation of biotests which can differ in their experimental design and endpoints. It is possible that some of the requirements of this document are not applicable to all test methods.

Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences relatives à la conception d’un essai interlaboratoires pour la validation des essais biologiques

This document aims to assist in designing and organizing trials for validation of biotests. The validation activities during the different steps of the standardization process are described. This document comprises the overall data evaluation and subsequent validation study conclusion. This document is intended for the validation of biotests which can differ in their experimental design and endpoints. It is possible that some of the requirements of this document are not applicable to all test methods.

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Status
Published
Publication Date
10-Nov-2022
Current Stage
6060 - International Standard published
Due Date
30-Sep-2023
Completion Date
11-Nov-2022
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Technical specification
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Standards Content (sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 5594
First edition
2022-11
Soil and water quality — Guidance
and requirements for designing an
interlaboratory trial for validation of
biotests
Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences relatives à
la conception d’un essai interlaboratoires pour la validation des essais
biologiques
Reference number
ISO/TS 5594:2022(E)
© ISO 2022
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ISO/TS 5594:2022(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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Published in Switzerland
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ISO/TS 5594:2022(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ..................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions .................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 3

5 Requirements, design and organization of method validation testing round(s)............................4

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

5.2 Prevalidation — Minimum requirements of test method performance ............................................. 4

5.3 First validation step — Demonstration of participating laboratories’ readiness for

testing ............................................................................................................................................................................................................. 5

5.4 Second validation step — Demonstration of laboratory capability and

transferability of the biotest ...................................................................................................................................................... 5

5.5 Third validation step — Method validation ................................................................................................................. 6

5.5.1 General ........................................................................................................................................................................................ 6

5.5.2 Participating laboratories .......................................................................................................................................... 6

5.5.3 Samples ....................................................................................................................................................................................... 6

5.5.4 Experimental design ....................................................................................................................................................... 7

5.5.5 Supporting information for participants ...................................................................................................... 7

5.5.6 Data analysis and statistical evaluation of interlaboratory testing ..................................... 8

6 Assessment ........................................................................................................................................... ......................................................................8

7 Documentation and reporting .............................................................................................................................................................. 9

Annex A (informative) Determination of accuracy (trueness and precision) in case the

results of ecotoxicity tests are expressed as toxicity metrics .........................................................................10

Annex B (informative) Estimation of the repeatability standard deviation ..........................................................15

Annex C (informative) Calculation and reporting of uncertainty of s .......................................................................17

Annex D (informative) Validation schema ..................................................................................................................................................19

Annex E (informative) Questionnaire (example) ................................................................................................................................20

Annex F (informative) Specific features of terrestrial biotests which are recommended to

be addressed by lead laboratories .................................................................................................................................................22

Annex G (informative) Specific features of water biotests which are recommended to be

addressed by lead laboratories .........................................................................................................................................................25

Annex H (informative) Summary of interlaboratory trials performed within the validation

of terrestrial biotests ...................................................................................................................................................................................27

Annex I (informative) Summary of interlaboratory trials performed within the validation

of water biotests ................................................................................................................................................................................................33

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................40

iii
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---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 5594:2022(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to

the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see

www.iso.org/iso/foreword.html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,

Biological characterization, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,

Subcommittee SC 5, Biological methods.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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ISO/TS 5594:2022(E)
Introduction

Validation of an ISO biotest standard aims to estimate the uncertainty of results by means of an

interlaboratory trial. This validation program typically involves three major steps.

a) Demonstration of readiness for testing: This 1st step is an opportunity for the lead laboratory to

ensure that recommended instrumentation is in place and that test organism and cell cultures have

been established using performance measures to ensure healthy organisms or cultures are used in

testing. These conditions are typically part of the clause/subclause entitled "Test organisms" or

"Test material" in an ISO standard.

b) Demonstration of laboratory capability and transferability of the biotest: In this 2nd step, the

participating laboratories aim to achieve successful control performance during this preliminary

interlaboratory testing round with a reference compound added either to a solid matrix or to a

liquid medium according to the biotest method to be validated. The ability to conduct the testing

standard is demonstrated by fulfilling the validity criteria (e.g. variability of controls expressed

as the coefficient of variation for the number of juveniles in a reproduction test) and qualifies the

laboratory for the final method validation step.

c) Method validation: The 3rd step involves only laboratories who have demonstrated the expertise in

conducting the ISO standard under development (step b). In case of validation of an ecotoxicological

or microbiological testing method, one or two rounds of interlaboratory method validation trial

using a contaminated environmental sample (or samples) are conducted and the results from

each round are used to calculate the intralaboratory and interlaboratory variability of the ISO

testing standard as a demonstration of method precision (Annex A). If repeated testing runs of

the biotest are feasible, repeatability is determined. For the validation of ecotoxicological methods

it can be useful to evaluate the correctness of the measured effect – the measurement trueness.

This holds true especially for methods of which the results are reported in terms of a quantitative

measurement such as a biological equivalence concentration. Obtained results are used for

confirming or adjusting the validity criteria.

For the validation study, representative samples should be selected according to the intended scope

of the standard (e.g. contaminated soils, amended soils, soils after remediation, waste materials,

wastewaters, eluates, surface water, groundwater, sediments and extracted samples).

An overall schema of the validation process can be found in Annex D.
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 5594:2022(E)
Soil and water quality — Guidance and requirements for
designing an interlaboratory trial for validation of biotests
1 Scope

This document aims to assist in designing and organizing trials for validation of biotests. The validation

activities during the different steps of the standardization process are described. This document

comprises the overall data evaluation and subsequent validation study conclusion.

This document is intended for the validation of biotests which can differ in their experimental design

and endpoints. It is possible that some of the requirements of this document are not applicable to all

test methods.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
control

material and/or matrix that duplicates all factors that can affect results except the specific condition or

treatment being studied

Note 1 to entry: In toxicity tests, the control should have all the same conditions as in the treatment exposure but

without the toxicant.
[SOURCE: Environment Canada 2005]
3.2
endpoint
statistically derived toxicity threshold (e.g. EC50)

[SOURCE: Environment Canada 2005, modified — The recommendation not to use the term for observed

variables, such as size, is deleted]
3.3
lead laboratory
laboratory responsible for organization of the interlaboratory validation study
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ISO/TS 5594:2022(E)
3.4
measurement trueness
trueness of measurement
trueness

closeness of agreement between the average of an infinite number of replicate measured quantity

values and a reference quantity value

Note 1 to entry: The requirement for an infinite number of replicate measurements has a theoretical background.

In practice a large series of test results is used to estimate the measurement trueness.

[SOURCE: ISO/IEC Guide 99:2007 2.14, modified — Notes to entry have been replaced]

3.5
performance characteristics

measures of the performance of a test under specific conditions, including its reliability and accuracy

Note 1 to entry: Performance characteristics are an indication of the test’s usefulness, limitations, and relevance.

[SOURCE: OECD 2005]
3.6
precision

closeness of agreement between indications or measured quantity values obtained by replicate

measurements on the same or similar objects under specified conditions

Note 1 to entry: Measurement precision is usually expressed numerically by measures of imprecision, such as

standard deviation, variance, or coefficient of variation under the specified conditions of measurement.

Note 2 to entry: The ‘specified conditions’ can be, for example, repeatability conditions (3.10) of measurement,

intermediate precision conditions of measurement, or reproducibility conditions (3.12) of measurement

(see ISO 5725-1).

Note 3 to entry: Measurement precision is used to define measurement repeatability (3.9), intermediate

measurement precision, and measurement reproducibility (3.11).

Note 4 to entry: Sometimes “measurement precision” is erroneously used to mean measurement accuracy.

[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.7
prevalidation
initial phase(s) of a validation study

Note 1 to entry: A small-scale study intended to obtain preliminary information on the relevance and reliability

of a test method. Based on the outcome of those studies, the test method protocol may be modified or optimized

to reduce intra- and/or interlaboratory variability and increase accuracy in subsequent validation studies. If

available, literature data may be used for this purpose.

[SOURCE: OECD: 2005, modified — Reasons for performing prevalidation are not included]

3.8
reference compound
chemical for which the response of the test organism is known
3.9
repeatability

measurement precision (3.6) under a set of repeatability conditions (3.10) of measurement

[SOURCE: JCGM 200:2012]
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ISO/TS 5594:2022(E)
3.10
repeatability condition

condition of measurement, out of a set of conditions that includes the same measurement procedure,

same operators, same measuring system, same operating conditions and same location, and replicate

measurements on the same or similar objects over a short period of time

Note 1 to entry: A condition of measurement is a repeatability condition only with respect to a specified set of

repeatability conditions.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.11
reproducibility

measurement precision (3.6) under reproducibility conditions (3.12) of measurement

Note 1 to entry: Relevant statistical terms are given in ISO 5725-1 and ISO 5725-2.

3.12
reproducibility condition

condition of measurement, out of a set of conditions that includes different locations, operators,

measuring systems, and replicate measurements on the same or similar objects

Note 1 to entry: The different measuring systems may use different measurement procedures.

Note 2 to entry: A specification should give the conditions changed and unchanged, to the extent practical.

[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.13
interlaboratory method validation trial

interlaboratory validation study in which all laboratories perform the same biotest using the same

material under testing and the same test protocol

Note 1 to entry: The purpose of the test is to determine inter laboratory and, whenever possible, intra laboratory

variability.
3.14
transferability

ability of a test procedure to be accurately and reliably performed in independent, competent

laboratories
[SOURCE: OECD: 2005]
4 Principle

Validation of a proposed test method is achieved through the demonstration of reasonable coefficients

of intralaboratory and interlaboratory variation, which have participated in the formal method

validation testing round(s) (i.e. the 3rd validation step, 5.5). Repeatability should preferentially be

determined. However, on occasion, the duration or workload of the test method prevents the analysis

by individual laboratories from being repeated. In case of missing experimental data obtained under

repeatability conditions, it is proposed to estimate repeatability from the confidence limits of the

toxic metric that integrates the variability of repeated measures of the biological variable in each

treatment/dilution (see Reference [67]). If appropriate, the measurement trueness of the method can

be determined in line with the method validation, in particular for methods the results of which are

reported in biological equivalence (BEQ) concentrations (see ISO 23196). The final decision to include

the measurement trueness in the interlaboratory method validation trial has to be taken by the lead

laboratory in consultation with other experts involved in the development of the method.

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ISO/TS 5594:2022(E)
5 Requirements, design and organization of method validation testing round(s)
5.1 General

A prerequisite for the performance of an interlaboratory trial is the method development has been

completed. As the aim of this kind of interlaboratory comparison is to evaluate the performance

characteristics of a biotest, technical aspects are defined within an interlaboratory method validation

trial procedure prepared by the lead laboratory and unique to each round of interlaboratory testing.

Specific features which are recommended to be addressed by lead laboratories are summarized in

Annexes F and G for terrestrial and water tests, respectively.

A lead laboratory should be able to demonstrate their level of competency for planning and conducting

the interlaboratory method validation trial. For example, the laboratory proposing to lead the validation

effort can state the years of experience of participating staff in conducting environmental toxicology

or microbiological testing (e.g., 10 + years); provide proof of recognised quality service through a

laboratory certification or accreditation program; provide proof that they have a track record in

planning and conducting multi-laboratory testing studies; demonstrate in writing that their staff have

a clear understanding of all steps the laboratory would be responsible for leading an inter-laboratory

validation program; clearly state their willingness to provide the materials to culture or holding and

acclimation organisms required to conduct the new biological testing standard prior to and during the

full validation testing round; or, state their willingness to provide remote or on-site training to assist

participating laboratories with preliminary steps needed to show their readiness to conduct the new

testing procedure. Specific suggestions and further details on steps and capability of a lead laboratory

and their staff are outlined in ISO 17043.
Within the interlaboratory method validation trial, the lead laboratory should:

— be responsible for the organization and performance of the three validation steps (5.3, 5.4, 5.5) or

interlaboratory testing rounds;

— prepare an interlaboratory method validation trial procedure for each round of testing, defining all

technical aspects of the performance of the biotest;

— supply the participants with the necessary instructions, test samples (e.g. contaminated soils,

amended soils, soils after remediation, waste materials, wastewaters, eluates, surface water,

groundwater, sediments and extracted samples) and materials selected by the lead laboratory, for

each testing round;

— be responsible for the analysis and reporting of results from each testing round;

— be responsible for requesting feedback from laboratory participants on the proposed interlaboratory

method validation trial procedure prior to each testing round, through an organized tele- or video

conference or e-mail exchange.

An example of different roles of personnel involved in organising of the interlaboratory method

validation trial can be found in ISO 5725-2:2019, Clause 6.

Unless requested otherwise by the lead laboratory, it is highly recommended to transfer all results

along with all test condition parameter measurements, immediately after completion of testing for

each specific testing round.
5.2 Prevalidation — Minimum requirements of test method performance

The primary step of method validation should rely on a thorough evaluation of the peer-reviewed

scientific literature and other relevant and credible reports and publications providing information

about the performance of the test method. This literature review should aim at identifying experimental

conditions which can have an impact on the outputs of a biotest. As a result, additional laboratory

experiments can be performed to refine and optimize the procedure accordingly. Special attention

should be paid to the ecological relevance of organisms and biological responses used in biological,

ecological and ecotoxicological testing with respect to the properties of the matrix to be considered, e.g.

© ISO 2022 – All rights reserved
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ISO/TS 5594:2022(E)

pH, organic matter, conductivity, clay content or turbidity. The interlaboratory method validation trial

design should cover the range of properties appropriate for the testing matrix (e.g. water, sediment,

soil) for which the biotest is relevant.

For the optimization of the biotest for ecotoxicity testing, controls have to be defined which differentiate

effects of intrinsic properties of the test samples from those caused by contaminants. For example, the

validation of a test with regards to its applicability in the risk assessment of contaminated sites, should

include a contaminated as well as a reference soil sample. The reference soil sample should have similar

intrinsic properties to the contaminated one, but contain no or negligible levels of the contaminants.

Test methods are often defined for two or more different type(s) of samples, for instance, contaminated

sites, amended soils, soils after remediation, waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge

from a wastewater treatment plant, composed material, or manure, especially those for possible land

disposal), wastewaters, eluates, surface water, groundwater, sediments, chemicals. Ideally, the test

method is validated using the most applicable contaminant or contaminated media type. However, full

validation of a method that incorporates a large variety of samples is typically not possible. It can be

unnecessary to perform such a wide validation if a limited number of samples is, to the lead laboratory

experts' opinion, considered representative of the most important fields of application. For example,

the validation of a test method for evaluating the quality of surface waters (e.g. river water samples

from a non-polluted upstream area and a downstream point affected by diffuse pollution or an effluent

discharge), or the efficiency of wastewater treatment plants (e.g. using liquid samples of pre-treatment

influent and/or final treated effluent) should consider the selection of samples appropriate for the

application purpose.

5.3 First validation step — Demonstration of participating laboratories’ readiness for

testing

The first step is to demonstrate the readiness of participating laboratories to culture test organisms

or cell cultures and to conduct the testing standard. It is recommended to evaluate readiness of the

participating laboratories using a questionnaire or survey completed by each participant (Annex E).

This questionnaire provides information to the validation trial coordinator of the lead laboratory

regarding the available technical know-how, experience and resources for the culturing of test

organisms and conductance of the test procedure.
5.4 Second validation step — Demonstration of laboratory capability and
transferability of the biotest

The second step of interlaboratory testing is used to perform a preliminary assessment of the

transferability and reliability of the test and to identify possible limitations of the test. Occasionally,

interlaboratory method validation trial rounds involving experienced laboratory participants do

not generate comparable data. In such a situation, the lead laboratory can further restrict method

options to bring a higher degree of standardization prior to the next round of inter-lab testing or can

conduct or sponsor additional method research to further standardize the culturing or testing parts

of the methodology. Results of the second validation step can be used in the design of the future

interlaboratory validation testing round.

At least one laboratory independent from the laboratory that developed the test method conducts the

full biotest for an initial assessment and review of its interlaboratory transferability and preliminary

reproducibility. Participating laboratories perform the biotest in control conditions and with a reference

compound with known toxicity at a specific test concentration or known concentration range provided

by the lead laboratory. Results are evaluated by the lead laboratory which can lead to optimization of

the organisms’ culturing and/or testing procedure. Only laboratories who pass the proposed validity

criteria (e.g. variability of controls expressed as the coefficient of variation, sensitivity, biological

response rate of the tested organisms in controls) should participate in the method validation testing

round (see 5.5). Involvement of inexperienced laboratories is outlined in 5.5.2. Integration of these

laboratories sometimes results in less precise conclusions leading to questions of test transferability.

In cases where the test method fails to provide sufficient reproducibility, depending on the degree of

failure, it can be considered for further optimization or can require further test method research. All

© ISO 2022 – All rights reserved
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ISO/TS 5594:2022(E)

requirements specified for the interlaboratory method validation trial in 5.5.5 are valid for the second

step.
5.5 Third validation step — Method validation
5.5.1 General

The third step involves a testing round (or rounds) to achieve method validation. The interlaboratory

method validation trial procedure is designed to evaluate the interlaboratory variability of the results

obtained. This is done by conducting the same measurements using the full test method in each

participating laboratory. Repeatability (intralaboratory variability) can be estimated if the testing

and data analyses are repeated by each laboratory. An alternative approach for the estimation of

repeatability using the confidence limits of the toxic metric that integrates the variability of repeated

measures of the biological variable in each treatment/dilution can be found in Annex B. If th

...

ISO/TC 190/SC 4
Date : : 2022-1011
ISO/DTSTS 5594:2022(F)
ISO/TC 190/SC 4
Secrétariat : : AFNOR
Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences relatives à la

conception d’un essai interlaboratoires pour la validation des essais biologiques

Soil and water quality — Guidance and requirements for designing an interlaboratory

trial for validation of biotests
ICS : 13.080.30 ; 13.060.70
Type du document : Norme internationale
Sous-type du document :
Stade du document : (60) Publication
Langue du document : F
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SPECIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 5594:2022(F)
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ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur l’internet ou sur un Intranet, sans

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Publié en Suisse
© ISO 2022 – Tous droits réservés 2
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ISO/TS 5594:2022(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................. iv

Introduction ..................................................................................................................................................................... v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................... 1

2 Références normatives .................................................................................................................................. 1

3 Termes et définitions ..................................................................................................................................... 1

4 Principe ............................................................................................................................................................... 3

5 Exigences, conception et organisation de la ou des campagnes d’essais de validation

de la méthode .................................................................................................................................................... 4

5.1 Généralités ......................................................................................................................................................... 4

5.2 Prévalidation — Exigences minimales relatives aux performances de la méthode

d’essai .................................................................................................................................................................. 5

5.3 Première étape de validation — Démonstration de l’état de préparation

des laboratoires participants en vue des essais ................................................................................... 5

5.4 Deuxième étape de validation — Démonstration de l’aptitude du laboratoire et de la

transférabilité de l’essai biologique ......................................................................................................... 6

5.5 Troisième étape de validation — Validation de la méthode ............................................................ 6

5.5.1 Généralités ......................................................................................................................................................... 6

5.5.2 Laboratoires participants ............................................................................................................................. 6

5.5.3 Échantillons ....................................................................................................................................................... 7

5.5.4 Plan d’expérimentation ................................................................................................................................. 8

5.5.5 Informations à fournir aux participants ................................................................................................. 8

5.5.6 Analyse de données et évaluation statistique des essais interlaboratoires .............................. 8

6 Évaluation ........................................................................................................................................................... 9

7 Documentation et rapport ......................................................................................................................... 10

Annexe A (informative) Détermination de l’exactitude (justesse et fidélité) lorsque les

résultats des essais d’écotoxicité sont exprimés en descripteurs de toxicité ........................ 11

Annexe B (informative) Estimation de l’écart-type de répétabilité ........................................................ 17

Annexe C (informative) Calcul et rapport d’incertitude de s ................................................................... 19

Annexe D (informative) Schéma de validation ............................................................................................... 22

Annexe E (informative) Questionnaire (exemple) ........................................................................................ 24

Annexe F (informative) Caractéristiques spécifiques des essais biologiques terrestres

recommandés par les laboratoires de référence .............................................................................. 26

Annexe G (informative) Caractéristiques spécifiques des essais biologiques aquatiques

recommandés par les laboratoires de référence .............................................................................. 30

Annexe H (informative) Résumé des essais interlaboratoires réalisés dans le cadre de la

validation d’essais biologiques terrestres ........................................................................................... 32

Annexe I (informative) Résumé des essais interlaboratoires réalisés dans le cadre de la

validation d’essais biologiques aquatiques ........................................................................................ 36

Bibliographie ................................................................................................................................................................ 41

© ISO 2022 – Tous droits réservés 3
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ISO/TS 5594:2022(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en

général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit

de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales

et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore

étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la

normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir

www.iso.org/directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de

ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les

références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l'élaboration

du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par

l'ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-proposle lien suivant : .

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190 Qualité du sol, sous-comité SC 4,

Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CENISO/TC 147, Qualité de l'eau,

sous--comité SC 5, Méthodes biologiques.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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ISO/TS 5594:2022(F)
Introduction

La validation d’une norme ISO relative à des essais biologiques a pour but d’estimer l’incertitude des

résultats au moyen d’un essai interlaboratoires. Ce programme de validation comporte généralement

trois étapes majeures.

a) Démonstration de l’état de préparation en vue des essais: cette première étape donne au laboratoire

de référence l’occasion de s’assurer que l’instrumentation recommandée est en place et que les

organismes d’essai et les cultures cellulaires ont été établis en utilisant des mesurages de

performance afin de garantir l’utilisation de cultures ou d’organismes sains lors des essais. Ces

conditions sont généralement spécifiées dans l’article ou le paragraphe intitulé «Organismes d’essai»

ou «Matériaux d’essai» dans une norme ISO.

b) Démonstration de l’aptitude du laboratoire et de la transférabilité de l’essai biologique: au cours

de cette deuxième étape, les laboratoires participants ont pour but d’atteindre les performances dans

les conditions contrôlées pendant cette campagne d’essais interlaboratoires préliminaires, en

ajoutant un composé de référence à une matrice solide ou à un milieu liquide, selon la méthode

d’essai biologique à valider. La capacité de mise en œuvre de la norme d’essai est démontrée lorsque

les critères de validité (par exemple la variabilité des témoins exprimée par le coefficient de variation

du nombre de jeunes dans le cadre d’un essai de reproduction) et qualifie le laboratoire pour

la dernière étape de validation de la méthode.

c) Validation de la méthode: la troisième étape n’implique que les laboratoires qui ont démontré leur

expertise à mettre en œuvre la norme ISO en cours d’élaboration (étape b). En cas de validation

d’une méthode d’essai écotoxicologique ou microbiologique, une ou deux campagnes d’essais

interlaboratoires de validation d’une méthode utilisant un ou plusieurs échantillons

environnementaux sont menées, et les résultats de chaque campagne servent à calculer la variabilité

intralaboratoire et interlaboratoires de la norme d’essai ISO afin de démontrer la fidélité de la

méthode (Annexe A). Si la répétition des campagnes d’essais biologiques est possible, la répétabilité

est déterminée. Pour la validation des méthodes écotoxicologiques, il peut s’avérer utile d’évaluer

l’exactitude de l’effet mesuré – la justesse de mesure. CeciCela prévaut en particulier pour les

méthodes dont les résultats sont rapportés sous forme de mesurage quantitatif tel qu’une

concentration biologique équivalente. Les résultats obtenus servent à confirmer ou ajuster les

critères de validité.

Pour l’étude de validation, il convient de choisir des échantillons représentatifs en fonction du domaine

d’application prévu de la norme (par exemple sols contaminés, sols amendés, sols après remédiation,

déchets, eaux usées, éluats, eaux de surface, eaux souterraines, sédiments et échantillons extraits).

L’Annexe D fournit un schéma global du processus de validation.
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ISO/TS 5594:2022(F)
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 5594:2022(F)
Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences
relatives à la conception d’un essai interlaboratoires pour
la validation des essais biologiques
1 Domaine d’application

Le présent document a pour but de faciliter la conception et l’organisation des essais de validation

d’essais biologiques. Il décrit les activités de validation au cours des différentes étapes du processus

de normalisation et comprend l’évaluation globale des données et la conclusion qui découle de l’étude

de validation.

Le présent document est destiné à la validation d’essais biologiques dont le plan d’expérimentation et

les critères d’effet peuvent différer. Il se peut que certaines exigences du présent document ne soient pas

applicables à toutes les méthodes d’essai.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes ::
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https://www.iso.org/obp ;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https://www.electropedia.org/.
3.1
témoin

matériau et/ou matrice qui reproduit tous les facteurs susceptibles d’avoir un impact sur les résultats,

à l’exception de la condition spécifique ou du traitement étudié

Note 1 à l’article: Dans les essais de toxicité, il convient que le témoin soit soumis à la totalité des conditions

rencontrées lors de l’exposition au traitement, mais sans le produit toxique.
[SOURCE: Environment Canada 2005]
3.2
critère d’effet
seuil de toxicité déterminé par voie statistique (CE50, par exemple)

[SOURCE: Environment Canada 2005, modifié — La recommandation de ne pas utiliser ce terme pour des

variables observées, telle que la taille, a été supprimée]
3.3
laboratoire de référence

laboratoire en charge de l’organisation de l’étude de validation interlaboratoires

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ISO/DTS TS 5594:2022(F)
3.4
justesse de mesure
justesse

étroitesse de l’accord entre la moyenne d’un nombre infini de valeurs mesurées répétées et une valeur

de référence

Note 1 à l’article: L’exigence d’un nombre infini de mesures répétées a un fondement théorique. Dans la pratique,

une grande série de résultats d’essai sert à estimer la justesse de mesure.

[SOURCE: Guide ISO/IEC 99:2007, 2.14, modifié — Les Notes à l’article ont été remplacées]

3.5
caractéristiques de performance

mesurages de la performance d’un essai dans des conditions particulières, y compris sa fiabilité et son

exactitude

Note 1 à l’article: Les caractéristiques de performance donnent une indication de l’utilité, des limites et de la

pertinence de l’essai.
[SOURCE: OCDE 2005]
3.6
fidélité

étroitesse de l’accord entre les indications ou les valeurs mesurées obtenues par des mesurages répétés

du même objet ou d’objets similaires dans des conditions spécifiées

Note 1 à l’article: La fidélité est en général exprimée numériquement par des caractéristiques, telles que l’écart--

type, la variance ou le coefficient de variation dans les conditions spécifiées.

Note 2 à l’article: Les conditions spécifiées peuvent être, par exemple, des conditions de répétabilité (3.10),

des conditions de fidélité intermédiaire ou des conditions de reproductibilité (3.12) (voir l’ISO 5725--1).

Note 3 à l’article: La fidélité sert à définir la répétabilité (3.9) de mesure, la fidélité intermédiaire de mesure

et la reproductibilité (3.11) de mesure.

Note 4 à l’article: Le terme «fidélité de mesure» est quelquefois utilisé improprement pour désigner l’exactitude de

mesure.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.7
prévalidation
phase(s) initiale(s) d’une étude de validation

Note 1 à l’article: Cette étude à petite échelle vise à obtenir des informations préliminaires sur la pertinence

et la fiabilité d’une méthode d’essai. Sur la base des résultats de cette étude, il est ensuite permis de modifier ou

d’optimiser le protocole de la méthode d’essai afin de réduire la variabilité intralaboratoire et/ou interlaboratoires

et d’augmenter l’exactitude des études de validation ultérieures. Si elles sont disponibles, les données de la

littérature peuvent être utilisées à cet effet.

[SOURCE: OCDE:2005, modifié — Les raisons de la réalisation d’une prévalidation ne sont pas précisées]

3.8
composé de référence
produit chimique pour lequel la réponse de l’organisme d’essai est connue
3.9
répétabilité
fidélité (3.6) de mesure selon un ensemble de conditions de répétabilité (3.10)
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ISO/TS 5594:2022(F)
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.10
condition de répétabilité

condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent la même procédure de mesure,

les mêmes opérateurs, le même système de mesure, les mêmes conditions de fonctionnement et le même

lieu, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets similaires pendant une courte

période de temps

Note 1 à l’article: Une condition de mesurage n’est une condition de répétabilité que par rapport à un ensemble

donné de conditions de répétabilité.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.11
reproductibilité

fidélité (3.6) de mesure selon un ensemble de conditions de reproductibilité (3.12)

Note 1 à l’article: Des termes statistiques pertinents sont donnés dans l’ISO 5725--1 et l’ISO 5725--2.

3.12
condition de reproductibilité

condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent des lieux, des opérateurs et des

systèmes de mesure différents, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets

similaires

Note 1 à l’article: Les différents systèmes de mesure peuvent utiliser des procédures de mesure différentes.

Note 2 à l’article: Il convient qu’une spécification relative aux conditions contienne, dans la mesure du possible,

les conditions que l’on fait varier et celles qui restent inchangées.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.13
essai de validation interlaboratoires d’une méthode

étude de validation interlaboratoires au cours de laquelle tous les laboratoires réalisent le même essai

biologique en utilisant le même matériau en essai et le même protocole d’essai

Note 1 à l’article: L’essai a pour objectif de déterminer la variabilité interlaboratoires et, dans la mesure du

possible, intralaboratoire.
3.14
transférabilité

capacité des laboratoires compétents et indépendants à mettre en œuvre une procédure d’essai

de manière précise et fiable
[SOURCE: OCDE:2005]
4 Principe

La validation d’une méthode d’essai proposée est obtenue par la démonstration de coefficients

de variation raisonnables dansintralaboratoire et entre les laboratoires interlaboratoires raisonnables

qui ont participé aux campagnes d’essais de validation formelle de la méthode (c’est-à-dire à la troisième

étape de validation, 5.5). Il convient, de préférence, de déterminer la répétabilité. Cependant, la durée ou

la charge de travail de la méthode d’essai empêche parfois la répétition de l’analyse par des laboratoires

individuels. En cas d’absence de données expérimentales obtenues dans des conditions de répétabilité, il

est proposé d’estimer la répétabilité à partir des limites de confiance du descripteur de toxicité qui

intègre la variabilité des mesurages répétés de la variable biologique dans chaque traitement/dilution

(voir référence [67]). Le cas échéant, la justesse de mesure de la méthode peut être déterminée en accord

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ISO/DTS TS 5594:2022(F)

avec la validation de la méthode, en particulier pour les méthodes dont les résultats sont rapportés en

concentrations biologiques équivalentes (CBE) (voir l’ISO 23196). La décision finale d’inclure la justesse

de mesure dans l’essai interlaboratoires de validation de la méthode doit être prise par le laboratoire de

référence, après consultation des autres experts impliqués dans l’élaboration de la méthode.

5 Exigences, conception et organisation de la ou des campagnes d’essais
de validation de la méthode
5.1 Généralités

Une condition préalable à la réalisation d’un essai interlaboratoires est que le développement de la

méthode soit achevé. Comme l’objectif de ce type de comparaison interlaboratoires est d’évaluer les

caractéristiques de performance d’un essai biologique, les aspects techniques sont définis dans une

procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode, préparée par le laboratoire de référence

et unique à chaque campagne d’essais interlaboratoires. Les caractéristiques spécifiques dont l’examen

est recommandé aux laboratoires de référence sont respectivement résumées dans les Annexes F et G

pour les essais terrestres et aquatiques, respectivement.

Il convient qu’un laboratoire de référence soit en mesure de démontrer son niveau de compétence

en matière de planification et de réalisation de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode.

Par exemple, le laboratoire qui propose de diriger le processus de validation peut indiquer les années

d’expérience du personnel participant à la réalisation des essais de toxicologie environnementale ou

de microbiologie (par exemple plus de 10 ans d’expérience) ;); apporter la preuve d’une qualité de service

reconnue par le biais d’un programme de certification ou d’accréditation; fournir la preuve qu’il dispose

d’un dossier de suivi de la planification et de la réalisation d’études d’essais multilaboratoires; démontrer

par écrit que son personnel comprend clairement toutes les étapes dont le laboratoire serait en charge

pour mener un programme de validation interlaboratoires; manifester clairement sa volonté de fournir

les matériaux nécessaires pour la culture ou le maintien et l’acclimatation des organismes requis pour la

mise en œuvre de la nouvelle norme d’essai biologique avant et pendant la campagne d’essais

de validation complète; ou indiquer sa volonté d’assurer une formation à distance ou sur site afin d’aider

les laboratoires participants aux étapes préliminaires nécessaires pour démontrer leur état de

préparation pour la mise en œuvre de la nouvelle procédure d’essai. Des suggestions spécifiques et des

détails supplémentaires concernant les étapes et l’aptitude d’un laboratoire de référence et de son

personnel sont décrits dans l’ISO 17043.

Dans le cadre de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode, il convient que le laboratoire

de référence:

— soit responsable de l’organisation et de l’exécution des trois étapes de validation (5.3, 5.4, 5.5) ou des

campagnes d’essais interlaboratoires;

— prépare une procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode pour chaque campagne

d’essais, en définissant tous les aspects techniques de l’exécution de l’essai biologique;

— fournisse aux participants les instructions nécessaires, les échantillons pour essai (par exemple sols

pollués, sols amendés, sols après remédiation, déchets, eaux usées, éluats, eaux de surface, eaux

souterraines, sédiments et échantillons extraits) et les matériaux sélectionnés par le laboratoire de

référence, pour chaque campagne d’essais;

— soit en charge de l’analyse et du compte-rendu des résultats de chaque campagne d’essais;

— soit chargé de demander aux laboratoires participants un retour d’information sur la procédure

d’essai de validation interlaboratoires de la méthode proposée, avant chaque campagne d’essais,

en organisant une télé- ou visio-conférence ou par un échange de courrier électronique.

Un exemple des différents rôles du personnel impliqué dans l’organisation de l’essai de validation

interlaboratoires de la méthode est donné dans l’ISO 5725--2:2019, Article 6
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ISO/TS 5594:2022(F)

Sauf spécification contraire du laboratoire de référence, il est fortement recommandé de transférer tous

les résultats ainsi que tous les mesurages des paramètres des conditions d’essai, juste après la fin

des essais pour chaque campagne spécifique.
5.2 Prévalidation — Exigences minimales relatives aux performances de la méthode
d’essai

Il convient que la première étape de validation de la méthode repose sur une évaluation minutieuse de la

littérature scientifique évaluée par les pairs et d’autres rapports et publications pertinents et crédibles

fournissant des informations sur les performances de la méthode d’essai. Il est recommandé d’axer cette

revue documentaire sur l’identification des conditions expérimentales susceptibles d’avoir un impact sur

les résultats d’un essai biologique. Des expériences complémentaires peuvent être réalisées en

laboratoire pour affiner et optimiser la procédure en conséquence. Il est recommandé de porter une

attention particulière à la pertinence écologique des organismes ainsi qu’aux réponses biologiques

utilisées dans les essais biologiques, écologiques et écotoxicologiques par rapport aux propriétés de la

matrice à étudier, par exemple le pH, la matière organique, la conductivité, la teneur en argile ou

la turbidité. Il convient que la conception de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode couvre

la plage de propriétés adaptée à la matrice d’essai (par exemple eau, sédiment, sol) pour laquelle l’essai

biologique est pertinent.

Pour optimiser l’essai biologique pour les essais d’écotoxicité, des témoins doivent être définis pour

différencier les effets des propriétés intrinsèques des échantillons pour essai de ceux causés par les

contaminants. Par exemple, il est recommandé que la validation d’un essai en ce qui concerne son

applicabilité dans l’évaluation des risques des sites pollués comprenne un échantillon de sol pollué ainsi

qu’un échantillon de sol de référence. Il convient que l’échantillon de sol de référence présente des

propriétés intrinsèques similaires à celles de l’échantillon contaminé, mais ne contienne aucun

contaminant ou un niveau de contaminants négligeable.

Des méthodes d’essai sont souvent définies pour au moins deux types d’échantillons différents,

par exemple des sites pollués, des sols amendés, des sols après remédiation, des déchets (par exemple

matériaux de dragage, boues municipales provenant d’une station d’épuration des eaux usées, matières

composées ou lisier, en particulier ceux destinés à un éventuel épandage), des eaux usées, des éluats,

des eaux de surface, des eaux souterraines, des sédiments ou des produits chimiques. Dans une situation

idéale, la méthode d’essai est validée en utilisant le type de contaminant le plus applicable ou le type

de milieu le plus contaminé. Cependant, la validation complète d’une méthode intégrant une grande

diversité d’échantillons n’est généralement pas possible. Il peut être inutile d’effectuer une validation

aussi étendue si un nombre limité d’échantillons est, d’après l’avis des experts du laboratoire de

référence, considéré comme représentatif des domaines d’application les plus importants. Par exemple,

il convient que la validation d’une méthode d’essai destinée à évaluer la qualité des eaux de surface

(par exemple des échantillons d’eau de rivière provenant d’une zone non polluée en amont et d’un point

en aval affecté par une pollution diffuse ou un rejet d’effluents), ou l’efficacité des stations d’épuration

des eaux usées (par exemple en utilisant des échantillons liquides d’effluents ayant été soumis à un

traitement préliminaire et/ou final) tienne compte de la sélection d’échantillons adaptés à l’objectif de

l’application.
5.3 Première étape de validation — Démonstration de l’état de préparation
des laboratoires participants en vue des essais

La première étape consiste à démontrer l’état de préparation des laboratoires participants pour la culture

des organismes d’essai ou des cultures cellulaires et la mise en œuvre de la norme d’essai. Il est

recommandé d’évaluer l’état de préparation des laboratoires participants à l’aide d’une enquête ou d’un

questionnaire complété par chaque participant (Annexe E). Ce questionnaire fournit au coordinateur des

essais de validation du laboratoire de référence, des informations concernant le savoir-faire technique,

l’expérience et les ressources disponibles pour la culture des organismes d’essai et la mise en œuvre

de la procédure d’essai.
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ISO/DTS TS 5594:2022(F)
5.4 Deuxième étape de validation — Démonstration de l’aptitude du laboratoire
et de la transférabilité de l’essai biologique

La deuxième étape de l’essai interlaboratoires consiste à réaliser une évaluation préliminaire de la

transférabilité et de la fiabilité de l’e
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 5594
Première édition
2022-11
Qualité de l’eau et du sol —
Recommandations et exigences
relatives à la conception d’un essai
interlaboratoires pour la validation
des essais biologiques
Soil and water quality — Guidance and requirements for designing an
interlaboratory trial for validation of biotests
Numéro de référence
ISO/TS 5594:2022(F)
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Sommaire Page

Avant-propos .............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ..................................................................................................................................................................................1

3 Termes et définitions ...................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe.......................................................................................................................................................................................................................... 3

5 Exigences, conception et organisation de la ou des campagnes d’essais de validation

de la méthode .......................................................................................................................................................................................................... 4

5.1 Généralités ................................................................................................................................................................................................. 4

5.2 Prévalidation — Exigences minimales relatives aux performances de la méthode

d’essai .............................................................................................................................................................................................................. 5

5.3 Première étape de validation — Démonstration de l’état de préparation

des laboratoires participants en vue des essais ....................................................................................................... 5

5.4 Deuxième étape de validation — Démonstration de l’aptitude du laboratoire et de

la transférabilité de l’essai biologique ............................................................................................................................... 5

5.5 Troisième étape de validation — Validation de la méthode ........................................................................... 6

5.5.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 6

5.5.2 Laboratoires participants .......................................................................................................................................... 6

5.5.3 Échantillons ............................................................................................................................................................................ 7

5.5.4 Plan d’expérimentation ................................................................................................................................................ 7

5.5.5 Informations à fournir aux participants ....................................................................................................... 8

5.5.6 Analyse de données et évaluation statistique des essais interlaboratoires .................. 8

6 Évaluation ................................................................................................................................................................................................................... 9

7 Documentation et rapport ......................................................................................................................................................................10

Annexe A (informative) Détermination de l’exactitude (justesse et fidélité) lorsque les

résultats des essais d’écotoxicité sont exprimés en descripteurs de toxicité .................................11

Annexe B (informative) Estimation de l’écart-type de répétabilité ................................................................................16

Annexe C (informative) Calcul et rapport d’incertitude de s ...............................................................................................18

Annexe D (informative) Schéma de validation ......................................................................................................................................20

Annexe E (informative) Questionnaire (exemple) .............................................................................................................................21

Annexe F (informative) Caractéristiques spécifiques des essais biologiques terrestres

recommandés par les laboratoires de référence ...........................................................................................................23

Annexe G (informative) Caractéristiques spécifiques des essais biologiques aquatiques

recommandés par les laboratoires de référence ...........................................................................................................27

Annexe H (informative) Résumé des essais interlaboratoires réalisés dans le cadre de la

validation d’essais biologiques terrestres ............................................................................................................................29

Annexe I (informative) Résumé des essais interlaboratoires réalisés dans le cadre de la

validation d’essais biologiques aquatiques ..........................................................................................................................33

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................39

iii
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Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a

été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir

www.iso.org/directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190 Qualité du sol, sous-comité SC 4,

Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-

comité SC 5, Méthodes biologiques.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

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ISO/TS 5594:2022(F)
Introduction

La validation d’une norme ISO relative à des essais biologiques a pour but d’estimer l’incertitude des

résultats au moyen d’un essai interlaboratoires. Ce programme de validation comporte généralement

trois étapes majeures.

a) Démonstration de l’état de préparation en vue des essais: cette première étape donne au

laboratoire de référence l’occasion de s’assurer que l’instrumentation recommandée est en place

et que les organismes d’essai et les cultures cellulaires ont été établis en utilisant des mesurages

de performance afin de garantir l’utilisation de cultures ou d’organismes sains lors des essais.

Ces conditions sont généralement spécifiées dans l’article ou le paragraphe intitulé «Organismes

d’essai» ou «Matériaux d’essai» dans une norme ISO.

b) Démonstration de l’aptitude du laboratoire et de la transférabilité de l’essai biologique: au cours

de cette deuxième étape, les laboratoires participants ont pour but d’atteindre les performances

dans les conditions contrôlées pendant cette campagne d’essais interlaboratoires préliminaires, en

ajoutant un composé de référence à une matrice solide ou à un milieu liquide, selon la méthode

d’essai biologique à valider. La capacité de mise en œuvre de la norme d’essai est démontrée lorsque

les critères de validité (par exemple la variabilité des témoins exprimée par le coefficient de

variation du nombre de jeunes dans le cadre d’un essai de reproduction) et qualifie le laboratoire

pour la dernière étape de validation de la méthode.

c) Validation de la méthode: la troisième étape n’implique que les laboratoires qui ont démontré

leur expertise à mettre en œuvre la norme ISO en cours d’élaboration (étape b). En cas de

validation d’une méthode d’essai écotoxicologique ou microbiologique, une ou deux campagnes

d’essais interlaboratoires de validation d’une méthode utilisant un ou plusieurs échantillons

environnementaux sont menées, et les résultats de chaque campagne servent à calculer la variabilité

intralaboratoire et interlaboratoires de la norme d’essai ISO afin de démontrer la fidélité de la

méthode (Annexe A). Si la répétition des campagnes d’essais biologiques est possible, la répétabilité

est déterminée. Pour la validation des méthodes écotoxicologiques, il peut s’avérer utile d’évaluer

l’exactitude de l’effet mesuré – la justesse de mesure. Cela prévaut en particulier pour les méthodes

dont les résultats sont rapportés sous forme de mesurage quantitatif tel qu’une concentration

biologique équivalente. Les résultats obtenus servent à confirmer ou ajuster les critères de validité.

Pour l’étude de validation, il convient de choisir des échantillons représentatifs en fonction du domaine

d’application prévu de la norme (par exemple sols contaminés, sols amendés, sols après remédiation,

déchets, eaux usées, éluats, eaux de surface, eaux souterraines, sédiments et échantillons extraits).

L’Annexe D fournit un schéma global du processus de validation.
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 5594:2022(F)
Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences
relatives à la conception d’un essai interlaboratoires pour
la validation des essais biologiques
1 Domaine d’application

Le présent document a pour but de faciliter la conception et l’organisation des essais de validation

d’essais biologiques. Il décrit les activités de validation au cours des différentes étapes du processus

de normalisation et comprend l’évaluation globale des données et la conclusion qui découle de l’étude

de validation.

Le présent document est destiné à la validation d’essais biologiques dont le plan d’expérimentation et

les critères d’effet peuvent différer. Il se peut que certaines exigences du présent document ne soient

pas applicables à toutes les méthodes d’essai.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
témoin

matériau et/ou matrice qui reproduit tous les facteurs susceptibles d’avoir un impact sur les résultats,

à l’exception de la condition spécifique ou du traitement étudié

Note 1 à l'article: Dans les essais de toxicité, il convient que le témoin soit soumis à la totalité des conditions

rencontrées lors de l’exposition au traitement, mais sans le produit toxique.
[SOURCE: Environment Canada 2005]
3.2
critère d’effet
seuil de toxicité déterminé par voie statistique (CE50, par exemple)

[SOURCE: Environment Canada 2005, modifié — La recommandation de ne pas utiliser ce terme pour

des variables observées, telle que la taille, a été supprimée]
3.3
laboratoire de référence

laboratoire en charge de l’organisation de l’étude de validation interlaboratoires

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ISO/TS 5594:2022(F)
3.4
justesse de mesure
justesse

étroitesse de l’accord entre la moyenne d’un nombre infini de valeurs mesurées répétées et une valeur

de référence

Note 1 à l'article: L’exigence d’un nombre infini de mesures répétées a un fondement théorique. Dans la pratique,

une grande série de résultats d’essai sert à estimer la justesse de mesure.

[SOURCE: Guide ISO/IEC 99:2007, 2.14, modifié — Les Notes à l’article ont été remplacées]

3.5
caractéristiques de performance

mesurages de la performance d’un essai dans des conditions particulières, y compris sa fiabilité et son

exactitude

Note 1 à l'article: Les caractéristiques de performance donnent une indication de l’utilité, des limites et de la

pertinence de l’essai.
[SOURCE: OCDE 2005]
3.6
fidélité

étroitesse de l’accord entre les indications ou les valeurs mesurées obtenues par des mesurages répétés

du même objet ou d’objets similaires dans des conditions spécifiées

Note 1 à l'article: La fidélité est en général exprimée numériquement par des caractéristiques, telles que l’écart-

type, la variance ou le coefficient de variation dans les conditions spécifiées.

Note 2 à l'article: Les conditions spécifiées peuvent être, par exemple, des conditions de répétabilité (3.10),

des conditions de fidélité intermédiaire ou des conditions de reproductibilité (3.12) (voir l’ISO 5725-1).

Note 3 à l'article: La fidélité sert à définir la répétabilité (3.9) de mesure, la fidélité intermédiaire de mesure

et la reproductibilité (3.11) de mesure.

Note 4 à l'article: Le terme «fidélité de mesure» est quelquefois utilisé improprement pour désigner l’exactitude

de mesure.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.7
prévalidation
phase(s) initiale(s) d’une étude de validation

Note 1 à l'article: Cette étude à petite échelle vise à obtenir des informations préliminaires sur la pertinence

et la fiabilité d’une méthode d’essai. Sur la base des résultats de cette étude, il est ensuite permis de modifier

ou d’optimiser le protocole de la méthode d’essai afin de réduire la variabilité intralaboratoire et/ou

interlaboratoires et d’augmenter l’exactitude des études de validation ultérieures. Si elles sont disponibles, les

données de la littérature peuvent être utilisées à cet effet.

[SOURCE: OCDE: 2005, modifié — Les raisons de la réalisation d’une prévalidation ne sont pas précisées]

3.8
composé de référence
produit chimique pour lequel la réponse de l’organisme d’essai est connue
3.9
répétabilité
fidélité (3.6) de mesure selon un ensemble de conditions de répétabilité (3.10)
[SOURCE: JCGM 200:2012]
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ISO/TS 5594:2022(F)
3.10
condition de répétabilité

condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent la même procédure de

mesure, les mêmes opérateurs, le même système de mesure, les mêmes conditions de fonctionnement

et le même lieu, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets similaires pendant une

courte période de temps

Note 1 à l'article: Une condition de mesurage n’est une condition de répétabilité que par rapport à un ensemble

donné de conditions de répétabilité.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.11
reproductibilité

fidélité (3.6) de mesure selon un ensemble de conditions de reproductibilité (3.12)

Note 1 à l'article: Des termes statistiques pertinents sont donnés dans l’ISO 5725-1 et l’ISO 5725-2.

3.12
condition de reproductibilité

condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent des lieux, des opérateurs et

des systèmes de mesure différents, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets

similaires

Note 1 à l'article: Les différents systèmes de mesure peuvent utiliser des procédures de mesure différentes.

Note 2 à l'article: Il convient qu’une spécification relative aux conditions contienne, dans la mesure du possible,

les conditions que l’on fait varier et celles qui restent inchangées.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.13
essai de validation interlaboratoires d’une méthode

étude de validation interlaboratoires au cours de laquelle tous les laboratoires réalisent le même essai

biologique en utilisant le même matériau en essai et le même protocole d’essai

Note 1 à l'article: L’essai a pour objectif de déterminer la variabilité interlaboratoires et, dans la mesure du

possible, intralaboratoire.
3.14
transférabilité

capacité des laboratoires compétents et indépendants à mettre en œuvre une procédure d’essai

de manière précise et fiable
[S OU RC E: O CDE: 2005 ]
4 Principe

La validation d’une méthode d’essai proposée est obtenue par la démonstration de coefficients

de variation intralaboratoire et interlaboratoires raisonnables qui ont participé aux campagnes d’essais

de validation formelle de la méthode (c’est-à-dire à la troisième étape de validation, 5.5). Il convient,

de préférence, de déterminer la répétabilité. Cependant, la durée ou la charge de travail de la méthode

d’essai empêche parfois la répétition de l’analyse par des laboratoires individuels. En cas d’absence

de données expérimentales obtenues dans des conditions de répétabilité, il est proposé d’estimer

la répétabilité à partir des limites de confiance du descripteur de toxicité qui intègre la variabilité

des mesurages répétés de la variable biologique dans chaque traitement/dilution (voir référence [67]).

Le cas échéant, la justesse de mesure de la méthode peut être déterminée en accord avec la validation

de la méthode, en particulier pour les méthodes dont les résultats sont rapportés en concentrations

biologiques équivalentes (CBE) (voir l’ISO 23196). La décision finale d’inclure la justesse de mesure

dans l’essai interlaboratoires de validation de la méthode doit être prise par le laboratoire de référence,

après consultation des autres experts impliqués dans l’élaboration de la méthode.

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ISO/TS 5594:2022(F)
5 Exigences, conception et organisation de la ou des campagnes d’essais
de validation de la méthode
5.1 Généralités

Une condition préalable à la réalisation d’un essai interlaboratoires est que le développement de la

méthode soit achevé. Comme l’objectif de ce type de comparaison interlaboratoires est d’évaluer les

caractéristiques de performance d’un essai biologique, les aspects techniques sont définis dans une

procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode, préparée par le laboratoire de référence

et unique à chaque campagne d’essais interlaboratoires. Les caractéristiques spécifiques dont l’examen

est recommandé aux laboratoires de référence sont respectivement résumées dans les Annexes F et G

pour les essais terrestres et aquatiques, respectivement.

Il convient qu’un laboratoire de référence soit en mesure de démontrer son niveau de compétence

en matière de planification et de réalisation de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode.

Par exemple, le laboratoire qui propose de diriger le processus de validation peut indiquer les années

d’expérience du personnel participant à la réalisation des essais de toxicologie environnementale

ou de microbiologie (par exemple plus de 10 ans d’expérience); apporter la preuve d’une qualité de

service reconnue par le biais d’un programme de certification ou d’accréditation; fournir la preuve qu’il

dispose d’un dossier de suivi de la planification et de la réalisation d’études d’essais multilaboratoires;

démontrer par écrit que son personnel comprend clairement toutes les étapes dont le laboratoire serait

en charge pour mener un programme de validation interlaboratoires; manifester clairement sa volonté

de fournir les matériaux nécessaires pour la culture ou le maintien et l’acclimatation des organismes

requis pour la mise en œuvre de la nouvelle norme d’essai biologique avant et pendant la campagne

d’essais de validation complète; ou indiquer sa volonté d’assurer une formation à distance ou sur site

afin d’aider les laboratoires participants aux étapes préliminaires nécessaires pour démontrer leur état

de préparation pour la mise en œuvre de la nouvelle procédure d’essai. Des suggestions spécifiques et

des détails supplémentaires concernant les étapes et l’aptitude d’un laboratoire de référence et de son

personnel sont décrits dans l’ISO 17043.

Dans le cadre de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode, il convient que le laboratoire

de référence:

— soit responsable de l’organisation et de l’exécution des trois étapes de validation (5.3, 5.4, 5.5) ou

des campagnes d’essais interlaboratoires;

— prépare une procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode pour chaque campagne

d’essais, en définissant tous les aspects techniques de l’exécution de l’essai biologique;

— fournisse aux participants les instructions nécessaires, les échantillons pour essai (par exemple

sols pollués, sols amendés, sols après remédiation, déchets, eaux usées, éluats, eaux de surface, eaux

souterraines, sédiments et échantillons extraits) et les matériaux sélectionnés par le laboratoire de

référence, pour chaque campagne d’essais;

— soit en charge de l’analyse et du compte-rendu des résultats de chaque campagne d’essais;

— soit chargé de demander aux laboratoires participants un retour d’information sur la procédure

d’essai de validation interlaboratoires de la méthode proposée, avant chaque campagne d’essais,

en organisant une télé- ou visio-conférence ou par un échange de courrier électronique.

Un exemple des différents rôles du personnel impliqué dans l’organisation de l’essai de validation

interlaboratoires de la méthode est donné dans l’ISO 5725-2:2019, Article 6.

Sauf spécification contraire du laboratoire de référence, il est fortement recommandé de transférer

tous les résultats ainsi que tous les mesurages des paramètres des conditions d’essai, juste après la fin

des essais pour chaque campagne spécifique.
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ISO/TS 5594:2022(F)
5.2 Prévalidation — Exigences minimales relatives aux performances de la méthode
d’essai

Il convient que la première étape de validation de la méthode repose sur une évaluation minutieuse de la

littérature scientifique évaluée par les pairs et d’autres rapports et publications pertinents et crédibles

fournissant des informations sur les performances de la méthode d’essai. Il est recommandé d’axer

cette revue documentaire sur l’identification des conditions expérimentales susceptibles d’avoir un

impact sur les résultats d’un essai biologique. Des expériences complémentaires peuvent être réalisées

en laboratoire pour affiner et optimiser la procédure en conséquence. Il est recommandé de porter

une attention particulière à la pertinence écologique des organismes ainsi qu’aux réponses biologiques

utilisées dans les essais biologiques, écologiques et écotoxicologiques par rapport aux propriétés de

la matrice à étudier, par exemple le pH, la matière organique, la conductivité, la teneur en argile ou

la turbidité. Il convient que la conception de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode couvre

la plage de propriétés adaptée à la matrice d’essai (par exemple eau, sédiment, sol) pour laquelle l’essai

biologique est pertinent.

Pour optimiser l’essai biologique pour les essais d’écotoxicité, des témoins doivent être définis pour

différencier les effets des propriétés intrinsèques des échantillons pour essai de ceux causés par les

contaminants. Par exemple, il est recommandé que la validation d’un essai en ce qui concerne son

applicabilité dans l’évaluation des risques des sites pollués comprenne un échantillon de sol pollué

ainsi qu’un échantillon de sol de référence. Il convient que l’échantillon de sol de référence présente

des propriétés intrinsèques similaires à celles de l’échantillon contaminé, mais ne contienne aucun

contaminant ou un niveau de contaminants négligeable.

Des méthodes d’essai sont souvent définies pour au moins deux types d’échantillons différents,

par exemple des sites pollués, des sols amendés, des sols après remédiation, des déchets (par exemple

matériaux de dragage, boues municipales provenant d’une station d’épuration des eaux usées, matières

composées ou lisier, en particulier ceux destinés à un éventuel épandage), des eaux usées, des éluats,

des eaux de surface, des eaux souterraines, des sédiments ou des produits chimiques. Dans une situation

idéale, la méthode d’essai est validée en utilisant le type de contaminant le plus applicable ou le type

de milieu le plus contaminé. Cependant, la validation complète d’une méthode intégrant une grande

diversité d’échantillons n’est généralement pas possible. Il peut être inutile d’effectuer une validation

aussi étendue si un nombre limité d’échantillons est, d’après l’avis des experts du laboratoire de

référence, considéré comme représentatif des domaines d’application les plus importants. Par exemple,

il convient que la validation d’une méthode d’essai destinée à évaluer la qualité des eaux de surface

(par exemple des échantillons d’eau de rivière provenant d’une zone non polluée en amont et d’un point

en aval affecté par une pollution diffuse ou un rejet d’effluents), ou l’efficacité des stations d’épuration

des eaux usées (par exemple en utilisant des échantillons liquides d’effluents ayant été soumis à un

traitement préliminaire et/ou final) tienne compte de la sélection d’échantillons adaptés à l’objectif de

l’application.
5.3 Première étape de validation — Démonstration de l’état de préparation
des laboratoires participants en vue des essais

La première étape consiste à démontrer l’état de préparation des laboratoires participants pour la

culture des organismes d’essai ou des cultures cellulaires et la mise en œuvre de la norme d’essai. Il est

recommandé d’évaluer l’état de préparation des laboratoires participants à l’aide d’une enquête ou d’un

questionnaire complété par chaque participant (Annexe E). Ce questionnaire fournit au coordinateur

des essais de validation du laboratoire de référence, des in
...

ISO/TC 190/SC 4
Date: 2022-0509-09
ISO/DTS 5594:2022
ISO/TC 190/SC 4
Secretariat: AFNOR
Soil and water quality — Guidance and requirements for designing an
interlaboratory trial for validation of biotests
German title
French title
ICS:
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ISO/DTS 5594:2022(E)
s© ISO 2022

All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation,

no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form or by any

means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an

intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the

address below or ISO’s member body in the country of the requester.
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Published in Switzerland
© ISO 2022 – All rights reserved
ii © ISO 2022 – All rights reserved
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ISO/DTS 5594:2022(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................ iv

Introduction .................................................................................................................................................... v

5.5.1 General .............................................................................................................................................. 6

5.5.2 Participating laboratories .......................................................................................................... 7

5.5.3 Samples.............................................................................................................................................. 7

5.5.4 Experimental design ..................................................................................................................... 8

5.5.5 Supporting information for participants .............................................................................. 8

5.5.6 Data analysis and statistical evaluation of interlaboratory testing ............................ 9

Annex A (informative) Determination of accuracy (trueness and precision) in case the

results of ecotoxicity tests are expressed as toxicity metrics ...................................... 11

Annex B (informative) Estimation of the repeatability of standard deviation ................... 18

Annex C (informative) Calculation and reporting of uncertainty of s ..................................20

Annex D (informative) Validation schema ....................................................................................... 23

Annex E (informative) Questionnaire (example) .......................................................................... 25

Annex F (informative) Specific features of terrestrial biotests which are recommended

to be addressed by lead laboratories ................................................................................... 27

Annex G (informative) Specific features of water biotests which are recommended to be

addressed by lead laboratories .............................................................................................. 31

Annex H (informative) Summary of interlaboratory trials performed within the

validation of terrestrial biotests ............................................................................................ 33

Annex I (informative) Summary of interlaboratory trials performed within the

validation of water biotests ..................................................................................................... 39

Bibliography ................................................................................................................................................ 45

© ISO 2022 – All rights reserved iii
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ISO/DTS 5594:2022(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national

standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally

carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a

technical committee has been established has the right to be represented on that committee.

International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part

in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all

matters of electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for

the different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with

the editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject

of patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details

of any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction

and/or on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see

www.iso.org/iso/foreword.html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,

Biological characterization, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,

Subcommittee SC 5, Biological methods.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body.

A complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
© ISO 2022 – All rights reserved
iv © ISO 2022 – All rights reserved
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ISO/DTS 5594:2022(E)
Introduction

Validation of an ISO biotest standard aims to estimate the uncertainty of results by means of an

interlaboratory trial. This validation program typically involves three major steps:.

a) Demonstration of readiness for testing: This 1st step is an opportunity for the lead laboratory to

ensure that recommended instrumentation is in place and that test organism and cell cultures

have been established using performance measures to ensure healthy organisms or cultures are

used in testing. These conditions are typically part of an ISO standard sectionthe

clause/subclause entitled "Test organisms" or "Test material;" in an ISO standard.

b) Demonstration of laboratory capability and transferability of the biotest: In this 2nd step, the

participating laboratories would aim to achieve successful control performance during this

preliminary interlaboratory testing round with a reference compound added either to a solid

matrix or to a liquid medium according to the biotest method to be validated. The ability to

conduct the testing standard is demonstrated by fulfilling the validity criteria (e.g. variability of

controls expressed as the coefficient of variation for the number of juveniles in a reproduction

test) and qualifies the laboratory for the final method validation step;.

c) Method Validationvalidation: The 3rd step involves only laboratories who have demonstrated

the expertise in conducting the ISO standard under development (step 2b). In case of validation

of an ecotoxicological or microbiological testing method, one or two rounds of interlaboratory

method validation trial using a contaminated environmental sample (or samples) are conducted

and the results from each round would beare used to calculate the within- and between-

laboratory variability of the ISO testing standard as a demonstration of method precision

(Annex A). If repeated testing runs of the biotest are feasible, repeatability is determined. For the

validation of ecotoxicological methods it can be useful to evaluate the correctness of the

measured effect – the measurement trueness (3.4).. This holds true especially for methods of

which the results are reported in terms of a quantitative measurement such as a biological

equivalence concentration. Obtained results are used for confirming or adjusting the validity

criteria.

For the validation study, representative samples should be selected according to the intended scope

of the standard (e.g. contaminated soils, amended soils, soils after remediation, waste materials,

wastewaters, eluates, surface water, groundwater, sediments and extracted samples).

An overall schema of the validation process can be found in Annex D.
© ISO 2022 – All rights reserved v
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ISO/DTS 5594:2022(E)
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/DTS 5594:2022(E)
Soil and water quality — Guidance and requirements for
designing an interlaboratory trial for validation of biotests
1 Scope

This document aims to assist in designing and organizing trials for validation of biotests. The

validation activities during the different steps of the standardization process are described. This

document comprises the overall data evaluation and subsequent validation study conclusion.

This document is intended for the validation of biotests which can differ in their experimental design

and endpoints. It is possible that some of the requirements of this guidance document are not

applicable to all test methods.
2 Normative references

ISO 5725-1:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 1:

General principles and definitions

ISO 5725-2:2019, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 2:

Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement

method
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminologicalterminology databases for use in standardization at the following

addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia: available at https://www.electropedia.org/
3.1
control

material and/or matrix that duplicates all factors that can affect results except the specific condition

or treatment being studied

Note 1 to entry: In toxicity tests, the control should have all the same conditions as in the treatment exposure

but without the toxicant.
[SOURCE: Environment Canada 2005]
© ISO 2022 – All rights reserved
© ISO 2022 – All rights reserved 1
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ISO/DTS 5594:2022(E)
3.2
endpoint

endpoint is generally defined as the statistically derived toxicity threshold (e.g. EC50)

[SOURCE: Environment Canada 2005, modified — The recommendation not to use the term for

observed variables, such as size, is deleted]
3.3
lead laboratory

laboratory selected byresponsible for organization of the member country proposing the new ISO

standardinterlaboratory validation study
3.4
measurement trueness
trueness of measurement
trueness

closeness of agreement between the average of an infinite number of replicate measured quantity

values and a reference quantity value

Note 1 to entry: The requirement for an infinite number of replicate measurements has a theoretical

background. In practice a large series of test results is used to estimate the measurement trueness.

[SOURCE: ISO/IEC Guide 99:2007 2.14, modified — Notes to entry have been replaced]

3.5
performance characteristics

operational characteristics of a test are the measures of itsthe performance of a test under specific

conditions, including its reliability and accuracy, and

Note 1 to entry: Performance characteristics are an indication of the test’s usefulness, limitations, and

relevance.
[SOURCE: OECD 2005]
3.6
precision

closeness of agreement between indications or measured quantity values obtained by replicate

measurements on the same or similar objects under specified conditions

Note 1 to entry: Measurement precision is usually expressed numerically by measures of imprecision, such as

standard deviation, variance, or coefficient of variation under the specified conditions of measurement.

Note 2 to entry: The ‘specified conditions’ can be, for example, repeatability conditions (3.10) of measurement,

intermediate precision conditions of measurement, or reproducibility conditions (3.12) of measurement

(see ISO 5725-1:1994).

Note 3 to entry: Measurement precision is used to define measurement repeatability, (3.9), intermediate

measurement precision, and measurement reproducibility. (3.11).

Note 4 to entry: Sometimes “measurement precision” is erroneously used to mean measurement accuracy.

[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.7
prevalidation
initial phase(s) of a validation study
2 © ISO 2022 – All rights reserved
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ISO/DTS 5594:2022(E)

Note 1 to entry: A small-scale study intended to obtain preliminary information on the relevance and reliability

of a test method. Based on the outcome of those studies, the test method protocol may be modified or optimized

to reduce intra- and/or interlaboratory variability and increase accuracy in subsequent validation studies. If

available, literature data may be used for this purpose.

[SOURCE: OECD:2005, modified — Reasons for perfomingperforming prevalidation are not included]

3.8
reference compound
chemical for which the response of the test organism is known
3.9
repeatability

measurement precision (3.6) under a set of repeatability conditions (3.10) of measurement

[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.10
repeatability conditionscondition

condition of measurement, out of a set of conditions that includes the same measurement procedure,

same operators, same measuring system, same operating conditions and same location, and replicate

measurements on the same or similar objects over a short period of time

Note 1 to entry: A condition of measurement is a repeatability condition only with respect to a specified set of

repeatability conditions.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.11
reproducibility

measurement precision (3.6) under reproducibility conditions (3.12) of measurement

Note 1 to entry: Relevant statistical terms are given in ISO 5725-1:1994 and ISO 5725-2:2019.

3.12
reproducibility conditionscondition

condition of measurement, out of a set of conditions that includes different locations, operators,

measuring systems, and replicate measurements on the same or similar objects

Note 1 to entry: The different measuring systems may use different measurement procedures.

Note 2 to entry: A specification should give the conditions changed and unchanged, to the extent practical.

[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.13
interlaboratory method validation trial

interlaboratory validation study in which all laboratories perform the same biotest using the same

material under testing and the same test protocol

Note 1 to entry: The purpose of the test is to determine inter laboratory and, whenever possible, intra

laboratory variability.
© ISO 2022 – All rights reserved
© ISO 2022 – All rights reserved 3
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ISO/DTS 5594:2022(E)
3.14
transferability

ability of a test procedure to be accurately and reliably performed in independent, competent

laboratories
[SOURCE: OECD:2005
4 Principle

Validation of a proposed test method is achieved through the demonstration of reasonable

coefficients of variation within- and between- laboratories, which have participated in the formal

method validation testing round(s) (i.e. the 3rd validation step, 5.5). Repeatability should

preferentially be determined. However, on occasion, the duration or workload of the test method

prevents the analysis by individual laboratories from being repeated. In case of missing experimental

data obtained under repeatability conditions, it is proposed to estimate repeatability from the

confidence limits of the toxic metric that integrates the variability of repeated measures of the

biological variable in each treatment/dilution (see reference [65Reference [67]). If appropriate, the

measurement trueness (3.4) of the method can be determined in line with the method validation, in

particular for methods the results of which are reported in biological equivalence (BEQ)

concentrations (see ISO 23196). The final decision to include the measurement trueness (3.4) in the

interlaboratory method validation trial (3.13) has to be taken by the lead laboratory in consultation

with other experts from the ISO working groups involved in the development of the standard. method.

5 Requirements, design and organization of method validation testing
round(s)
5.1 General

A prerequisite for the performance of an interlaboratory trial is the method development has been

completed. As the aim of this kind of interlaboratory comparison is to evaluate the performance

characteristics of a biotest, technical aspects are defined within an interlaboratory method validation

trial procedure prepared by the lead laboratory and unique to each round of interlaboratory testing.

Specific features which are recommended to be addressed by lead laboratories are summarized in

Annexes F and G for terrestrial and water tests, respectively.

A lead laboratory should be able to demonstrate their level of competency for planning and

conducting the interlaboratory method validation trial for the validation of the proposed ISO

standard.. For example, the laboratory proposing to lead the validation effort can state the years of

experience of participating staff in conducting environmental toxicology or microbiological testing

(e.g., 10 + years); provide proof of recognised quality service through a laboratory certification or

accreditation program; provide proof that they have a track record in planning and conducting multi-

laboratory testing studies; demonstrate in writing that their staff have a clear understanding of all

steps the laboratory would be responsible for leading an inter-laboratory validation program; clearly

state their willingness to provide the materials to culture or holding and acclimation organisms

required to conduct the new biological testing standard prior to and during the full validation testing

round; or, state their willingness to provide remote or on-site training to assist participating

laboratories with preliminary steps needed to show their readiness to conduct the new testing

procedure. Specific suggestions and further details on steps and capability of a lead laboratory and

their staff are outlined in ISO 17043.
Within the interlaboratory method validation trial, the lead laboratory should:

— be responsible for the organization and performance of the three validation steps (5.3, 5.4, 5.5)

or interlaboratory testing rounds;
4 © ISO 2022 – All rights reserved
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ISO/DTS 5594:2022(E)

— prepare an interlaboratory method validation trial procedure for each round of testing, defining

all technical aspects of the performance of the biotest;

— supply the participants with the necessary instructions, test samples (e.g. contaminated soils,

amended soils, soils after remediation, waste materials, wastewaters, eluates, surface water,

groundwater, sediments and extracted samples) and materials selected by the lead laboratory,

for each testing round;

— be responsible for the analysis and reporting of results from each testing round; and

— be responsible for requesting feedback from laboratory participants on the proposed

interlaboratory method validation trial procedure prior to each testing round, through an

organized tele- or video conference or e-mail exchange.

An example of different roles of personnel involved in organising of the interlaboratory method

validation trial can be found in ISO 5725-2:2019, Clause 6.

Unless requested otherwise by the lead laboratory, it is highly recommended to transfer all results

along with all test condition parameter measurements, immediately after completion of testing for

each specific testing round.
5.2 Prevalidation -— Minimum requirements of test method performance

The primary step of method validation should rely on a thorough evaluation of the peer-reviewed

scientific literature and other relevant and credible reports and publications providing information

about the performance of the test method. This literature review should aim at identifying

experimental conditions which can have an impact on the outputs of a biotest. As a result, additional

laboratory experiments can be performed to refine and optimize the procedure accordingly. Special

attention should be paid to the ecological relevance of organisms and biological responses used in

biological, ecological and ecotoxicological testing with respect to the properties of the matrix to be

considered, e.g. pH, organic matter, conductivity, clay content or turbidity. The standard, and

subsequently theThe interlaboratory method validation trial design, should cover the range of

properties appropriate for the testing matrix (e.g. water, sediment, soil, etc.)) for which the biotest is

relevant.

For the optimization of the biotest for ecotoxicity testing, controls have to be defined which will

differentiate effects of intrinsic properties of the test samples from those caused by contaminants.

For example, the validation of a test with regards to its applicability in the risk assessment of

contaminated sites, should include a contaminated as well as a reference soil sample. The reference

soil sample should have similar intrinsic properties to the contaminated one, but contain no or

negligible levels of the contaminants.

Test methods are often defined for two or more different type(s) of samples, for instance,

contaminated sites, amended soils, soils after remediation, waste materials (e.g. dredged material,

municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed material, or manure, especially those

for possible land disposal), wastewaters, eluates, surface water, groundwater, sediments, chemicals.

Ideally, the test method is validated using the most applicable contaminant or contaminated media

type. However, full validation of a method that incorporates a large variety of samples is typically not

possible. It can be unnecessary to perform such a wide validation if a limited number of samples is,

to the lead laboratory experts' opinion, considered representative of the most important fields of

application. For example, the validation of a test method for evaluating the quality of surface waters

(of e.g.,. river water samples from a non-polluted upstream area and a downstream point affected by

diffuse pollution or an effluent discharge), or the efficiency of wastewater treatment plants (e.g.,.

© ISO 2022 – All rights reserved
© ISO 2022 – All rights reserved 5
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ISO/DTS 5594:2022(E)

using liquid samples of pre-treatment influent and/or final treated effluent) should consider the

selection of samples appropriate for the application purpose.

5.3 First validation step: — Demonstration of participating laboratories’ readiness

for testing

The first step is to demonstrate the readiness of participating laboratories to culture test organisms

or cell cultures and to conduct the testing standard. It is recommended to evaluate readiness of the

participating laboratories using a questionnaire or survey completed by each participant (Annex E).

This questionnaire will provideprovides information to the validation trial coordinator of the lead

laboratory regarding the available technical know-how, experience and resources for the culturing of

test organisms and conductance of the test procedure.
5.4 Second validation step: — Demonstration of laboratory capability and
transferability of the biotest

The second step of interlaboratory testing is used to perform a preliminary assessment of the

transferability and reliability of the test and to identify possible limitations of the test. Occasionally,

interlaboratory method validation trial rounds involving experienced laboratory participants doesdo

not generate comparable data. In such a situation, the lead laboratory can further restrict method

options to bring a higher degree of standardization prior to the next round of inter-lab testing or can

conduct or sponsor additional method research to further standardize the culturing or testing parts

of the methodology. Results of the second validation step can be used in the design of the future

interlaboratory validation testing round.

At least one laboratory independent from the laboratory that developed the test method will

conductconducts the full biotest for an initial assessment and review of its interlaboratory

transferability and preliminary reproducibility. Participating laboratories will perform the biotest in

control conditions and with a reference compound with known toxicity at a specific test

concentration or known concentration range provided by the lead laboratory. Results will beare

evaluated by the lead laboratory which can lead to optimization of the organisms’ culturing and/or

testing procedure. Only laboratories who pass the proposed validity criteria (e.g. variability of

controls expressed as the coefficient of variation, sensitivity, biological response rate of the tested

organisms in controls) should participate in the method validation testing round (see 5.5).

Involvement of inexperienced laboratories is outlined in 5.5.2. Integration of these laboratories

sometimes results in less precise conclusions leading to questions of test transferability. In cases

where the test method fails to provide sufficient reproducibility, depending on the degree of failure,

it can be considered for further optimization or can require further test method research. All

requirements specified for the interlaboratory method validation trial in 5.5.5 are valid for the second

step.
5.5 Third Validation Step:validation dtep — Method validation
5.5.1 General

The third step involves a testing round (or rounds) to achieve method validation. The interlaboratory

method validation trial procedure is designed to evaluate the interlaboratory variability of the results

obtained by applying the draft standard.. This is done by conducting the same measurements using

the full test method in each participating laboratory. Repeatability (intralaboratory variability) can

be estimated if the testing and data analyses are repeated by each laboratory. An alternative approach

for the estimation of repeatability would be using the confidence limits of the toxic metric that

integrates the variability of repeated measures of the biological variable in each treatment/dilution

can be found in Annex B. If the output of a standard is not a numerical value (e.g. standard for

extraction of DNA), a specific approach is needed to evaluate reproducibility (see 5.5.6).

6 © ISO 2022 – All rights reserved
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ISO/DTS 5594:2022(E)
5.5.2 Participating laboratories

The number of participants has an influence on the reliability of the statistically calculated

performance data. It is suggested obtainingto obtain valid datasets from a minimum of 6 laboratories

located in 3 different countries. Therefore, it is strongly recommended that a greater number of test

laboratories and countries be invited and participate in interlaboratory method validation trials. The

Annex C provides guidance on how to proceed if a lower number of valid datasets is achieved by

calculating and reporting the uncertainty of the reproducibility variance.

Participation in this kind of trials is voluntary, and each participant laboratory should be given a code

(that can be communicated to the respective laboratory) to maintain anonymous the source of the

validation trial datasets. If the call for participants yields an insufficient number of laboratories that

are experienced with the method, assistance in applying this method should be provided by the lead

laboratory (e.g. offer to train personnel at inexperienced laboratories, host a training workshop,

propose a planning teleconference, etc.).).

An invitation to interested inter-laboratoryinterlaboratory participants shall be circulated well in

advance of the interlaboratory method validation trial launch. It is recommended that the lead

laboratory organizing the interlaboratory program circulate the invitation to potential participating

laboratories five months prior to the start of the first round of interlaboratory testing. Laboratories

should be asked to express their interest in participating within four weeks of receiving the

announcement of the interlaboratory trial.

If a full validation of a method is already present, the ISO working group responsible for the

development of the standard may decide to adopt the method may be adopted without a further

“interlaboratory method validation trial”..
5.5.3 Samples
Sample matrices shall reflect the scope of the draft stand
...

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 5594
First edition
Soil and water quality — Guidance
and requirements for designing an
interlaboratory trial for validation of
biotests
Member bodies are requested to consult relevant national interests in ISO/TC
147/SC 5 before casting their ballot to the e-Balloting application.
PROOF/ÉPREUVE
Reference number
ISO/TS 5594:2022(E)
© ISO/TS 2022
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on

the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below

or ISO’s member body in the country of the requester.
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CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
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ISO/TS 5594:2022(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ..................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions .................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 3

5 Requirements, design and organization of method validation testing round(s)............................4

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

5.2 Prevalidation — Minimum requirements of test method performance ............................................. 4

5.3 First validation step — Demonstration of participating laboratories’ readiness for

testing ............................................................................................................................................................................................................. 5

5.4 Second validation step — Demonstration of laboratory capability and

transferability of the biotest ...................................................................................................................................................... 5

5.5 Third validation dtep — Method validation ................................................................................................................ 6

5.5.1 General ........................................................................................................................................................................................ 6

5.5.2 Participating laboratories .......................................................................................................................................... 6

5.5.3 Samples ....................................................................................................................................................................................... 6

5.5.4 Experimental design ....................................................................................................................................................... 7

5.5.5 Supporting information for participants ...................................................................................................... 7

5.5.6 Data analysis and statistical evaluation of interlaboratory testing ..................................... 8

6 Assessment ........................................................................................................................................... ......................................................................8

7 Documentation and reporting .............................................................................................................................................................. 9

Annex A (informative) Determination of accuracy (trueness and precision) in case the

results of ecotoxicity tests are expressed as toxicity metrics .........................................................................10

Annex B (informative) Estimation of the repeatability of standard deviation ...................................................15

Annex C (informative) Calculation and reporting of uncertainty of s .......................................................................17

Annex D (informative) Validation schema ..................................................................................................................................................19

Annex E (informative) Questionnaire (example) ................................................................................................................................20

Annex F (informative) Specific features of terrestrial biotests which are recommended to

be addressed by lead laboratories .................................................................................................................................................22

Annex G (informative) Specific features of water biotests which are recommended to be

addressed by lead laboratories .........................................................................................................................................................25

Annex H (informative) Summary of interlaboratory trials performed within the validation

of terrestrial biotests ...................................................................................................................................................................................27

Annex I (informative) Summary of interlaboratory trials performed within the validation

of water biotests ................................................................................................................................................................................................32

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................39

iii
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ISO/TS 5594:2022(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to

the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see

www.iso.org/iso/foreword.html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,

Biological characterization, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,

Subcommittee SC 5, Biological methods.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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ISO/TS 5594:2022(E)
Introduction

Validation of an ISO biotest standard aims to estimate the uncertainty of results by means of an

interlaboratory trial. This validation program typically involves three major steps.

a) Demonstration of readiness for testing: This 1st step is an opportunity for the lead laboratory to

ensure that recommended instrumentation is in place and that test organism and cell cultures have

been established using performance measures to ensure healthy organisms or cultures are used in

testing. These conditions are typically part of the clause/subclause entitled "Test organisms" or

"Test material" in an ISO standard.

b) Demonstration of laboratory capability and transferability of the biotest: In this 2nd step, the

participating laboratories aim to achieve successful control performance during this preliminary

interlaboratory testing round with a reference compound added either to a solid matrix or to a

liquid medium according to the biotest method to be validated. The ability to conduct the testing

standard is demonstrated by fulfilling the validity criteria (e.g. variability of controls expressed

as the coefficient of variation for the number of juveniles in a reproduction test) and qualifies the

laboratory for the final method validation step.

c) Method validation: The 3rd step involves only laboratories who have demonstrated the

expertise in conducting the ISO standard under development (step b). In case of validation of an

ecotoxicological or microbiological testing method, one or two rounds of interlaboratory method

validation trial using a contaminated environmental sample (or samples) are conducted and the

results from each round are used to calculate the within- and between-laboratory variability of

the ISO testing standard as a demonstration of method precision (Annex A). If repeated testing

runs of the biotest are feasible, repeatability is determined. For the validation of ecotoxicological

methods it can be useful to evaluate the correctness of the measured effect – the measurement

trueness. This holds true especially for methods of which the results are reported in terms of a

quantitative measurement such as a biological equivalence concentration. Obtained results are

used for confirming or adjusting the validity criteria.

For the validation study, representative samples should be selected according to the intended scope

of the standard (e.g. contaminated soils, amended soils, soils after remediation, waste materials,

wastewaters, eluates, surface water, groundwater, sediments and extracted samples).

An overall schema of the validation process can be found in Annex D.
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 5594:2022(E)
Soil and water quality — Guidance and requirements for
designing an interlaboratory trial for validation of biotests
1 Scope

This document aims to assist in designing and organizing trials for validation of biotests. The validation

activities during the different steps of the standardization process are described. This document

comprises the overall data evaluation and subsequent validation study conclusion.

This document is intended for the validation of biotests which can differ in their experimental design

and endpoints. It is possible that some of the requirements of this document are not applicable to all

test methods.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
control

material and/or matrix that duplicates all factors that can affect results except the specific condition or

treatment being studied

Note 1 to entry: In toxicity tests, the control should have all the same conditions as in the treatment exposure but

without the toxicant.
[SOURCE: Environment Canada 2005]
3.2
endpoint
statistically derived toxicity threshold (e.g. EC50)

[SOURCE: Environment Canada 2005, modified — The recommendation not to use the term for observed

variables, such as size, is deleted]
3.3
lead laboratory
laboratory responsible for organization of the interlaboratory validation study
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ISO/TS 5594:2022(E)
3.4
measurement trueness
trueness of measurement
trueness

closeness of agreement between the average of an infinite number of replicate measured quantity

values and a reference quantity value

Note 1 to entry: The requirement for an infinite number of replicate measurements has a theoretical background.

In practice a large series of test results is used to estimate the measurement trueness.

[SOURCE: ISO/IEC Guide 99:2007 2.14, modified — Notes to entry have been replaced]

3.5
performance characteristics

measures of the performance of a test under specific conditions, including its reliability and accuracy

Note 1 to entry: Performance characteristics are an indication of the test’s usefulness, limitations, and relevance.

[SOURCE: OECD 2005]
3.6
precision

closeness of agreement between indications or measured quantity values obtained by replicate

measurements on the same or similar objects under specified conditions

Note 1 to entry: Measurement precision is usually expressed numerically by measures of imprecision, such as

standard deviation, variance, or coefficient of variation under the specified conditions of measurement.

Note 2 to entry: The ‘specified conditions’ can be, for example, repeatability conditions (3.10) of measurement,

intermediate precision conditions of measurement, or reproducibility conditions (3.12) of measurement

(see ISO 5725-1).

Note 3 to entry: Measurement precision is used to define measurement repeatability (3.9), intermediate

measurement precision, and measurement reproducibility (3.11).

Note 4 to entry: Sometimes “measurement precision” is erroneously used to mean measurement accuracy.

[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.7
prevalidation
initial phase(s) of a validation study

Note 1 to entry: A small-scale study intended to obtain preliminary information on the relevance and reliability

of a test method. Based on the outcome of those studies, the test method protocol may be modified or optimized

to reduce intra- and/or interlaboratory variability and increase accuracy in subsequent validation studies. If

available, literature data may be used for this purpose.

[SOURCE: OECD: 2005, modified — Reasons for performing prevalidation are not included]

3.8
reference compound
chemical for which the response of the test organism is known
3.9
repeatability

measurement precision (3.6) under a set of repeatability conditions (3.10) of measurement

[SOURCE: JCGM 200:2012]
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ISO/TS 5594:2022(E)
3.10
repeatability condition

condition of measurement, out of a set of conditions that includes the same measurement procedure,

same operators, same measuring system, same operating conditions and same location, and replicate

measurements on the same or similar objects over a short period of time

Note 1 to entry: A condition of measurement is a repeatability condition only with respect to a specified set of

repeatability conditions.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.11
reproducibility

measurement precision (3.6) under reproducibility conditions (3.12) of measurement

Note 1 to entry: Relevant statistical terms are given in ISO 5725-1 and ISO 5725-2.

3.12
reproducibility condition

condition of measurement, out of a set of conditions that includes different locations, operators,

measuring systems, and replicate measurements on the same or similar objects

Note 1 to entry: The different measuring systems may use different measurement procedures.

Note 2 to entry: A specification should give the conditions changed and unchanged, to the extent practical.

[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.13
interlaboratory method validation trial

interlaboratory validation study in which all laboratories perform the same biotest using the same

material under testing and the same test protocol

Note 1 to entry: The purpose of the test is to determine inter laboratory and, whenever possible, intra laboratory

variability.
3.14
transferability

ability of a test procedure to be accurately and reliably performed in independent, competent

laboratories
[S OU RC E: OECD: 2005 ]
4 Principle

Validation of a proposed test method is achieved through the demonstration of reasonable coefficients

of variation within- and between- laboratories, which have participated in the formal method validation

testing round(s) (i.e. the 3rd validation step, 5.5). Repeatability should preferentially be determined.

However, on occasion, the duration or workload of the test method prevents the analysis by individual

laboratories from being repeated. In case of missing experimental data obtained under repeatability

conditions, it is proposed to estimate repeatability from the confidence limits of the toxic metric that

integrates the variability of repeated measures of the biological variable in each treatment/dilution

(see Reference [67]). If appropriate, the measurement trueness of the method can be determined in line

with the method validation, in particular for methods the results of which are reported in biological

equivalence (BEQ) concentrations (see ISO 23196). The final decision to include the measurement

trueness in the interlaboratory method validation trial has to be taken by the lead laboratory in

consultation with other experts involved in the development of the method.
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ISO/TS 5594:2022(E)
5 Requirements, design and organization of method validation testing round(s)
5.1 General

A prerequisite for the performance of an interlaboratory trial is the method development has been

completed. As the aim of this kind of interlaboratory comparison is to evaluate the performance

characteristics of a biotest, technical aspects are defined within an interlaboratory method validation

trial procedure prepared by the lead laboratory and unique to each round of interlaboratory testing.

Specific features which are recommended to be addressed by lead laboratories are summarized in

Annexes F and G for terrestrial and water tests, respectively.

A lead laboratory should be able to demonstrate their level of competency for planning and conducting

the interlaboratory method validation trial. For example, the laboratory proposing to lead the validation

effort can state the years of experience of participating staff in conducting environmental toxicology

or microbiological testing (e.g., 10 + years); provide proof of recognised quality service through a

laboratory certification or accreditation program; provide proof that they have a track record in

planning and conducting multi-laboratory testing studies; demonstrate in writing that their staff have

a clear understanding of all steps the laboratory would be responsible for leading an inter-laboratory

validation program; clearly state their willingness to provide the materials to culture or holding and

acclimation organisms required to conduct the new biological testing standard prior to and during the

full validation testing round; or, state their willingness to provide remote or on-site training to assist

participating laboratories with preliminary steps needed to show their readiness to conduct the new

testing procedure. Specific suggestions and further details on steps and capability of a lead laboratory

and their staff are outlined in ISO 17043.
Within the interlaboratory method validation trial, the lead laboratory should:

— be responsible for the organization and performance of the three validation steps (5.3, 5.4, 5.5) or

interlaboratory testing rounds;

— prepare an interlaboratory method validation trial procedure for each round of testing, defining all

technical aspects of the performance of the biotest;

— supply the participants with the necessary instructions, test samples (e.g. contaminated soils,

amended soils, soils after remediation, waste materials, wastewaters, eluates, surface water,

groundwater, sediments and extracted samples) and materials selected by the lead laboratory, for

each testing round;

— be responsible for the analysis and reporting of results from each testing round;

— be responsible for requesting feedback from laboratory participants on the proposed interlaboratory

method validation trial procedure prior to each testing round, through an organized tele- or video

conference or e-mail exchange.

An example of different roles of personnel involved in organising of the interlaboratory method

validation trial can be found in ISO 5725-2:2019, Clause 6.

Unless requested otherwise by the lead laboratory, it is highly recommended to transfer all results

along with all test condition parameter measurements, immediately after completion of testing for

each specific testing round.
5.2 Prevalidation — Minimum requirements of test method performance

The primary step of method validation should rely on a thorough evaluation of the peer-reviewed

scientific literature and other relevant and credible reports and publications providing information

about the performance of the test method. This literature review should aim at identifying experimental

conditions which can have an impact on the outputs of a biotest. As a result, additional laboratory

experiments can be performed to refine and optimize the procedure accordingly. Special attention

should be paid to the ecological relevance of organisms and biological responses used in biological,

ecological and ecotoxicological testing with respect to the properties of the matrix to be considered, e.g.

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ISO/TS 5594:2022(E)

pH, organic matter, conductivity, clay content or turbidity. The interlaboratory method validation trial

design should cover the range of properties appropriate for the testing matrix (e.g. water, sediment,

soil) for which the biotest is relevant.

For the optimization of the biotest for ecotoxicity testing, controls have to be defined which differentiate

effects of intrinsic properties of the test samples from those caused by contaminants. For example, the

validation of a test with regards to its applicability in the risk assessment of contaminated sites, should

include a contaminated as well as a reference soil sample. The reference soil sample should have similar

intrinsic properties to the contaminated one, but contain no or negligible levels of the contaminants.

Test methods are often defined for two or more different type(s) of samples, for instance, contaminated

sites, amended soils, soils after remediation, waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge

from a wastewater treatment plant, composed material, or manure, especially those for possible land

disposal), wastewaters, eluates, surface water, groundwater, sediments, chemicals. Ideally, the test

method is validated using the most applicable contaminant or contaminated media type. However, full

validation of a method that incorporates a large variety of samples is typically not possible. It can be

unnecessary to perform such a wide validation if a limited number of samples is, to the lead laboratory

experts' opinion, considered representative of the most important fields of application. For example,

the validation of a test method for evaluating the quality of surface waters (e.g. river water samples

from a non-polluted upstream area and a downstream point affected by diffuse pollution or an effluent

discharge), or the efficiency of wastewater treatment plants (e.g. using liquid samples of pre-treatment

influent and/or final treated effluent) should consider the selection of samples appropriate for the

application purpose.

5.3 First validation step — Demonstration of participating laboratories’ readiness for

testing

The first step is to demonstrate the readiness of participating laboratories to culture test organisms

or cell cultures and to conduct the testing standard. It is recommended to evaluate readiness of the

participating laboratories using a questionnaire or survey completed by each participant (Annex E).

This questionnaire provides information to the validation trial coordinator of the lead laboratory

regarding the available technical know-how, experience and resources for the culturing of test

organisms and conductance of the test procedure.
5.4 Second validation step — Demonstration of laboratory capability and
transferability of the biotest

The second step of interlaboratory testing is used to perform a preliminary assessment of the

transferability and reliability of the test and to identify possible limitations of the test. Occasionally,

interlaboratory method validation trial rounds involving experienced laboratory participants do

not generate comparable data. In such a situation, the lead laboratory can further restrict method

options to bring a higher degree of standardization prior to the next round of inter-lab testing or can

conduct or sponsor additional method research to further standardize the culturing or testing parts

of the methodology. Results of the second validation step can be used in the design of the future

interlaboratory validation testing round.

At least one laboratory independent from the laboratory that developed the test method conducts the

full biotest for an initial assessment and review of its interlaboratory transferability and preliminary

reproducibility. Participating laboratories perform the biotest in control conditions and with a reference

compound with known toxicity at a specific test concentration or known concentration range provided

by the lead laboratory. Results are evaluated by the lead laboratory which can lead to optimization of

the organisms’ culturing and/or testing procedure. Only laboratories who pass the proposed validity

criteria (e.g. variability of controls expressed as the coefficient of variation, sensitivity, biological

response rate of the tested organisms in controls) should participate in the method validation testing

round (see 5.5). Involvement of inexperienced laboratories is outlined in 5.5.2. Integration of these

laboratories sometimes results in less precise conclusions leading to questions of test transferability.

In cases where the test method fails to provide sufficient reproducibility, depending on the degree of

failure, it can be considered for further optimization or can require further test method research. All

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requirements specified for the interlaboratory method validation trial in 5.5.5 are valid for the second

step.
5.5 Third validation dtep — Method validation
5.5.1 General

The third step involves a testing round (or rounds) to achieve method validation. The interlaboratory

method validation trial procedure is designed to evaluate the interlaboratory variability of the results

obtained. This is done by conducting the same measurements using the full test method in each

participating laboratory. Repeatability (intralaboratory variability) can be estimated if the testing

and data analyses are repeated by each laboratory. An alternative approach for the estimation of

repeatability using the confidence limits of the toxic metric that integrates the variabili

...

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