ISO 11269-2:2012
(Main)Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 2: Effects of contaminated soil on the emergence and early growth of higher plants
Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 2: Effects of contaminated soil on the emergence and early growth of higher plants
This part of ISO 11269 describes a method to assess the quality of an unknown soil and the soil habitat function by determining the emergence and early growth response of at least two terrestrial plant species compared to reference or standard control soils. It is applicable to soils of unknown quality, e.g. from contaminated sites, amended soils or soils after remediation.
Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 2: Effets des sols contaminés sur l'émergence et la croissance des végétaux supérieurs
La présente partie de l'ISO 11269 décrit une méthode d'évaluation de la qualité d'un sol inconnu et de la fonction d'habitat d'un sol en déterminant l'émergence et la réponse sur les premiers stades de croissance d'au moins deux espèces de végétaux terrestres par rapport à des sols de référence ou à des sols témoins standards. Elle est applicable à des sols de qualité inconnue, par exemple des sols provenant de sites contaminés, des sols amendés ou des sols après réhabilitation.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11269-2
Third edition
2012-01-15
Soil quality — Determination of the
effects of pollutants on soil flora —
Part 2:
Effects of contaminated soil on the
emergence and early growth of higher
plants
Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du
sol —
Partie 2: Effets des sols contaminés sur l’émergence et la croissance
des végétaux supérieurs
Reference number
©
ISO 2012
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ii © ISO 2012 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Units . 3
5 Principle . 3
6 Test plants . 3
7 Materials . 4
7.1 Test vessels . 4
7.2 Soil . 4
8 Equipment . 6
9 Reference substance . 6
10 Procedure . 6
10.1 Experimental design . 6
10.2 Preparation of the pots . 7
10.3 Preparation of the seeds . 7
10.4 Growth conditions . 8
10.5 Start of the test . 8
10.6 Handling during the test . 8
11 Validity criteria . 9
12 Assessment of the results . 9
12.1 Data presentation . 9
12.2 Expression of the results . 9
13 Statistical analysis . 9
13.1 General . 9
13.2 Range-finding test .10
13.3 Final test .10
14 Test report . 11
Annex A (informative) Additional recommended plant species based on test results gained by applying
[4]
Environment Canada Test Method: EPS 1/RM/45 .13
Annex B (informative) Phytotoxic values for reference compounds: sodium trichloro-acetate
and boric acid .15
Annex C (informative) Recommended method for the measuring of the water-holding capacity
of the soil .16
Annex D (informative) Recommendations for nutrient supply of soils .17
Bibliography .18
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11269-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological methods.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 11269-2:2005), which has been technically revised.
ISO 11269 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Determination of the effects of
pollutants on soil flora:
— Part 1: Method for the measurement of inhibition of root growth
— Part 2: Effects of contaminated soil on the emergence and early growth of higher plants
iv © ISO 2012 – All rights reserved
Introduction
This part of ISO 11269 describes a procedure for evaluating the quality of soils of different origin carrying
unknown contaminations. The evaluation of the effects on plant growth is based on emergence and inhibitory
effects on early growth of at least two species of higher plants. Guidance for assessing potential effects of
[14]
substances on seedling emergence and growth is given in OECD Guideline 208 .
This part of ISO 11269 refers closely to ISO 22030 and is based on:
a) results from the German research project “Entwicklung eines innovativen und technischen Instrumentariums
zur Optimierung der ökotoxikologischen Bewertung von Böden im Hinblick auf Sanierungsziele und
Schutzerfordernisse”;
b) discussions within the joint project “Ecotoxicological Test Batteries” forming part of the BMBF Joint
[23]
Research Group “Processes for the Bioremediation of Soil” ;
c) results from the BMBF Joint Research Group ERNTE “Erprobung und Vorbereitung einer praktischen
[17]
Nutzung ökotoxikologischer Testsysteme” ;
d) ring-test results of “Ecotoxicological Characterisation of Waste — Results and Experiences from an
[8]
International Ring Test” .
Plant growth can be influenced strongly by soil properties such as texture, pH or levels of nutrients. When
testing natural soils either reference soils (uncontaminated soils with the same properties as the test soil) or
standard soils are used as mixing and control substrate. In the latter case, variations in plant growth can result
from either soil contaminants or differences in soil properties like nutrients and texture. Therefore, results from
soil testing can less easily be interpreted than results from testing of chemicals .
INTERNATIONAL STANDARD ISO 11269-2:2012(E)
Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil
flora —
Part 2:
Effects of contaminated soil on the emergence and early growth
of higher plants
WARNING — Contaminated soils may contain unknown mixtures of toxic, mutagenic, or otherwise
harmful chemicals or infectious micro-organisms. Occupational health risks may arise from dust
or evaporated chemicals during handling and incubation. Furthermore, test plants might take up
chemicals from the soil and safety measures should also be considered when handling the test plants.
1 Scope
This part of ISO 11269 describes a method to assess the quality of an unknown soil and the soil habitat function
by determining the emergence and early growth response of at least two terrestrial plant species compared
to reference or standard control soils. It is applicable to soils of unknown quality, e.g. from contaminated sites,
amended soils or soils after remediation.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document
(including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under
aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level using
barium chloride solution
ISO 11268-1, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms — Part 1: Determination of acute toxicity to
Eisenia fetida/Eisenia andrei
ISO 11268-2, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms — Part 2: Determination of effects on
reproduction to Eisenia fetida/Eisenia andrei
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric method
ISO 22030, Soil quality — Biological methods — Chronic toxicity in higher plants
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
emergence
appearance of the coleoptile or cotyledon above the soil
3.2
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
[28]
[ISO 15176:2002 ]
3.3
hormesis
improvement of seedling emergence, growth or survival (or other response of the test plants) at low concentrations
[1][2]
of chemicals or mixtures of soil that are toxic when applied at higher levels in comparison to the control
3.4
lowest observed effect rate or effect concentration
LOEC
lowest tested percentage of a test soil in a reference or a standard control soil or concentration of a substance
at which a statistically significant effect is observed
NOTE The LOEC is expressed as a percentage of the test-soil dry mass per soil-mixture dry mass. All test mixtures
above the LOEC have a harmful effect equal to or greater than that observed at the LOEC. If this condition cannot be
satisfied, an explanation should be given for how the LOEC and NOEC (3.5) have been selected.
3.5
no observed effect concentration
NOEC
test-soil percentage immediately below the LOEC, which when compared to the control has no statistically
significant effect (r < 0,05)
3.6
x % effect concentration
EC
x
x % effect rate
ER
x
percentage of a test soil at which a given endpoint is inhibited by x % compared to the control
3.7
soil mixture ratio
ratio between the test soil and the reference/control soil in a soil mixture, expressed in percent based on
soil dry mass
NOTE Different ratios may be applied in a dilution series to establish a dose-response relationship.
3.8
reference soil
uncontaminated site-specific soil (e.g. collected in the vicinity of a contaminated site) with similar properties
(nutrient concentrations, pH, organic carbon content and texture) as the test soil
2 © ISO 2012 – All rights reserved
3.9
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (e.g. pH, texture, organic matter content) are within
a known range
[11] [14] 1)
EXAMPLE Euro-soils , artificial soil , LUFA soil.
NOTE The properties of standard soils can differ from the test soil.
3.10
control soil
reference or standard soil used as a control and as a medium for preparing dilution series with test soils or a
reference substance
NOTE Both EC and NOEC are expressed in milligrams of test substance per kilogram (dry mass) of the test
substrate. Soil mixtures are given in per cent based on soil dry mass.
4 Units
Emergence is expressed as the percentage of seedlings which emerge as compared with the control pots. The
biomass of the shoots is expressed as dry mass per plant or, if needed, as dry mass per pot.
5 Principle
The test measures emergence and early growth of at least two terrestrial plant species (one monocotyledonous
and one dicotyledonous). The test compares the development of plants in a test soil and/or a series of mixtures
with a control soil. Seeds of the selected plant species are planted in pots containing the soil/soil mixtures
and in control pots containing a reference or standard soil. Pots are kept under growth conditions for the test
species selected. After 50 % of the seedlings in the control have emerged, emergence rates are determined and
plants are thinned out to a specified number. After a period of two weeks to three weeks, the remaining plants
are harvested to determine their biomass. The relative growth inhibition in undiluted test soil is determined to
assess the function of the test soil as a habitat for plants. In addition, NOEC, LOEC or EC and ER values can
x x
be calculated from the dose response curve gained from mixtures of the test soil with control soil.
NOTE An early plant growth test may include additional testing endpoints, e.g. shoot length, root length and root dry
mass. In many instances, root endpoints are more sensitive than shoot dry mass. In almost all cases, emergence is a less
sensitive endpoint.
6 Test plants
One monocotyledonous and one dicotyledonous species are tested in parallel. Oat (Avena sativa) is
recommended as the monocotyledonous and turnip rape (Brassica rapa) and/or wild turnip (Brassica rapa ssp.
rapa) as the dicotyledonous plant species. Oat, turnip rape and wild turnip grow in sandy as well as in loamy
soil with varying water content and a range of pH values from 5,0 to 7,5.
Other species might be selected, e.g. plants with specific physiological characteristics like C-4 plants (corn,
sugar cane, millet), plants in symbiosis with nitrogen-fixing bacteria (e.g. Fabaceae) or plants with ecological or
economical significance in certain regions of the world, provided that these species grow unhindered in control
soil and fulfil the validity criteria of the test (Clause 11). Only plants that tolerate the properties of the test soils
and test conditions (beside their chemical contamination) should be selected. For example, a species sensitive
to low pH values should not be used for testing forest soils with low pH values. Species that do not tolerate wet
soils should not be used in combination with wick watering. Reasons for selecting species other than oat and
wild turnip or turnip rape shall be justified in the test report.
NOTE Additional recommended species including validity criteria and reference toxicant test data for different
endpoints are compiled in Annexes A and B.
1) Euro-soils, artificial soil and LUFA soil are examples of suitable products available commercially. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
7 Materials
7.1 Test vessels
The test vessels shall be non-porous plastics or glazed pots with a top internal diameter of between 85 mm and
95 mm, taking into account the size. It is recommended to use an automatic watering system, e.g. pots equipped
with glass-fibre wicks, to avoid the time-consuming daily manual adjustment of soil moisture as proposed in
ISO 22030. In this case, one or two glass-fibre wicks (∅ 1 mm) shall be introduced through the bottom of the
vessels. The wicks reach a water reservoir and ensure the water supply during the test. Therefore, at least one
hole shall be prepared to fix the wick. Commercial plant pots often have more than one hole, what might result
in flow back of water. In addition, roots might grow through open holes and circumvent the soil contaminants.
A filter disk can prevent growth of roots through additional holes. Wicks are not used, when the test soil does
not take up water by wicks as shown by a pretest (see 10.2).
7.2 Soil
7.2.1 General
Assessing the toxic potential of field soil from a contaminated site or that of remediated soil, the selected soils
should have pH values after sieving within a range that is not toxic to the test plants, e.g. between 5,0 and 7,5
for Brassica rapa and Avena sativa.
The soil pH should not be corrected. For the time being, pH limits for plant species other than turnip rape and
oat cannot be stated. It is a matter of future research to systematically test more plants on a variety of soils.
Furthermore, tolerance limits for texture, salinity or other soil properties cannot be given for different plant
species so far.
When comparing soils of known and unknown quality, the control soil and field soil under test should be of the
same textural class, and be as similar as practicable in all respects other than the presence of the chemical or
contaminant being investigated. Indeed, significant differences in soil characteristics other than the presence
of contaminants may lead to differences in plant growth and may induce false positive test results.
7.2.2 Test soil
The sample(s) of test soil might be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern,
or waste materials (e.g., dredged material, municipal sludge from a sewage sludge treatment plant, composed
material, or manure) under consideration for possible land disposal.
The soils used in the test shall be passed through a sieve of 4 mm square mesh to remove coarse fragments
and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air dried without heating before sieving. Storage of test soils
should be as short as possible. The soil shall be stored in accordance with ISO 10381-6 using containers that
minimize losses of soil contaminants by volatilization and sorption to the container walls. Soil pH should not be
corrected as it may influence bioavailability of soil contaminants.
For interpretation of test results, the following characteristics should be determined for each soil sampled from
a field site:
a) soil texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277,
b) pH (KCl) value in accordance with ISO 10390,
c) water content in accordance with ISO 11465,
d) water-holding capacity (Annex C),
e) cationic exchange capacity in accordance with ISO 11260,
f) organic matter content in accordance with ISO 10694,
g) total and water soluble amounts of potassium, nitrogen and phosphorous.
4 © ISO 2012 – All rights reserved
NOTE It is important to measure the water-holding capacity of all mixtures used in the test.
7.2.3 Control soil
Either reference or standard soils can be used as the control soil, if unhindered growth of the test plants in these
soils can be expected. In any case, differences in nutrient levels between a test soil and a control soil can affect
the dose-response pattern. For example, a control soil much richer in nutrients than a test soil might result in a
false positive result (i.e. the test soil appears to have a “toxic” effect on the growth of the test plants). If a control
soil is poorer in nutrients than a test soil, hormesis (3.3) can be expected at low soil mixture ratios or even an
inverse dose response relationship if nutrient supply becomes the main effect. It is therefore recommended to
add nutrients to test and control/reference soils in order to avoid false positive or negative test results (10.6.3).
7.2.3.1 Reference soils
If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should be treated
and characterized like the test soils. If a toxic contamination or unusual soil properties cannot be ruled out,
standard control soils should be preferred.
7.2.3.2 Standard soils
Standard soils should be uncontaminated, nutrient-poor natural or artificial soil. If a natural soil is used, its
organic matter content should not exceed 5 %. Fine particles (<20 µm according to ISO 11277) should not
exceed 20 %. Alternatively, artificial soil according to ISO11268-1 and ISO 11268-2 may be used, regardless
of its higher organic matter content. However, the organic matter content of the test and control soil should be
as close to each other as possible.
The substrate called “artificial soil” has the following composition:
Percentage expressed
on dry-mass basis
— Sphagnum peat finely ground and with no visible plant remains 10 %
— Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
— Industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 50 % 69 %
of particle size 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverized, analytical grade) is necessary to get a
pH of 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Taking the properties of non-polar (log P > 2) or ionizing substances into account, 5 % of peat have proven
OW
to be sufficient for maintaining the desired structure of the artificial soil. In this case, the respective percentages of the
constituents are modified as follows: peat, 5 %; clay, 20 %; sand 75 %).
NOTE 2 pH (KCl) is measured in a mixed sample in a 1 M solution of potassium chloride (KCl) or a 0,01 M solution of
calcium chloride (CaCl ).
The artificial soil is prepared, at least three days prior to starting the test, by mixing the dry constituents listed
above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required to obtain half of the
final water content of 40 % to 60 % of the maximum water-holding capacity is added while mixing is continued.
The mixed artificial soil shall be stored at room temperature for at least two days to equilibrate acidity. The
amount of calcium carbonate required might vary, depending on properties of the individual batch of sphagnum
peat and should be determined by measuring the pH of subsamples immediately before the test. The total
water-holding capacity is determined according to Annex C, the pH is determined according to ISO 10390.
Allowance should be made for any water that is to be used for introducing the test substance into the soil.
To obtain a dilution series, the test soil is mixed with the control soil thoroughly (either manually or by using a
hand mixer). The homogeneity of the mixture is checked visually.
8 Equipment
Standard laboratory equipment including the following materials is required.
8.1 Controlled environmental chamber, phytotron, plant growth room or greenhouse suitable to maintain
the specified conditions.
8.2 Balance (±0,1 mg).
8.3 Balance for heavier loads (e.g. 10 kg) for preparation of soil mixtures.
8.4 Sieve, stainless steel, with mesh size 4 mm.
8.5 Glass-fibre wicks (∅ 1 mm).
9 Reference substance
It is recommended that a reference substance be tested to demonstrate the uniformity of the laboratory test
conditions and the response of the particular batch of seeds. Sodium trichloroacetate or boric acid is suggested
as the reference substance. A reference test should be carried out regularly and if any major changes in operating
procedures are introduced, for example, change of phytotron/growth room/greenhouse, change of soil or change
of watering regime, etc. Examples of phytotoxic values for two reference compounds are given in Annex B.
10 Procedure
10.1 Experimental design
A sample of field-collected test soil may be tested at a single concentration (typically 100 %) or evaluated for
toxicity in a multi-concentration test whereby a series of concentrations (dilutions) are prepared by mixing
defined quantities with a control soil.
Depending on the knowledge of relevant response levels, a preliminary range-finding test may precede the
final test. Each final test consists of a series of soil mixtures (treatments). Each treatment is replicated at least
four times, i.e. four test pots containing a number of test plants are used.
To avoid any masking of the phytotoxic effect expression by nutrient deficiency, all treatment groups including
control soils are amended by fertilizers (10.6.3) after seedlings have emerged. It has been shown that effects
[6][7][17][22][25]
of pollutants on plant growth are pronounced in soils with optimum nutrient supply .
To assure functioning of the watering system (see 10.6.2), it should be checked whether the test soil sucks
water via wicks sufficiently. Water repellence or poor water transport can occur with very sandy soils, soils
highly contaminated with hydrocarbons or even with soil of high clay content that tend to compact even when
these soils have a high water-holding capacity (determined after initially submerging soils). For this reason, a
pretest including all soils selected for the test and replicated twice should be performed to decide whether wick
watering is applicable or manual watering is required.
10.1.1 Pretest
Two pots equipped with wicks are prepared for each soil, the test soil, the dilutions of the test soil with control
soil, the control soil and (if available) the reference soil. After filling with the sieved test soils, and/or soil
mixtures, the pots are installed above a water reservoir by using a suitable device that avoids direct contact
of the pots with the water supply. The water should reach the soil surface within 24 h. If this is the case, the
soil is expected to be watered successfully by wicks. Otherwise, water should be added manually onto the soil
surface until the soil is wet (but not highly soaked). In many cases, wick watering is successful after such an
initial manual watering. In rare cases, the soils shall be watered manually throughout the whole test period.
6 © ISO 2012 – All rights reserved
10.1.2 Range-finding test
A preliminary test to find the range of mixture ratio affecting plant growth is optional. The test soil is mixed with
the reference or a standard control soil by appropriate techniques. Mixture rates of 0 %, 12,5 %, 25 %, 50 %,
and 100 % test soil are suggested. If toxic effects become evident after emergence, the test may be finished
before the end of the growth period of two weeks.
10.1.3 Definitive test
The design of the definitive test depends on the test objectives. Typically, the habitat properties of samples of
a field-collected test soil are characterized by a comparison of the biological effects for the test soil(s) with the
effects found in a reference soil or, if not available or not appropriate due to toxicity or atypical physicochemical
characteristics, in a standard soil. Results for the standard soil assist in distinguishing contaminant effects from
non-contaminant effects caused by soil physicochemical properties. Regardless of whether a reference soil or
sta
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11269-2
Troisième édition
2012-01-15
Qualité du sol — Détermination des effets
des polluants sur la flore du sol —
Partie 2:
Effets des sols contaminés sur
l’émergence et la croissance des
végétaux supérieurs
Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora —
Part 2: Effects of contaminated soil on the emergence and early growth
of higher plants
Numéro de référence
©
ISO 2012
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de l’ISO à l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2012 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Unités . 3
5 Principe . 3
6 Végétaux d’essai . 3
7 Matériaux . 4
7.1 Récipients pour essais . 4
7.2 Sol . 4
8 Équipement . 6
9 Substance de référence . 6
10 Mode opératoire . 7
10.1 Dispositif expérimental . 7
10.2 Préparation des pots . 8
10.3 Préparation des semences . 8
10.4 Conditions de croissance . 8
10.5 Mise en route de l’essai . 9
10.6 Manipulation au cours de l’essai . 9
11 Critères de validité .10
12 Évaluation des résultats .10
12.1 Présentation des données .10
12.2 Expression des résultats .10
13 Analyse statistique . 11
13.1 Généralités . 11
13.2 Essai préliminaire . 11
13.3 Essai définitif . 11
14 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Espèces végétales supplémentaires préconisées sur la base de résultats
[4]
d’essai obtenus en appliquant la méthode d’essai «Environment Canada: EPS 1/RM/45» .14
Annexe B (informative) Données de phytotoxicité pour les composés de référence: trichloroacétate de
sodium et acide borique .17
Annexe C (informative) Méthode recommandée pour mesurer la capacité de rétention en eau du sol .18
Annexe D (informative) Recommandations pour l’alimentation des sols en éléments nutritifs .19
Bibliographie .20
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 11269-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 11269-2:2005), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
L’ISO 11269 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Détermination
des effets des polluants sur la flore du sol:
— Partie 1: Méthode de mesurage de l’inhibition de la croissance des racines
— Partie 2: Effets des sols contaminés sur l’émergence et la croissance précoce des végétaux supérieurs
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés
Introduction
La présente partie de l’ISO 11269 décrit un mode opératoire d’évaluation de la qualité des sols de différentes
origines porteurs de contaminations inconnues. L’évaluation des effets sur la croissance des végétaux est
basée sur l’émergence et les effets inhibiteurs sur les premiers stades de croissance d’au moins deux espèces
de végétaux supérieurs. Des orientations pour l’évaluation des effets potentiels de substances sur l’émergence
[14]
et la croissance de plantules sont données dans les lignes directrices 208 de l’OCDE .
La présente partie de l’ISO 11269 se réfère étroitement à l’ISO 22030 et s’appuie sur:
a) les résultats du projet de recherche allemand «Entwicklung eines innovativen und technischen
Instrumentariums zur Optimierung der ökotoxikologischen Bewertung von Böden im Hinblick auf
Sanierungsziele und Schutzerfordernisse» (Développement d’un instrument technologique innovant pour
l’évaluation des sols à des fins d’assainissement et en tenant compte des exigences de protection);
b) les discussions dans le cadre du projet commun «Ecotoxicological Test Batteries» (batteries d’essais
écotoxicologiques) qui fait partie du Groupe de recherche interdisciplinaire du BMFB (Ministère fédéral
allemand de l’éducation et de la recherche) «Processes for the Bioremediation of Soil» (Procédés de bio-
[23]
réhabilitation du sol) ;
c) les résultats du Groupe de recherche interdisciplinaire ERNTE «Erprobung und Vorbereitung einer
praktischen Nutzung ökotoxikologischer Testsysteme» (Mise à l’épreuve et préparation d’une application
[17]
pratique de systèmes d’essais écotoxicologiques) du BMFB ;
d) les résultats de l’essai interlaboratoires «Ecotoxicological Characterisation of Waste — Results and
Experiences from an International Ring Test» (Caractérisation écotoxicologique des déchets — Résultats
[8]
et expériences d’un essai interlaboratoires international) .
La croissance des végétaux peut être fortement influencée par les propriétés du sol, telles que la texture, le
pH ou le niveau d’éléments nutritifs. Lors des essais menés sur des sols naturels, on utilise comme substrat de
mélange et substrat témoin soit des sols de référence (sols non contaminés ayant les mêmes propriétés que le
sol d’essai), soit des sols standards. Dans le deuxième cas, les variations de croissance des végétaux peuvent
résulter soit de la présence de contaminants dans le sol, soit de différences dans les propriétés du sol telles
que les éléments nutritifs et la texture. Par conséquent, les résultats d’essais menés sur les sols sont moins
faciles à interpréter que les résultats d’essais sur substances chimiques.
NORME INTERNATIONALE ISO 11269-2:2012(F)
Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la
flore du sol —
Partie 2:
Effets des sols contaminés sur l’émergence et la croissance
des végétaux supérieurs
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de substances
chimiques toxiques, mutagènes ou autrement dangereux ou des micro-organismes infectieux. La
poussière ou les substances chimiques évaporées au cours de la manipulation et de l’incubation
peuvent faire courir des risques sanitaires professionnels. De plus, les végétaux peuvent absorber
des substances chimiques présentes dans le sol; il convient donc de prendre également des mesures
de sécurité lors de la manipulation des végétaux d’essai.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 11269 décrit une méthode d’évaluation de la qualité d’un sol inconnu et de la fonction
d’habitat d’un sol en déterminant l’émergence et la réponse sur les premiers stades de croissance d’au moins
deux espèces de végétaux terrestres par rapport à des sols de référence ou à des sols témoins standards. Elle
est applicable à des sols de qualité inconnue, par exemple des sols provenant de sites contaminés, des sols
amendés ou des sols après réhabilitation.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d’échange cationique effective et du taux de
saturation en bases échangeables à l’aide d’une solution de chlorure de baryum
ISO 11268-1, Qualité du sol — Effets des polluants vis‑à‑vis des vers de terre — Partie 1: Détermination de la
toxicité aiguë vis‑à‑vis de Eisenia fetida/Eisenia andrei
ISO 11268-2, Qualité du sol — Effets des polluants vis‑à‑vis des vers de terre — Partie 2: Détermination des
effets sur la reproduction de Eisenia fetida/Eisenia andrei
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des sols —
Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
ISO 22030, Qualité du sol — Méthodes biologiques — Toxicité chronique sur les plantes supérieures
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
émergence
apparition du coléoptile ou du cotylédon au-dessus du sol
3.2
contaminant
substance ou agent présent dans le sol à la suite d’une activité humaine
[28]
[ISO 15176:2002 ]
3.3
hormèse
amélioration, par rapport au témoin, de l’émergence, de la croissance ou de la survie des plantules (ou autre
réponse des végétaux d’essai) en présence de faibles concentrations de substances chimiques ou de mélanges
[1][2]
de sols qui sont toxiques lorsqu’ils sont appliqués en concentrations plus élevées
3.4
concentration minimale avec effet observé ou concentration effective
CMEO
plus faible pourcentage testé du mélange de sol soumis à essai avec un sol de référence ou un sol témoin
standard d’une substance pour lequel un effet statistiquement significatif est observé
NOTE La CMEO est exprimée en pourcentage de la masse sèche du sol soumis à essai par rapport à la masse
sèche du mélange de sols. Tous les mélanges d’essai au-dessus de la CMEO ont un effet nocif égal ou supérieur à l’effet
observé à la CMEO. Si cette condition ne peut pas être satisfaite, il convient d’expliquer la façon dont la CMEO et la CSEO
(3.5) ont été choisies.
3.5
concentration sans effet observé
CSEO
pourcentage d’essai de sols immédiatement inférieur à la CMEO qui, comparé au témoin, n’a pas d’effet
statistiquement significatif (ρ < 0,05)
3.6
concentration effective, x %
CE
x
rapport effectif, x %
RE
x
pourcentage du sol soumis à essai pour lequel un critère d’effet donné est inhibé de x % par rapport au témoin
3.7
rapport de mélange de sols
rapport entre le sol soumis à essai et le sol de référence/témoin dans un mélange de sols, exprimé en
pourcentage sur la base de la masse sèche de sol
NOTE Différents rapports peuvent être appliqués dans une série de dilutions pour établir une relation dose-réponse
3.8
sol de référence
sol non contaminé d’un site spécifique (par exemple collecté dans le voisinage d’un site contaminé) avec des
propriétés similaires (concentrations nutritives, pH, teneur en carbone organique et texture) à celles du sol d’essai
2 © ISO 2012 – Tous droits réservés
3.9
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les principales propriétés (par exemple pH, texture, teneur en
matières organiques) se situent dans une gamme connue
[11] [14] 1)
EXEMPLE Euro-Soils , sol artificiel , LUFA soils .
NOTE Les propriétés des sols standards peuvent différer du sol d’essai.
3.10
sol témoin
sol de référence ou sol standard utilisé comme contrôle et comme milieu pour préparer les séries de dilution
avec des sols d’essai ou une substance de référence
NOTE CE et CSEO sont toutes deux exprimées en milligrammes d’une substance d’essai par kilogramme (masse
sèche) du substrat d’essai. Les mélanges de sols sont donnés en pourcentages basés sur une masse sèche de sol.
4 Unités
L’émergence est exprimée en pourcentage de plantules qui émergent par rapport aux pots témoins. La
biomasse des pousses est exprimée sous forme de masse sèche par végétal ou, si nécessaire, sous forme
de masse sèche par pot.
5 Principe
L’essai mesure l’émergence et les premiers stades de croissance d’au moins deux espèces de végétaux
terrestres (une espèce monocotylédone et une espèce dicotylédone). L’essai compare le développement des
végétaux dans un sol soumis à essai et/ou dans une série de mélanges de celui-ci avec un sol témoin. Les
semences de l’espèce végétale sélectionnée sont plantées dans des pots contenant le sol/les mélanges de
sols et dans des pots témoins contenant un sol de référence ou un sol standard. Les pots sont conservés
dans des conditions de croissance adaptées aux espèces sélectionnées. Lorsque 50 % des plantules des
pots témoins ont émergé, les taux d’émergence sont déterminés et les végétaux sont éclaircis de manière à
obtenir un nombre spécifié. Après une période de deux à trois semaines, les végétaux restants sont recueillis
pour déterminer leur biomasse. L’inhibition relative de la croissance dans un sol soumis à essai non dilué est
déterminée pour évaluer sa fonction d’habitat pour les végétaux. Les valeurs de CSEO, de CMEO ou de CE
x
et de RE peuvent, en outre, être calculées à partir de la courbe dose-réponse obtenue avec des mélanges du
x
sol soumis à essai avec le sol témoin.
NOTE Un essai de croissance des végétaux peut inclure des critères d’effet d’essai supplémentaires, par exemple la
longueur des pousses, la longueur des racines et la masse sèche des racines. Dans de nombreux cas, les critères d’effets
relatifs aux racines sont plus sensibles que la masse sèche des pousses. Dans presque tous les cas, l’émergence est un
critère d’effet moins sensible.
6 Végétaux d’essai
Une espèce monocotylédone et une espèce dicotylédone sont soumises à essai en parallèle. L’avoine (Avena
sativa) est préconisée en tant qu’espèce végétale monocotylédone et la navette (Brassica rapa) et/ou le navet
sauvage (Brassica rapa ssp. rapa) en tant qu’espèce végétale dicotylédone. L’avoine, la navette et le navet
sauvage poussent aussi bien dans un sol sableux que dans un sol limoneux avec des teneurs en eau variables
et des valeurs de pH allant de 5,0 à 7,5.
D’autres espèces peuvent être sélectionnées, par exemple des végétaux dotés de caractéristiques
physiologiques spécifiques, tels que les végétaux de type C4 (maïs, canne à sucre, millet), des végétaux en
symbiose avec des bactéries fixatrices d’azote (par exemple Fabaceae) ou des végétaux ayant une signification
écologique ou économique dans certaines régions du monde, à condition que ces espèces poussent sans
1) Les Euro-Soils, le sol artificiel et les LUFA soils sont des exemples de produits appropriés disponibles sur le marché.
Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve
ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.
contraintes dans le sol témoin et qu’elles remplissent les critères de validité de l’essai (Article 11). Il convient de
ne sélectionner que les végétaux qui tolèrent les propriétés des sols soumis à essai et les conditions d’essai
(hormis leur contamination chimique). Par exemple, il convient de ne pas utiliser une espèce sensible aux
faibles pH pour tester des sols forestiers acides. Il convient de ne pas utiliser d’espèces qui ne tolèrent pas
les sols humides en même temps qu’une hydratation par mèche. Les raisons qui président au choix d’espèces
autres que l’avoine et le navet sauvage ou la navette doivent être justifiées dans le rapport d’essai.
NOTE Une liste d’espèces préconisées supplémentaires, y compris les critères de validité et les données relatives
aux substances toxiques de référence pour différents critères d’effet, est présentée dans les Annexes A et B.
7 Matériaux
7.1 Récipients pour essais
Les récipients pour essais doivent être des pots en plastique ou des pots en terre cuite émaillés, non poreux,
dont le diamètre intérieur au sommet mesure entre 85 mm et 95 mm.
Il est recommandé d’utiliser un système d’hydratation automatique, par exemple des pots équipés de mèches
en fibre de verre, pour éviter le travail fastidieux d’ajustement manuel quotidien de l’humidité du sol, comme
proposé dans l’ISO 22030. Dans ce cas, une ou deux mèche(s) en fibre de verre (∅ 1 mm) doit (doivent) être
introduite(s) par le fond des récipients. Les mèches rejoignent un réservoir d’eau et assurent l’alimentation en
eau pendant l’essai. Par conséquent, au moins un trou doit être ménagé pour installer la mèche. Les pots de
fleurs du commerce ont plusieurs trous, d’où un risque de refoulement de l’eau. De plus, les racines risquent
de passer à travers les trous ouverts et d’éviter les contaminants du sol. Un disque filtrant peut empêcher le
passage des racines à travers les trous supplémentaires. Les mèches ne sont pas utilisées lorsque le sol
soumis à essai n’absorbe pas l’eau par capillarité, comme le montre un pré-test (voir 10.2).
7.2 Sol
7.2.1 Généralités
Pour évaluer le potentiel toxique d’un sol provenant d’un site contaminé ou d’un sol réhabilité, il convient que
les sols sélectionnés aient une valeur de pH après tamisage comprise dans une gamme non toxique pour les
végétaux d’essai, par exemple entre 5,0 et 7,5 pour Brassica rapa et Avena sativa.
Il convient que le pH du sol ne soit pas corrigé. À l’heure actuelle, les limites de pH pour d’autres espèces de
végétaux que la navette et l’avoine ne peuvent être indiquées. Des recherches futures auront pour objet de
mener des essais systématiques sur un plus grand nombre de végétaux sur différents sols. De plus, il n’est
pas possible pour l’instant de fournir des limites de tolérance relatives à la texture, à la salinité ou à d’autres
propriétés du sol pour différentes espèces de végétaux.
Lorsque l’on compare des sols de qualité connue et inconnue, il convient que le sol témoin et le sol soumis
à essai appartiennent à la même classe de texture et qu’ils soient aussi similaires que possible pour toutes
les caractéristiques autres que la présence de la substance chimique ou du contaminant étudié. En effet, des
différences significatives dans les caractéristiques des sols autres que la présence de contaminants peuvent
entraîner des différences de croissance des végétaux et peuvent induire des résultats d’essai «faux positifs».
7.2.2 Sol d’essai
L’échantillon ou les échantillons de sol soumis à essai peut (peuvent) être un sol prélevé sur le terrain provenant
d’un site industriel, agricole ou autre visé par l’étude, ou il peut s’agir de déchets (par exemple matériau de
dragage, boue de station d’épuration domestique, matériau composé ou lisier) dont l’éventuel dépôt sur une
terre agricole est envisagé.
Les sols utilisés dans l’essai doivent être filtrés à travers un tamis à mailles carrées de 4 mm pour éliminer les
fragments grossiers, puis soigneusement mélangés. Si nécessaire, le sol peut être séché à l’air, sans chauffage,
avant d’être tamisé. Il convient que la durée de conservation des sols d’essai soit la plus courte possible. Le
sol doit être conservé conformément à l’ISO 10381-6 en utilisant des récipients qui minimisent les pertes de
4 © ISO 2012 – Tous droits réservés
contaminants du sol par volatilisation et par sorption sur les parois du récipient. Il convient que le pH du sol ne
soit pas corrigé afin de ne pas prendre le risque d’influencer la biodisponibilité des contaminants du sol.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, il convient de déterminer les caractéristiques suivantes pour chaque
sol prélevé sur site:
a) la texture du sol (sable, loam, limon) selon l’ISO 11277;
b) le pH (KCl) selon l’ISO 10390;
c) la teneur en eau selon l’ISO 11465;
d) la capacité de rétention en eau (Annexe C);
e) la capacité d’échange cationique selon l’ISO 11260;
f) la teneur en matière organique selon l’ISO 10694;
g) les quantités de potassium, d’azote et de phosphore totales et solubles dans l’eau.
NOTE Il est important de mesurer la capacité de rétention en eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai.
7.2.3 Sol témoin
On peut utiliser comme sol témoin soit un sol de référence, soit un sol standard, dans la mesure où aucun
retard de croissance des végétaux d’essai dans ces sols n’est à attendre. Dans tous les cas, des différences
du niveau d’éléments nutritifs entre un sol soumis à essai et un sol témoin peuvent affecter la relation
dose-réponse. Par exemple, un sol témoin beaucoup plus riche en éléments nutritifs que le sol soumis à
essai peut donner lieu à un résultat «faux positif» (c’est-à-dire que le sol soumis à essai semble avoir un effet
«toxique» sur la croissance des végétaux d’essai). Si un sol témoin est moins riche en éléments nutritifs que le
sol soumis à essai, on peut s’attendre à un phénomène d’hormèse (3.3) pour les rapports de mélange de sols
faibles, ou même à une relation dose-réponse inverse si l’apport d’éléments nutritifs devient l’effet principal.
Par conséquent, il est recommandé d’ajouter des éléments nutritifs au sol d’essai et au sol témoin/de référence
afin d’éviter des résultats d’essai «faux positifs» ou «faux négatifs» (10.6.3).
7.2.3.1 Sols de référence
Si l’on dispose de sols de référence provenant de zones non contaminées proches d’un site contaminé,
il convient de traiter et de caractériser ces sols de la même manière que les sols soumis à essai. Si une
contamination toxique ou des propriétés pédologiques inhabituelles ne peuvent être exclues, il convient de
privilégier des sols témoins standards.
7.2.3.2 Sols standards
Il convient que le sol standard soit un sol naturel ou artificiel à teneur faible en éléments nutritifs, non contaminé.
Si un sol naturel est utilisé, il convient que sa teneur en matière organique ne dépasse pas 5 %. Il convient
que les particules fines (<20 µm selon l’ISO 11277) ne dépassent pas 20 %. En variante, un sol artificiel selon
l’ISO 11268-1 et l’ISO 11268-2 peut être utilisé, même si sa teneur en matière organique est plus élevée. Il
convient toutefois que les teneurs en matière organique du sol soumis à essai et du sol témoin soient aussi
proches que possible.
Le substrat appelé «sol artificiel» a la composition suivante:
Pourcentage exprimé sur
la base de la masse sèche
— Tourbe de sphaigne finement broyée et exempte de résidus végétaux 10 %
visibles
— Argile kaolinite contenant au minimum 30 % de kaolinite 20 %
— Sable de quartz industriel (sable fin dominant contenant plus de 50 % de 69 %
grains de granulométrie comprise entre 0,05 mm et 0,2 mm)
Entre 0,3 % et 1,0 % environ de carbonate de calcium (CaCO , en poudre, qualité analytique) est nécessaire
pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Considérant les propriétés des substances non polaires (log P > 2) ou des substances ionisantes, un
OW
pourcentage de 5 % de tourbe s’est avéré suffisant pour conserver au sol artificiel la structure désirée. Dans ce cas, les
pourcentages respectifs des constituants sont modifiés comme suit: tourbe, 5 %; argile, 20 %; sable, 75 %.
NOTE 2 Le pH (KCl) est mesuré dans un échantillon mélangé dans une solution de chlorure de potassium (KCl) à 1M
ou dans une solution de chlorure de calcium (CaCI ) à 0,01 M.
Le sol artificiel est préparé, au moins trois jours avant le début de l’essai, en mélangeant soigneusement les
constituants secs énumérés ci-dessus dans un mélangeur de laboratoire de grande capacité. Une partie de
l’eau déionisée requise pour obtenir la moitié de la teneur en eau finale requise, correspondant à 40 % à 60 %
de la capacité maximale de rétention en eau, est ajoutée pendant le mélange. Le sol artificiel mélangé doit
être conservé à température ambiante pendant au moins deux jours pour équilibrer l’acidité. La quantité de
carbonate de calcium requise peut varier en fonction des propriétés du lot donné de tourbe de sphaigne; il
convient par conséquent de la déterminer en mesurant des sous-échantillons juste avant l’essai. La capacité
de rétention en eau totale est déterminée selon l’Annexe C, le pH est déterminé selon l’ISO 10390.
Il convient de tenir compte de l’eau qui est éventuellement utilisée pour introduire la substance d’essai dans le sol.
Pour obtenir une série de dilutions, le sol soumis à essai est soigneusement mélangé au sol témoin (soit
manuellement, soit en utilisant un batteur manuel). L’homogénéité du mélange est vérifiée visuellement.
8 Équipement
L’équipement de laboratoire courant incluant les appareils suivants est requis.
8.1 Chambre à commande thermostatique, phytotron, chambre de croissance des végétaux ou serre
capable d’assurer le maintien des conditions spécifiées.
8.2 Balance (à ± 0,1 mg).
8.3 Balance pour les charges plus lourdes (par exemple 10 kg) pour la préparation des mélanges de sols.
8.4 Tamis, acier inoxydable, mailles carrées de 4 mm.
8.5 Mèches en fibre de verre (∅ 1 mm).
9 Substance de référence
Il est recommandé de soumettre à essai une substance de référence pour démontrer l’uniformité des
conditions d’essai du laboratoire et de la réponse du lot particulier de semences. Le trichloroacétate de sodium
ou l’acide borique est proposé comme substance de référence. Il convient d’effectuer un essai de référence
régulièrement, et également en cas d’introduction de changements importants dans les modes opératoires,
comme par exemple un changement du phytotron/de la chambre de croissance des végétaux/de la serre, un
6 © ISO 2012 – Tous droits réservés
changement du sol ou un changement du régime d’hydratation, etc. Des exemples de données de phytotoxicité
pour les deux composés de référence sont donnés dans l’Annexe B.
10 Mode opératoire
10.1 Dispositif expérimental
Un échantillon de sol prélevé sur le terrain peut être soumis à essai à une concentration unique (généralement
100 %) ou à des concentrations multiples dans un objectif d’évaluation de la toxicité pour lequel une série de
concentrations (dilutions) est préparée en mélangeant des quantités définies à un sol témoin.
En fonction de la connaissance des niveaux de réponse pertinents, un essai préliminaire peut précéder l’essai
définitif. Chaque essai définitif consiste en une série de mélanges de sols (traitements). Pour chaque traitement,
on prépare au moins quatre réplicats, c’est-à-dire quatre pots contenant plusieurs végétaux d’essai.
Pour éviter que l’effet phytotoxique soit masqué par un déficit en éléments nutritifs, tous les traitements, y
compris les sols témoins, sont amendés par des fertilisants (10.6.3) après l’émergence des plantules. Il a été
démontré que les effets des polluants sur la croissance des végétaux sont prononcés dans les sols bénéficiant
[6][7][16][22][25]
d’un apport en éléments nutritifs optimal .
Pour assurer le bon fonctionnement du système d’hydratation (voir 10.6.2), il convient de vérifier que le sol
soumis à essai absorbe suffisamment d’eau par capillarité. Un phénomène d’hydrophobicité ou un transfert
d’eau faible peut survenir avec des sols très sableux, des sols à forte contamination par des hydrocarbures ou
même des sols à forte teneur en argile qui ont tendance à se compacter même lorsqu’ils ont une capacité de
rétention en eau élevée (déterminée après submersion initiale des sols). C’est pourquoi il convient d’effectuer
un essai préliminaire incluant tous les sols sélectionnés pour l’essai, et de le répéter deux fois, afin de décider
si l’hydratation par mèche est applicable ou si une hydratation manuelle est nécessaire.
10.1.1 Pré-test
Deux pots munis de mèches sont préparés pour chaque sol, le sol soumis à essai, les dilutions de celui-ci
avec le sol témoin, le sol témoin et, le cas échéant, le sol de référence. Après avoir été remplis avec les sols
soumis à essai tamisés et/ou les mélanges de sols, les pots sont installés au-dessus d’un réservoir d’eau au
moyen d’un dispositif approprié qui évite tout contact direct des pots avec la réserve d’eau. Il convient que l’eau
atteigne la surface du sol en moins de 24 h; si tel est le cas, on peut s’attendre à une hydratation satisfaisante
du sol par capillarité. Dans le cas contraire, il convient d’hydrater manuellement à la surface du sol jusqu’à ce
que celui-ci soit humide (mais pas détrempé). Dans de nombreux cas, l’hydratation par capillarité fonctionne
bien après une hydratation manuelle initiale. Dans de rares cas, les sols doivent être hydratés manuellement
pendant toute la durée de l’essai.
10.1.2 Essai préliminaire
Un essai préliminaire pour déterminer la gamme de mélanges affectant la croissance des végétaux est
facultatif. Le sol d’essai est mélangé au sol de référence ou à un sol témoin standard par des techniques
appropriées. Des taux de mélange de 0 %, 12,5 %, 25 %, 50 % et 100 % de sol d’essai sont suggérés. Si des
effets toxiques sont avérés après l’émergence, l’essai peut être terminé avant la fin de la période de croissance
de deux semaines.
10.1.3 Essai définitif
La conception de l’essai définitif dépend des objectifs de l’essai. Les propriétés d’habitat d’échantillons de sol
soumis à essai prélevé sur le terrain sont généralement caractérisées en comparant les effets biologiques
observés pour le(s) sol(s) soumis à essai et les effets observés dans un sol de référence ou dans un sol
standard si l’on ne dispose pas de sol de référence ou si celui-ci s’avère inapproprié en raison de sa toxicité
ou de caractéristiques physico-chimiques atypiques. Les résultats obtenus pour le sol standard aident à faire
la différence entre les effets dus à un contaminant et les effets non dus à un contaminant et causés par
les propriétés physico-chimiques du sol. Que l’on utilise un sol de référence ou un sol standard pour les
comparaisons statistiques, les résultats obtenus pour le sol standard doivent être utilisés pour apprécier la
[4]
validité et l’acceptabilité de l’essai (voir Article 11) .
S’il s’avère nécessaire, pour des raisons de caractérisation, d’inclure des séries de dilutions dans le dispositif
d’essai, les trois dispositifs suivants sont possibles (les concentrations ne doivent pas être espacées d’un
facteur plus grand que 2).
— Pour l’approche CSEO, il convient d’utiliser au moins cinq concentrations en série géométrique. Quatre
réplicats de chaque concentration, plus huit témoins, sont recommandés.
— Pour les approches RE et CE il convient d’utiliser 12 concentrations. Deux réplicats de chaque
x x
concentration, plus six témoins, sont recommandés. Le facteur de séparation peut être variable: plus petit
aux faibles concentrations, plus grand aux concentrations élevées.
— Dans les cas où les deux niveaux de seuil sont requis pour une approche mixte, il convient d’utiliser
6 concentrations à 8 concentrations selon une série géométrique. Quatre réplicats de chaque concentration,
plus huit témoins, sont recommandés. Cette approche mixte permet aussi bien une évaluation de la CSEO
qu’une évaluation de RE /CE .
x x
Un essai limite peut suffire si aucun effet toxique n’a été observé au cours de l’essai préliminaire. Dans l’essai limite,
seuls le sol soumis à essai, sans dilution, et le témoin doivent être testés, avec au moins quatre réplicats pour chacun.
10.2 Préparation des pots
Si les sols ou les mélanges de sols ont été conservés, il convient de les mélanger à nouveau juste avant
utilisation. Les pots, munis de mèches ou sans mèches, sont remplis avec les mélanges de sol jusqu’à environ
1 cm au-dessous du bord. Il convient que tous les pots de chaque mélange contiennent le même volume de
sol. La plupart des sols peuvent être manipulés plus facilement si leur teneur en eau est comprise entre 20 % et
40 % de leur capacité maximale de rétention en eau. Les sols humides ont tendance à se compacter fortement.
De plus, les semences risquent d’adhérer aux pinces si elles sont humides. Par conséquent, il peut s’avérer
nécessaire de partiellement sécher à l’air ou de réhumidifier les sols avant de remplir les pots. Il convient que
la teneur en eau réelle de chaque mélange soit connue afin de calculer la quantité d’eau nécessaire pour
l’hydratation initiale au début de l’essai.
Il convient que le sol ne soit pas trop tassé. Cependant, si la structure du sol semble trop meuble ou sans cohésion,
on peut lui imposer un tassement en lâchant les pots sur une surface dure d’une hauteur de 5 cm au plus.
10.3 Préparation des semences
Planter 10 semences uniformes non traitées des espèces sélectionnées immédiatement après avoir rempli les
pots. Si des pots différents de ceux qui sont préconisés sont utilisés, il peut s’avérer nécessaire de corriger
le nombre de semences pour que les végétaux disposent de volumes de sol et de surfaces de croissance
équivalents. Creuser des trous de 5 mm à 10 mm de profondeur pour Brassica rapa ou de 10 mm à 15 mm
de profondeur pour Avena sativa et placer une semence dans chaque trou. Lisser ensuite soigneusement la
surface du sol. Sinon, saisir les semences du bout des pinces et les planter directement à la profondeur requise.
Les semences d’avoine peuvent être sélectionnées au poids. En rejetant les semences de poids très faible
et de poids très élevé, on peut arriver à une variation de poids légèrement plus faible entre les végétaux.
Les semences de Brassica rapa sont trop petites pour être sélectionnées au poids. Rien n’indique que des
semences de couleur différente, indiquant des niveaux de maturité différents, connaissent un développement
différent. Il convient de rejeter les semences de forme irrégulière. Si d’autres espèces ont été choisies, d’autres
critères de sélection des semences peuvent être appropriés.
10.4 Conditions de croissance
La température, l’humidité et les conditions d’éclairage doivent être adaptées pour permettre une croissance
normale des végétaux d’essai. Les essais peuvent être effectués dans un phytotron, dans une chambre de
croissance pour végétaux ou dans une serre. En plus de la lumière du jour (serre), on peut utiliser des tubes
fluorescents, des lampes à décharge, à halogénure de métal, à vapeur de mercure à haute pression et au
sodium à haute pression. Il convient de choisir des lampes de croissance pour plantes. Il convient que les
8 © ISO 2012 – Tous droits réservés
lampes éclairent suffisamment pour être installées à au moins 1 m au-dessus de la surface du sol afin de
permettre la manipulation des végétaux pendant l’essai (repositionnement des pots, hydratation) et d’éviter
une répartition non homogène de la température. De plus, le niveau d’éclairage doit être fondamentalement
homogène sur toute la surface occupée par les pots pendant l’essai.
Pour Avena sativa et Brassica rapa, il convient qu’une période d’éclairage de 16 h avec une intensité d’au
moins 7 000 lx soit suivie de 8 h d’obscurité.
Une température de 23 °C ± 3 °C est indiquée pour les deux espèces. Une gamme plus large est toutefois
acceptable à condition que l’émergence et la croissance des végétaux se déroulent normalement.
Il convient d’assurer une ventilation suffisante pour éviter une contamination croisée entre les traitements par
des substances toxiques volatiles et pour empêcher tout risque pour la santé.
10.5 Mise en route de l’essai
Dans les cas où une sub-irrigation à l’aide de mèches en fibre de verre peut être utilisée (voir 10.1), les pots
peuvent être installés au-dessus des réservoirs d’eau sans hydratation supplémentaire des sols humidifiés
(voir 10.2). Seules les mèches sont laissées en contact avec l’eau. Seuls des pots correspondant aux mêmes
traitements peuvent utiliser le même réservoir. Les substances chimiques ou les éléments nutritifs risquant de
se diluer dans les réservoirs, il convient que le volume d’eau soit limité (par exemple <0,5 l par pot).
Le taux d’humidité du sol ne doit pas être ajusté par hydratation ou par une nouvelle pesée, mais doit être
maintenu constant à un pourcentage proche de la capacité maximale de rétention en eau (C ). Les
w,max
pots doivent être vérifiés visuellement pour s’assurer que le système d’hydratation par capillarité fournit une
alimentation en eau suffisant au maintien de bonnes conditions de croissance.
Si les résultats du pré-test montrent que l’hydratation par capillarité ne convient pas, le sol doit être hydraté
de manière à atteindre une teneur en eau équivalente à 60 % à 80 % de la C immédiatement après
w,max
l’introduction des semences dans le sol humide (voir 10.2).
Le taux d’humidité du sol doit être ajusté chaque jour pour maintenir un pourcentage prédéterminé de la
capacité de rétention en eau, par exemple 80 % pour Avena sativa et 60 % pour Brassica rapa. La pesée
quotidienne de plusieurs pots choisis au hasard peut constituer un bon moyen de vérification. Il convient
d’éviter les conditions anaérobies. Il convient de mentionner de telles conditions dans le rapport d’essai.
Il convient de positionner les pots individuels ou les groupes de traitement de manière aléatoire dans la zone
d’incubation.
10.6 Manipulation au cours de l’essai
10.6.1 Nombre de végétaux et éclaircissage
Pour compenser les semences qui ne vont pas germer, on plante dans chaque pot un plus grand nombre de
semences (typiquement 10) que de végétaux nécessaires pour l’essai. Après avoir procédé à une évaluation
de l’émergence dans chaque pot (pour Avena sativa, entre trois jours et cinq jours, et pour Brassica rapa, entre
sept jours et huit jours, après le semis), réduire le nombre de plantules de manière à obtenir un total de cinq
spécimens représentatifs des végétaux uniformément répartis dans les pots. Il est important que la densité
des végétaux dans un récipient d’essai ne limite pas la croissance normale. Le nombre de cinq spécimens par
pot s’applique pour Avena sativa et Brassica rapa avec les pots spécifiés ci-dessus; il doit être ajusté en cas
d’utilisation d’espèces différentes ou de pots de taille différente. Les végétaux peuvent être prélevés soit en les
tirant du sol, soit en les coupant si le sol est très compact ou si les plantules sont très serrées. Lorsqu’on coupe
l’avoine, il arrive parfois que l’on ait une pousse secondaire que l’on doit couper de nouveau ultérieurement. Si
nécessaire, les pertes d’eau dans les réservoirs sont compensées par une solution de fertilisant (10.6.3). Terminer
l’essai au minimum 14 jours et au maximum 21
...
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