Water quality -- Requirements for establishing performance characteristics of quantitative microbiological methods

ISO 13843:2017 deals with characterization of microbiological methods. In terms of ISO 13843:2017, characterization means the study of parameters that can be measured to describe how the method is likely to perform in a given set of conditions, which can be described as performance characteristics. ISO 13843:2017 describes procedures for the determination of performance characteristics which can be used for subsequent validation or verification of methods. The emphasis is on selective quantitative methods and ISO 13843:2017 applies to all types of water. For methods that are not based upon direct microscopic count, colony count or most probable number, the applicability of the procedures described in ISO 13843:2017 should be considered carefully.

Qualité de l'eau -- Exigences pour l'établissement des caractéristiques de performance des méthodes microbiologiques quantitatives

L'ISO 13843:2017 traite de la caractérisation des méthodes microbiologiques. Au sens de l'ISO 13843:2017, la caractérisation signifie l'étude de paramčtres mesurables dans le but de décrire la maničre dont les méthodes sont susceptibles d'ętre appliquées dans un ensemble donné de conditions, qui peuvent ętre décrits comme des caractéristiques de performance. L'ISO 13843:2017 décrit les modes opératoires pour la détermination des caractéristiques de performance qui peuvent ętre utilisées pour la validation ou la vérification ultérieure de méthodes. L'accent est mis sur les méthodes quantitatives sélectives et l'ISO 13843:2017 s'applique ŕ tous les types d'eau. Pour les méthodes qui ne reposent pas sur un comptage microscopique direct, un comptage des colonies ou le nombre le plus probable, il convient de vérifier de maničre approfondie l'applicabilité des modes opératoires décrits dans l'ISO 13843:2017.

General Information

Status
Published
Publication Date
26-Jun-2017
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
05-May-2017
Completion Date
27-Jun-2017
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ISO 13843:2017 - Water quality -- Requirements for establishing performance characteristics of quantitative microbiological methods
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ISO 13843:2017 - Qualité de l'eau -- Exigences pour l'établissement des caractéristiques de performance des méthodes microbiologiques quantitatives
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13843
First edition
2017-06
Water quality — Requirements
for establishing performance
characteristics of quantitative
microbiological methods
Qualité de l’eau — Exigences pour l’établissement des caractéristiqes
de performance des méthodes microbiologiques quantitatives
Reference number
ISO 13843:2017(E)
ISO 2017
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 13843:2017(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2017, Published in Switzerland

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

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ii © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 13843:2017(E)
Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Basic concepts ......................................................................................................................................................................................................... 6

4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 6

4.2 Characterization .................................................................................................................................................................................... 7

4.3 Verification ................................................................................................................................................................................................. 8

4.4 Method comparison ............................................................................................................................................................................ 8

4.5 Samples ......................................................................................................................................................................................................... 9

5 Specifications: some guideline values ............................................................................................................................................ 9

6 Designs for determining performance characteristics of a method ............................................................10

6.1 General considerations .................................................................................................................................................................10

6.2 Determination of sensitivity, specificity, efficiency, selectivity, false positive rate

and false negative rate ...................................................................................................................................................................10

6.2.1 Type of samples to be used ..................................................................................................................................10

6.2.2 Number of samples .....................................................................................................................................................11

6.2.3 Procedure ............................................................................................................................................................................11

6.2.4 Categorical performance characteristics .................................................................................................11

6.2.5 Worked example .................. .................................................... ......................................................................................12

6.3 Determination of the upper limit and consideration of the lower limit of detection .............14

6.3.1 Working range .................................................................................................................................................................14

6.3.2 Upper limit related to linearity.........................................................................................................................14

6.3.3 Type and number of samples to be used .................................................................................................14

6.3.4 Worked example .................. .................................................... ......................................................................................15

6.3.5 The lower limit of detection ................................................................................................................................16

6.4 Assessment of precision: Determination of repeatability and reproducibility ............................16

6.4.1 General...................................................................................................................................................................................16

6.4.2 Repeatability ....................................................................................................................................................................17

6.4.3 Intralaboratory reproducibility .......................................................................................................................18

6.5 Robustness ..............................................................................................................................................................................................20

6.5.1 General...................................................................................................................................................................................20

6.5.2 Experimental designs for effects due to time and temperature ..........................................20

6.6 Relative recovery ................................................................................................................................................................................21

6.6.1 General...................................................................................................................................................................................21

6.6.2 Determination of relative recovery ...............................................................................................................21

6.7 Uncertainty of counting ................................................................................................................................................................22

6.7.1 General...................................................................................................................................................................................22

6.7.2 Experimental design for assessing the uncertainty of counting colonies ...................22

6.7.3 Example of individual (or personal) uncertainty of counting colonies .........................22

6.7.4 Example of intralaboratory uncertainty of counting colonies ..............................................23

6.7.5 Example of intralaboratory uncertainty of reading MPN ..........................................................23

7 Designs for single laboratory verification of a method .............................................................................................24

7.1 General considerations .................................................................................................................................................................24

7.2 Calculation of sensitivity, specificity, efficiency, selectivity, false positive rate and

false negative rate ..............................................................................................................................................................................24

7.2.1 Type of sample to be used ....................................................................................................................................24

7.2.2 Number of samples .....................................................................................................................................................25

7.2.3 Procedure for confirmation .................................................................................................................................25

7.2.4 Categorical performance characteristics .................................................................................................25

7.3 Determination of repeatability ..............................................................................................................................................26

© ISO 2017 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 13843:2017(E)

7.4 Uncertainty of counting ................................................................................................................................................................26

7.5 Procedure for single laboratory verification ..............................................................................................................26

Annex A (informative) Mathematical models of variation..........................................................................................................30

Annex B (normative) Assessment of the lower limits ......................................................................................................................40

Annex C (normative) Assessment of the upper limit ........................................................................................................................43

Annex D (normative) Determination of the operational variability in repeatability and

intralaboratory reproducibility conditions ..........................................................................................................................44

Annex E (normative) Uncertainty of counting .........................................................................................................................................48

Annex F (normative) Determination of the operational variability (interlaboratory

reproducibility) in a collaborative performance study ............................................................................................50

Annex G (informative) Glossary of principal symbols .....................................................................................................................58

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................60

iv © ISO 2017 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 13843:2017(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following

URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,

Microbiological methods.

This first edition of ISO 13843 cancels and replaces ISO/TR 13843:2000, which has been technically

revised.
© ISO 2017 – All rights reserved v
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ISO 13843:2017(E)
Introduction

Methods are considered microbiological when the quantitative estimate is based on counting of

microbial particles either directly with the aid of a microscope or indirectly on the basis of growth

(multiplication) into colonies, turbidity, a colour change or fluorescence. The principles and procedures

within the scope of this document are commonly known as microscopic count, most probable number

(MPN) and colony count. Most of the procedures for the determination of performance characteristics

described in this document are applicable to all three types of method. However, where the procedures

are not applicable, alternative suggestions are made within the body of the document or in Annexes D

and E (for repeatability, reproducibility and uncertainty of counting).

Plaque counts of bacteriophages are in most respects similar to bacterial colony counts.

Some of the ”newer” microbiological methods such as those utilizing fluorescent in situ hybridization

(FISH) or polymerase chain reaction (PCR) can also be covered by this document. However, they may

require special consideration, depending upon how they are used. The issues of importance in these

situations include the mechanism of determining the numbers of microbes present (e.g. standard curve

for qPCR or microscopic count for FISH) and the viability of the organisms detected. If such techniques

are used for confirmation as part of a method then all sections of this document are relevant.

While not essential, during the characterization of microbiological methods it may be beneficial

to generate data using stressed organisms. Various methods can be used to stress organisms, but

the two that are most useful for water are disinfectant stress (usually chlorine injury) and nutrient

depletion caused by organisms being in a low nutrient environment (i.e. drinking water and other

oligotrophic waters) for a period prior to testing. The effect on some of the performance characteristics

of “stressing” organisms is almost totally dependent on the type and degree of stress applied and it is

inappropriate to include such detail in this document. However, there are descriptions in the literature

that laboratories can follow in case they should wish to determine performance characteristics of a

method with stressed cells.
vi © ISO 2017 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 13843:2017(E)
Water quality — Requirements for establishing
performance characteristics of quantitative
microbiological methods
1 Scope

This document deals with characterization of microbiological methods. In terms of this document,

characterization means the study of parameters that can be measured to describe how the method is

likely to perform in a given set of conditions, which can be described as performance characteristics.

The document describes procedures for the determination of performance characteristics which can be

used for subsequent validation or verification of methods.

The emphasis is on selective quantitative methods and this document applies to all types of water. For

methods that are not based upon direct microscopic count, colony count or most probable number, the

applicability of the procedures described in this document should be considered carefully.

2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 17994:2014, Water quality — Requirements for the comparison of the relative recovery of

microorganisms by two quantitative methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org ./ obp
3.1
accuracy
measurement accuracy

closeness of agreement between a measured quantity value and an assigned quantity value of a

measurand

Note 1 to entry: The concept ‘measurement accuracy’ is not a quantity and is not given a numerical quantity

value. A measurement is said to be more accurate when it offers a smaller measurement error.

Note 2 to entry: ‘Measurement accuracy’ is sometimes understood as closeness of agreement between measured

quantity values that are being attributed to the measurand.
[16]

[SOURCE: ISO/IEC Guide 99:2007, 2.13 , modified — “…a true quantity value” replaced by “… an

assigned quantity value; Notes 1 and 2 to entry added]
© ISO 2017 – All rights reserved 1
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ISO 13843:2017(E)
3.2
analyte
component represented in the name of a measurable quantity

Note 1 to entry: In water microbiology, the analyte is ideally defined as a list of taxonomically defined species.

In most cases, in practice the analyte can only be defined by group designations less accurate than taxonomic

definitions.
[14]
[SOURCE: ISO 17511:2003, 3.2 ]
3.3
analytical portion
test portion

volume of particle suspension (sample) inoculated into a detector unit (agar plate, membrane filter, test

tube, microscopic grid square)
3.4
bias
measurement bias

estimate of a systematic measurement error, or the systematic difference between the quantitative

assigned value and the average of measurement replicate results
3.5
categorical characteristics

method performance characteristic numerically expressed as a relative frequency based on P/A or

+/‑ classification
3.6
colony-forming unit
CFU
colony‑forming particle
CFP

organism (or cluster of organisms) with the ability to form a colony under certain specified conditions

Note 1 to entry: The term was originally introduced to convey the idea that a colony may originate not only from

a single cell but from a solid chain or aggregate of cells, a cluster of spores, a piece of mycelium, etc. It mistakenly

equates the number of colonies observed to the number of living entities seeded on the medium. Growth unit,

viable particle, propagule and germ are terms with the same meaning but convey the original idea better and

apply not only to colony count methods but also to the most probable number (MPN).

3.7
collaborative method performance

method or laboratory performance test where several laboratories join in an experiment planned and

co‑ordinated by a leader laboratory

Note 1 to entry: Collaborative tests are mainly of two types. Intercalibration exercises are made to allow

laboratories to compare their analytical results with those of other participating laboratories.

Note 2 to entry: Method performance tests produce precision estimates (repeatability, reproducibility) out of data

accumulated when several participating laboratories study identical samples with a strictly standardized method.

3.8
confirmed colony count
verified colony count
presumptive colony count corrected for false positives
Note 1 to entry: Mathematically:
pc= c
where
2 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 13843:2017(E)
c is the presumptive count;
p is the true positive rate;
n is the number of presumptive positives isolated for confirmation;
k is the number confirmed.
3.9
corroborated count
count obtained when using a secondary confirmation procedure
3.10
detection level

minimum concentration of organisms that produce evidence of growth with a probability of P = 0,95

when inoculated into a specified culture medium and incubated under defined conditions

Note 1 to entry: The theoretical level that conforms to this definition is an average of three viable cells in an

inoculum volume.
3.11
detection set

combination of plates or tubes on which quantitative estimation of sample microbial concentration

is based

Note 1 to entry: The detection set is the set of plates or tubes utilized for numerical estimation of a single value.

EXAMPLE Parallel plates of a suspension, plates from consecutive dilutions, 3 × 5 tube MPN system,

microtitre plate.
3.12
detector
particle detector

plate of solid matrix or a tube of liquid containing a nutrient medium for counting or detecting

biologically active particles
3.13
efficiency
fraction of colonies that are correctly assigned as positives and negatives
Note 1 to entry: Mathematically:
ad+
E =
where

a is the number of typical colonies confirmed as being the target organism (true positives);

d is the number of atypical colonies confirmed as not being the target organism (true negatives);

n is the total number of colonies tested for confirmation.
3.14
false negative

result indicated by the test method to be negative which has subsequently been shown to contain the

target organism
© ISO 2017 – All rights reserved 3
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ISO 13843:2017(E)
3.15
false positive

result indicated by the test method to be positive which was subsequently shown not to contain the

target organism
3.16
germ

entity capable of biological activity (e.g. respiration or reproduction in a nutrient medium)

3.17
limit of determination

lowest analyte concentration per analytical portion where the expected relative standard uncertainty,

equals a specified value
3.18
method-defined count
count obtained by using only the procedures in the described method
3.19
negative binomial distribution
particular “overdispersed” statistical distribution of counts
2 22
Note 1 to entry: Its variance can be expressed as sx=+ux ()x =mean .

Note 2 to entry: In this document, the square of the relative operational standard deviation (u ) is substituted for

the inverse of the exponent (1/k) of the standard equation for the negative binomial distribution.

3.20
outlier
member of a set of values which is inconsistent with other members of that set

Note 1 to entry: An extreme value which normally appears randomly in less than 1 % of repetitive tests, but more

frequently if abnormal situations occur. Statistical test procedures can be used to quantify this probability.

3.21
over-dispersion
variation in excess of Poisson randomness

Note 1 to entry: Detected qualitatively by the Poisson index of dispersion and measured quantitatively by

estimating the parameter u (relative operational standard deviation) of the negative binomial distribution.

3.22
parallel counts

particle or colony numbers in equal analytical portions drawn from the same suspension

3.23
Poisson distribution

fully random distribution of particle numbers when sampling a perfectly mixed suspension

Note 1 to entry: The probability P(k) of observing exactly k units in a test portion when the mean equals µ is

calculated from
Pk()= e
4 © ISO 2017 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 13843:2017(E)
3.24
precision
measurement precision

closeness of agreement between indications or measured quantity values obtained by replicate

measurements on the same or similar objects under specified conditions

Note 1 to entry: Measurement precision is usually expressed numerically by measures of imprecision, such as

standard deviation, variance, or coefficient of variation under the specified conditions of measurement.

Note 2 to entry: The ‘specified conditions’ can be, for example, repeatability conditions of measurement,

intermediate precision conditions of measurement, or reproducibility conditions of measurement (see

[4]
ISO 5725-3 ).

Note 3 to entry: Measurement precision is used to define measurement repeatability, intermediate measurement

precision, and measurement reproducibility.
3.25
proportionality

agreement of observed particle counts with the volume (or dilution) of a series of analytical portions

from a common root suspension

Note 1 to entry: Proportionality is evaluated as the log‑likelihood ratio statistic G with n-1 degrees of freedom.

3.26
recovery

general term used for the number of particles estimated in a test portion or sample, with the

understanding that there is a true (although unknown) number of particles of which 100 % or less are

“recovered” by the employed methodology
[12]

Note 1 to entry: Another similar term commonly used is productivity (see ISO 11133 ).

3.27
relative recovery

ratio of colony counts obtained by two methods tested on equal test portions of the same suspension

3.28
relative operational standard deviation

operational variability, expressed as a relative standard uncertainty, associated with the technical

steps of the analytical procedure

Note 1 to entry: The relative operational standard deviation is often expressed in percent.

3.29
relative operational variance
over-dispersion constant, the square of relative operational standard deviation
3.30
relative standard deviation
rel

estimate of the standard deviation of a population from a sample of n results divided by the mean of

that sample
3.31
relative variance
rel
square of relative standard deviation
© ISO 2017 – All rights reserved 5
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ISO 13843:2017(E)
3.32
repeatability
measurement repeatability
measurement precision under a set of repeatability conditions of measurement
3.33
repeatability conditions

condition of measurement, out of a set of conditions that includes the same measurement procedure,

same operators, same measuring system, same operating conditions and same location, and replicate

measurements on the same or similar objects over a short period of time
3.34
reproducibility
measurement reproducibility
measurement precision under reproducibility conditions of measurement
[2] [3]

Note 1 to entry: Relevant statistical terms are given in ISO 5725‑1 and ISO 5725-2 .

3.35
reproducibility conditions

condition of measurement, out of a set of conditions that includes different locations, operators,

measuring systems, and replicate measurements on the same or similar objects
3.36
robustness
insensitivity of an analytical method to small changes in procedure

Note 1 to entry: To examine the robustness it is advisable to “abuse” the method in a controlled way.

3.37
sensitivity

fraction of the total number of positive cultures or colonies correctly assigned in the presumptive

inspection
3.38
specificity

fraction of the total number of negative cultures or colonies correctly assigned in the presumptive

inspection
3.39
standard uncertainty
uncertainty of the result of a measurement expressed as a standard deviation
3.40
uncertainty of counting

relative standard deviation of results of repeated counting of the colonies or particles of the same

plate(s) or field(s) under stipulated conditions (same person, different persons in one laboratory)

3.41
verification

performance of a second characterization by a different laboratory to confirm the results of the original

characterization
4 Basic concepts
4.1 General

As far as particle statistics are concerned, microscopic counts obey the same laws as viable counts but

they are, with the exception of microcolony methods, free from the biological problems associated with

growth. Differential stains, specifically labelled compl
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 13843
Première édition
2017-06
Qualité de l’eau — Exigences pour
l’établissement des caractéristiqes
de performance des méthodes
microbiologiques quantitatives
Water quality — Requirements for establishing performance
characteristics of quantitative microbiological methods
Numéro de référence
ISO 13843:2017(F)
ISO 2017
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 13843:2017(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2017, Publié en Suisse

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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www.iso.org
ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 13843:2017(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Concepts de base .................................................................................................................................................................................................. 7

4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 7

4.2 Caractérisation ........................................................................................................................................................................................ 7

4.3 Vérification ................................................................................................................................................................................................. 8

4.4 Comparaison des méthodes......................................................................................................................................................... 9

4.5 Échantillons ............................................................................................................................................................................................... 9

5 Spécifications: quelques valeurs guides ...................................................................................................................................10

6 Plans d’expériences pour la détermination des caractéristiques de performance

d’une méthode .....................................................................................................................................................................................................11

6.1 Considérations d’ordre général .............................................................................................................................................11

6.2 Détermination de la sensibilité, de la spécificité, de l’efficacité, de la sélectivité, du

taux de faux positifs et du taux de faux négatifs .....................................................................................................11

6.2.1 Type d’échantillons à utiliser .............................................................................................................................11

6.2.2 Nombre d’échantillons.............................................................................................................................................11

6.2.3 Mode opératoire ............................................................................................................................................................11

6.2.4 Caractéristiques de performance de catégories ................................................................................12

6.2.5 Exemple pratique .........................................................................................................................................................13

6.3 Détermination de la limite supérieure et prise en considération de la limite

inférieure de détection ..................................................................................................................................................................15

6.3.1 Gamme de travail ..........................................................................................................................................................15

6.3.2 Limite supérieure liée à la linéarité ..............................................................................................................15

6.3.3 Type et nombre d’échantillons à utiliser .................................................................................................15

6.3.4 Exemple pratique .........................................................................................................................................................16

6.3.5 Limite inférieure de détection ...........................................................................................................................17

6.4 Estimation de la fidélité: détermination de la répétabilité et de la reproductibilité ...............17

6.4.1 Généralités .........................................................................................................................................................................17

6.4.2 Répétabilité .......................................................................................................................................................................18

6.4.3 Reproductibilité intralaboratoire ...................................................................................................................19

6.5 Robustesse ...............................................................................................................................................................................................21

6.5.1 Généralités .........................................................................................................................................................................21

6.5.2 Plans d’expériences pour les effets dus à la durée et à la température .........................21

6.6 Rendement relatif ..............................................................................................................................................................................22

6.6.1 Généralités .........................................................................................................................................................................22

6.6.2 Détermination du rendement relatif ...........................................................................................................22

6.7 Incertitude de comptage ......... .....................................................................................................................................................23

6.7.1 Généralités .........................................................................................................................................................................23

6.7.2 Plan d’expériences pour l’évaluation de l’incertitude de comptage des colonies 23

6.7.3 Exemple d’incertitude individuelle (ou personnelle) de comptage des colonies .23

6.7.4 Exemple d’incertitude intralaboratoire de comptage des colonies ..................................24

6.7.5 Exemple d’incertitude de lecture intralaboratoire de NPP ......................................................25

7 Plans d’expériences pour la vérification d’une méthode par un seul laboratoire ........................25

7.1 Considérations d’ordre général .............................................................................................................................................25

7.2 Calcul de la sensibilité, de la spécificité, de l’efficacité, de la sélectivité, du taux de

faux positifs et du taux de faux négatifs .........................................................................................................................26

7.2.1 Type d’échantillon à utiliser ...............................................................................................................................26

7.2.2 Nombre d’échantillons.............................................................................................................................................26

7.2.3 Procédure de confirmation ..................................................................................................................................26

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ISO 13843:2017(F)

7.2.4 Caractéristiques de performance de catégories ................................................................................26

7.3 Détermination de la répétabilité ..........................................................................................................................................27

7.4 Incertitude de comptage ......... .....................................................................................................................................................28

7.5 Procédure pour la vérification par un seul laboratoire ....................................................................................28

Annexe A (informative) Modèles mathématiques de variation .............................................................................................31

Annexe B (normative) Évaluation des limites inférieures ..........................................................................................................41

Annexe C (normative) Évaluation de la limite supérieure ..........................................................................................................44

Annexe D (normative) Détermination de la variabilité opérationnelle dans des conditions

de répétabilité et de reproductibilité intralaboratoire ............................................................................................45

Annexe E (normative) Incertitude de comptage ...................................................................................................................................49

Annexe F (normative) Détermination de la variabilité opérationnelle (reproductibilité

interlaboratoires) dans une étude collaborative de performances .............................................................51

Annexe G (informative) Glossaire des principaux symboles ....................................................................................................59

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................61

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ISO 13843:2017(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien

suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ foreword .html.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité

SC 4, Méthodes microbiologiques.

Cette première édition de l’ISO 13843 annule et remplace l’ISO/TR 13843:2000 qui a fait l’objet d’une

révision technique.
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ISO 13843:2017(F)
Introduction

Les méthodes sont considérées comme étant microbiologiques lorsque l’estimation quantitative

repose sur le comptage des particules microbiologiques, soit directement à l’aide d’un microscope, soit

indirectement en se basant sur la croissance (multiplication) des colonies, l’apparition d’une turbidité,

un changement de couleur ou la fluorescence. Les principes et les modes opératoires entrant dans le

domaine d’application du présent document sont généralement le comptage à l’aide d’un microscope,

le nombre le plus probable (NPP) et le comptage de colonies. La plupart des modes opératoires pour la

détermination des caractéristiques de performance décrits dans le présent document, sont applicables

aux trois types de méthodes. Toutefois, lorsque les modes opératoires ne sont pas applicables, des

méthodes alternatives sont suggérées dans le corps du présent document ou aux Annexes D et E (pour la

répétabilité, la reproductibilité et l’incertitude du comptage).

Dans la plupart des cas, les comptages de plages de bactériophages sont similaires aux comptages de

colonies bactériennes.

Certaines des méthodes microbiologiques « plus récentes », telles que celles utilisant l’hybridation

in situ fluorescente (FISH) ou l’amplification en chaîne par polymérase (PCR), peuvent être couvertes

par le présent document. Cependant, il est possible qu’elles nécessitent une approche spéciale, selon

la manière dont elles sont utilisées. Dans ces situations, les questions importantes comprennent le

mécanisme de détermination des nombres de microbes présents (par exemple, la courbe d’étalonnage

pour la qPCR ou le comptage microscopique pour la méthode FISH) et la viabilité des organismes

détectés. Si de telles techniques sont utilisées pour la confirmation dans le cadre d’une méthode utilisée,

tous les articles du présent document sont alors pertinents.

Bien que cela ne soit pas essentiel, il peut être intéressant, lors de la caractérisation des méthodes

microbiologiques, de produire des données en utilisant des organismes stressés. Diverses méthodes

peuvent être utilisées pour stresser des organismes, mais les deux méthodes les plus utiles pour

l’eau sont celles qui utilisent les désinfectants pour stresser les organismes (habituellement stress au

chlore) et l’épuisement des nutriments causé par les organismes dans un environnement pauvre en

nutriments (c’est-à-dire, eau potable et autres eaux oligotrophes) pendant un intervalle de temps donné

avant les essais. L’effet de certaines des caractéristiques de performance des organismes «stressés»

dépend presque totalement du type et du degré de contrainte «stress» appliqués et l’ajout de tels détails

dans le présent document est inapproprié. Cependant, des ouvrages de référence décrivent des modes

opératoires que les laboratoires peuvent suivre lorsqu’ils souhaitent déterminer les caractéristiques de

performance d’une méthode avec des cellules stressées.
vi © ISO 2017 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 13843:2017(F)
Qualité de l’eau — Exigences pour l’établissement
des caractéristiqes de performance des méthodes
microbiologiques quantitatives
1 Domaine d’application

Le présent document traite de la caractérisation des méthodes microbiologiques. Au sens du présent

document, la caractérisation signifie l’étude de paramètres mesurables dans le but de décrire la

manière dont les méthodes sont susceptibles d’être appliquées dans un ensemble donné de conditions,

qui peuvent être décrits comme des caractéristiques de performance. Le document décrit les modes

opératoires pour la détermination des caractéristiques de performance qui peuvent être utilisées pour

la validation ou la vérification ultérieure de méthodes.

L’accent est mis sur les méthodes quantitatives sélectives et le présent document s’applique à tous les

types d’eau. Pour les méthodes qui ne reposent pas sur un comptage microscopique direct, un comptage

des colonies ou le nombre le plus probable, il convient de vérifier de manière approfondie l’applicabilité

des modes opératoires décrits dans le présent document.
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 17994:2014, Qualité de l’eau — Exigences pour la comparaison du rendement relatif des

microorganismes par deux méthodes quantitatives
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ ;

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org ./ obp.

3.1
exactitude
exactitude de mesure

étroitesse de l’accord entre une valeur mesurée et une valeur assignée d’un mesurande

Note 1 à l’article: L’exactitude de mesure n’est pas une grandeur et ne s’exprime pas numériquement. Un mesurage

est quelquefois dit plus exact s’il fournit une plus petite incertitude de mesure.

Note 2 à l’article: L’exactitude de mesure est quelquefois interprétée comme l’étroitesse de l’accord entre les

valeurs mesurées qui sont attribuées au mesurande.
[16]

[SOURCE: Guide ISO/IEC 99:2007, 2.13, modifiée — remplacement de «… une valeur vraie» par

«... une valeur assignée»; ajout des Notes 1 et 2 à l’article]
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ISO 13843:2017(F)
3.2
analyte
composant représenté au nom d’une grandeur mesurable

Note 1 à l’article: En microbiologie de l’eau, l’analyte est de préférence défini par une liste d’espèces définies

de manière taxonomique. Dans la plupart des cas pratiques, l’analyte peut uniquement être défini par des

désignations de groupe moins précises que les définitions taxonomiques.
[14]
[SOURCE: ISO 17511:2003, 3.2]
3.3
prise analytique
prise d’essai

volume d’une suspension de particules (échantillon) inoculé dans une unité de détecteur (boîte de

gélose, membrane filtrante, tube d’essai, grille carrée microscopique)
3.4
biais
biais de mesure

estimation d’une erreur systématique ou de la différence systématique entre la valeur quantitative

assignée et la moyenne des résultats répétés d’un mesurage
3.5
caractéristiques de catégorie

caractéristique de performance de la méthode exprimée numériquement sous forme de fréquence

relative basée sur une classification P/A ou ±
3.6
unité formant colonie
UFC
particule formant colonie
PFC

organisme (ou groupe d’organismes) pouvant former une colonie dans certaines conditions spécifiées

Note 1 à l’article: Ces termes ont été introduits à l’origine pour communiquer l’idée qu’une colonie peut provenir

non seulement d’une seule cellule mais également d’une chaîne solide ou d’un agrégat de cellules, d’un groupe

de spores, d’un morceau de mycélium, etc. On considère, à tort, que le nombre de colonies observé est égal au

nombre d’entités vivantes ensemencées dans le milieu. L’unité de croissance, la particule viable, la propagule et

le germe sont des termes ayant la même signification, mais qui transmettent mieux l’idée initiale et s’appliquent

non seulement aux méthodes de comptage des colonies mais aussi au nombre le plus probable (NPP).

3.7
performances collaboratives d’une méthode

étude des performances de la méthode ou du laboratoire pour laquelle plusieurs laboratoires se

regroupent pour réaliser une expérience planifiée et coordonnée par un laboratoire leader

Note 1 à l’article: Il existe principalement deux types d’études collaboratives: les exercices d’intercalibration,

qui sont effectués pour permettre aux laboratoires de comparer leurs résultats analytiques à ceux des autres

laboratoires participants.

Note 2 à l’article: Les essais de performance de la méthode fournissent des estimations de fidélité (répétabilité,

reproductibilité) d’après des données recueillies lorsque plusieurs laboratoires participants étudient des

échantillons identiques à l’aide d’une méthode strictement normalisée.
3.8
comptage de colonies confirmé
comptage de colonies vérifié
comptage de colonies présomptif, corrigé des faux positifs
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ISO 13843:2017(F)
Note 1 à l’article: Mathématiquement:
pc= c
c est le comptage présomptif;
p est le taux de vrais positifs;
n est le nombre de positifs présomptifs isolés pour confirmation;
k est le nombre confirmé.
3.9
comptage corroboré
comptage obtenu en utilisant un mode opératoire de confirmation secondaire
3.10
niveau de détection

concentration minimale en organismes fournissant la preuve de la croissance avec une probabilité

de P = 0,95 lorsqu’ils sont inoculés dans un milieu de culture spécifié et incubés dans des conditions

spécifiées

Note 1 à l’article: Le niveau théorique conforme à cette définition est une moyenne de trois cellules viables dans

un volume d’inoculum.
3.11
série de détection

combinaison de boîtes ou de tubes sur laquelle est basée l’estimation quantitative de la concentration

microbienne de l’échantillon

Note 1 à l’article: La série de détection est la série de boîtes ou de tubes utilisée dans le cadre de l’estimation

numérique d’une seule valeur.

EXEMPLE Boîtes parallèles d’une suspension, boîtes de dilutions consécutives, système NPP 3 × 5 tubes,

microplaque.
3.12
détecteur
détecteur de particules

boîte de matrice solide ou tube de liquide contenant un milieu nutritif pour le dénombrement ou la

détection de particules biologiquement actives
3.13
efficacité
fraction de colonies correctement assignées comme étant positives ou négatives
Note 1 à l’article: Mathématiquement:
ad+
E =
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ISO 13843:2017(F)

a est le nombre de colonies typiques confirmées comme étant l’organisme cible (vrais positifs);

d est le nombre de colonies atypiques confirmées comme n’étant pas l’organisme cible (vrais négatifs);

n est le nombre total de colonies testée pour confirmation.
3.14
faux négatif

résultat indiqué par la méthode d’essai comme étant négatif et qui s’est avéré par la suite contenir

l’organisme cible
3.15
faux positif

résultat indiqué par la méthode d’essai comme étant positif et qui s’est avéré par la suite ne pas contenir

l’organisme cible
3.16
germe

entité capable d’avoir une activité biologique (par exemple, respiration ou reproduction dans un milieu

nutritif)
3.17
limite de détermination

concentration d’analyte la plus faible par prise analytique lorsque l’incertitude-type relative prévue est

égale à une valeur spécifiée
3.18
comptage défini par la méthode

comptage obtenu en utilisant uniquement les modes opératoires de la méthode décrite

3.19
distribution binomiale négative
distribution statistique particulière «surdispersée» des comptages
2 22

Note 1 à l’article: Sa variance peut être exprimée comme étant sx=+ux ()x =moyenne .

Note 2 à l’article: Dans le présent document, le carré de l’écart-type opérationnel relatif (u ) se substitue à

l’inverse de l’exposant (1/k) de l’équation normalisée de la distribution binomiale négative.

3.20
valeur aberrante

valeur d’un ensemble de valeurs qui est incohérente avec les autres valeurs de cet ensemble

Note 1 à l’article: La probabilité d’apparition d’une telle valeur extrême est normalement inférieure à 1 % des

essais répétitifs, mais augmente en cas de situations anormales. Des méthodes de test statistique peuvent être

employées pour quantifier cette probabilité.
3.21
surdispersion
variation excédentaire du caractère aléatoire de Poisson

Note 1 à l’article: Détectée qualitativement par l’indice de dispersion de Poisson et mesurée quantitativement

lors de l’estimation du paramètre u (écart-type opérationnel relatif) de la distribution binomiale négative.

3.22
comptages parallèles

nombre de particules ou de colonies dans des prises analytiques égales provenant de la même

suspension
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ISO 13843:2017(F)
3.23
distribution de Poisson

distribution entièrement aléatoire des nombres de particules lors de l’échantillonnage d’une suspension

parfaitement homogénéisée

Note 1 à l’article: La probabilité P(k) d’observer exactement k unités dans une prise d’essai, lorsque la moyenne

est égale à µ, se calcule à l’aide de la formule suivante:
Pk()= e
3.24
fidélité
fidélité de mesure

étroitesse de l’accord entre les indications ou les valeurs mesurées obtenues par des mesurages répétés

du même objet ou d’objets similaires dans des conditions spécifiées

Note 1 à l’article: La fidélité est en général exprimée numériquement par des caractéristiques telles que l’écart-

type, la variance ou le coefficient de variation dans les conditions spécifiées.

Note 2 à l’article: Les conditions spécifiées peuvent être, par exemple, des conditions de répétabilité, des

[4]

conditions de fidélité intermédiaire ou des conditions de reproductibilité (voir ISO 5725-3 ).

Note 3 à l’article: La fidélité sert à définir la répétabilité de mesure, la fidélité intermédiaire de mesure et la

reproductibilité de mesure.
3.25
proportionnalité

correspondance des comptages de particules effectués avec un volume (ou une dilution) d’une série de

prises analytiques à partir d’une suspension à racine commune

Note 1 à l’article: La proportionnalité est calculée pour une évaluation statistique en tant que ratio de log-

vraisemblance G avec n-1 degrés de liberté.
3.26
rendement

terme général désignant le nombre de particules estimé dans une prise d’essai ou dans un échantillon,

sachant qu’il y a un nombre réel (même s’il est inconnu) de particules dont 100 % ou moins sont

«récupérés» par la méthode employée
[12]

Note 1 à l’article: Un autre terme similaire couramment employé est la productivité (voir ISO 11133 ).

3.27
rendement relatif

rapport des comptages de colonies obtenus par deux méthodes soumises à l’essai sur des prises d’essai

équivalentes d’une même suspension
3.28
écart-type opérationnel relatif

variabilité opérationnelle, exprimée comme une incertitude-type relative, associée aux étapes

techniques du mode opératoire d’analyse

Note 1 à l’article: L’écart-type opérationnel relatif est souvent exprimé en pourcentage.

3.29
variance opérationnelle relative
constante de surdispersion, le carré de l’écart-type opérationnel relatif
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ISO 13843:2017(F)
3.30
écart-type relatif
rel
estimation de l’écart-type d’une population d’un éch
...

Questions, Comments and Discussion

Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.