SIST ISO 20963:2006

Soil quality -- Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea funesta) -- Determination of acute toxicity

This International Standard describes a method for the determination of the effects of contaminated soils and substances on the survival of the larvae of Oxythyrea funesta. The larvae are exposed to the pollutants by cuticular and alimentary uptake. For contaminated soils, the effects on the survival are determined in the test soil and in a control soil. Depending on the objectives of the study, the control and dilution substrates (dilution series of contaminated soil) are either uncontaminated soil comparable to the soil sample to be tested or artificial soil substrate. Effects of substances are assessed using a defined artificial soil substrate. This International Standard is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which Henry's constant or the air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,001 33 Pa at 25 °C.

Qualité du sol -- Effets des polluants vis-à-vis des larves d'insectes (Oxythyrea funesta) -- Détermination de la toxicité aiguë

L'ISO 20963:2005 décrit une méthode de détermination des effets des sols contaminés et des substances sur la survie des larves de Oxythyrea funesta. Les larves sont exposées aux polluants par absorption cuticulaire et ingestion.
Pour les sols contaminés, les effets sur la survie sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol témoin. Selon l'objectif de l'étude, le substrat utilisé pour le témoin et les dilutions (série de dilutions du sol contaminé) sont soit un sol non contaminé comparable à l'échantillon de sol à soumettre à essai, soit un substrat de sol artificiel. Les effets des substances sont évalués en utilisant un substrat de sol artificiel défini.
L'ISO 20963:2005 n'est pas applicable aux substances volatiles, c'est-à-dire des substances pour lesquelles la constante de Henry ou le coefficient de partition air/eau est supérieur à 1, ou des substances pour lesquelles la pression de vapeur excède 0,001 33 Pa à 25 °C.
Cette méthode ne prend pas en compte la dégradation possible des substances ou des polluants au cours de l'essai.

Kakovost tal – Vpliv onesnaževal na ličinke žuželk (Oxythyrea funesta) – Določanje akutne toksičnosti

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 30-Nov-2006
• Withdrawal Date: 30-Nov-2006
• ICS: 13.080.30 - Biological properties of soils
• Technical Committee: KAT - Soil quality
• Current Stage: 6060 - National Implementation/Publication (Adopted Project)
• Start Date: 01-Dec-2006
• Due Date: 01-Dec-2006
• Completion Date: 01-Dec-2006
• Ref Project: ISO 20963:2005 - Soil quality — Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea funesta) — Determination of acute toxicity

Relations

• Revised: SIST EN ISO 20963:2011 - Soil quality - Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea funesta) - Determination of acute toxicity (ISO 20963:2005)
• Effective Date: 01-Apr-2011

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20963
First edition
2005-04-01

Soil quality — Effects of pollutants on
insect larvae (Oxythyrea funesta) —
Determination of acute toxicity
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des larves d'insectes
(Oxythyrea funesta) — Détermination de la toxicité aiguë





Reference number
ISO 20963:2005(E)
©
ISO 2005

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ISO 20963:2005(E)
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Web www.iso.org
Published in Switzerland

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ISO 20963:2005(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope. 1
2 Normative references. 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
5 Test environment. 3
6 Reagents. 3
7 Apparatus. 4
8 Procedure. 4
8.1 Test design. 4
8.2 Preparation of test mixture . 5
8.3 Preparation of control container . 6
8.4 Food addition. 6
8.5 Introduction of the biological material. 6
8.6 Test conditions and measurements. 6
8.7 Reference substance. 6
9 Expression of results. 7
9.1 Calculation. 7
9.2 Expression of results. 8
10 Validity of the test . 8
11 Test report. 8
Annex A (informative) Example of breeding technique for Oxythyrea funesta . 9
Annex B (informative) Results of the collaborative trial carried out in France. 11
Bibliography . 12

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ISO 20963:2005(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 20963 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
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ISO 20963:2005(E)
Introduction
This International Standard describes a method for the determination of the acute toxicity of contaminated
soils and chemicals to the larvae of Oxythyrea funesta, a phytophagous coleopteran (Scarabaeidae,
Cetoniinae) with wide geographic distribution (Europe, North Africa and the Middle East).
Oxythyrea funesta has many characteristics which make it suitable for soil quality monitoring or testing effects
of chemicals:
 ecological relevance: this type of organism contributes in many ways to soil structure by stimulating soil
aeration and drainage;
 the first stages of development, i.e. incubation of eggs, larval cycle and pupation, are underground;
 the larvae of Oxythyrea funesta are tolerant to modifications of the test substrate granulometry;
 this species can be bred under controlled conditions.

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20963:2005(E)

Soil quality — Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea
funesta) — Determination of acute toxicity
1 Scope
This International Standard describes a method for the determination of the effects of contaminated soils and
substances on the survival of the larvae of Oxythyrea funesta. The larvae are exposed to the pollutants by
cuticular and alimentary uptake.
For contaminated soils, the effects on the survival are determined in the test soil and in a control soil.
Depending on the objectives of the study, the control and dilution substrates (dilution series of contaminated
soil) are either uncontaminated soil comparable to the soil sample to be tested or artificial soil substrate.
Effects of substances are assessed using a defined artificial soil substrate.
This International Standard is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which Henry’s constant
or the air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,001 33 Pa at
25 °C.
NOTE This method does not take into account the possible degradation of the substances or pollutants during the
test.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 11268-1, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) — Part 1: Determination of
acute toxicity using artificial soil substrate
1)
ISO 11269-2:— , Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 2: Effects of
chemicals on the emergence and growth of higher plants
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

1) To be published. (Revision of ISO 11269-2:1995)
© ISO 2005 – All rights reserved 1

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ISO 20963:2005(E)
3.1
lethal concentration 50
LC 50
median lethal concentration of test substance or percent dilution of contaminated soil, which kills 50 % of the
test organism within the test period
3.2
lethal concentration x
LCx
concentration of the test substance or percent dilution of contaminated soil which kills x % of the test organism
within the test period
NOTE x is the percentage (10, 20, 25) of this effect.
3.3
Lowest Observed Effect Concentration
LOEC
lowest tested concentration of test substance or contaminated soil at which a statistically significant effect is
observed compared with the control
NOTE All test concentrations above the LOEC have a harmful effect equal or greater than those observed at the
LOEC.
3.4
No Observed Effect Concentration
NOEC
highest tested concentration of test substance or contaminated soil at which no statistically significant effect is
observed compared with the control
NOTE The NOEC is the test concentration immediately below the LOEC.
3.5
test mixture
mixture of the test substance with the test substrate, mixture of contaminated soil with the test substrate or
mixture of contaminated soil with an uncontaminated soil comparable to the soil sample to be tested
3.6
diapause
interruption of metabolism during egg, larva, pupa or imago development
4 Principle
Larvae of Cetoniinae (species Oxythyrea funesta) are exposed to a dilution range of contaminated soil or to a
range of concentrations of test substance. The mortality of larvae is determined after 10 days. Test mixtures
are prepared at the start of the test and are not renewed within the test period.
The results obtained from the test are compared with a control and are used to determine the concentration
which causes mortality of 50 % of the larvae (LC 50 ).
10days
The test is conducted in two steps:
 a preliminary test to determine appropriate dilution/concentration range in the final test;
 the definitive test to determine the dilutions/concentrations causing between 10 % and 90 % mortality,
which yields the test result.
2 © ISO 2005 – All rights reserved

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ISO 20963:2005(E)
It may also be possible to determine the effects of contaminated soils or substances on the growth of larvae
(optional). The increase in mass within the test period allows this criterion to be considered as complementary
to mortality, in order to assess the effects of contaminated soils or substances.
5 Test environment
Tests shall be performed at a temperature of (26 ± 1) °C in complete darkness.
6 Reagents
6.1 Biological material
The species used in the test is Oxythyrea funesta (Scarabaeidae, Cetoniinae). Third-instar larvae with a fresh
mass within the range 100 mg to 200 mg are required to perform the test. The larvae shall be healthy, without
any bites or other visible injuries.
NOTE Depending on the breeding conditions, described in Annex A, larvae approximately two weeks old are suitable
for the test.
Larvae of similar size shall be selected. The difference in mass between the smallest and the largest larva
within a single test container shall not exceed 50 mg.
Eliminate the particles of breeding substrate stuck to the integument using, for example, a soft brush before
weighing the larvae. It is also possible to leave the animals to move along on slightly moist paper in order to
eliminate the breeding substrate stuck to the integument.
Synchronisation of breeding is necessary. An example of breeding technique for Oxythyrea funesta is given in
Annex A.
6.2 Test substrate
The mass of substrate used per glass container (7.1) shall be equivalent to 300 g (dry mass).
The substrate, called artificial soil, shall have the following composition (in accordance with ISO 11268-1):
 sphagnum peat, air-dried, finely ground and with no visible plant remains: 10 % (expressed on a dry mass
basis);
 kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite: 20 % (expressed on a dry mass basis);
 industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 50 % particle size between 0,05 mm and
0,20 mm): 70 % (expressed on a dry mass basis).
Add pulverised calcium carbonate (CaCO ), of recognised analytical grade, as necessary to bring the pH of
3
the wetted substrate to 6,0 ± 0,5 (commonly between 0,5 % and 1 % of the mass of the dry ingredients).
Prepare the artificial soil by mixing the dry constituents listed above thoroughly in a large-scale laboratory
mixer. The amount of calcium carbonate required can vary, depending on properties of the individual batch of
sphagnum peat, and should be determined by weighing subsamples immediately before the test.
Store the mixed artificial soil at room temperature. To determine pH and the maximum water-holding capacity,
pre-moisten the dry artificial soil at least two days before starting the test by adding deionized water to obtain
half of the required final water content of 50 % of the maximum water-holding capacity.
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ISO 20963:2005(E)
Determine the water-holding capacity in accordance with ISO 11269-2:—, Annex A, and pH in accordance
with ISO 10390. If the measured pH is not within the required range, add a sufficient amount of CaCO or
3
prepare a new batch of artificial soil.
6.3 Larvae food, i.e. dried and finely ground cow-dung, no piece larger than 1 mm.
The cow-dung shall come from healthy animals which have not received any treatment (antibiotics, growth
promoters) during a two-week period preceding the date of sampling. It should be verified especially that
animals have not recently been treated against intestinal worms.
6.4 Reference substance, i.e. 2,4,5-trichlorophenol of recognised analytical grade.
7 Apparatus
Use usual laboratory equipment and the following materials.
7.1 Glass containers, of capacity about 0,5 l to 1 l, covered with a polyethylene membrane (7.5) to allow
exchange between the medium and the atmosphere.
7.2 Crusher, or any other apparatus to obtain food as described in 6.3.
7.3 Large scale laboratory mixer for the preparation of the test substrate (6.2).
7.4 Precision balance with an accuracy of at least 1 mg.
7.5 Polyethylene membrane, perforated with small holes to allow exchange between the medium and the
atmosphere.
8 Procedure
8.1 Test design
8.1.1 Preliminary test
Carry out this test over a large range of dilutions/concentrations (e.g. contaminated soils: 0 %, 1 %, 5 %, 25 %,
50 %, 75 %, 100 %; substances: 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 1 000 mg/kg).
Substances are usually not tested at concentrations higher than 1 000 mg/kg (dry mass of test substrate).
Use preliminary test results to select the range of dilutions/concentrations for the final test. In order to
establish this range, the highest concentration at which no lethal effect is observed and the lowest
concentration at which 100 % mortality is observed should be determined.
Conduct the preliminary test without replication.
When no effects are observed, even at a concentration of 1 000 mg/kg, the definitive test can be designed as
a limit test.
8.1.2 Definitive test
Select a range of at least five
...

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 20963:2006
01-december-2006
.DNRYRVWWDO±9SOLYRQHVQDåHYDOQDOLþLQNHåXåHON2[\WK\UHDIXQHVWD±'RORþDQMH
DNXWQHWRNVLþQRVWL
Soil quality -- Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea funesta) -- Determination
of acute toxicity
Qualité du sol -- Effets des polluants vis-à-vis des larves d'insectes (Oxythyrea funesta) -
- Détermination de la toxicité aiguë
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 20963:2005
ICS:
13.080.30 Biološke lastnosti tal Biological properties of soils
SIST ISO 20963:2006 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 20963:2006

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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20963
First edition
2005-04-01

Soil quality — Effects of pollutants on
insect larvae (Oxythyrea funesta) —
Determination of acute toxicity
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des larves d'insectes
(Oxythyrea funesta) — Détermination de la toxicité aiguë





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ISO 2005

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ISO 20963:2005(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope. 1
2 Normative references. 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
5 Test environment. 3
6 Reagents. 3
7 Apparatus. 4
8 Procedure. 4
8.1 Test design. 4
8.2 Preparation of test mixture . 5
8.3 Preparation of control container . 6
8.4 Food addition. 6
8.5 Introduction of the biological material. 6
8.6 Test conditions and measurements. 6
8.7 Reference substance. 6
9 Expression of results. 7
9.1 Calculation. 7
9.2 Expression of results. 8
10 Validity of the test . 8
11 Test report. 8
Annex A (informative) Example of breeding technique for Oxythyrea funesta . 9
Annex B (informative) Results of the collaborative trial carried out in France. 11
Bibliography . 12

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ISO 20963:2005(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 20963 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
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ISO 20963:2005(E)
Introduction
This International Standard describes a method for the determination of the acute toxicity of contaminated
soils and chemicals to the larvae of Oxythyrea funesta, a phytophagous coleopteran (Scarabaeidae,
Cetoniinae) with wide geographic distribution (Europe, North Africa and the Middle East).
Oxythyrea funesta has many characteristics which make it suitable for soil quality monitoring or testing effects
of chemicals:
 ecological relevance: this type of organism contributes in many ways to soil structure by stimulating soil
aeration and drainage;
 the first stages of development, i.e. incubation of eggs, larval cycle and pupation, are underground;
 the larvae of Oxythyrea funesta are tolerant to modifications of the test substrate granulometry;
 this species can be bred under controlled conditions.

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20963:2005(E)

Soil quality — Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea
funesta) — Determination of acute toxicity
1 Scope
This International Standard describes a method for the determination of the effects of contaminated soils and
substances on the survival of the larvae of Oxythyrea funesta. The larvae are exposed to the pollutants by
cuticular and alimentary uptake.
For contaminated soils, the effects on the survival are determined in the test soil and in a control soil.
Depending on the objectives of the study, the control and dilution substrates (dilution series of contaminated
soil) are either uncontaminated soil comparable to the soil sample to be tested or artificial soil substrate.
Effects of substances are assessed using a defined artificial soil substrate.
This International Standard is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which Henry’s constant
or the air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,001 33 Pa at
25 °C.
NOTE This method does not take into account the possible degradation of the substances or pollutants during the
test.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 11268-1, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) — Part 1: Determination of
acute toxicity using artificial soil substrate
1)
ISO 11269-2:— , Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 2: Effects of
chemicals on the emergence and growth of higher plants
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

1) To be published. (Revision of ISO 11269-2:1995)
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SIST ISO 20963:2006
ISO 20963:2005(E)
3.1
lethal concentration 50
LC 50
median lethal concentration of test substance or percent dilution of contaminated soil, which kills 50 % of the
test organism within the test period
3.2
lethal concentration x
LCx
concentration of the test substance or percent dilution of contaminated soil which kills x % of the test organism
within the test period
NOTE x is the percentage (10, 20, 25) of this effect.
3.3
Lowest Observed Effect Concentration
LOEC
lowest tested concentration of test substance or contaminated soil at which a statistically significant effect is
observed compared with the control
NOTE All test concentrations above the LOEC have a harmful effect equal or greater than those observed at the
LOEC.
3.4
No Observed Effect Concentration
NOEC
highest tested concentration of test substance or contaminated soil at which no statistically significant effect is
observed compared with the control
NOTE The NOEC is the test concentration immediately below the LOEC.
3.5
test mixture
mixture of the test substance with the test substrate, mixture of contaminated soil with the test substrate or
mixture of contaminated soil with an uncontaminated soil comparable to the soil sample to be tested
3.6
diapause
interruption of metabolism during egg, larva, pupa or imago development
4 Principle
Larvae of Cetoniinae (species Oxythyrea funesta) are exposed to a dilution range of contaminated soil or to a
range of concentrations of test substance. The mortality of larvae is determined after 10 days. Test mixtures
are prepared at the start of the test and are not renewed within the test period.
The results obtained from the test are compared with a control and are used to determine the concentration
which causes mortality of 50 % of the larvae (LC 50 ).
10days
The test is conducted in two steps:
 a preliminary test to determine appropriate dilution/concentration range in the final test;
 the definitive test to determine the dilutions/concentrations causing between 10 % and 90 % mortality,
which yields the test result.
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ISO 20963:2005(E)
It may also be possible to determine the effects of contaminated soils or substances on the growth of larvae
(optional). The increase in mass within the test period allows this criterion to be considered as complementary
to mortality, in order to assess the effects of contaminated soils or substances.
5 Test environment
Tests shall be performed at a temperature of (26 ± 1) °C in complete darkness.
6 Reagents
6.1 Biological material
The species used in the test is Oxythyrea funesta (Scarabaeidae, Cetoniinae). Third-instar larvae with a fresh
mass within the range 100 mg to 200 mg are required to perform the test. The larvae shall be healthy, without
any bites or other visible injuries.
NOTE Depending on the breeding conditions, described in Annex A, larvae approximately two weeks old are suitable
for the test.
Larvae of similar size shall be selected. The difference in mass between the smallest and the largest larva
within a single test container shall not exceed 50 mg.
Eliminate the particles of breeding substrate stuck to the integument using, for example, a soft brush before
weighing the larvae. It is also possible to leave the animals to move along on slightly moist paper in order to
eliminate the breeding substrate stuck to the integument.
Synchronisation of breeding is necessary. An example of breeding technique for Oxythyrea funesta is given in
Annex A.
6.2 Test substrate
The mass of substrate used per glass container (7.1) shall be equivalent to 300 g (dry mass).
The substrate, called artificial soil, shall have the following composition (in accordance with ISO 11268-1):
 sphagnum peat, air-dried, finely ground and with no visible plant remains: 10 % (expressed on a dry mass
basis);
 kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite: 20 % (expressed on a dry mass basis);
 industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 50 % particle size between 0,05 mm and
0,20 mm): 70 % (expressed on a dry mass basis).
Add pulverised calcium carbonate (CaCO ), of recognised analytical grade, as necessary to bring the pH of
3
the wetted substrate to 6,0 ± 0,5 (commonly between 0,5 % and 1 % of the mass of the dry ingredients).
Prepare the artificial soil by mixing the dry constituents listed above thoroughly in a large-scale laboratory
mixer. The amount of calcium carbonate required can vary, depending on properties of the individual batch of
sphagnum peat, and should be determined by weighing subsamples immediately before the test.
Store the mixed artificial soil at room temperature. To determine pH and the maximum water-holding capacity,
pre-moisten the dry artificial soil at least two days before starting the test by adding deionized water to obtain
half of the required final water content of 50 % of the maximum water-holding capacity.
© ISO 2005 – All rights reserved 3

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SIST ISO 20963:2006
ISO 20963:2005(E)
Determine the water-holding capacity in accordance with ISO 11269-2:—, Annex A, and pH in accordance
with ISO 10390. If the measured pH is not within the required range, add a sufficient amount of CaCO or
3
prepare a new batch of artificial soil.
6.3 Larvae food, i.e. dried and finely ground cow-dung, no piece larger than 1 mm.
The cow-dung shall come from healthy animals which have not received any treatment (antibiotics, growth
promoters) during a two-week period preceding the date of sampling. It should be verified especially that
animals have not recently been treated against intestinal worms.
6.4 Reference substance, i.e. 2,4,5-trichlorophenol of recognised analytical grade.
7 Apparatus
Use usual laboratory equipment and the following materials.
7.1 Glass containers, of capacity about 0,5 l to 1 l, covered with a polyethylene membrane (7.5) to allow
exchange between the medium and the atmosphere.
7.2 Crusher, or any other apparatus to obtain food as described in 6.3.
7.3 Large scale laboratory mixer for the preparation of the test substrate (6.2).
7.4 Precision balance with an accuracy of at least 1 mg.
7.5 Polyethylene membrane, perforated with small holes to allow exchange between the medium and the
atmosphere.
8 Procedure
8.1 Test design
8.1.1 Preliminary test
Carry out this test over a large range of dilutions/concentrations (e.g. contaminated soils: 0 %, 1 %, 5 %, 25 %,
50 %, 75 %, 100 %; substances: 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 1 000 mg/kg).
Substances are usually not tested at concentrations higher than 1 000 mg/kg (dry mass of test subs
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20963
Première édition
2005-04-01

Qualité du sol — Effets des polluants
vis-à-vis des larves d'insectes
(Oxythyrea funesta) — Détermination de
la toxicité aiguë
Soil quality — Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea
funesta) — Determination of acute toxicity





Numéro de référence
ISO 20963:2005(F)
©
ISO 2005

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ISO 20963:2005(F)
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Publié en Suisse

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ISO 20963:2005(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 2
5 Environnement de l’essai. 3
6 Réactifs. 3
7 Appareillage. 4
8 Mode opératoire. 4
8.1 Protocole d'essai. 4
8.2 Préparation des mélanges d'essai . 5
8.3 Préparation du récipient témoin. 6
8.4 Apport de nourriture . 6
8.5 Introduction du matériel biologique. 6
8.6 Conditions d’essai et mesurages. 6
8.7 Substance de référence. 7
9 Expression des résultats. 7
9.1 Calculs. 7
9.2 Expression des résultats. 8
10 Validité de l’essai . 8
11 Rapport d’essai. 8
Annexe A (informative) Exemple de technique d’élevage pour Oxythyrea funesta . 10
Annexe B (informative) Résultats de l’essai circulaire réalisé en France . 12
Bibliographie . 13

© ISO 2005 – Tous droits réservés iii

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ISO 20963:2005(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 20963 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4, Méthodes
biologiques.
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ISO 20963:2005(F)
Introduction
La présente Norme internationale décrit une méthode de détermination de la toxicité aiguë de sols
contaminés et de produits chimiques vis-à-vis des larves de Oxythyrea funesta, un coléoptère phytophage
(Scarabaeidae, Cetoniinae) ayant une vaste répartition géographique (Europe, Afrique du Nord et Moyen-
Orient).
Oxythyrea funesta possède de nombreuses caractéristiques qui permettent de l'utiliser pour suivre la qualité
du sol ou pour évaluer les effets des produits chimiques:
 une pertinence écologique: ce type d'organisme contribue d'un grand nombre de façons à la structure du
sol en stimulant l'aération du sol et l'écoulement des eaux;
 les premiers stades de développement (incubation des œufs, cycle larvaire et nymphose) sont
souterrains;
 les larves de Oxythyrea funesta sont tolérantes aux modifications de la granulométrie du substrat d’essai;
 cette espèce peut être élevée en conditions contrôlées.

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NORME INTERNATIONALE ISO 20963:2005(F)

Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des larves
d'insectes (Oxythyrea funesta) — Détermination de la toxicité
aiguë
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit une méthode de détermination des effets des sols contaminés et des
substances sur la survie des larves de Oxythyrea funesta. Les larves sont exposées aux polluants par
absorption cuticulaire et ingestion.
Pour les sols contaminés, les effets sur la survie sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol
témoin. Selon l'objectif de l'étude, le substrat utilisé pour le témoin et les dilutions (série de dilutions du sol
contaminé) sont soit un sol non contaminé comparable à l'échantillon de sol à soumettre à essai, soit un
substrat de sol artificiel. Les effets des substances sont évalués en utilisant un substrat de sol artificiel défini.
La présente Norme internationale n'est pas applicable aux substances volatiles, c'est-à-dire des substances
pour lesquelles la constante de Henry ou le coefficient de partition air/eau est supérieur à 1, ou des
substances pour lesquelles la pression de vapeur excède 0,001 33 Pa à 25 °C.
NOTE Cette méthode ne prend pas en compte la dégradation possible des substances ou des polluants au cours de
l'essai.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation de sols destinés à une étude en laboratoire des processus microbiens aérobies
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 11268-1, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) — Partie 1:
Détermination de la toxicité aiguë en utilisant des substrats de sol artificiel
1)
ISO 11269-2:— Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 2: Effets
des substances chimiques sur l'émergence et la croissance des végétaux supérieurs

1) À publier. (Révision de l'ISO 11269-2:1995)
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ISO 20963:2005(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
concentration létale 50
CL 50
concentration létale médiane de la substance expérimentée ou pourcentage de dilution du sol contaminé qui
provoque la mort de 50 % des organismes d’essai pendant la période d'expérimentation
3.2
concentration létale x
CLx
concentration de la substance expérimentée ou pourcentage de dilution du sol contaminé qui provoque la
mort de x % des organismes d’essai pendant la période d'expérimentation
NOTE x correspond au pourcentage (10, 20, 25) de cet effet.
3.3
concentration minimale avec effet observé
CMEO
plus faible concentration soumise à essai de la substance expérimentée ou du sol contaminé à laquelle est
observé un effet statistiquement significatif par rapport au témoin
NOTE Toutes les concentrations d'essai supérieures à la CMEO ont un effet nocif supérieur ou égal à celui observé
à la CMEO.
3.4
concentration sans effet observable
CSEO
plus forte concentration soumise à essai de la substance expérimentée ou du sol contaminé pour laquelle
aucun effet statistiquement significatif n’est observé par rapport au témoin
NOTE La CSEO est la concentration d'essai immédiatement inférieure à la CMEO.
3.5
mélange d'essai
mélange de la substance expérimentée avec le substrat d’essai, mélange de sol contaminé avec le substrat
d’essai ou mélange de sol contaminé avec un sol non contaminé comparable à l'échantillon de sol soumis à
essai
3.6
diapause
interruption du métabolisme durant le développement de l'œuf, de la larve, de la nymphe ou de l'imago
4 Principe
Des larves de Cetoniinae (espèce Oxythyrea funesta) sont exposées à une gamme de dilutions d'un sol
contaminé ou à une gamme de concentrations de la substance soumise à essai. La mortalité des larves est
déterminée après 10 jours. Les mélanges d'essai sont préparés au début de l'essai et ne sont pas renouvelés
pendant la période d’expérimentation.
Les résultats obtenus à l’issue de l’essai sont comparés à un témoin et sont utilisés pour déterminer la
concentration qui provoque 50 % de mortalité chez les larves (CL 50 ).
10jours
L'essai est conduit en deux étapes:
 un essai préliminaire qui détermine la gamme appropriée de dilution/concentration lors de l’essai final;
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ISO 20963:2005(F)
 un essai définitif qui permet de déterminer les dilutions/concentrations provoquant entre 10 % et 90 % de
mortalité, ceci constituant le résultat de l’essai.
Il est également possible de déterminer les effets des sols contaminés ou des substances sur la croissance
des larves (en option). Le gain de poids au cours de la période d'expérimentation permet en effet de
considérer ce critère comme complémentaire de la mortalité pour l’évaluation des effets des sols contaminés
ou des substances.
5 Environnement de l’essai
Les essais doivent être réalisés à une température de (26 ± 1) °C dans l’obscurité complète.
6 Réactifs
6.1 Matériel biologique
L'espèce utilisée est Oxythyrea funesta (Scarabaeidae, Cetoniinae). Des larves de troisième stade, dont le
poids frais est compris entre 100 mg et 200 mg, sont requises pour réaliser l’essai. Les larves doivent être
saines et exemptes de morsures ou d’autres blessures apparentes.
NOTE Selon les conditions d’élevage décrites à l’Annexe A, des larves âgées approximativement de deux semaines
conviennent pour l’essai.
Des larves de taille similaire doivent être sélectionnées. La différence de masse entre la plus petite et la plus
grosse des larves ne doit pas dépasser 50 mg dans un récipient d’essai donné.
Éliminer les particules de substrat d’élevage collées au tégument en utilisant, par exemple, un pinceau doux
avant de peser les larves. Il est également possible de laisser les animaux se déplacer sur un papier
légèrement humide pour éliminer le substrat d’élevage collé au tégument.
Il est nécessaire de synchroniser l’élevage. Un exemple de technique d’élevage de Oxythyrea funesta est
donné à l’Annexe A.
6.2 Substrat d’essai
La quantité de substrat utilisé par récipient en verre (7.1) doit être équivalente à 300 g (poids sec).
Le substrat, appelé sol artificiel, doit avoir la composition suivante (conformément à l’ISO 11268-1):
 tourbe de sphaigne séchée à l’air, finement moulue et exempte de tout résidu de végétaux visible: 10 %
(exprimé en équivalent sec);
 argile à kaolinite contenant au moins 30 % de kaolinite: 20 % (exprimé en équivalent sec);
 sable de quartz industriel (principalement du sable fin dont plus de 50 % des particules ont une taille
comprise entre 0,05 mm et 0,20 mm): 70 % (exprimé en équivalent sec).
Ajouter du carbonate de calcium (CaCO ), pulvérisé et de qualité analytique reconnue, jusqu’à amener le pH
3
du substrat humidifié à 6,0 ± 0,5 (communément entre 0,5 % et 1 % du poids des ingrédients secs).
Préparer le sol artificiel en mélangeant soigneusement les composants secs énumérés ci-dessus dans un
mélangeur de laboratoire de grande dimension. La quantité de carbonate de calcium requise peut varier selon
les propriétés du lot individuel de tourbe de sphaigne et il convient de la déterminer en mesurant des sous-
échantillons immédiatement avant l’essai.
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ISO 20963:2005(F)
Conserver le sol artificiel mélangé à température ambiante. Pour déterminer le pH et la capacité maximale de
rétention d’eau, préhumidifier le sol artificiel sec au moins deux jours avant le début de l’essai en ajoutant de
l’eau déionisée de façon à obtenir la moitié de la teneur en eau finale requise, à savoir 50 % de la capacité
maximale de rétention d’eau.
Déterminer la capacité de rétention d’eau selon l’Annexe A de l’ISO 11269-2:— et déterminer le pH selon
l’ISO 10390. Si le pH mesuré n’est pas dans la gamme requise, ajouter une quantité suffisante de CaCO ou
3
préparer un nouveau lot de sol artificiel.
6.3 Nourriture pour larves, c'est-à-dire de la bouse de vache séchée et finement moulue, aucune
particule de plus de 1 mm.
La bouse de vache doit provenir d’animaux sains qui n’ont reçu aucun traitement (antibiotiques, stimulateur ou
activateur de croissance) durant les deux semaines précédant la date de prélèvement. Il convient de vérifier
tout particulièrement que les animaux n’ont pas été traités récemment contre les vers intestinaux.
6.4 Substance de référence, c'est-à-dire du 2,4,5-trichlorophénol de qualité analytique reconnue.
7 Appareillage
Utiliser le matériel courant de laboratoire et les matériels suivants.
7.1 Récipients en verre, d’une capacité de 0,5 l à 1 l environ, recouverts d’une membrane en polyéthylène
(7.5) permettant les échanges entre le milieu et l’atmosphère.
7.2 Broyeur, ou tout autre appareil utilisable pour préparer la nourriture comme décrit en 6.3.
7.3 Mélangeur de laboratoire de grande dimension, pour la préparation du substrat d’essai (6.2).
7.4 Balance, avec une précision d’au moins 1 mg.
7.5 Membrane en polyéthylène, perforée de petits trous pour permettre les échanges entre le milieu et
l'atmosphère.
8 Mode opératoire
8.1 Protocole d'essai
8.1.1 Essai préliminaire
Réaliser le présent essai dans une gamme étendue de dilutions/concentrations (par exemple pour les sols
contaminés: 0 %, 1 %, 5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %; pour les substances: 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg,
100 mg/kg, 1 000 mg/kg).
Les substances ne sont généralement pas soumises à essai à des concentrations supérieures à 1 000 mg/kg
(substrat d'essai exprimé en poids sec).
Utiliser les résultats de l'essai préliminaire pour sélectionner la gamme de dilutions/concentrations pour l'essai
définitif. Pour établir cette gamme, il est recommandé de déterminer la concentration la plus élevée à laquelle
aucun effet létal n’est observé et la concentration la plus faible à laquelle une mortalité de 100 % est observée.
Conduire l'essai préliminaire sans répétition.
Lorsque aucun effet n’est observé, même à la concentration de 1 000 mg/kg, l'essai définitif peut être conçu
comme un essai limite.
4 © ISO 2005 – Tous droits réservés

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ISO 20963:2005(F)
8.1.2 Essai définitif
Sélectionner une gamme d'au moins cinq dilutions/concentrations du sol contaminé ou de la
...