SIST ISO 16308:2018
Water quality - Determination of glyphosate and AMPA - Method using high performance liquid chromatography (HPLC) with tandem mass spectrometric detection
Water quality - Determination of glyphosate and AMPA - Method using high performance liquid chromatography (HPLC) with tandem mass spectrometric detection
This International Standard specifies a method for the determination of dissolved fraction of glyphosate
and its major metabolite, aminomethylphosphonic acid (AMPA), in drinking water, ground water, and
surface water at concentrations of 0,03 μg/l to 1,5 μg/l. It does not apply to marine or salty water. This
method can be applicable to other types of waters, provided the method is validated for each case.
Qualité de l'eau - Détermination du glyphosate et de l'AMPA - Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) avec détection par spectrométrie de masse en tandem
L'ISO 16308:2014 sp�cifie une m�thode de d�termination de la fraction dissoute de glyphosate et de son principal m�tabolite, l'acide aminom�thylphosphonique (AMPA) dans l'eau potable, l'eau souterraine et l'eau de surface � des concentrations de 0,03 �g/l � 1,5 �g/l. Elle ne s'applique pas � l'eau de mer ou � l'eau sal�e. Cette m�thode peut s'appliquer � d'autres types d'eaux � condition qu'elle soit valid�e pour chaque cas.
Kakovost vode - Določevanje glifosata in AMPA - Metoda tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) s sklopljeno masno spektrometrijo
Ta mednarodni standard določa metodo za določevanje raztopljenega dela glifosata in njegovega glavnega metabolita, aminometilfosfonske kisline (AMPA), v pitni vodi, podtalnici in površinski vodi pri koncentracijah med 0,03 μg/l in 1,5 μg/l. Ne uporablja se za morsko ali slano vodo. Ta metoda se lahko uporablja za druge vrste voda pod pogojem, da je potrjena za vsak posamezen primer.
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МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 16308
Первое издание
2014-09-15
Качество воды. Определение
глифосата и АМФК. Метод с
использованием высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с
тандемной масс-спектрометрией
Water quality — Determination of glyphosate and AMPA – Method using
high performance liquid chromatography (HPLC) with tandem mass-
spectrometric detection
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(Российская Федерация) в соответствии со статьѐй 18.1 Устава
Ссылочный номер
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©
ISO 2014
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Опубликовано в Швейцарии
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Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Сущность метода .1
4 Помехи .2
5 Реактивы .2
6 Аппаратура .4
7 Отбор проб .5
8 Проведение испытания .5
8.1 Предварительная обработка (при подозрении на содержание определенного
материала) .5
8.2 Разрушение хелатов и дериватизация .5
8.3 Предварительное концентрирование .7
8.4 Хроматографическое определение .8
8.5 Идентификация и подтверждение аналитов .8
8.6 Мониторинг холостых контролей .9
9 Градуировка .9
9.1 Диапазоны концентрации .9
9.2 Градуировка подходящей матрицы .9
9.3 Градуировка внутреннего стандарта . 10
10 Обработка результатов . 11
11 Протокол испытания . 12
Приложение A (информативное) Данные по эффективности . 13
Приложение B (информативное) Примеры условий проведения хроматографии . 16
Приложение C (информативное) Примеры хроматограмм . 17
Приложение D (информативное) Анализ глюфозината . 18
Приложение E (информативное) Предварительная обработка проб жесткой воды . 22
Библиография . 24
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ISO 16308:2014(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) всемирная федерация национальных органов
по стандартизации (комитеты-члены ISO). Работа по подготовке международных стандартов обычно
ведется через технические комитеты ISO. Каждый комитет-член ISO, проявляющий интерес к
тематике, по которой учрежден технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные организации, государственные и негосударственные, имеющие связи с ISO,
также принимают участие в работе. ISO тесно сотрудничает с Международной электротехнической
комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области электротехники.
Процедуры, используемые для разработки данного документа, и процедуры, предусмотренные для его
дальнейшего ведения, описаны в Директивах ISO/IEC Directives, Part 1. В частности, следует отметить
различные критерии утверждения, требуемые для различных типов документов ISO. Проект данного
документа был разработан в соответствии с редакционными правилами Директив ISO/IEC Directives,
Part 2. www.iso.org/directives .
Необходимо обратить внимание на возможность того, что ряд элементов данного документа могут
быть предметом патентных прав. Международная организация ISO не должна нести ответственность
за идентификацию таких прав, частично или полностью. Сведения о патентных правах,
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полученных ISO объявлениях о патентном праве. www.iso.org/patents .
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также информация о соблюдении Международной организацией ISO принципов ВТО по техническим
барьерам в торговле (TБT), см. следующий унифицированный локатор ресурса (URL): Foreword -
Supplementary information.
Технический комитет, несущий ответственность за данный документ, ISO/TC 147, Качество воды,
Подкомитет SC 2, Физические, химические и биохимические методы.
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Введение
Глифосат [N-(фосфонометил)глицин] является неизбирательным гербицидом широкого спектра.
Эффективность этого соединения делает его самым продаваемым и одним из наиболее широко
распространенных гербицидов в мире с момента его поступления на рынок в 1974 г. Вместе с
основным продуктом его разложения, аминометилфосфоновой кислотой (AMPA = АМФК), глифосат
является одним из самых обнаруживаемых веществ в водоемах большинства развитых стран.
Необходимо также отметить, что АМФК может выделяться в процессе обработки сточных вод,
например, за счет разложения моющих средств для текстиля.
Глифосат и АМФК принадлежат к семейству аминофосфатов и имеют конкретные физико-химические
свойства, которые требуют разработки сложных аналитических методов для анализа и обнаружения.
Сложность анализа, главным образом, связана с высокой растворимостью глифосата и АМФК и их
хелатной природой. Для решения подобных проблем используют их предколоночную дериватизацию с
9-торенилметилхлороформат (FMOC-Cl) с образованием менее полярных производных, что
обеспечивает лучшее разделение с помощью жидкостной хроматографии.
Глюфозинат, другой аминофосфонат, подлежит регулированию в меньшей степени и может быть
определен одновременно, при условии возможности продемонстрировать, что это не помешает
анализу пробы.
В настоящее время имеется международный стандарт на определение методом жидкостной
хроматографии с флюорометрическим обнаружением; но определение методом ВЭЖХ–ESI–МС/МС
может оказаться гораздо более специфичным (однозначная идентификация) и более чувствительным
(пределы количественного обнаружения составляют примерно 30 нг/л как для глифосата, так и для
АМФК). Данный международный стандарт основан на данной методике анализа и предназначен для
лабораторий, задействованных в нормативном регулировании водной среды. Большинство таких
лабораторий в настоящее время оснащено таким типом оборудования.
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МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 16308:2014(R)
Качество воды. Определение глифосата и АМФК. Метод с
использованием высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ) с тандемной масс-спектрометрией
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Пользователи данного международного стандарта должны быть знакомы
с обычной лабораторной практикой. Настоящий стандарт не преследует цели рассмотреть все
вопросы, связанные с безопасностью, если они возникают при его использовании.
Пользователь сам несет ответственность за разработку соответствующих правил техники
безопасности и охраны здоровья, а также за обеспечение соответствия условиям
национальных регламентов.
ВНИМАНИЕ! – Самое главное, чтобы анализ в соответствии с настоящим международным
стандартом выполнялся обученным персоналом.
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод определения растворенной доли
глифосата и его основного метаболита, аминометилфосфоновой кислоты (АМФК), в питьевой воде,
грунтовой воде, и поверхностных водах в концентрации от 0,03 мкг/л до 1,5 мкг/л. Он не
распространяется на морскую или соленую воду. Этот метод можно применять к другим типам вод, при
условии, что метод подтверждается для каждого отдельного случая.
2 Нормативные ссылки
Следующие ниже стандарты являются обязательными для применения настоящего документа. В
отношении датированных ссылок действительно только приведенное издание. В отношении
недатированных ссылок действует последнее издание (включая любые изменения).
ISO 3696, Вода для лабораторного анализа. Технические условия и методы испытаний
ISO 5667-3, Качество воды. Отбор проб. Часть 3: Консервация проб воды и обращение с ними
ISO 8466-1, Качество воды. Калибровка и оценивание аналитических методов, а также
эксплуатационных характеристик. Часть 1: Статистическая оценка линейной калибровочной
функции
3 Сущность метода
Глифосат и АМФК (растворенная доля после фильтрации) дериватизируют с помощью 9-
флуоренилметилхлороформиат (FMOC-Cl) (5.17) для снижения их полярности увеличения
удерживания соединения при разделении в колонке с обращенной фазой (например, C18), а также
улучшения масс-спектрометрического детектирования. Если масс-спектрометр имеет достаточную
способность к обнаружению, можно пропустить этапto твердофазной экстракции и анализировать
аналиты методом прямого ввода (см. 8.2.1).
Дериватизированную пробу очищают посредством экстракции жидкость/жидкость, а затем
концентрируют с помощью твердофазной экстракции (ТФЭ = SPE).
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ISO 16308:2014(R)
Выполняют анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-
спектрометрией через источник ионизации электрораспылением (ВЭЖХ-ЭСИ-МС/МС = HPLC–ESI–
MS/MS), используя калибровку с совпадающей матрицей.
Таблица 1 — Референтные вещества
Молекулярная
Номер по
Наименование Формула масса
a
CAS-RN
г/моль
Глифосат
C H NO P 169,1 1071–83–6
3 8 5
N-(фосфонометил)глицин
АМФК
CH NO P 111,0 1066–51–9
6 3
Аминометилфосфоновая кислота
a
CAS-RN Регистрационный номер Службы Chemical Abstracts
ПРИМЕЧАНИЕ Глюфозинат, принадлежащий к семейству аминофосфонатов, можно определять
одновременно, при условии возможности продемонстрировать отсутствие помех в отношении пробы (матрицы),
подлежащей анализу.
4 Помехи
Данный метод подтвержден для жесткой воды, содержащей до 3,2 ммоль/л кальция и магния в сумме.
Для воды с высоким содержанием кальция и магния может потребоваться увеличение концентрации
ЭДТА-Na (5.16) на этапе дериватизации (см. Приложение D).
2
Может потребоваться включение этапа ацидификации, описанной в Приложении D, даже для
некоторых типов воды, содержащей кальция и магния в сумме меньше 3,2 ммоль/л. Лаборатория
должна проверить необходимость такой процедуры для повседневного анализа.
Присутствие свободного хлора, например, в очищенной воде, может привести к потере глифосата за
счет окисления. Следовательно должен использоваться тиосульфат натрия (см. Раздел 7).
5 Реактивы
Если нет иных указаний, все реактивы и растворители должны быть достаточной чистоты, например,
―для анализа микропримесей‖.
5.1 Деионизованная вода.
5.2 Ультрачистая вода, соответствующая классу 1 по ISO 3696.
5.3 Азот, N , чистота ≥ 99,996 % по объему.
2
5.4 Лабораторное моющее средство, щелочное.
5.5 Тиосульфат натрия, Na S O .
2 2 3
5.6 Ацетонитрил, C H N, для ВЭЖХ.
2 3
5.7 Метанол, CH O, для ВЭЖХ.
4
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ISO 16308:2014(R)
5.8 Этанол, C H O, 95 % по массе, для ВЭЖХ.
2 6
5.9 Этилацетат, C H O , для ВЭЖХ.
4 8 2
5.10 Ацетат аммония, C H O N.
2 7 2
5.11 Триэтиламин, C H N.
6 15
5.12 Гидроксид аамония, NH OH 28 % по массе.
4 ,
5.13 Муравьиная кислота, CH O .
2 2
5.14 Соляная кислота, HCl, 300 г/л
5.15 Ледяная уксусная кислота, C H O .
2 4 2
5.16 Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА = EDTA), двунатриевая соль, дигидрат,
C H N O Na ·2H O, минимальной чистоты 99 % по массе.
10 14 2 8 2 2
5.17 9-флуоренилметилхлороформиат,(FMOC-Cl), C H ClO , минимальной чистоты 97 % по массе.
15 11 2
FMOC-Cl используют для приготовления реактива для дериватизации, раствор FMOC-Cl, 50 мг/мл, в
ацетонитриле (5.6). Этот раствор можно хранить при температуре −18 °C ± 3 °C в течение 6 месяцев.
Для прямого ввода (8.2.1), используют раствор FMOC-Cl в ацетонитриле концентрацией 0,5 мг/мл.
5.18 Референтные вещества, по Таблице 1.
5.18.1 Глифосат, N-(фосфонометил)глицин, C H NO P, чистотой > 98 % по массе.
3 8 5
5.18.2 АМФК, аминометилфосфоновая кислота, CH NO P, чистотой > 98 % по массе.
6 3
13 15
5.18.3 Глифосат, изотопно-меченый 1,2- C , N, суррогатный стандарт (стандарт-суррогат),
2
чистотой > 98 % по массе.
13 15
5.18.4 АМФК, изотопно-меченая C, N, суррогатный стандарт, чистотой > 98 % по массе.
5.19 Градуировочные растворы.
Отдельные исходные растворы глифосата (5.18.1) и АМФК (5.18.2), концентрацией 100 мг/л,
приготовленные в ультрачистой воде (5.2). Эти растворы можно хранить при температуре 4 °C ± 3 °C в
течение 1 месяца.
-13 15 13 15
Отдельные исходные растворы 1,2 C , N-изотопно-меченного глифосата (5.18.3) и C, N-изотопно-
2
меченой АМФК (5.18.4), концентрацией 100 мг/л, приготовленные в ультрачистой воде (5.2). Эти
растворы можно хранить при температуре 4 °C ± 3 °C в течение 1 месяца.
13 15 13 15
Многокомпонентный раствор суррогатов: 1,2- C , N- изотопно-меченного глифосата и C, N-
2
изотопно-меченой АМФК, концентрацией 20 мкг/л, приготовленные в ультрачистой воде (5.2). Этот
раствор можно хранить при температуре 4 °C ± 3 °C в течение 1 месяца.
ПРИМЕЧАНИЕ Исходные и градуировочные растворы можно хранить в течение более длительного срока при
условии соответствующего подтверждения их стабильности.
5.20 Буферный раствор ацетата триэтиламмония, 0,1 %-ный раствор триэтиламмония (5.11)
доводят до pH 9,5 ледяной уксусной кислотой (5.15) (подвижная фаза).
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5.21 Тетраборат натрия, декагидрат, Na B O ·10H O.
2 4 7 2
5.22 Буферный раствор бората натрия, 0,05 моль/л; pH = 9,2.
Растворяют19 ± 0,1 г тетрабората натрия (5.21), декагидрата в 1 л воды (5.1). Этот раствор можно
хранить в течение приблизительно 1 месяца при температуре 4 °C ± 3 °C.
2+
5.23 Минеральная вода, содержащая менее 3,2 ммоль/л двухвалентных катионов (Mg и общего
2+
Ca ), для подготовки градуировки с соответствующей матрицей.
6 Аппаратура
На материале или частях, которые могут прийти в соприкосновение с пробой, не должны оставаться
остатков, которые могли бы стать заметной помехой в холостых опытах.
Можно использовать емкости из стекла или пластика для отбора проб и для всех этапов до
дериватизации. После дериватизации должны применяться только стеклянные виалы (6.10) и
пробирки (6.11).
6.1 Обычная стеклянная лабораторная посуда, или оборудование и, в частности, следующее.
6.2 Стеклянные, полиэтиленовые (PE) или полипропиленовые (PP) бутыли, минимальной
вместимостью 50 мл, для отбора проб.
6.3 Стеклянный, полиэтиленовый (PE) или полипропиленовый (PP) шприц, 50 мл, для
фильтрования пробы.
6.4 Фильтр однократного использования для шприца, диаметр 25 мм, с гидрофильной
мембраной, 0,45 мкм, например из регенерированной целлюлозы.
6.5 Стеклянные или одноразовые PE или PP конические пробирки, вместимостью
приблизительно 50 мл, для дериватизации.
6.6 Микропипетки, регулируемые от 100 мкл до 500 мкл.
6.7 pH-метр.
®
1
6.8 Картриджи SPE, например, Oasis HLB Waters, 60 мг, 3 мл, или аналогичные.
−1
6.9 Ценотрифуга, обеспечивающая скорость вращения 6 500 м .
6.10 Стеклянные виалы, подходящие для автодозатора, с крышками и септами
(самоуплотняющимися мембранами для хроматографии) из политетрафторэтилена (ПТФЭ = PTFE)
или силиконовой резины.
6.11 Стеклянные пробирки, вместимостью 15 мл или меньше.
® ® ®
1
Oasis HLB , XBridge C18 и Gemini -NX являются примерами подходящей продукции, имеющейся в продаже.
Эта информация дается для удобства пользователей данного документа и не указывает на предпочтение,
оказываемое ISO этой продукции.
4 © ISO 2014 – Все права сохраняются
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®1)
6.12 Колонка для обращено-фазовой хроматографии, например, колонка XBridge C18 [колонка
Waters, 50 мм × 2,1 мм внутренним диаметром (ВД) 2,5 мкм,] с предколонкой (Waters, 10 мм × 2,1 мм
ВД 2,5 мкм).
Настоятельно рекомендуется колонка с неподвижной фазой, устойчивой к действию щелочей (pH 9 -
pH 9,5).
® 1)
ПРИМЕЧАНИЕ Также подойдет колонка Gemini -NX (Phenomenex) аналогичных размеров. Можно
использовать другие колонки при условии соответствия условий разделения.
6.13 Высокоэффективный жидкостной хроматограф (ВЭЖХ), состоящий из 6.13.1 - 6.13.5.
6.13.1 Дозатор, ручной или автоматический.
6.13.2 Градиентный насос.
6.13.3 Печь с терморегулятором, для колонки ВЭЖХ.
6.13.4 Масс-спектрометр, с тройным квадрупольным анализатором и источником
элекетрораспыления.
6.13.5 Система сбора и обработки данных.
7 Отбор проб
Если бутыли для пробоотбора не однократного пользования, их (6.2) споласкивают деионизованной
водой (5.1), затем моют лабораторным моющим средством (5.4). Споласкивают водой (5.1), затем
ультрачистой водой (5.2), и, наконец, 95 %-ным этанолом (5.8).
Отбор проб производят в соответствии с ISO 5667-3 в эти бутыли (6.2) (приблизительно 50 мл).
При подозрении, что вода содержит свободный хлор, добавляют примерно 2 мг тиосульфата натрия
(5.5) или любого другого вещества, снижающего содержание хлора на 100 мл пробы.
Пробы хранят в соответствии с ISO 5667-3 при температуре 3 °C ± 2 °C и предварительно
обрабатывают в течение 24 ч.
8 Проведение испытания
8.1 Предварительная обработка (при подозрении на содержание определенного
материала)
Помещают фильтр (6.4) на шприц (6.3). Споласкивают порцией объемом 5 мл ультрачистой воды (5.2).
Фильтруют пробу (приблизительно 50 мл), первые 5 мл отбрасывают. Фильтрат собирают в пробирку с
конической нижней частью (6.5).
Хранят профильтрованные пробы при температуре 4 °C ± 3 °C в течение максимум одной недели
перед этапом дериватизации.
8.2 Разрушение хелатов и дериватизация
8.2.1 Общие положения
Адаптируют этап дериватизации к типу аналитического анализа, следующему за дериватизацией:
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ISO 16308:2014(R)
— при использовании масс-спектрометра с достаточной способностью обнаружения
предварительного концентрирования не требуется, и дериватизированную пробу вводят
непосредственно после дериватизации согласно 8.2.2;
— в противном случае, можно использовать этап предварительного концентрирования, чтобы
достичь нужного предела количественного обнаружения (LOQ), а дериватизации выполняют
согласно 8.2.3.
8.2.2 Разрушение хелатов и дериватизация для прямого ввода
Помещают, например, 5 мл пробы (различные количества пробы требуют применения эквивалентных
количеств следующих реактивов) в колбу Эрленмейера вместимостью 25 мл со стеклянной пробкой и
якорем магнитной мешалки внутри.
Добавляют 50 мкл многокомпонентного водного раствора концентрацией 20 мкг/л (5.19), включающего
-13 15 13 15
1,2 C , N-изотопно-меченый глифосат (5.18.3) и C, N-изотопно-меченую АМФК (5.18.4) в
2
ультрачистой воде (5.2) в качестве суррогата дериватизации.
Добавляют 100 мкл ЭДТА-Na (5.16) [раствор в ультрачистой воде концентрацией 0,1 моль/л (5.2)],
2
встряхивают и выдерживают в течение 10 мин в закрытой колбе.
Добавляют, например, 2 мл буферного раствора бората Na (5.22), концентрацией 0,05 моль/л и
−1
перемешивают в течение 30 мин со скоростью 400 мин , чтобы отрегулировать значение pH 9,0 -
pH 9,5.
Добавляют 400 мкл раствора FMOC-Cl (5.17 для прямого ввода); перемешивают в течение 4 ч со
−1
скоростью 400 мин и выдерживают в течение приблизительно 12 ч (на ночь).
Нейтрализуют раствор соляной кислотой концентрацией 30 % (5.14).
Фильтруют и используют для анализа (8.4).
Конечный объем предварительно обработанной пробы должен учитываться при расчете конечного
результата.
ПРИМЕЧАНИЕ Кран, перекрывающий поток элюата за колонкой до и после прохождения аналитов в отходы,
является хорошим средством защиты источника ионов детектора МС/МС от загрязнения.
8.2.3 Разрушение хелатов и дериватизация до предварительного концентрирования
С помощью микропипетки, например, (6.6), пипетки из полиэтилена или полипропилена, переносят
5 мл пробы впробирку из полипропилена с конической нижней частью (6.5).
-13 15
Добавляют 50 мкл многокомпонентного водного раствора, 20 мкг/л, 1,2 C , N- изотопно-меченого
2
13 15
глифосата (5.18.3) и C, N- изотопно-меченой АМФК (5.18.4) в ультрачистой воде (5.2) в качестве
суррогата дериватизации.
Добавляют 325 мкл буферного раствора бората Na (5.22) в стряхивают.
Добавляют 200 мкл раствора ЭДТА-Na (5.16) [0,1 моль/л в ультрачистой воде (5.2)], встряхивают и
2
дают постоять в течение 5 мин. Добавление ЭДТА позволяет выделить глифосат и АМФК из
2+ 2+
комплексов с двухвалентными катионами (например, Ca , Mg ).
Добавляют 4,5 мл ацетонитрила (5.6). Энергично встряхивают в течение 1 мин для гомогенизации (на
этом этапе не должно происходить разделения фаз).
6 © ISO 2014 – Все права сохраняются
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ISO 16308:2014(R)
Добавляют 0,6 мл раствора FMOC-Cl (5.17) и снова встряхивают.
Оставляют на 30 мин в темном месте при комнатной температуре (от 20 °C до 25 °C) для реакции.
После дериватизации избыток FMOC-Cl и побочные продукты реакции (например, FMOC-OH) удаляют
в процессе предварительного концентрирования (8.3).
Если вода жесткая, c(CaCO ) > 3 ммоль/л, рекомендуется дополнительная предварительная обработка
3
пробы (см. Приложение E).
8.3 Предварительное концентрирование
8.3.1 Экстракция анализируемых производных жидкость-жидкостью
Концентрируют анализируемую пробу приблизительно до объема 5 мл в токе азота (20 мл/мин -
40 мл/мин) при комнатной температуре для удаления ацетонитрила. Ацетонитрил необходимо
выпарить в течение не более 60 мин. На стенке пробирки может кристаллизоваться FMOC-Cl (избыток
реактива) и FMOC-OH (побочный продукт).
Переносят раствор из пластиковой пробирки в стеклянную (6.11). Споласкивают пластиковую пробирку
порцией приблизительно 500 мкл ультрачистой воды (5.2) и переносят эту воду в стеклянную трубку.
Экстрагируют три раза порциями по 1,5 мл этилацетата (5.9). При необходимости центрифугируют в
−1
течение 20 с при 6 500 м после каждой экстракции, чтобы разделить две фазы. Надосадочную фазу
удаляют пипеткой Пастера (для каждой экстракции используют новую пипетку).
Затем концентрируют водную фазу в токе азота в течение 15 мин, чтобы выпарить остаток
этилацетата, встряхивая пробирку каждые 5 мин.
Конечный объем должен составлять примерно 6 мл.
Затем экстракт подкисляют до pH 3 муравьиной кислотой (5.13), чтобы предотвратить возможную
реакцию с остатком FMOC-Cl и осуществить дальнейшее предварительное концентрирование
экстрактов с помощью SPE (8.3.2). Для этой цели добавляют 100 мкл 5 %-ного по объему раствора
муравьиной кислоты (5.13) в ультрачистой воде (5.2), доводят объем до 6 мл ультрачистой водой (5.2),
при необходимости, а затем гомогенизируют в течение 1 мин.
8.3.2 Твердофазная экстракция
8.3.2.1 Общие требования
Используют картриджи SPE (6.8), содержащие, например, 60 мг полимерной твердой фазы
полистирол-дивинилбензол с размером частиц 60 мкм. Выход проверяют регулярно.
1)
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Можно использовать картриджи Oasis HLB® (60 мкм, 60 мг, 3 мл, Waters).
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Допускается онлайн очистка и концентрация SPE.
8.3.2.2 Кондиционирование картриджей
Промывают 2 × 500 мкл метанола (5.7) и 2 × 500 мкл водного раствора 0,1 %-ной по объему
муравьиной кислоты (5.13).
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ISO 16308:2014(R)
8.3.2.3 Очистка
Пропускают 6 мл подкисленного водного экстракта (pH 3) через картридж со скоростью
приблизительно 1 мл/мин.
Споласкивают пробирку SPE порцией 1 мл водного раствора 0,1 %-ной по объему муравьиной кислоты
(5.13), затем 2 × 500 мкл ультрачистой воды (5.2).
Сушат картридж под вакуумом или в слабом токе азота в течение приблизительно 1 мин для удаления
основной части воды.
Элюируют 3 порциями по 700 мкл метанола (5.7): 20 г/л гидроксида аммония (5.12) в ультрачистой
воде (5.2) (70:30 по объему).
Собирают элюат в стеклянную пробирку (6.11) и уменьшают в токе азота, пока метанол не будет
удален. Конечный объем должен составить приблизительно 0,7 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ Остатки метанола могут разлагаться в условиях хроматографии, давая раздвоенные пики.
Доводят до 1 мл ультрачистой водой (5.2). Очищенный экстракт можно хранить в течение 48 ч при
температуре не более 4 °C ± 3 °C до анализа, поскольку производные FMOC стабильны в воде.
8.4 Хроматографическое определение
8.4.1 Общие требования
Оборудование используют в соответствии с инструкциями изготовителя.
Регулярно проверяют требуемую стабильность системы. Регулируют и оптимизируют установки
параметров приборов в соответствии с инструкциями изготовителей.
В результате использования забуференной подвижной фазы рекомендуется регулярно промывать
аналитическую колонку и хроматографическую систему в соответствии с инструкциями изготовителя.
8.4.2 Условия проведения хроматографического анализа
Разделяют производные глифосата и АМФК методом ВЭЖХ , используя колонку для обращено-фазовой
хроматографии и соответствующие условия. Показатель pH подвижной фазы должен быть щелочным (pH 9 -
pH 9,5), чтобы получить лучшую эффективность хроматографии (симметрию пиков близкую к 1 и узкие пики),
что предполагает использование конкретной колонки (гибридная неподвижная фаза).
Примеры соответствующих условий хроматографии показаны в Приложениях B - D.
8.5 Идентификация и подтверждение аналитов
Идентификация целевых соединений достигается сравнением времени их удерживания с временем
удерживания референтного вещества, и их масс-спектры в режиме отрицательной ионизаци
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16308
First edition
2014-09-15
Water quality — Determination of
glyphosate and AMPA — Method
using high performance liquid
chromatography (HPLC) with tandem
mass spectrometric detection
Qualité de l’eau — Détermination du glyphosate et de l’AMPA —
Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance
(CLHP) avec détection par spectrométrie de masse en tandem
Reference number
ISO 16308:2014(E)
©
ISO 2014
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ISO 16308:2014(E)
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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
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Web www.iso.org
Published in Switzerland
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ISO 16308:2014(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Principle . 1
4 Interferences . 2
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling . 5
8 Procedure. 5
8.1 Pre-treatment (Suspended particular matter) . 5
8.2 Chelate break and derivatization . 5
8.3 Pre-concentration . 6
8.4 Chromatographic determination. 7
8.5 Identification and confirmation of the analytes . 8
8.6 Blank control monitoring. 8
9 Calibration . 8
9.1 Concentration ranges . 8
9.2 Matrix-matched calibration . 8
9.3 Internal standard calibration . 9
10 Expression of results .10
11 Test report .10
Annex A (informative) Performance data .11
Annex B (informative) Examples of chromatographic conditions .14
Annex C (informative) Examples of chromatograms .15
Annex D (informative) Analysis of gluphosinate .16
Annex E (informative) Pre-treatment of hard water samples .20
Bibliography .22
© ISO 2014 – All rights reserved iii
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ISO 16308:2014(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 2, Physical,
chemical and biochemical methods.
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ISO 16308:2014(E)
Introduction
Glyphosate [N-(phosphonomethyl)glycine] is a non-selective broad-spectrum herbicide. The efficiency
of this compound makes it a top selling and one of the most widely used herbicides in the world since
it entered the market in 1974. Together with its main degradation product, aminomethylphosphonic
acid (AMPA), glyphosate is one of the most detected substances in water bodies in many developed
countries. Note also that AMPA can be released during sewage treatment, e.g. due to breakdown of
detergent formulations for textiles.
Glyphosate and AMPA belong to the aminophosphonate family and have specific physico-chemical
properties that require the development of complex analytical methods for analysis and detection. The
difficulty in analysis is mainly linked to the high solubility of glyphosate and AMPA and their chelating
nature. To solve these problems, their pre-column derivatization with 9-fluorenylmethylchloroformate
(FMOC-Cl) to form less polar derivatives allows a better separation using liquid chromatography.
Gluphosinate, another aminophosphonate, is less commonly subject to regulation and can be determined
simultaneously, provided it can be demonstrated that there is no interference with the sample under
analysis.
There is currently an International Standard for the determination by liquid chromatography and
fluorometric detection; however, the determination by HPLC–ESI–MS/MS can be much more specific
(unambiguous identification) and more sensitive (limits of quantification of approximately 30 ng/l for
both glyphosate and AMPA). This International Standard is based on this analytical technique and is
intended for laboratories involved in the regulatory control of the aquatic environment. Many such
laboratories are now equipped with this kind of apparatus.
© ISO 2014 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16308:2014(E)
Water quality — Determination of glyphosate and AMPA
— Method using high performance liquid chromatography
(HPLC) with tandem mass spectrometric detection
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if
any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International
Standard be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of dissolved fraction of glyphosate
and its major metabolite, aminomethylphosphonic acid (AMPA), in drinking water, ground water, and
surface water at concentrations of 0,03 µg/l to 1,5 µg/l. It does not apply to marine or salty water. This
method can be applicable to other types of waters, provided the method is validated for each case.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 5667-3, Water quality — Sampling — Part 3: Preservation and handling of water samples
ISO 8466-1, Water quality — Calibration and evaluation of analytical methods and estimation of performance
characteristics — Part 1: Statistical evaluation of the linear calibration function
3 Principle
Glyphosate and AMPA (dissolved fraction after filtration) are derivatized using
9-fluorenylmethylchloroformate (FMOC-Cl) (5.17) to lower their polarity and increase the retention
of compound in a separation on a reverse phase column (e.g. C18) as well as to improve the mass
spectrometric detection. If the mass spectrometer has sufficient detection capability, it is possible to
omit the solid phase extraction and to analyse the analytes by direct injection (see 8.2.1).
The derivatized sample is purified by liquid/liquid extraction and then concentrated by solid phase
extraction (SPE).
The analysis is performed by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass
spectrometry via an electrospray source (HPLC–ESI–MS/MS), using matrix-matched calibration.
© ISO 2014 – All rights reserved 1
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ISO 16308:2014(E)
Table 1 — Substances addressed
Molecular mass
a
Name Formula CAS-RN
g/mol
Glyphosate
C H NO P 169,1 1071–83–6
3 8 5
N-(phosphonomethyl)glycine
AMPA
CH NO P 111,0 1066–51–9
6 3
Aminomethylphosphonic acid
a
CAS-RN Chemical Abstracts Service Registry Number
NOTE Gluphosinate, belonging to the aminophosphonate family, can be determined simultaneously, provided
it can be demonstrated that there is no interference with the sample (matrix) subject to analysis.
4 Interferences
This method is validated for hard water containing up to 3,2 mmol/l of the sum of calcium and
magnesium. For waters with a higher calcium and magnesium content, it may be necessary to increase
the concentration of EDTA-Na (5.16) at the derivatization step (see Annex D).
2
It can prove necessary to include the acidification step described in Annex D even for some water types
below 3,2 mmol/l of the sum of calcium and magnesium. The laboratory shall check the necessity of this
procedure for its routine samples.
The presence of free chlorine, e.g. in treated waters, can cause losses of glyphosate by oxidation.
Consequently sodium thiosulfate shall be used (see Clause 7).
5 Reagents
Unless otherwise stated, all reagents and solvents shall be of sufficient purity, e.g. “for trace analysis”.
5.1 Deionized water.
5.2 Ultra-pure water, complying with grade 1 of ISO 3696.
5.3 Nitrogen, N , purity ≥ 99,996 % volume fraction.
2
5.4 Laboratory detergent, alkaline.
5.5 Sodium thiosulfate, Na S O .
2 2 3
5.6 Acetonitrile, C H N, HPLC grade.
2 3
5.7 Methanol, CH O, HPLC grade.
4
5.8 Ethanol, C H O, 95 %, HPLC grade mass fraction.
2 6
5.9 Ethyl acetate, C H O , HPLC grade.
4 8 2
5.10 Ammonium acetate, C H O N.
2 7 2
5.11 Triethylamine, C H N.
6 15
5.12 Ammonium hydroxide, NH OH 28 % mass fraction.
4 ,
2 © ISO 2014 – All rights reserved
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ISO 16308:2014(E)
5.13 Formic acid, CH O .
2 2
5.14 Hydrochloric acid, HCl, 300 g/l.
5.15 Glacial acetic acid, C H O .
2 4 2
5.16 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), disodium salt dihydrate, C H N O Na ·2H O, with a
10 14 2 8 2 2
minimum purity of 99 % mass fraction.
5.17 9-Fluorenylmethyl chloroformate,(FMOC-Cl), C H ClO , with a minimum purity of 97 % mass
15 11 2
fraction.
FMOC-Cl is used to prepare the derivatization reagent, FMOC-Cl solution, 50 mg/ml, in acetonitrile
(5.6). This solution can be stored at −18 °C ± 3 °C for 6 months.
For direct injection (8.2.1), use a FMOC-Cl solution of 0,5 mg/ml in acetonitrile.
5.18 Reference substances, according to Table 1.
5.18.1 Glyphosate, N-(phosphonomethyl)glycine, C H NO P, purity > 98 % mass fraction.
3 8 5
5.18.2 AMPA, aminomethylphosphonic acid, CH NO P, purity > 98 % mass fraction.
6 3
13 15
5.18.3 1,2- C , N-labelled glyphosate, surrogate standard, purity > 98 % mass fraction.
2
13 15
5.18.4 C, N-labelled AMPA, surrogate standard, purity > 98 % mass fraction.
5.19 Calibration solutions.
Individual stock solutions of glyphosate (5.18.1) and AMPA (5.18.2), 100 mg/l, prepared in ultra-pure
water (5.2). These solutions can be stored at 4 °C ± 3 °C for 1 month.
-13 15 13 15
Individual stock solutions of 1,2 C , N-labelled glyphosate (5.18.3) and C, N-labelled AMPA
2
(5.18.4) 100 mg/l, prepared in ultra-pure water (5.2). These solutions can be stored at 4 °C ± 3 °C for
1 month.
13 15 13 15
Multi-substance working solution of surrogates: 1,2- C , N-labelled glyphosate and C, N-labelled
2
AMPA, 20 µg/l, prepared in ultra-pure water (5.2). This solution can be stored at 4 °C ± 3 °C for 1 month.
NOTE Stock and calibration solutions can be stored longer, provided the adequate justifications are given
regarding stability.
5.20 Triethylammonium acetate buffer, 0,1 % triethylamine (5.11) solution adjusted to pH 9,5 with
glacial acetic acid (5.15) (mobile phase).
5.21 Sodium tetraborate, decahydrate, Na B O ·10H O.
2 4 7 2
5.22 Borate-Na buffer, 0,05 mol/l; pH = 9,2.
Dissolve 19 ± 0,1 g of sodium tetraborate (5.21), decahydrate in 1 l of water (5.1). This solution can be
stored for approximately 1 mo at 4 °C ± 3 °C.
2+ 2+
5.23 Mineral water, containing less than 3,2 mmol/l divalent cations (Mg and total Ca ), for preparing
matrix-matched calibration.
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ISO 16308:2014(E)
6 Apparatus
The material or any parts that are likely come into contact with the sample shall be free from any residue
that could cause unacceptable interference in the blanks.
Glass and plastics containers can be used for sampling and for all steps before derivatization. Glass vials
(6.10) and glass test tubes (6.11) shall be used after the derivatization step.
6.1 Usual laboratory glassware, or apparatus and in particular the following.
6.2 Glass, polyethene (PE) or polypropene (PP) bottles, minimum 50 ml, for sampling.
6.3 Glass, polyethene (PE) or polypropene (PP) syringe, 50 ml, for sample filtration.
6.4 Single use filter for syringe, diameter 25 mm, with a hydrophilic membrane, 0,45 µm, e.g. from
regenerated cellulose.
6.5 Glass, or single use PE or PP conical bottomed tubes, approximately 50 ml, for derivatization.
6.6 Micropipettes, adjustable from 100 µl to 500 µl.
6.7 pH-meter.
1)
®
6.8 SPE cartridges, e.g. Oasis HLB Waters, 60 mg, 3 ml, or equivalent.
−1
6.9 Centrifugation device, capable of 6 500 m .
6.10 Glass vials, suitable for autosampler, with caps and polytetrafluoroethene (PTFE) or silicon rubber
septa.
6.11 Glass test tube, 15 ml or smaller.
®1)
6.12 Reversed phase column, e.g. XBridge C18 column [Waters, 50 mm × 2,1 mm internal diameter
(i.d.) 2,5 µm, column] with guard column (Waters, 10 mm × 2,1 mm i.d. 2,5 µm).
A column whose stationary phase is alkali proof (pH 9 to pH 9,5) is highly recommended.
® 1)
NOTE A Gemini -NX column (Phenomenex) with similar dimensions is also suitable. Other columns can be
used, provided the separation conditions are adjusted.
6.13 High performance liquid chromatograph (HPLC), consisting of 6.13.1 to 6.13.5.
6.13.1 Injector, manual or automated.
6.13.2 Gradient pump.
6.13.3 Thermoregulation oven, for HPLC column.
6.13.4 Mass spectrometer, with triple quadrupole analyser and an electrospray source.
® ® ®
1) Oasis HLB , XBridge C18 and Gemini -NX are examples of suitable products available commercially. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO
of these products.
4 © ISO 2014 – All rights reserved
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ISO 16308:2014(E)
6.13.5 Data acquisition and processing system.
7 Sampling
If the sampling bottles are not for single use, rinse the sample bottles (6.2) with deionized water (5.1),
then clean with a laboratory detergent (5.4). Rinse with water (5.1), then with ultra-pure water (5.2),
and finally with 95 % ethanol (5.8).
Perform the sampling in accordance with ISO 5667-3 in these bottles (6.2) (approximately 50 ml).
For samples suspected of containing free chlorine, add about 2 mg of sodium thiosulfate (5.5) or any
other chlorine reducing agent per 100 ml of sample.
Store the samples according to ISO 5667-3 at 3 °C ± 2 °C and pre-treat within 24 h.
8 Procedure
8.1 Pre-treatment (Suspended particular matter)
Place filter (6.4) on syringe (6.3). Rinse with 5 ml of ultra-pure water (5.2).
Filter the sample (approximately 50 ml), discard the first 5 ml. Collect the filtrate in a conical bottomed
tube (6.5).
Store the filtered samples at 4 °C ± 3 °C for one week maximum before the derivatization step.
8.2 Chelate break and derivatization
8.2.1 General
Adapt the derivatization step to the kind analytical step which follows derivatization:
— using a mass spectrometer with sufficient detection capability, no pre-concentration is needed and
the derivatized sample is injected directly after derivatization according to 8.2.2;
— otherwise, a pre-concentration step can be useful to reach the intended limit of quantification (LOQ)
performance, and derivatization shall be performed according to 8.2.3.
8.2.2 Chelate break and derivatization for direct injection
Place, e.g. 5 ml of the sample (different sample amounts requires the use of the equivalent amounts of
the following reagents) in a 25 ml Erlenmeyer flask with glass stopper, add the magnetic stir bar.
-13 15
Add 50 µl of a 20 µg/l multi-substances aqueous solution (5.19) of 1,2 C , N-labelled glyphosate
2
13 15
(5.18.3) and C, N-labelled AMPA (5.18.4) in ultra-pure water (5.2) as derivatization surrogate.
Add 100 µl EDTA-Na (5.16) [0,1 mol/l solution in ultra-pure water (5.2)], shake, and allow to stand for
2
10 min in the closed flask.
−1
Add, e.g. 2 ml of the borate-Na buffer (5.22) 0,05 mol/l and stir for 30 min at 400 min to adjust to
pH 9,0 to pH 9,5.
−1
Add 400 µl of FMOC-Cl solution (5.17 for direct injection); stir for 4 h with 400 min and wait for approx.
12 h (overnight).
Neutralize the solution with 30 % hydrochloric acid (5.14).
Filter and use for analysis (8.4).
© ISO 2014 – All rights reserved 5
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ISO 16308:2014(E)
The final volume of the pre-treated sample shall be considered when calculating the final result.
NOTE Valve switching of the eluate flow behind the column before and after passing of the analytes into the
waste is a good choice to protect the ion source of the MS/MS detector from contamination.
8.2.3 Chelate break and derivatization prior to pre-concentration
Use, e.g. a micropipette (6.6), PP or PE pipette, place 5 ml sample in, for example, a conical bottomed PP
tube (6.5).
-13 15
Add 50 µl of a 20 µg/l multi-substances aqueous solution of 1,2 C , N-labelled glyphosate (5.18.3)
2
13 15
and C, N-labelled AMPA (5.18.4) in ultra-pure water (5.2) as derivatization surrogate.
Add 325 µl of borate-Na buffer (5.22) and shake.
Add 200 µl EDTA-Na (5.16) [0,1 mol/l solution in ultra-pure water (5.2)], shake and allow to stand for
2
5 min. Addition of EDTA allows glyphosate and AMPA to be released from the complexes with divalent
2+ 2+
cations (e.g. Ca , Mg ).
Add 4,5 ml acetonitrile (5.6). Shake well for 1 min to homogenize (there shall be no phase separation
during this step of the procedure).
Add 0,6 ml of FMOC-Cl solution (5.17) and shake again.
Allow to stand for 30 min in the dark at room temperature (20 °C to 25 °C) for reaction.
After derivatization, excess FMOC-Cl and reaction byproducts (e.g. FMOC-OH) are removed during pre-
concentration (8.3).
If the water is hard, c(CaCO ) > 3 mmol/l, an additional sample pre-treatment is recommended (see
3
Annex E).
8.3 Pre-concentration
8.3.1 Liquid/liquid extraction of analytes derivates
Concentrate the analytical sample to approximately 5 ml under a nitrogen flow (20 ml/min to 40 ml/min)
at room temperature to remove acetonitrile. The evaporation of the acetonitrile shall be completed
and should not exceed 60 min. A FMOC-Cl (reagent excess) and FMOC-OH (byproduct) precipitate may
crystallize on the tube wall.
Transfer the solution from the plastic tube in a glass test tube (6.11). Rinse the plastic tube with
approximately 500 µl of ultra-pure water (5.2) and transfer into the glass tube.
−1
Extract three times with 1,5 ml of ethyl acetate (5.9). If necessary, centrifuge for 20 s at 6 500 m after
each extraction to separate the two phases. Eliminate the supernatant with a Pasteur pipette (use a new
pipette for each extraction).
Then concentrate the aqueous phase under a nitrogen flow for 15 min to evaporate the remaining ethyl
acetate, shaking the tube every 5 min.
The final volume shall be approximately 6 ml.
The extract is then acidified to pH 3 with formic acid (5.13) to prevent any possible reaction with the
residual FMOC-Cl and to allow the further pre-concentration of the extracts with SPE (8.3.2). For this
purpose, add 100 µl of a 5 % volume fraction solution of formic acid (5.13) in ultra-pure water (5.2),
adjust the volume to 6 ml with ultra-pure water (5.2) if necessary, and then homogenize for 1 min.
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ISO 16308:2014(E)
8.3.2 Solid phase extraction
8.3.2.1 General requirements
Use SPE cartridges (6.8) containing, e.g. 60 mg of 60 μm polystyrene-divinylbenzene polymeric solid
phase. The recovery shall be checked on a regular basis.
1)
NOTE 1 Oasis HLB® (60 µm, 60 mg, 3 ml, Waters), or equivalent may be used.
NOTE 2 Online SPE purification and concentration is allowed.
8.3.2.2 Cartridges conditioning
Rinse with 2 × 500 µl of methanol (5.7) and with 2 × 500 µl aqueous solution of 0,1 % volume fraction
formic acid (5.13).
8.3.2.3 Purification
Pass 6 ml of acidified aqueous extract (pH 3) through the cartridge with an approximately 1 ml/min
flow rate.
Rinse the SPE tube with 1 ml of an aqueous 0,1 % volume fraction solution of formic acid (5.13), then
with 2 × 500 µl ultra-pure water (5.2).
Dry cartridge under vacuum or under a gentle stream of nitrogen during approximately 1 min to remove
the main part of the water.
Elute with 3 × 700 µl of methanol (5.7): 20 g/l ammonium hydroxide (5.12) in ultra-pure water (5.2)
(70:30 volume fraction).
Collect the eluate in a glass test tube (6.11) and reduce under a nitrogen flow until the methanol is
removed. Final volume shall be approximately 0,7 ml.
NOTE Residues of methanol can cause degradation in chromatographic conditions, resulting in split peaks.
Adjust to 1 ml with ultra-pure water (5.2). The purified extract can be stored for 48 h at 4 °C ± 3 °C
maximum prior to analysis due to the stability of the FMOC derivatives in water.
8.4 Chromatographic determination
8.4.1 General requirements
Use equipment in accordance with the instructions provided by the manufacturer.
Check the required system stability regularly. Adjust and optimize instrument parameter settings in
accordance with the manufacturer’s instructions.
Due to the use of a buffered mobile phase, it is recommended that the analytical column and the
chromatographic system be rinsed according to the manufacturer’s instructions on a regular basis.
8.4.2 Chromatographic conditions
Separate the glyphosate and AMPA derivatives by HPLC using a reversed phase column and appropriate
chromatographic conditions. The pH of the mobile phase shall be alkaline (pH 9 to pH 9,5) in order
to have better chromatographic performances (peak symmetry close to 1 and narrow peaks), which
implies the use of a particular column (hybrid stationary phase).
Examples of appropriate chromatographic conditions are shown in Annexes B to D.
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ISO 16308:2014(E)
8.5 Identification and confirmation of the analytes
Identification of target compounds is achieved by comparing their retention time to the retention time
of the referenced substance, and their single reaction monitoring (SRM) negative ionization mode mass
spectra with the reference substances. Table 2 gives the characteristic transitions used.
Table 2 — ESI–MS/MS detection
Analytes Quantifying transition Qualifying transition
Glyphosate-FMOC 390 > 168 390 > 150
AMPA-FMOC 332 > 110 332 > 136
-13 15
1,2 C , N-labelled glyphosate–FMOC 393 > 171 393 > 153
2
13 15
C, N-labelled AMPA–FMOC 334 > 112 334 > 138
The ratios between the quantifying and the qualifying transitions depend on the SRM conditions (i.e.
collision energy and gas pressure in the collision cell). These ratios shall be determined using reference
substances and checked for the samples to lie within ±20 % of the observed value for the reference
substance, using the same equipment optimization.
Examples of chromatograms are given in Annex C.
8.6 Blank control monitoring
Blank controls are obtained with the application of procedure to a mineral water (5.23) spiked with
-13 15 13 15
1,2 C , N-labelled glyphosate (5.18.3) and C, N-labelled AMPA (5.18.4) only. Blank controls and
2
samples shall be treated and analysed simultaneously. The residual content of both glyphosate and
AMPA should be lower than 1/3 of the limits of quantification (LOQs).
9
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 16308:2018
01-junij-2018
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHJOLIRVDWDLQ$03$0HWRGDWHNRþLQVNH
NURPDWRJUDILMHYLVRNHORþOMLYRVWL +3/& VVNORSOMHQRPDVQRVSHNWURPHWULMR
Water quality - Determination of glyphosate and AMPA - Method using high performance
liquid chromatography (HPLC) with tandem mass spectrometric detection
Qualité de l'eau - Détermination du glyphosate et de l'AMPA - Méthode par
chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) avec détection par
spectrométrie de masse en tandem
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 16308:2014
ICS:
13.060.50 3UHLVNDYDYRGHQDNHPLþQH Examination of water for
VQRYL chemical substances
71.040.50 Fizikalnokemijske analitske Physicochemical methods of
metode analysis
SIST ISO 16308:2018 en,fr
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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SIST ISO 16308:2018
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16308
First edition
2014-09-15
Water quality — Determination of
glyphosate and AMPA — Method
using high performance liquid
chromatography (HPLC) with tandem
mass spectrometric detection
Qualité de l’eau — Détermination du glyphosate et de l’AMPA —
Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance
(CLHP) avec détection par spectrométrie de masse en tandem
Reference number
ISO 16308:2014(E)
©
ISO 2014
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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
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Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
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Web www.iso.org
Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Principle . 1
4 Interferences . 2
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling . 5
8 Procedure. 5
8.1 Pre-treatment (Suspended particular matter) . 5
8.2 Chelate break and derivatization . 5
8.3 Pre-concentration . 6
8.4 Chromatographic determination. 7
8.5 Identification and confirmation of the analytes . 8
8.6 Blank control monitoring. 8
9 Calibration . 8
9.1 Concentration ranges . 8
9.2 Matrix-matched calibration . 8
9.3 Internal standard calibration . 9
10 Expression of results .10
11 Test report .10
Annex A (informative) Performance data .11
Annex B (informative) Examples of chromatographic conditions .14
Annex C (informative) Examples of chromatograms .15
Annex D (informative) Analysis of gluphosinate .16
Annex E (informative) Pre-treatment of hard water samples .20
Bibliography .22
© ISO 2014 – All rights reserved iii
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SIST ISO 16308:2018
ISO 16308:2014(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 2, Physical,
chemical and biochemical methods.
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SIST ISO 16308:2018
ISO 16308:2014(E)
Introduction
Glyphosate [N-(phosphonomethyl)glycine] is a non-selective broad-spectrum herbicide. The efficiency
of this compound makes it a top selling and one of the most widely used herbicides in the world since
it entered the market in 1974. Together with its main degradation product, aminomethylphosphonic
acid (AMPA), glyphosate is one of the most detected substances in water bodies in many developed
countries. Note also that AMPA can be released during sewage treatment, e.g. due to breakdown of
detergent formulations for textiles.
Glyphosate and AMPA belong to the aminophosphonate family and have specific physico-chemical
properties that require the development of complex analytical methods for analysis and detection. The
difficulty in analysis is mainly linked to the high solubility of glyphosate and AMPA and their chelating
nature. To solve these problems, their pre-column derivatization with 9-fluorenylmethylchloroformate
(FMOC-Cl) to form less polar derivatives allows a better separation using liquid chromatography.
Gluphosinate, another aminophosphonate, is less commonly subject to regulation and can be determined
simultaneously, provided it can be demonstrated that there is no interference with the sample under
analysis.
There is currently an International Standard for the determination by liquid chromatography and
fluorometric detection; however, the determination by HPLC–ESI–MS/MS can be much more specific
(unambiguous identification) and more sensitive (limits of quantification of approximately 30 ng/l for
both glyphosate and AMPA). This International Standard is based on this analytical technique and is
intended for laboratories involved in the regulatory control of the aquatic environment. Many such
laboratories are now equipped with this kind of apparatus.
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SIST ISO 16308:2018
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SIST ISO 16308:2018
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16308:2014(E)
Water quality — Determination of glyphosate and AMPA
— Method using high performance liquid chromatography
(HPLC) with tandem mass spectrometric detection
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if
any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International
Standard be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of dissolved fraction of glyphosate
and its major metabolite, aminomethylphosphonic acid (AMPA), in drinking water, ground water, and
surface water at concentrations of 0,03 µg/l to 1,5 µg/l. It does not apply to marine or salty water. This
method can be applicable to other types of waters, provided the method is validated for each case.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 5667-3, Water quality — Sampling — Part 3: Preservation and handling of water samples
ISO 8466-1, Water quality — Calibration and evaluation of analytical methods and estimation of performance
characteristics — Part 1: Statistical evaluation of the linear calibration function
3 Principle
Glyphosate and AMPA (dissolved fraction after filtration) are derivatized using
9-fluorenylmethylchloroformate (FMOC-Cl) (5.17) to lower their polarity and increase the retention
of compound in a separation on a reverse phase column (e.g. C18) as well as to improve the mass
spectrometric detection. If the mass spectrometer has sufficient detection capability, it is possible to
omit the solid phase extraction and to analyse the analytes by direct injection (see 8.2.1).
The derivatized sample is purified by liquid/liquid extraction and then concentrated by solid phase
extraction (SPE).
The analysis is performed by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass
spectrometry via an electrospray source (HPLC–ESI–MS/MS), using matrix-matched calibration.
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SIST ISO 16308:2018
ISO 16308:2014(E)
Table 1 — Substances addressed
Molecular mass
a
Name Formula CAS-RN
g/mol
Glyphosate
C H NO P 169,1 1071–83–6
3 8 5
N-(phosphonomethyl)glycine
AMPA
CH NO P 111,0 1066–51–9
6 3
Aminomethylphosphonic acid
a
CAS-RN Chemical Abstracts Service Registry Number
NOTE Gluphosinate, belonging to the aminophosphonate family, can be determined simultaneously, provided
it can be demonstrated that there is no interference with the sample (matrix) subject to analysis.
4 Interferences
This method is validated for hard water containing up to 3,2 mmol/l of the sum of calcium and
magnesium. For waters with a higher calcium and magnesium content, it may be necessary to increase
the concentration of EDTA-Na (5.16) at the derivatization step (see Annex D).
2
It can prove necessary to include the acidification step described in Annex D even for some water types
below 3,2 mmol/l of the sum of calcium and magnesium. The laboratory shall check the necessity of this
procedure for its routine samples.
The presence of free chlorine, e.g. in treated waters, can cause losses of glyphosate by oxidation.
Consequently sodium thiosulfate shall be used (see Clause 7).
5 Reagents
Unless otherwise stated, all reagents and solvents shall be of sufficient purity, e.g. “for trace analysis”.
5.1 Deionized water.
5.2 Ultra-pure water, complying with grade 1 of ISO 3696.
5.3 Nitrogen, N , purity ≥ 99,996 % volume fraction.
2
5.4 Laboratory detergent, alkaline.
5.5 Sodium thiosulfate, Na S O .
2 2 3
5.6 Acetonitrile, C H N, HPLC grade.
2 3
5.7 Methanol, CH O, HPLC grade.
4
5.8 Ethanol, C H O, 95 %, HPLC grade mass fraction.
2 6
5.9 Ethyl acetate, C H O , HPLC grade.
4 8 2
5.10 Ammonium acetate, C H O N.
2 7 2
5.11 Triethylamine, C H N.
6 15
5.12 Ammonium hydroxide, NH OH 28 % mass fraction.
4 ,
2 © ISO 2014 – All rights reserved
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SIST ISO 16308:2018
ISO 16308:2014(E)
5.13 Formic acid, CH O .
2 2
5.14 Hydrochloric acid, HCl, 300 g/l.
5.15 Glacial acetic acid, C H O .
2 4 2
5.16 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), disodium salt dihydrate, C H N O Na ·2H O, with a
10 14 2 8 2 2
minimum purity of 99 % mass fraction.
5.17 9-Fluorenylmethyl chloroformate,(FMOC-Cl), C H ClO , with a minimum purity of 97 % mass
15 11 2
fraction.
FMOC-Cl is used to prepare the derivatization reagent, FMOC-Cl solution, 50 mg/ml, in acetonitrile
(5.6). This solution can be stored at −18 °C ± 3 °C for 6 months.
For direct injection (8.2.1), use a FMOC-Cl solution of 0,5 mg/ml in acetonitrile.
5.18 Reference substances, according to Table 1.
5.18.1 Glyphosate, N-(phosphonomethyl)glycine, C H NO P, purity > 98 % mass fraction.
3 8 5
5.18.2 AMPA, aminomethylphosphonic acid, CH NO P, purity > 98 % mass fraction.
6 3
13 15
5.18.3 1,2- C , N-labelled glyphosate, surrogate standard, purity > 98 % mass fraction.
2
13 15
5.18.4 C, N-labelled AMPA, surrogate standard, purity > 98 % mass fraction.
5.19 Calibration solutions.
Individual stock solutions of glyphosate (5.18.1) and AMPA (5.18.2), 100 mg/l, prepared in ultra-pure
water (5.2). These solutions can be stored at 4 °C ± 3 °C for 1 month.
-13 15 13 15
Individual stock solutions of 1,2 C , N-labelled glyphosate (5.18.3) and C, N-labelled AMPA
2
(5.18.4) 100 mg/l, prepared in ultra-pure water (5.2). These solutions can be stored at 4 °C ± 3 °C for
1 month.
13 15 13 15
Multi-substance working solution of surrogates: 1,2- C , N-labelled glyphosate and C, N-labelled
2
AMPA, 20 µg/l, prepared in ultra-pure water (5.2). This solution can be stored at 4 °C ± 3 °C for 1 month.
NOTE Stock and calibration solutions can be stored longer, provided the adequate justifications are given
regarding stability.
5.20 Triethylammonium acetate buffer, 0,1 % triethylamine (5.11) solution adjusted to pH 9,5 with
glacial acetic acid (5.15) (mobile phase).
5.21 Sodium tetraborate, decahydrate, Na B O ·10H O.
2 4 7 2
5.22 Borate-Na buffer, 0,05 mol/l; pH = 9,2.
Dissolve 19 ± 0,1 g of sodium tetraborate (5.21), decahydrate in 1 l of water (5.1). This solution can be
stored for approximately 1 mo at 4 °C ± 3 °C.
2+ 2+
5.23 Mineral water, containing less than 3,2 mmol/l divalent cations (Mg and total Ca ), for preparing
matrix-matched calibration.
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ISO 16308:2014(E)
6 Apparatus
The material or any parts that are likely come into contact with the sample shall be free from any residue
that could cause unacceptable interference in the blanks.
Glass and plastics containers can be used for sampling and for all steps before derivatization. Glass vials
(6.10) and glass test tubes (6.11) shall be used after the derivatization step.
6.1 Usual laboratory glassware, or apparatus and in particular the following.
6.2 Glass, polyethene (PE) or polypropene (PP) bottles, minimum 50 ml, for sampling.
6.3 Glass, polyethene (PE) or polypropene (PP) syringe, 50 ml, for sample filtration.
6.4 Single use filter for syringe, diameter 25 mm, with a hydrophilic membrane, 0,45 µm, e.g. from
regenerated cellulose.
6.5 Glass, or single use PE or PP conical bottomed tubes, approximately 50 ml, for derivatization.
6.6 Micropipettes, adjustable from 100 µl to 500 µl.
6.7 pH-meter.
1)
®
6.8 SPE cartridges, e.g. Oasis HLB Waters, 60 mg, 3 ml, or equivalent.
−1
6.9 Centrifugation device, capable of 6 500 m .
6.10 Glass vials, suitable for autosampler, with caps and polytetrafluoroethene (PTFE) or silicon rubber
septa.
6.11 Glass test tube, 15 ml or smaller.
®1)
6.12 Reversed phase column, e.g. XBridge C18 column [Waters, 50 mm × 2,1 mm internal diameter
(i.d.) 2,5 µm, column] with guard column (Waters, 10 mm × 2,1 mm i.d. 2,5 µm).
A column whose stationary phase is alkali proof (pH 9 to pH 9,5) is highly recommended.
® 1)
NOTE A Gemini -NX column (Phenomenex) with similar dimensions is also suitable. Other columns can be
used, provided the separation conditions are adjusted.
6.13 High performance liquid chromatograph (HPLC), consisting of 6.13.1 to 6.13.5.
6.13.1 Injector, manual or automated.
6.13.2 Gradient pump.
6.13.3 Thermoregulation oven, for HPLC column.
6.13.4 Mass spectrometer, with triple quadrupole analyser and an electrospray source.
® ® ®
1) Oasis HLB , XBridge C18 and Gemini -NX are examples of suitable products available commercially. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO
of these products.
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SIST ISO 16308:2018
ISO 16308:2014(E)
6.13.5 Data acquisition and processing system.
7 Sampling
If the sampling bottles are not for single use, rinse the sample bottles (6.2) with deionized water (5.1),
then clean with a laboratory detergent (5.4). Rinse with water (5.1), then with ultra-pure water (5.2),
and finally with 95 % ethanol (5.8).
Perform the sampling in accordance with ISO 5667-3 in these bottles (6.2) (approximately 50 ml).
For samples suspected of containing free chlorine, add about 2 mg of sodium thiosulfate (5.5) or any
other chlorine reducing agent per 100 ml of sample.
Store the samples according to ISO 5667-3 at 3 °C ± 2 °C and pre-treat within 24 h.
8 Procedure
8.1 Pre-treatment (Suspended particular matter)
Place filter (6.4) on syringe (6.3). Rinse with 5 ml of ultra-pure water (5.2).
Filter the sample (approximately 50 ml), discard the first 5 ml. Collect the filtrate in a conical bottomed
tube (6.5).
Store the filtered samples at 4 °C ± 3 °C for one week maximum before the derivatization step.
8.2 Chelate break and derivatization
8.2.1 General
Adapt the derivatization step to the kind analytical step which follows derivatization:
— using a mass spectrometer with sufficient detection capability, no pre-concentration is needed and
the derivatized sample is injected directly after derivatization according to 8.2.2;
— otherwise, a pre-concentration step can be useful to reach the intended limit of quantification (LOQ)
performance, and derivatization shall be performed according to 8.2.3.
8.2.2 Chelate break and derivatization for direct injection
Place, e.g. 5 ml of the sample (different sample amounts requires the use of the equivalent amounts of
the following reagents) in a 25 ml Erlenmeyer flask with glass stopper, add the magnetic stir bar.
-13 15
Add 50 µl of a 20 µg/l multi-substances aqueous solution (5.19) of 1,2 C , N-labelled glyphosate
2
13 15
(5.18.3) and C, N-labelled AMPA (5.18.4) in ultra-pure water (5.2) as derivatization surrogate.
Add 100 µl EDTA-Na (5.16) [0,1 mol/l solution in ultra-pure water (5.2)], shake, and allow to stand for
2
10 min in the closed flask.
−1
Add, e.g. 2 ml of the borate-Na buffer (5.22) 0,05 mol/l and stir for 30 min at 400 min to adjust to
pH 9,0 to pH 9,5.
−1
Add 400 µl of FMOC-Cl solution (5.17 for direct injection); stir for 4 h with 400 min and wait for approx.
12 h (overnight).
Neutralize the solution with 30 % hydrochloric acid (5.14).
Filter and use for analysis (8.4).
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SIST ISO 16308:2018
ISO 16308:2014(E)
The final volume of the pre-treated sample shall be considered when calculating the final result.
NOTE Valve switching of the eluate flow behind the column before and after passing of the analytes into the
waste is a good choice to protect the ion source of the MS/MS detector from contamination.
8.2.3 Chelate break and derivatization prior to pre-concentration
Use, e.g. a micropipette (6.6), PP or PE pipette, place 5 ml sample in, for example, a conical bottomed PP
tube (6.5).
-13 15
Add 50 µl of a 20 µg/l multi-substances aqueous solution of 1,2 C , N-labelled glyphosate (5.18.3)
2
13 15
and C, N-labelled AMPA (5.18.4) in ultra-pure water (5.2) as derivatization surrogate.
Add 325 µl of borate-Na buffer (5.22) and shake.
Add 200 µl EDTA-Na (5.16) [0,1 mol/l solution in ultra-pure water (5.2)], shake and allow to stand for
2
5 min. Addition of EDTA allows glyphosate and AMPA to be released from the complexes with divalent
2+ 2+
cations (e.g. Ca , Mg ).
Add 4,5 ml acetonitrile (5.6). Shake well for 1 min to homogenize (there shall be no phase separation
during this step of the procedure).
Add 0,6 ml of FMOC-Cl solution (5.17) and shake again.
Allow to stand for 30 min in the dark at room temperature (20 °C to 25 °C) for reaction.
After derivatization, excess FMOC-Cl and reaction byproducts (e.g. FMOC-OH) are removed during pre-
concentration (8.3).
If the water is hard, c(CaCO ) > 3 mmol/l, an additional sample pre-treatment is recommended (see
3
Annex E).
8.3 Pre-concentration
8.3.1 Liquid/liquid extraction of analytes derivates
Concentrate the analytical sample to approximately 5 ml under a nitrogen flow (20 ml/min to 40 ml/min)
at room temperature to remove acetonitrile. The evaporation of the acetonitrile shall be completed
and should not exceed 60 min. A FMOC-Cl (reagent excess) and FMOC-OH (byproduct) precipitate may
crystallize on the tube wall.
Transfer the solution from the plastic tube in a glass test tube (6.11). Rinse the plastic tube with
approximately 500 µl of ultra-pure water (5.2) and transfer into the glass tube.
−1
Extract three times with 1,5 ml of ethyl acetate (5.9). If necessary, centrifuge for 20 s at 6 500 m after
each extraction to separate the two phases. Eliminate the supernatant with a Pasteur pipette (use a new
pipette for each extraction).
Then concentrate the aqueous phase under a nitrogen flow for 15 min to evaporate the remaining ethyl
acetate, shaking the tube every 5 min.
The final volume shall be approximately 6 ml.
The extract is then acidified to pH 3 with formic acid (5.13) to prevent any possible reaction with the
residual FMOC-Cl and to allow the further pre-concentration of the extracts with SPE (8.3.2). For this
purpose, add 100 µl of a 5 % volume fraction solution of formic acid (5.13) in ultra-pure water (5.2),
adjust the volume to 6 ml with ultra-pure water (5.2) if necessary, and then homogenize for 1 min.
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SIST ISO 16308:2018
ISO 16308:2014(E)
8.3.2 Solid phase extraction
8.3.2.1 General requirements
Use SPE cartridges (6.8) containing, e.g. 60 mg of 60 μm polystyrene-divinylbenzene polymeric solid
phase. The recovery shall be checked on a regular basis.
1)
NOTE 1 Oasis HLB® (60 µm, 60 mg, 3 ml, Waters), or equivalent may be used.
NOTE 2 Online SPE purification and concentration is allowed.
8.3.2.2 Cartridges conditioning
Rinse with 2 × 500 µl of methanol (5.7) and with 2 × 500 µl aqueous solution of 0,1 % volume fraction
formic acid (5.13).
8.3.2.3 Purification
Pass 6 ml of acidified aqueous extract (pH 3) through the cartridge with an approximately 1 ml/min
flow rate.
Rinse the SPE tube with 1 ml of an aqueous 0,1 % volume fraction solution of formic acid (5.13), then
with 2 × 500 µl ultra-pure water (5.2).
Dry cartridge under vacuum or under a gentle stream of nitrogen during approximately 1 min to remove
the main part of the water.
Elute with 3 × 700 µl of methanol (5.7): 20 g/l ammonium hydroxide (5.12) in ultra-pure water (5.2)
(70:30 volume fraction).
Collect the eluate in a glass test tube (6.11) and reduce under a nitrogen flow until the methanol is
removed. Final volume shall be approximately 0,7 ml.
NOTE Residues of methanol can cause degradation in chromatographic conditions, resulting in split peaks.
Adjust to 1 ml with ultra-pure water (5.2). The purified extract can be stored for 48 h at 4 °C ± 3 °C
maximum prior to analysis due to the stability of the FMOC derivatives in water.
8.4 Chromatographic determination
8.4.1 General requirements
Use equipment in accordance with the instructions provided by the manufacturer.
Check the required system stability regularly. Adjust and optimize instrument parameter settings in
accordance with the manufacturer’s instructions.
Due to the use of a buffered mobile phase, it is recommended that the analytical column and the
chromatographic system be rinsed according to the manufacturer’s instructions on a regular basis.
8.4.2 Chromatographic conditions
Separate the glyphosate and AMPA derivatives by HPLC using a reversed phase column and appropriate
chromatographic conditions. The pH of the mobile phase shall be alkaline (pH 9 to pH 9,5) in order
to have better chromatographic performances (peak symmetry close to 1 and narrow peaks), which
implies the use of a particular column (hybrid stationary phase).
Examples of appropriate chromatographic conditions are shown in Annexes B to D.
© ISO 2014 – All rights reserved 7
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SIST ISO 16308:2018
ISO 16308:2014(E)
8.5 Identification and conf
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16308
Première édition
2014-09-15
Qualité de l’eau — Détermination du
glyphosate et de l’AMPA — Méthode
par chromatographie en phase liquide
à haute performance (CLHP) avec
détection par spectrométrie de masse
en tandem
Water quality — Determination of glyphosate and AMPA — Method
using high performance liquid chromatography (HPLC) with tandem
mass spectrometric detection
Numéro de référence
ISO 16308:2014(F)
©
ISO 2014
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ISO 16308:2014(F)
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
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Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO 16308:2014(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Principe . 1
4 Interférences . 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 4
7 Échantillonnage . 5
8 Mode opératoire. 5
8.1 Prétraitement (matières en suspension) . 5
8.2 Séparation et dérivation du chélate . 5
8.3 Préconcentration . 6
8.4 Dosage chromatographique . 7
8.5 Identification et confirmation des analytes . 8
8.6 Contrôle des témoins à blanc . . 8
9 Étalonnage . 8
9.1 Gammes de concentration . 8
9.2 Étalonnage en matrice . 9
9.3 Étalonnage avec étalon interne.10
10 Expression des résultats.11
11 Rapport d’essai .11
Annexe A (informative) Données de performance .12
Annexe B (informative) Exemples de conditions chromatographiques .15
Annexe C (informative) Exemples de chromatogrammes .16
Annexe D (informative) Analyse du glufosinate.17
Annexe E (informative) Prétraitement d’échantillons d’eau dure .21
Bibliographie .23
© ISO 2014 – Tous droits réservés iii
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ISO 16308:2014(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de
la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant
les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations
supplémentaires.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 2, Méthodes physiques, chimiques et biochimiques.
iv © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO 16308:2014(F)
Introduction
Le glyphosate [N-(phosphonométhyl)glycine] est un herbicide à large spectre non sélectif. L’efficacité de
ce composé en fait l’herbicide le plus vendu et le plus utilisé au monde depuis son arrivée sur le marché
en 1974. Associé à son principal produit de dégradation, l’acide aminométhylphosphonique (AMPA), le
glyphosate est l’une des substances les plus fréquemment détectées dans les masses d’eau de la plupart
des pays développés. À noter toutefois que l’AMPA peut également provenir des rejets liées au traitement
des eaux usées (par exemple, en raison de la dégradation des formulations détergentes pour textiles).
Le glyphosate et l’AMPA appartiennent à la famille des aminophosphonates et possèdent des propriétés
physico-chimiques nécessitant la mise en œuvre de méthodes d’analyse complexes pour l’analyse et
la détection. La difficulté d’analyse est principalement liée à la haute solubilité du glyphosate et de
l’AMPA ainsi qu’à leur fonction chélatante. Pour résoudre ces problèmes, leur dérivation pré-colonne est
effectuée avec du 9-fluorénylméthylchloroformiate (FMOC-Cl) pour former des dérivés moins polaires,
ce qui permet une meilleure séparation par chromatographie en phase liquide.
Le glufosinate, un autre membre de la famille des aminophosphonates, est moins concerné par les
réglementations et peut être dosé simultanément, à condition de prouver l’absence d’interférence avec
l’échantillon soumis à l’analyse.
Il existe actuellement une Norme internationale dédiée au dosage par chromatographie en phase
liquide et par détection fluorimétrique; néanmoins, le dosage par CLHP-ESI-SM/SM peut être bien plus
spécifique (identification univoque) et plus sensible (limites de quantification d’environ 30 ng/l pour
le glyphosate et l’AMPA). La présente Norme internationale repose sur cette technique d’analyse et
s’adresse aux laboratoires impliqués dans le contrôle réglementaire du milieu aquatique. La majorité de
ces laboratoires est désormais équipée de ce type d’appareillage.
© ISO 2014 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 16308:2014(F)
Qualité de l’eau — Détermination du glyphosate et
de l’AMPA — Méthode par chromatographie en phase
liquide à haute performance (CLHP) avec détection par
spectrométrie de masse en tandem
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse
bien les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de
traiter de tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe
à l’utilisateur de la présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et
de sécurité et de s’assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon la présente Norme internationale
soient effectués par un personnel qualifié de manière adéquate.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la fraction dissoute de
glyphosate et de son principal métabolite, l’acide aminométhylphosphonique (AMPA) dans l’eau potable,
l’eau souterraine et l’eau de surface à des concentrations de 0,03 µg/l à 1,5 µg/l. Elle ne s’applique pas à
l’eau de mer ou à l’eau salée. Cette méthode peut s’appliquer à d’autres types d’eaux à condition qu’elle
soit validée pour chaque cas.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 5667-3, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 3: Conservation et manipulation des échantillons
d’eau
ISO 8466-1, Qualité de l’eau — Étalonnage et évaluation des méthodes d’analyse et estimation des caractères
de performance — Partie 1: Évaluation statistique de la fonction linéaire d’étalonnage
3 Principe
Le glyphosate et l’AMPA (fraction dissoute après filtration) sont dérivés en utilisant du
9-fluorénylméthylchloroformiate (FMOC-Cl) (5.17) pour réduire leur polarité et augmenter la rétention
des composés lors de leur séparation sur une colonne de chromatographie en phase inverse (par exemple,
C18) ainsi que pour l’amélioration de la détection par spectrométrie de masse. Si le spectromètre de
masse a une capacité de détection suffisante, il est possible d’omettre l’extraction en phase solide et
d’analyser des analytes par injection directe (voir 8.2.1).
L’échantillon dérivé est purifié par extraction liquide-liquide puis concentré par extraction en phase
solide (SPE).
L’analyse est effectuée en réalisant une chromatographie en phase liquide à haute performance couplée
à une spectrométrie de masse en tandem via une source électrospray (CLHP-ESI-SM/SM), en utilisant
l’étalonnage en matrice.
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ISO 16308:2014(F)
Tableau 1 — Substances concernées
Masse moléculaire
Nom Formule N° CAS
g/mol
Glyphosate
C H NO P 169,1 1071–83–6
3 8 5
N-(phosphonométhyl)glycine
AMPA
CH NO P 111,0 1066–51–9
6 3
Acide aminométhylphosphonique
a
CAS-RN Chemical Abstracts Service Registry Number
NOTE Le glufosinate, qui appartient à la famille des aminophosphonates, peut être dosé simultanément, à
condition de prouver l’absence d’interférence avec l’échantillon (matrice) soumis à l’analyse.
4 Interférences
Cette méthode est validée pour l’eau dure contenant jusqu’à 3,2 mmol/l de la somme du calcium et
du magnésium. Pour les eaux ayant une teneur plus élevée en calcium et en magnésium, il peut être
nécessaire d’augmenter la concentration en EDTA disodique (5.16) lors de l’étape de dérivation (voir
l’Annexe D).
Il peut s’avérer nécessaire d’inclure l’étape d’acidification décrite dans l’Annexe D même pour certains
types d’eaux inférieurs à 3,2 mmol/l de la somme du calcium et du magnésium. Le laboratoire doit
vérifier la nécessité de ce mode opératoire pour ses échantillons de routine.
La présence de chlore libre, par exemple dans les eaux traitées, peut provoquer des pertes de glyphosate
par oxydation. Par conséquent, du thiosulfate de sodium doit être utilisé (voir l’Article 7).
5 Réactifs
Sauf indication contraire, tous les réactifs et solvants doivent être de pureté suffisante, par exemple,
«pour l’analyse des traces».
5.1 Eau déionisée.
5.2 Eau ultra-pure, conforme au grade 1 de l’ISO 3696.
5.3 Azote, N , pureté ≥99,996 % en fraction volumique.
2
5.4 Détergent de laboratoire, alcalin.
5.5 Thiosulfate de sodium, Na S O .
2 2 3
5.6 Acétonitrile, C H N, qualité CLHP.
2 3
5.7 Méthanol, CH O, qualité CLHP.
4
5.8 Éthanol, C H O, 95 % en fraction massique, qualité CLHP.
2 6
5.9 Acétate d’éthyle, C H O , qualité CLHP.
4 8 2
5.10 Acétate d’ammonium, C H O N.
2 7 2
5.11 Triéthylamine, C H N.
6 15
2 © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO 16308:2014(F)
5.12 Hydroxyde d’ammonium, NH OH 28 % en fraction massique.
4 ,
5.13 Acide formique, CH O .
2 2
5.14 Acide chlorhydrique, HCl, 300 g/l.
5.15 Acide acétique glacial, C H O .
2 4 2
5.16 Acide éthylènediaminetétracétique (EDTA), sel disodique dihydraté, C H N O Na ·2H O,
10 14 2 8 2 2
pureté minimale de 99 % en fraction massique.
5.17 9-fluorénylméthylchloroformiate (FMOC-Cl), C H ClO , pureté minimale de 97 % en fraction
15 11 2
massique.
Le FMOC-Cl sert à préparer le réactif de dérivation, la solution FMOC-Cl, 50 mg/ml, dans de l’acétonitrile
(5.6). Cette solution peut être conservée pendant 6 mois à -18 ℃ ± 3 °C.
Pour l’injection directe (8.2.1), utiliser une solution FMOC-Cl de 0,5 mg/ml dans de l’acétonitrile.
5.18 Substances de référence, selon le Tableau 1.
5.18.1 Glyphosate, N-(phosphonométhyl)glycine, C H NO P, pureté >98 % en fraction massique.
3 8 5
5.18.2 AMPA, acide aminométhylphosphonique, CH NO P, pureté >98 % en fraction massique.
6 3
13 15
5.18.3 Étalon d’extraction de glyphosate marqué au 1,2- C , N, pureté >98 % en fraction massique.
2
13 15
5.18.4 Étalon d’extraction d’AMPA marqué au C, N, pureté >98 % en fraction massique.
5.19 Solutions d’étalonnage
Solutions mères individuelles de glyphosate (5.18.1) et d’AMPA (5.18.2), 100 mg/l, préparées dans de
l’eau ultra-pure (5.2). Ces solutions peuvent être conservées pendant 1 mois à 4 °C ± 3 °C.
13 15
Solutions mères individuelles de glyphosate marqué au 1,2- C , N (5.18.3) et d’AMPA marqué au
2
13 15
C, N (5.18.4), 100 mg/l, préparées dans de l’eau ultra-pure (5.2). Ces solutions peuvent être conservées
pendant 1 mois à 4 °C ± 3 °C.
13 15
Solution de travail multisubstances constituée d’étalons d’extraction: glyphosate marqué au 1,2- C , N
2
13 15
et AMPA marqué au C, N, 20 µg/l, préparées dans de l’eau ultra-pure (5.2). Cette solution peut être
conservée pendant 1 mois à 4 °C ± 3 °C.
NOTE Les solutions mères et les solutions d’étalonnage peuvent être conservées plus longtemps à condition
de fournir les justifications adéquates concernant la stabilité.
5.20 Tampon acétate de triéthylammonium, solution de triéthylamine à 0,1 % (5.11) ajustée à pH 9,5
avec de l’acide acétique glacial (5.15) (phase mobile).
5.21 Tétraborate de sodium, décahydraté, Na B O ·10H O.
2 4 7 2
5.22 Tampon borate de sodium, 0,05 mol/l; pH = 9,2.
Dissoudre 19 ± 0,1 g de tétraborate de sodium (5.21), décahydraté, dans 1 l d’eau (5.1). Cette solution
peut être conservée pendant environ 1 mois à 4 °C ± 3 °C.
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ISO 16308:2014(F)
2+ 2+
5.23 Eau minérale, contenant moins de 3,2 mmol/l de cations divalents (Mg et Ca total), pour
préparer l’étalonnage en matrice.
6 Appareillage
Le matériel ou l’une quelconque de ses parties, susceptible d’entrer en contact avec l’échantillon, doit
être exempt(e) de tout résidu susceptible de provoquer des interférences inacceptable dans les blancs.
Des récipients en verre et en plastique peuvent être utilisés pour l’échantillonnage et pour toutes les
étapes qui précèdent la dérivation. Des flacons en verre (6.10) et des tubes à essai en verre (6.11) doivent
être utilisés après l’étape de dérivation.
6.1 Verrerie courante de laboratoire, ou matériel courant de laboratoire, et en particulier ce qui suit.
6.2 Flacons en verre, en polyéthylène (PE) ou en polypropylène (PP), minimum 50 ml, pour
l’échantillonnage.
6.3 Seringue en verre, en polyéthylène (PE) ou en polypropylène (PP), minimum 50 ml, pour la
filtration des échantillons.
6.4 Filtre pour seringue à usage unique, 25 mm de diamètre, avec membrane hydrophile, 0,45 µm,
par exemple de cellulose régénérée,.
6.5 Tubes à fond conique en verre ou en PE ou PP à usage unique, environ 50 ml, pour la dérivation.
6.6 Micropipettes, réglables entre 100 µl et 500 µl.
6.7 pH-mètre.
1)
6.8 Cartouches SPE, par exemple Oasis HLB® Waters 60 mg, 3 ml, ou équivalentes.
6.9 Dispositif de centrifugation, permettant d’obtenir une accélération de 6 500 g.
6.10 Fioles en verre, adaptées à l’échantillonneur automatique, équipées de bouchons et
polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou de septums en caoutchouc de silicone.
6.11 Tube à essai en verre, 15 ml ou moins.
1)
6.12 Colonne en phase inverse, par exemple colonne XBridge C ® [Waters, 50 mm × 2,1 mm,
18
diamètre intérieur (D.I.) 2,5 µm) avec précolonne (Waters, 10 mm × 2,1 mm, D.I. 2,5 µm).
Il est hautement recommandé d’utiliser une colonne dont la phase stationnaire est résistante aux bases
(pH 9 à pH 9,5).
1)
NOTE Une colonne Gemini NX® (Phenomenex) ayant des dimensions similaires convient également.
D’autres colonnes peuvent être utilisées, à condition d’ajuster les conditions de séparation.
6.13 Chromatographe en phase liquide à haute performance (CLHP), constituée des éléments 6.13.1
à 6.13.5.
6.13.1 Injecteur, manuel ou automatique.
® ® ®
1) Oasis HLB , XBridge C18 et Gemini -NX sont des exemples de produits appropriés disponibles dans le
commerce. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document
et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ces produits.
4 © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO 16308:2014(F)
6.13.2 Pompe à gradient.
6.13.3 Four thermorégulé, pour la colonne CLHP.
6.13.4 Spectromètre de masse, équipé d’un analyseur quadripôle et d’une source électrospray.
6.13.5 Système d’acquisition et de traitement des données.
7 Échantillonnage
Si les flacons de prélèvement ne sont pas à usage unique, rincer les flacons d’échantillons (6.2) avec de
l’eau déionisée (5.1) puis nettoyer avec un détergent de laboratoire (5.4). Rincer avec de l’eau (5.1) puis
avec de l’eau ultra-pure (5.2) et, pour finir, avec de l’éthanol à 95 % (5.8).
Effectuer l’échantillonnage conformément à l’ISO 5667-3 dans ces flacons (6.2) (environ 50 ml).
Pour les échantillons suspectés de contenir du chlore libre, ajouter environ 2 mg de thiosulfate de sodium
(5.5) ou de tout autre agent réducteur de chlore pour 100 ml d’échantillon.
Conserver les échantillons conformément à l’ISO 5667-3, à 4 °C ± 3 °C, et les prétraiter dans les 24 h.
8 Mode opératoire
8.1 Prétraitement (matières en suspension)
Placer le filtre (6.4) sur la seringue (6.3). Rincer avec 5 ml d’eau ultra-pure (5.2).
Filtrer l’échantillon (environ 50 ml) et jeter les 5 premiers millilitres. Collecter le filtrat dans un tube à
fond conique (6.5).
Conserver les échantillons filtrés à 4 °C ± 3 °C pendant une semaine maximum avant l’étape de dérivation.
8.2 Séparation et dérivation du chélate
8.2.1 Généralités
Adapter l’étape de dérivation au type d’étape analytique qui suit la dérivation:
— avec un spectromètre de masse ayant une capacité de détection suffisante, aucune préconcentration
n’est nécessaire et l’échantillon dérivé est directement injecté après la dérivation, conformément au
paragraphe 8.2.2;
— sinon, une étape de préconcentration peut être utile pour atteindre la limite de quantification (LOQ)
prévue et la dérivation doit être effectuée conformément au paragraphe 8.2.3.
8.2.2 Libération des chélates et dérivation pour l’injection directe
Placer, par exemple, 5 ml de l’échantillon (des quantités d’échantillons différentes requièrent l’utilisation
de quantités équivalentes des réactifs suivants) dans une fiole Erlenmeyer de 25 ml équipée d’un
bouchon en verre et ajouter le barreau magnétique.
Ajouter 50 µl d’une solution aqueuse multisubstances à 20 µg/l (5.19) constituée de glyphosate marqué
13 15 13 15
au 1,2- C , N (5.18.3) et d’AMPA marqué au C, N (5.18.4) dans de l’eau ultra-pure (5.2) comme
2
étalon de dérivation.
Ajouter 100 µl d’EDTA disodique (5.16) [solution à 0,1 mol/l dans de l’eau ultra-pure (5.2)], agiter et
laisser reposer pendant 10 min dans la fiole fermée.
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ISO 16308:2014(F)
Ajouter, par exemple, 2 ml du tampon borate de sodium (5.22) à 0,05 mol/l et agiter pendant 30 min à
400 g pour ajuster le pH entre 9,0 et 9,5.
Ajouter 400 µl de solution FMOC-Cl (5.17 pour l’injection directe), agiter pendant 4 h à 400 g et patienter
pendant environ 12 h (toute une nuit).
Neutraliser la solution avec de l’acide chlorhydrique à 30 % (5.14).
Filtrer et utiliser pour l’analyse (8.4).
Le volume final de l’échantillon prétraité doit être pris en compte lors du calcul du résultat final.
NOTE La commutation de vanne du débit d’éluat derrière la colonne avant et après le passage des analytes
vers le conteneur à déchets est un bon choix pour protéger la source d’ions du détecteur SM/SM contre la
contamination.
8.2.3 Séparation et dérivation du chélate avant la préconcentration
Utiliser, par exemple, une micropipette (6.6), une pipette en PP ou en PE, placer un échantillon de 5 ml
dans un tube à fond conique en PP (6.5), par exemple.
Ajouter 50 µl d’une solution aqueuse multisubstances à 20 µg/l constituée de glyphosate marqué au
13 15 13 15
1,2- C , N (5.18.3) et d’AMPA marqué au C, N (5.18.4) dans de l’eau ultra-pure (5.2) comme étalon
2
de dérivation.
Ajouter 325 µl de tampon borate de sodium (5.22) et agiter.
Ajouter 200 µl d’EDTA disodique (5.16) [solution à 0,1 mol/l dans de l’eau ultra-pure (5.2)], agiter et
laisser reposer pendant 5 min. L’ajout d’EDTA permet de libérer le glyphosate et l’AMPA des complexes
2+ 2+
avec les cations divalents (par exemple, Ca , Mg ).
Ajouter 4,5 ml d’acétonitrile (5.6). Bien agiter, pendant 1 min, pour homogénéiser (les phases ne doivent
pas se séparer pendant cette étape du mode opératoire).
Ajouter 0,6 ml de solution FMOC-Cl (5.17) et agiter à nouveau.
Laisser reposer pendant 30 min à l’abri de la lumière et à température ambiante (20 °C à 25 °C) pour la
réaction.
Après la dérivation, tout excédent de FMOC-Cl et tous les sous-produits de réaction (par exemple, le
FMOC-OH) sont éliminés pendant la préconcentration (8.3).
En cas d’eau dure, c(CaCO ) >3 mmol/l, il est recommandé d’effectuer un prétraitement supplémentaire
3
des échantillons (voir l’Annexe E).
8.3 Préconcentration
8.3.1 Extraction liquide-liquide des dérivés des analytes
Concentrer l’échantillon analytique à environ 5 ml sous un courant d’azote (20 ml/min à 40 ml/min) à
température ambiante pour éliminer l’acétonitrile. L’évaporation de l’acétonitrile doit être complète et il
convient qu’elle ne dure pas plus de 60 min. Un précipité de FMOC-Cl (excédent de réactif) et de FMOC-
OH (sous-produit) peut cristalliser la paroi du tube.
Transférer la solution du tube en plastique vers un tube à essai en verre (6.11). Rincer le tube en plastique
avec environ 500 µl d’eau ultra-pure (5.2) et transférer son contenu dans le tube en verre.
Extraire 3 fois avec 1,5 ml d’acétate d’éthyle (5.9). Si nécessaire, centrifuger pendant 20 s à 6 500 g
après chaque extraction pour séparer les deux phases. Éliminer le surnageant avec une pipette Pasteur
(utiliser une nouvelle pipette pour chaque extraction).
6 © ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO 16308:2014(F)
Concentrer ensuite la phase liquide sous un courant d’azote pendant 15 min pour évaporer l’acétate
d’éthyle restant, en agitant le tube toutes les 5 min.
Le volume final doit être d’environ 6 ml.
L’extrait est ensuite acidifié à pH 3 avec de l’acide formique (5.13) pour prévenir toute éventuelle réaction
avec le FMOC-Cl résiduel et pour permettre de préconcentrer les extraits par SPE (8.3.2). Pour ce faire,
ajouter 100 µl d’une solution d’acide formique (5.13) ayant une fraction volumique de 5 % dans de l’eau
ultra-pure (5.2), ajuster le volume à 6 ml avec de l’eau ultra-pure (5.2) si nécessaire, puis homogénéiser
pendant 1 min.
8.3.2 Extraction en phase solide
8.3.2.1 Exigences générales
Utiliser des cartouches SPE (6.8) contenant, par exemple, 60 mg de phase solide polymère constituées
de polystyrène-divinylbenzène de 60 μm. Le taux de récupération doit être contrôlé régulièrement.
1)
NOTE 1 Les cartouches Oasis HLB® (60 µm, 60 mg, 3 ml, Waters), ou des cartouches équivalentes peuvent
être utilisées.
NOTE 2 La purification et la concentration en ligne sur SPE sont autorisées.
8.3.2.2 Conditionnement des cartouches
Rincer avec 2 × 500 µl de méthanol (5.7) et avec 2 × 500 µl de solution aqueuse d’acide formique à 0,1 %
en fraction volumique (5.13).
8.3.2.3 Purification
Injecter 6 ml d’extrait aqueux acidifié (pH 3) dans la cartouche avec un débit d’environ 1 ml/min.
Rincer le tube SPE avec 1 ml d’une solution aqueuse d’acide formique (5.13) à 0,1 % en fraction volumique,
puis avec 2 × 500 µl d’eau ultra-pure (5.2).
Sécher la cartouche sous vide ou sous un courant modéré d’azote pendant environ 1 min pour éliminer
la majeure partie de l’eau.
Éluer avec 3 × 700 µl de méthanol (5.7)/ 20 g/l d’hydroxyde d’ammonium (5.12) dans de l’eau ultra-pure
(5.2) (70/30, fraction volumique).
Collecter l’éluat dans un tube à essai en v
...
PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 16308
ISO/TC 147/SC 2 Secrétariat: DIN
Début de vote Vote clos le
2013-02-11 2013-05-11
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION • МЕЖДУНАРОДНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ • ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Qualité de l'eau — Détermination du glyphosate et de l'AMPA —
Méthode par chromatographie en phase liquide à haute
performance (CLHP) avec détection par spectrométrie de masse
en tandem
Water quality — Determination of glyphosate and AMPA — Method using high performance liquid
chromatography (HPLC) with tandem mass spectrometric detection
ICS 13.060.50
Pour accélérer la distribution, le présent document est distribué tel qu'il est parvenu du
secrétariat du comité. Le travail de rédaction et de composition de texte sera effectué au
Secrétariat central de l'ISO au stade de publication.
To expedite distribution, this document is circulated as received from the committee
secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text composition will be undertaken at
publication stage.
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D'ÊTRE EXAMINÉS POUR ÉTABLIR S'ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE.
© Organisation Internationale de Normalisation, 2013
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quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur l’internet ou sur un
Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à l’adresse ci-après ou au
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Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 16308
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Principe . 1
4 Interférences . 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 4
7 Échantillonnage . 5
8 Mode opératoire . 5
9 Étalonnage . 8
10 Expression des résultats . 11
11 Rapport d’essai . 11
Annexe A (informative) Exemples de conditions chromatographiques . 12
Annexe B (informative) Exemples de chromatogrammes . 13
Annexe C (informative) Analyse du glufosinate . 14
Annexe D (informative) Prétraitement d’échantillons d’eau dure . 18
Bibliographie . 20
© ISO 2013 – Tous droits réservés iii
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ISO/DIS 16308
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 16308 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 2,
Méthodes physiques, chimiques et biochimiques.
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ISO/DIS 16308
Introduction
Le glyphosate [N-(phosphonométhyl)glycine] est un herbicide à large spectre non sélectif. L’efficacité de ce
composé en fait l’herbicide le plus vendu et le plus utilisé au monde depuis son arrivée sur le marché en
1974. Associé à son principal produit de dégradation, l’acide aminométhylphosphonique (AMPA), le
glyphosate est l’une des substances les mieux détectées dans les étendues d’eau de la plupart des pays
développés. À noter toutefois que l’AMPA peut également provenir des émanations liées au traitement des
eaux usées (par exemple, en raison de l’utilisation de formulations détergentes pour les textiles).
Le glyphosate et l’AMPA appartiennent à la famille des aminophosphonates et possèdent des propriétés
physico-chimiques nécessitant la mise en œuvre de méthodes d’analyse complexes pour l’analyse des
traces. La difficulté de leur analyse est principalement liée à la haute solubilité du glyphosate et de l’AMPA
ainsi qu’à leur fonction chélatante. Pour résoudre ces problèmes, leur dérivation pré-colonne est effectuée
avec du 9-fluorénylméthylchloroformiate (FMOC-Cl) pour former des dérivés moins polaires, ce qui permet
une meilleure séparation par chromatographie en phase liquide.
Bien que moins concerné par les réglementations, le glufosinate, qui appartient à la famille des
aminophosphonates, peut être dosé simultanément, à condition de prouver l'absence d'interférence avec
l'échantillon soumis à l'analyse.
Il s’agit de la norme actuelle en matière de dosage par chromatographie en phase liquide et par détection
fluorimétrique ; néanmoins, le dosage par CLHP-ESI-SM/SM peut être bien plus spécifique (identification
univoque) et plus sensible (limites de quantification d’environ 30 ng/l). La présente Norme internationale
repose sur cette technique d’analyse et répond au besoin croissant des laboratoires impliqués dans le
contrôle réglementaire du milieu aquatique qui est désormais couramment équipé de ce type d’appareillage.
© ISO 2013 – Tous droits réservés v
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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 16308
Qualité de l'eau — Détermination de la teneur en glyphosate et
en AMPA — Méthode par chromatographie en phase liquide à
haute performance (CLHP) avec détection par spectrométrie de
masse en tandem
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente norme n’a pas pour but de traiter de tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur de la
présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité et de s’assurer
de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon la présente Norme internationale
soient effectués par un personnel adéquatement qualifié.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la fraction dissoute de
glyphosate et de son principal métabolite, l’acide aminométhylphosphonique (AMPA) dans l’eau potable, l’eau
souterraine et l’eau de surface à des concentrations de 0,03 µg/l à 1,5 µg/l. Elle ne s’applique pas à l’eau de
mer ou à l’eau salée. Cette méthode peut s’appliquer à d’autres types d’eaux à condition qu’elle soit validée
pour chaque cas.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence (y compris les éventuels amendements)
s'applique.
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 5667-3, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 3 : Conservation et manipulation des échantillons
d'eau
ISO 8466-1, Qualité de l’eau — Étalonnage et évaluation des méthodes d’analyse et estimation des
caractères de performance — Partie 1 : Évaluation statistique de la fonction linéaire d'étalonnage
3 Principe
Le glyphosate et l’AMPA (fraction dissoute après filtration) sont dérivés en utilisant du 9-
fluorénylméthylchloroformiate (FMOC-Cl) (5.16.1) pour réduire leur polarité et augmenter la rétention des
composés par séparation sur une colonne de chromatographie en phase inverse (par exemple, C18).
L’échantillon dérivé est purifié par extraction liquide-liquide puis concentré par extraction en phase solide
(SPE).
© ISO 2013 – Tous droits réservés 1
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ISO/DIS 16308
L’analyse est effectuée en réalisant une chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à
une spectrométrie de masse en tandem via une source électrospray (CLHP-ESI-SM/SM), en utilisant
l’étalonnage avec adaptation matricielle.
Tableau 1 — Substances concernées
Masse moléculaire
Nom Formule N° CAS
(g/mol)
Glyphosate
C H NO P
169,1 1071-83-6
3 8 5
N-(phosphonométhyl)glycine
AMPA
CH NO P
111,0 1066-51-9
6 3
Acide
aminométhylphosphonique
NOTE Le glufosinate, qui appartient à la famille des aminophosphonates, peut être dosé simultanément, à condition
de prouver l'absence d'interférence avec l'échantillon soumis à l'analyse.
4 Interférences
Cette méthode est validée pour l’eau dure contenant jusqu’à 3,2 mmol/l de la somme du calcium et du
magnésium. Pour les eaux ayant une plus haute teneur en calcium et en magnésium, il peut être nécessaire
d'augmenter la concentration en EDTA sodique (5.15) lors de l’étape de dérivation (voir l’Annexe C).
NOTE Il peut être nécessaire d’inclure l’étape d’acidification décrite dans l’Annexe C même pour certains types
d’eaux inférieurs à 3,2 mmol/l de la somme du calcium et du magnésium. Le laboratoire doit vérifier la nécessité de ce
mode opératoire pour ses échantillons de routine.
La présence de chlore libre, par exemple dans les eaux traitées, peut provoquer des pertes de glyphosate par
oxydation. Par conséquent, du thiosulfate de sodium doit être utilisé (voir l’Article 7).
5 Réactifs
Sauf indication contraire, tous les réactifs et solvants doivent être de pureté suffisante, par exemple, « pour
l’analyse des traces ».
5.1 Eau déionisée
5.2 Eau ultra-pure, conforme au grade 1 de l’ISO 3696.
5.3 Azote, N , pureté ≥99,996 %.
2
5.4 Détergent de laboratoire, alcalin.
5.5 Thiosulfate de sodium, Na S O .
2 2 3
5.6 Acétonitrile, C H N, qualité CLHP.
2 3
5.7 Méthanol, CH O, qualité CLHP.
4
5.8 Éthanol, C H O, 95 %, qualité CLHP.
2 6
5.9 Acétate d’éthyle, C H O , qualité CLHP.
4 8 2
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 16308
5.10 Acétate d’ammonium, C H O N.
2 7 2
5.11 Triéthylamine, C H N.
6 15
5.12 Ammoniac, NH , 28 %.
3
5.13 Acide formique, CH O .
2 2
5.14 Acide chlorhydrique, HCl, 30 %.
5.15 Acide acétique glacial, C H O .
2 4 2
5.16 Acide éthylènediaminetétracétique (EDTA), sel disodique dihydraté, C H N Na O ·2H O, pureté
10 14 2 2 8 2
minimale de 99 %. 5.17 9-fluorénylméthylchloroformiate, FMOC-Cl, C H ClO , pureté minimale de
15 11 2
97 %.
Le FMOC-Cl sert à préparer le réactif de dérivation, la solution FMOC-Cl, 50 mg/ml, dans de l’acétonitrile
(5.6). Cette solution peut être conservée pendant 6 mois à -18 °C ± 3 °C.
5.18 Substances de référence, selon le Tableau 1.
⎯ Glyphosate, N-(phosphonométhyl)glycine, C H NO P, pureté >98 %.
3 8 5
⎯ AMPA, acide aminométhylphosphonique, CH NO P, pureté >98 %.
6 3
13 15
⎯ Étalon d’extraction de glyphosate marqué au 1,2 C , N, pureté >98 %.
2
13 15
⎯ Étalon d’extraction d’AMPA marqué au C, N, pureté >98 %.
5.19 Solutions d’étalonnage
Solutions mères individuelles de glyphosate et d’AMPA, 100 mg/l, préparées dans de l'eau ultra-pure (5.2).
Ces solutions peuvent être conservées pendant 1 mois à 4 °C ± 3 °C.
13 15 13 15
Solutions mères individuelles de glyphosate marqué (1,2 C , N) et d’AMPA marqué ( C, N), 100 mg/l,
2
préparées dans de l'eau ultra-pure (5.2). Ces solutions peuvent être conservées pendant 1 mois à
4 °C ± 3 °C.
13 15
Solution de travail multisubstances constituée d’étalons d’extraction : glyphosate marqué (1,2 C , N) et
2
13 15
AMPA marqué ( C, N), 20 µg/l, préparée dans de l'eau ultra-pure (5.2). Cette solution peut être conservée
pendant 1 mois à 4 °C ± 3 °C.
NOTE Les solutions mères et les solutions d’étalonnage peuvent être conservées plus longtemps à condition de
fournir les justifications adéquates.
5.20 Tampon acétate de triéthylammonium, solution de triéthylamine à 0,1 % (5.11) ajustée à pH 9,5 avec
de l’acide acétique glacial (5.15) (phase mobile).
5.21 Tétraborate de sodium, décahydraté, Na B O ·10H O.
2 4 7 2
5.22 Tampon borate de sodium, 0,05 mol/l ; pH = 9,2.
Dissoudre 19 ± 0,1 g de tétraborate de sodium (5.21), décahydraté, dans 1 l d’eau (5.1). Cette solution peut
être conservée pendant environ 1 mois à 4 °C ± 3 °C.
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ISO/DIS 16308
2+ 2+
5.23 Eau minérale, contenant moins de 3,2 mmol/l de cations divalents (Mg et Ca total), pour préparer
l’étalonnage avec adaptation matricielle.
6 Appareillage
Le matériel ou l’une de ses parties, qui risque d’entrer en contact avec l’échantillon, doit être exempt(e) de
tout résidu susceptible de provoquer des interférences inacceptable dans les blancs.
Des récipients en verre et en plastique peuvent être utilisés pour l’échantillonnage et pour toutes les étapes
qui précèdent la dérivation. Des flacons en verre (6.10) et des tubes à essai en verre (6.11) doivent être
utilisés après l’étape de dérivation.
6.1 Verrerie de laboratoire
6.2 Flacons en verre, en polyéthylène (PE) ou en polypropylène (PP), minimum 50 ml, pour
l’échantillonnage.
6.3 Seringue en verre, en polyéthylène (PE) ou en polypropylène (PP), minimum 50 ml, pour la filtration
des échantillons.
6.4 Filtre pour seringue à usage unique, ø 25 mm, avec membrane hydrophile en cellulose régénérée,
0,45 µm.
6.5 Tubes à fond conique en verre ou en PE ou PP à usage unique, environ 50 ml, pour la dérivation.
6.6 Micropipettes, réglables entre 100 µl et 500 µl.
6.7 pH-mètre
1)
6.8 Cartouches SPE, par exemple Oasis HLB® Waters 60 mg, 3 ml, ou équivalentes.
6.9 Dispositif de centrifugation, permettant d’obtenir une accélération de 6 500 g.
6.10 Fioles en verre, adaptées à l’échantillonneur automatique, équipées de bouchons et de septums en
polytétrafluoroéthylène (PTFE).
6.11 Tube à essai en verre, 15 ml ou moins.
1)
6.12 Colonne en phase inverse, par exemple colonne XBridge® C18 (Waters, 50 mm x 2,1 mm, D.I.
2,5 µm) avec précolonne (Waters, 10 mm x 2,1 mm, D.I. 2,5 µm).
1)
NOTE Une colonne Gemini NX® (Phenomenex) ayant des dimensions similaires convient également. D’autres
types de colonnes peuvent être utilisés, à condition d’ajuster les conditions de séparation. Il est hautement recommandé
d’utiliser une colonne dont la phase stationnaire est résistante aux alcalis (pH = 9 à 9,5).
6.13 Chromatographe en phase liquide à haute performance (CLHP), constituée des éléments suivants :
⎯ un injecteur, manuel ou automatique ;
⎯ une pompe à gradient ;
⎯ un four thermorégulé, pour la colonne CLHP ;
1)
OASIS HLB®, XBridge® et Gemini® sont des exemples de produits appropriés disponibles dans le commerce. Cette
information est donnée par souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer
un engagement de l'ISO à l’égard de ces produits.
4 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 16308
⎯ un spectromètre de masse, équipé d’un analyseur quadripôle et d’une source électrospray ;
⎯ un système d’acquisition et de traitement des données.
7 Échantillonnage
Si les flacons de prélèvement ne sont pas à usage unique, rincer les flacons d’échantillons (6.2) avec de l’eau
déionisée (5.1) puis nettoyer avec un détergent de laboratoire (5.4). Rincer avec de l’eau (5.1) puis avec de
l’eau ultra-pure (5.2) et, pour finir, avec de l’éthanol à 95 % (5.8).
Effectuer l’échantillonnage conformément à l’ISO 5667-3 dans ces flacons (6.2) (environ 50 ml).
Pour les échantillons suspectés de contenir du chlore libre, ajouter environ 2 mg de thiosulfate de sodium
(5.5) ou de tout autre agent réducteur de chlore pour 100 ml d'échantillon.
Conserver les échantillons à 4 °C ± 3 °C et les prétraiter dans les 24 h.
8 Mode opératoire
8.1 Prétraitement (SPM)
Adapter le filtre (6.4) sur la seringue (6.3). Rincer avec 5 ml d’eau ultra-pure (5.2).
Filtrer l’échantillon (environ 50 ml) et jeter les 5 premiers millilitres. Collecter le filtrat dans un tube à fond
conique (6.5).
Conserver les échantillons filtrés à 4 °C ± 3 °C pendant une semaine maximum avant l’étape de dérivation.
8.2 Séparation et dérivation du chélate
La condition de la dérivation doit être adaptée au type d’étape analytique qui suit la dérivation :
⎯ si une importante quantité d’analyte est suspectée, aucune préconcentration n’est nécessaire et
l’échantillon dérivé est directement injecté après la dérivation, conformément au paragraphe 8.2.1.
⎯ sinon, une étape de préconcentration peut être utile pour atteindre la performance LOQ prévue et la
dérivation doit être effectuée conformément au paragraphe 8.2.2.
8.2.1 Séparation et dérivation du chélate pour l’injection directe
Placer, par exemple, 5 ml de l’échantillon dans une fiole Erlenmeyer de 25 ml équipée d’un bouchon en verre
et ajouter le barreau magnétique.
Ajouter 50 µl d’une solution aqueuse multisubstances à 20 µg/l (5.19) constituée de glyphosate marqué (1,2
13 15 13 15
C , N) (5.18) et d’AMPA marqué ( C, N) (5.18) dans de l’eau ultra-pure (5.2) comme étalon d’extraction
2
de dérivation.
Ajouter 100 µl d’EDTA disodique (5.16) (solution à 0,1 mol/l dans de l’eau ultra-pure (5.2)), agiter et laisser
reposer pendant 10 min dans la fiole fermée.
Ajouter 2 ml du tampon borate de sodium (5.22) à 0,05 mol/l et agiter pendant 30 min à 400 g pour ajuster le
pH entre 9,0 et 9,5.
Ajouter 4 µl de solution de FMOC-Cl (4.17), agiter pendant 4 h à 400 g et patienter pendant environ 12 h
(toute une nuit).
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ISO/DIS 16308
Neutraliser la solution avec de l’acide chlorhydrique à 30 % (4.14).
Filtrer et utiliser pour l’analyser (8.4).
Le volume final de l’échantillon prétraité doit être pris en compte lors du calcul du résultat final.
NOTE La commutation de vanne du débit d’éluat derrière la colonne dans les déchets est un bon choix pour protéger
la source d’ions du détecteur SM/SM contre la contamination.
8.2.2 Séparation et dérivation du chélate avant la préconcentration
Utiliser, par exemple, une micropipette (6.6), une pipette en PP ou en PE, placer un échantillon de 5 ml dans
un tube à fond conique en PP (6.5), par exemple.
13
Ajouter 50 µl d’une solution aqueuse multisubstances à 20 µg/l constituée de glyphosate marqué (1,2 C ,
2
15 13 15
N) (5.18) et d’AMPA marqué ( C, N) (5.18) dans de l’eau ultra-pure (5.2) comme étalon d’extraction de
dérivation.
Ajouter 325 µl de tampon borate de sodium (5.22) et agiter.
Ajouter 200 µl d’EDTA disodique (5.15) (solution à 0,1 mol/l dans de l’eau ultra-pure (5.2)), agiter et laisser
reposer pendant 5 min. L’ajout d’EDTA permet de libérer les complexes de glyphosate et d’AMPA avec les
2+ 2+
cations divalents (par exemple, Ca , Mg ).
Ajouter 4,5 ml d’acétonitrile (5.6). Bien agiter, pendant 1 min, pour homogénéiser (les phases ne doivent pas
se séparer pendant cette étape du mode opératoire).
Ajouter 0,6 ml de solution FMOC-Cl (5.17) et agiter à nouveau.
Laisser reposer pendant 30 min à l’abri de la lumière et à température ambiante (20 °C à 25 °C) pour la
réaction.
Après la dérivation, tout excédent de FMOC-Cl et tous les sous-produits de réaction (par exemple, le
FMOC-OH) sont éliminés pendant la préconcentration (8.3).
NOTE En présence d’eau dure (c(CaCO ) > 3 mmol/l), il est recommandé d’effectuer un prétraitement
3
supplémentaire des échantillons (voir l’Annexe D).
8.3 Préconcentration
8.3.1 Extraction liquide-liquide des dérivés des analytes
Concentrer l’échantillon analytique à environ 5 ml sous un courant d’azote (20 ml/min à 40 ml/min) à
température ambiante pour éliminer l’acétonitrile. L’évaporation de l’acétonitrile doit être complète et il
convient qu’elle ne dure pas plus de 60 min. Un précipité de FMOC-Cl (excédent de réactif) et de FMOC-OH
(sous-produit) peut cristalliser la paroi du tube.
Transférer la solution du tube en plastique vers un tube à essai en verre (6.11). Rincer le tube en plastique
avec environ 500 µl d’eau ultra-pure (5.2) et transférer son contenu dans le tube en verre.
Extraire 3 fois avec 1,5 ml d’acétate d’éthyle (5.9). Si nécessaire, centrifuge pendant 20 s à 6 500 g après
chaque extraction pour séparer les deux phases. Éliminer le surnageant avec une pipette Pasteur (utiliser une
nouvelle pipette pour chaque extraction).
Concentrer ensuite la phase liquide sous un courant d’azote pendant 15 min pour évaporer l’acétate d’éthyle
restant, en agitant le tube toutes les 5 min.
Le volume final doit être d’environ 6 ml.
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L’extrait est ensuite acidifié à pH = 3 avec de l’acide formique (5.13) pour prévenir toute éventuelle réaction
avec le FMOC-Cl résiduel et pour permettre de préconcentrer les extraits par extraction en phase solide (8.4).
Pour ce faire, ajouter 100 µl d’une solution d’acide formique (5.13) ayant une fraction volumique de 5 % dans
de l’eau ultra-pure (5.2), ajuster le volume à 6 ml avec de l’eau ultra-pure (5.2) si nécessaire, puis
homogénéiser pendant 1 min.
8.3.2 Extraction en phase solide
8.3.2.1 Exigences générales
Utiliser des cartouches SPE contenant environ : 60 mg de cartouches d’extraction en phase solide (SPE)
polymère constituées de polystyrène-divinylbenzène de 60 µm. Le taux de récupération doit être contrôlé
régulièrement.
NOTE 1 Les cartouches Oasis HLB® (60 µm, 60 mg, 3 ml, Waters) ou des cartouches équivalentes peuvent être
utilisées.
NOTE 2 La purification et la concentration en ligne sur SPE sont autorisées.
8.3.2.2 Conditionnement des cartouches
Rincer avec 2 x 500 µl de méthanol (5.7) et avec 2 x 500 µl de solution aqueuse d’acide formique à 0,1 %
(5.13).
8.3.2.3 Purification
Injecter 6 ml d’extrait aqueux acidifié (pH = 3) dans la cartouche avec un débit d’environ 1 ml/min.
Rincer le tube SPE avec 1 ml d’une solution aqueuse d’acide formique (5.13) à 0,1 %, puis avec 2 x 500 µl
d’eau ultra-pure (5.2).Sécher la cartouche sous vide ou sous un courant modéré d’azote pendant environ
1 min pour éliminer la majeure partie de l’eau.
Éluer avec 3 x 700 µl de méthanol (5.7)/ 2 % d’ammoniac (5.12) dans de l’eau ultra-pure (5.2) (70/30, fraction
volumique).
Collecter l’éluat dans un tube à essai en verre (6.11) et réduire sous un courant d’azote jusqu’à ce que le
méthanol soit éliminé. Le volume final doit être d’environ 0,7 ml.
NOTE Les résidus de méthanol peuvent dégrader les conditions chromatographiques, avec une séparation
des pics.
Compléter à 1 ml avec de l’eau ultra-pure (5.2). L’extrait purifié peut être conservé pendant 48 h à 4 °C ± 3 °C
maximum avant analyse en raison de la stabilité des dérivés FMOC dans l’eau.
8.4 Dosage chromatographique
8.4.1 Exigences générales
Utiliser l’équipement conformément aux instructions du fabricant.
Vérifier régulièrement la stabilité du système. Ajuster et optimiser les paramètres des instruments
conformément aux instructions du fabricant.
En raison de l’utilisation de phases mobiles tamponnées, il est recommandé de rincer régulièrement la
colonne analytique et le système chromatographique conformément aux instructions du fabricant.
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8.4.2 Conditions chromatographiques
Séparer les dérivés de glyphosate et d’AMPA par CLHP en utilisant une colonne en phase inverse et des
conditions chromatographiques appropriées. Le pH de la phase mobile doit être alcalin (pH = 9 à 9,5) de
façon à obtenir les meilleures performances chromatographiques (symétrie des pics proche de 1 et pics
étroits), ce qui implique l’utilisation d’une colonne particulière (phase stationnaire hybride). Les Annexes A à C
illustrent des exemples de conditions chromatographiques appropriées.
8.5 Identification et confirmation des analytes
L’identification des composés cibles est effectuée en comparant leur temps de rétention à celui de la
substance de référence, ainsi que leur spectre de masse en mode d’ionisation négatif SRM (« single reaction
monitoring ») à celui des substances de référence. Le Tableau 2 donne les transitions caractéristiques
utilisées.
Tableau 2 —Détection ESI-SM/SM
Analytes Transition de quantification Transition de qualification
Glyphosate-FMOC 390>168 390>150
AMPA-FMOC
332>110 332>136
Glyphosate-FMOC marqué (1,2 393>171 393>153
13 15
C , N)
2
13 15
334>112 334>138
AMPA-FMOC marqué ( C, N)
Les rapports entre les transitions de quantification et de qualification dépendent des conditions SRM (c’est-à-
dire, l’énergie de collision et la pression gazeuse dans la cellule de collision). Ces rapports doivent être
déterminés en utilisant des substances de références et doivent représenter, pour les échantillons, ± 20 % de
la valeur observée pour la substance de référence, en utilisant la même optimisation de l’équipement.
Des exemples de chromatogrammes sont donnés dans l’Annexe B.
8.6 Contrôle des témoins à blanc
Les témoins à blanc sont obtenus en appliquant le mode opératoire sur une eau minérale (5.23)
13 15 13 15
supplémentée avec du glyphosate (1,2 C , N) et de l’AMPA ( C, N) uniquement. Les témoins à blanc
2
et les échantillons doivent être traités et analysés simultanément. Il convient que la teneur résiduelle en
glyphosate et en AMPA soit inférieure aux limites de quantification (LOQ).
9 Étalonnage
9.1 Gammes de concentration
Préparer un étalonnage en 5 points conformément à l’ISO 8466-1 couvrant le domaine de mesure de
13 15
0,03 µg/l à 1,5 µg/l pour le glyphosate et l’AMPA, ainsi que pour le glyphosate marqué (1,2 C , N) et
2
13 15
l’AMPA m
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.