Soil quality — Determination of soil microbial diversity — Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the simple PLFA extraction method

ISO/TS 29843-2:2011 specifies a simple method for the extraction of only phospholipid fatty acids (PLFA) from soils.

Qualité du sol — Détermination de la diversité microbienne du sol — Partie 2: Méthode par analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA) en utilisant la méthode simple d'extraction des PLFA

L'ISO/TS 29843-2:2011 spécifie une méthode simple permettant d'extraire uniquement les acides gras phospholipidiques (PLFA) du sol.

General Information

Status
Withdrawn
Publication Date
11-Sep-2011
Withdrawal Date
11-Sep-2011
Current Stage
9599 - Withdrawal of International Standard
Start Date
20-Jul-2021
Completion Date
20-Jul-2021
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Technical specification
ISO/TS 29843-2:2011 - Soil quality -- Determination of soil microbial diversity
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ISO/TS 29843-2:2011 - Qualité du sol -- Détermination de la diversité microbienne du sol
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Standards Content (sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 29843-2
First edition
2011-09-15
Corrected version
2012-0-
Soil quality — Determination of soil
microbial diversity —
Part 2:
Method by phospholipid fatty acid
analysis (PLFA) using the simple PLFA
extraction method
Qualité du sol — Détermination de la diversité microbienne du sol —
Partie 2: Méthode par analyse des acides gras phospholipidiques
(PLFA) en utilisant la méthode simple d’extraction des PLFA
Reference number
ISO/TS 29843-2:2011(E)
ISO 2011
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ISO/TS 29843-2:2011(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2011

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,

electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or ISO’s

member body in the country of the requester.
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Published in Switzerland
ii © ISO 2011 – All rights reserved
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ISO/TS 29843-2:2011(E)
Contents Page

Foreword ............................................................................................................................................................................iv

Introduction ........................................................................................................................................................................ v

1 Scope ...................................................................................................................................................................... 1

2 Normative references ......................................................................................................................................... 1

3 Symbols and abbreviated terms (except chemical products and reagents) ....................................... 1

4 Principle ................................................................................................................................................................. 1

5 Test materials ....................................................................................................................................................... 2

5.1 Soil ........................................................................................................................................................................... 2

5.2 Reagents ................................................................................................................................................................ 2

5.3 Apparatus .............................................................................................................................................................. 4

6 Procedures ............................................................................................................................................................ 5

6.1 Lipid extraction (Bligh-Dyer extraction) ........................................................................................................ 5

6.2 Separation of lipids by SI column ................................................................................................................... 5

6.3 Derivatization — Transmethylation — Clean-up ......................................................................................... 5

6.4 PLFA analysis ....................................................................................................................................................... 6

Bibliography ....................................................................................................................................................................... 7

© ISO 2011 – All rights reserved iii
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ISO/TS 29843-2:2011(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International

Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a technical

committee may decide to publish other types of document:

— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in

an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members

of the parent committee casting a vote;

— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical

committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee

casting a vote.

An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a further

three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is confirmed,

it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an International

Standard or be withdrawn.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO/TS 29843-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,

Biological methods.

ISO/TS 29843 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Determination of soil

microbial diversity:

— Part 1: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) and phospholipid ether lipids (PLEL) analysis

— Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the simple PLFA extraction method

In this corrected version, the missing Equation (1) in 6.1 has been added.
iv © ISO 2011 – All rights reserved
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ISO/TS 29843-2:2011(E)
Introduction

Phospholipids are essential components of membranes of all living cells. Extracted from soil samples in fatty

acid form (PLFA: phospholipid fatty acids) or ether-linked isoprenoid side chains (PLEL: phospholipid ether

lipid), they provide quantitative and qualitative insights into the soil’s viable/active microbial biomass. Cellular

enzymes hydrolyse and release the phosphate group within minutes to hours following cell death (Reference [1]).

The determination of total PLFA and PLEL provides a quantitative measure of the viable biomass of soil, i.e.

microorganisms from all three domains of the biosphere (bacteria, fungi and archaebacteria). PLFA and PLEL

can also allow for taxonomic differentiation within complex microbial communities (References [2] and [3]).

This approach is now well established in soil ecology and serves as a phenotypic, and thus complementary,

tool to genotypic (molecular genetic) approaches for determining microbial diversity. Apart from taxonomic

descriptions, the PLFA technique enables the determination of physiological changes within microbial consortia.

For instance, the monoenic PLFA 16:1ω7c and 18:1ω7c are increasingly converted to the cyclopropyl fatty acids

cy17:0 and cy19:0 in Gram-negative bacteria in response to environmental stress (Reference [4]).

Different methodologies are available for the determination of soil fatty acids. These methodologies present

different levels of complexity when applied and provide different levels of resolution in the description of soil

microbial communities. ISO/TS 29843-1 deals with the generally called “extended PLFA extraction method” while

this part of ISO/TS 29843 deals with the generally called “simple PLFA extraction method” (References [5] and[6]).

This part of ISO/TS 29843, which deals with the simple PLFA extraction method, is accessible to most research

and analytical laboratories involved in soil sciences. This methodology can be used for a wide range of soils. It

provides a broad diversity measurement of a soil microbial community at the phenotypic level. It can be applied

to biomass estimation and can be used to differentiate microbial communities among different soil samples

(with the aid of an adapted statistical method). This method is especially adapted for detecting rapid changes

in the soil microbial community structure. It can also be used to give a rough description of microbial groups

present in soil samples (e.g. Gram-positive bacteria, actinomycetes, fungi). Table 1 (adapted from Table 1 in

Reference [5]), presents a comparison of the sensitivity of the “extended PLFA” versus “simple PLFA” techniques.

Table 1 — Comparison of the sensitivity of the “simple” and “extended” PLFA techniques

in characterizing shifts in the composition of microbial communities
Property PLFA (simple) PLFA (extended)
Ability to differentiate between two communities (with the Yes Yes
aid of multivariate statistical methods)
Applicability for biomass estimation Yes Yes
Ability to register all single components of an entire No Yes
community structure (“fingerprint”)
Ability to register FAs other than EL-FAs No Yes
Estimation of number of FAs in soil samples <50 200 to 400
Capacity to determine the linkage of the FAs to lipids in Yes, EL Yes, EL, NEL
the molecule
Capacity to detect defined FAs in lower concentrations in No Yes
the soil extract
Capacity to detect unusual FAs in the soil extract No Yes
Number of available signatures of FAs for defined Few High numbers
organisms
Relationships of FAs widespread in the profile High Natura
Ability to identify the organisms causing the shift in No Basically yes
microbial community

This method has been derived from the one first proposed in Reference [7] and later modified in Reference [1].

This revised method has been widely used (Reference [8]) and has also been discussed and compared to the

extended PLFA extraction method in peer-reviewed articles (References [5] and [6]).

© ISO 2011 – All rights reserved v
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 29843-2:2011(E)
Soil quality — Determination of soil microbial diversity —
Part 2:
Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the
simple PLFA extraction method
1 Scope

This part of ISO/TS 29843 specifies a simple method for the extraction of only phospholipid fatty acids

(PLFA) from soils.

ISO/TS 29843-1 specifies an extended method for the extraction and determination of both PLFA and

PLEL from soils.
2 Normative references

The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated

references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document

(including any amendments) applies.

ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under

aerobic conditions for the assessment of m
...

SPÉCIFICATION  ISO/TS
TECHNIQUE 29843-2
Première édition
2011-09-15
Qualité du sol — Détermination de la
diversité microbienne du sol —
Partie 2:
Méthode par analyse des acides gras
phospholipidiques (PLFA) en utilisant la
méthode simple d’extraction des PLFA
Soil quality — Determination of soil microbial diversity —
Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the
simple PLFA extraction method
Numéro de référence
ISO/TS 29843-2:2011(F)
 ISO 2011
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2011(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
©  ISO 2011

Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous

quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit

de l’ISO à l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
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Publié en Suisse
ii © ISO 2011 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 29843-2:2011(F)
Sommaire Page

Avant-propos .....................................................................................................................................................................iv

Introduction ........................................................................................................................................................................ v

1 Domaine d’application ....................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ...................................................................................................................................... 1

3 Symboles et termes abrégés (à l’exception des produits chimiques et des réactifs) ...................... 1

4 Principe .................................................................................................................................................................. 1

5 Matériaux d’essai ................................................................................................................................................. 2

5.1 Sol ............................................................................................................................................................................ 2

5.2 Réactifs .................................................................................................................................................................. 2

5.3 Appareillage .......................................................................................................................................................... 4

6 Modes opératoires .............................................................................................................................................. 5

6.1 Extraction des lipides (extraction de Bligh-Dyer) ....................................................................................... 5

6.2 Séparation des lipides par colonne SI ........................................................................................................... 5

6.3 Dérivation — Transméthylation — Purification ........................................................................................... 5

6.4 Analyse PLFA ....................................................................................................................................................... 6

Bibliographie ...................................................................................................................................................................... 7

© ISO 2011 – Tous droits réservés  iii
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ISO/TS 29843-2:2011(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux

comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité

technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,

en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission

électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication

comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.

Dans d’autres circonstances, en particulier lorsqu’il existe une demande urgente du marché, un comité

technique peut décider de publier d’autres types de documents:

—  une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans un

groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des membres

votants du comité dont relève le groupe de travail;

—  une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d’un comité technique

et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.

Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l’objet d’un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois

nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu’une ISO/PAS ou ISO/TS

a été confirmée, elle fait l’objet d’un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa transformation en

Norme internationale soit de son annulation.

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits

de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir

identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L’ISO/TS 29843-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,

Méthodes biologiques.

L’ISO/TS 29843 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Détermination

de la diversité microbienne du sol:

—  Partie 1: Méthode par analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA) et par analyse des lipides éther

phospholipidiques (PLEL)

—  Partie 2: Méthode par analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA) en utilisant la méthode simple

d’extraction des PLFA
iv © ISO 2011 – Tous droits réservés
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ISO/TS 29843-2:2011(F)
Introduction

Les phospholipides sont des composants essentiels des membranes de toutes les cellules vivantes. Extraits

d’échantillons de sol sous forme d’acides gras (PLFA: acides gras phospholipidiques) ou de chaînes latérales

isopréniques à liaison éther (PLEL: lipides éther phospholipidiques), ils apportent des connaissances

quantitatives et qualitatives relatives à la biomasse microbienne viable/active du sol. Les enzymes

cellulaires hydrolysent et libèrent le groupe phosphate dans les minutes ou les heures qui suivent la mort

cellulaire (Référence [1]). Le dosage des PLFA et des PLEL totaux fournit une mesure quantitative de la biomasse

viable du sol, c’est-à-dire des micro-organismes des trois domaines de la biosphère (bactéries, champignons

et archaebactéries). Les PLFA et les PLEL peuvent également permettre une différentiation taxonomique à

l’intérieur de communautés microbiennes complexes (Références [2] et [3]). Cette approche est désormais

bien établie dans le domaine de l’écologie des sols et sert d’outil phénotypique. Elle est donc complémentaire

aux approches génotypiques (génétique moléculaire) pour déterminer la diversité microbienne. En plus des

descriptions taxonomiques, la technique PLFA permet de déterminer les modifications physiologiques au sein

des consortiums microbiens. Par exemple, les PLFA monoéniques 16:1ω7c et 18:1ω7c sont progressivement

convertis en acides gras cyclopropyliques cy17:0 et cy19:0 dans les bactéries Gram-négatives en réponse aux

contraintes environnementales (Référence [4]).

Il existe différentes méthodes de dosage des acides gras présents dans le sol. Ces méthodes présentent, lors

de leur application, des niveaux de complexité variables et permettent d’obtenir différents niveaux de résolution

concernant la description des communautés microbiennes du sol. L’ISO/TS 29843-1 traite de la méthode

généralement appelée «méthode étendue d’extraction des PLFA» tandis que la présente partie de l’ISO/TS 29843

traite de celle généralement appelée «méthode simple d’extraction des PLFA» (Références [5] et [6]).

La présente partie de l’ISO/TS 29843 traitant de la méthode simple d’extraction des PLFA est accessible à la

plupart des laboratoires d’analyse et de recherche concernés par les sciences de la terre. Cette méthode peut

être utilisée pour un large éventail de sols. Elle fournit une mesure de la grande diversité de la communauté

microbienne du sol à un niveau phénotypique. Elle peut être appliquée à l’estimation de la biomasse et peut

être utilisée pour différencier les communautés microbiennes dans différents échantillons de sol (à l’aide d’une

méthode statistique adaptée). Cette méthode est particulièrement adaptée à la détection des modifications

rapides de la structure de la communauté microbienne du sol. Elle peut également être utilisée pour une

description sommaire des groupes microbiens présents dans les échantillons de sol (par exemple les bactéries

Gram-positives, les actinomycètes, les champignons). Le Tableau 1 (adapté de la Référence [5]) présente une

comparaison de la sensibilité des techniques «PLFA étendue» et «PLFA simple».
© ISO 2011 – Tous droits réservés  v
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ISO/TS 29843-2:2011(F)

Tableau 1 — Comparaison de la sensibilité des techniques PLFA «simple» et «étendue» pour la

caractérisation des changements dans la composition des communautés microbiennes
Propriété PLFA (simple) PLFA (étendue)
Aptitude à différencier deux communautés (à l’aide de  Oui Oui
méthodes statistiques à plusieurs variables)
Applicabilité pour l’estimation de la biomasse Oui Oui
Aptitude à répertorier tous les composants simples de la  Non Oui
structure d’une communauté entière («empreinte»)
Aptitude à répertorier les acides gras autres que les  Non Oui
acides gras à liaison ester
Estimation du nombre d’acides gras dans les échantillons  <50 200 à 400
de sol

Capacité à doser la liaison des acides gras aux lipides  Oui, liaison ester (EL) Oui, liaison ester (EL), sans

dans la molécule liaison ester (NEL)
Capacité à détecter les acides gras définis à de faibles  Non Oui
concentrations dans l’extrait de sol
Capacité à détecter les acides gras inhabituels dans  Non Oui
l’extrait de sol
Nombre de signatures disponibles d’acides gras pour des  Peu Nombre élevé
organismes définis
Relation des acides gras répandus dans le profil Importante Naturelle
Aptitude à identifier les organismes provoquant des  Non Oui, dans l’ensemble
changements dans la communauté microbienne

La présente méthode est dérivée de la première méthode proposée par la Référence [7] et modifiée

ultérieurement par la Référence [1]. Cette méthode révisée a été largement utilisée (Référence [8]) et a

également été examinée et comparée à la méthode étendue d’extraction des PLFA dans des articles publiés

par des pairs (Références [5] et [6]).
vi © ISO 2011 – Tous droits réservés
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 29843-2:2011(F)
Qualité du sol — Détermination de la diversité microbienne du
sol —
Partie 2:
Méthode par analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA)
en utilisant la méthode simple d’extraction des PLFA
1 Domaine d’application

La présente partie de l’ISO/TS 29843 spécifie une méthode simple permettant d’extraire uniquement les acides

gras phospholipidiques (PLFA) du sol.

L’ISO/TS 29843-1 spécifie une méthode étendue permettant d’extraire et de doser aussi bien les acides gras

phospholipidiques (PLFA)que les lipides éther phospholipidiques (PLEL) du sol.
2 Références normatives

Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les

références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du

document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).

ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation

et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire des proce

...

Questions, Comments and Discussion

Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.