ISO 11268-2:2012
(Main)Soil quality — Effects of pollutants on earthworms — Part 2: Determination of effects on reproduction of Eisenia fetida/Eisenia andrei
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms — Part 2: Determination of effects on reproduction of Eisenia fetida/Eisenia andrei
ISO 11268-2:2012 specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining the effects of soil contaminants and chemicals on the reproduction of Eisenia fetida/Eisenia andrei by dermal and alimentary uptake. This chronic test is applicable to soils and soil materials of unknown quality, e.g. from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites concerned, and waste materials. Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For contaminated soils, the effects are determined in the test soil and in a control soil. According to the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) should be either an uncontaminated soil comparable to the soil sample to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g. artificial soil). Information is provided on how to use this method for testing chemicals under temperate as well as under tropical conditions. The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry's constant) or the air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at 25 °C. This method does not take into account the persistence of the substance during the test.
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre — Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction de Eisenia fetida/Eisenia andrei
L'ISO 11268-2:2012 spécifie l'une des méthodes permettant d'évaluer la fonction d'habitat des sols et de déterminer les effets de contaminants du sol et de produits chimiques sur la reproduction d'Eisenia fetida/Eisenia andrei par absorption cutanée et ingestion. Cet essai chronique s'applique aux sols et aux matériaux de type sol de qualité inconnue, provenant par exemple de sites contaminés, de sols amendés, de sols après remédiation, de sols agricoles ou autres sites d'intérêt et de déchets. Les effets des substances sont évalués à l'aide d'un sol standard, de préférence un substrat de sol artificiel défini. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol témoin. Selon l'objectif de l'étude, le substrat témoin et de dilution (gamme de dilutions d'un sol contaminé) peut être soit un sol non contaminé comparable à l'échantillon de sol à évaluer (sol de référence), soit un sol standard (par exemple un sol artificiel). Des informations sont fournies sur la manière d'utiliser cette méthode pour évaluer des produits chimiques dans des conditions tempérées ainsi que dans des conditions tropicales. La méthode ne s'applique pas aux substances volatiles, c'est-à-dire aux substances pour lesquelles H (constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de vapeur à 25 °C excède 0,013 3 Pa. Cette méthode ne tient pas compte de la stabilité de la substance pendant l'essai.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11268-2
Second edition
2012-11-01
Soil quality — Effects of pollutants on
earthworms —
Part 2:
Determination of effects on reproduction
of Eisenia fetida/Eisenia andrei
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre —
Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction de Eisenia fetida/
Eisenia andrei
Reference number
ISO 11268-2:2012(E)
©
ISO 2012
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ISO 11268-2:2012(E)
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Published in Switzerland
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ISO 11268-2:2012(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 3
5 Reagents and material . 4
6 Apparatus . 5
7 Procedure . 6
7.1 Experimental design . 6
7.2 Preparation of test mixture . 7
7.3 Addition of the earthworms . 8
7.4 Test conditions and measurements . 8
7.5 Reference substance . 9
8 Calculation and expression of results . 9
8.1 Calculation . 9
8.2 Expression of results . 9
9 Validity of the test . 9
10 Statistical analysis . 9
10.1 General . 9
10.2 Single-concentration tests .10
10.3 Multi-concentration tests .10
11 Test report . 11
Annex A (informative) Determination of the chronic toxicity of chemicals on earthworms under
tropical conditions .13
Annex B (informative) Culturing of Eisenia fetida and Eisenia andrei .15
Annex C (informative) Determination of water holding capacity of artificial soil .16
Annex D (informative) Techniques for counting juvenile worms hatched from cocoons.17
Annex E (informative) Performance of the method .18
Bibliography .20
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ISO 11268-2:2012(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11268-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 11268-2:1998), which has been technically revised.
ISO 11268 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Effects of pollutants on earthworms:
— Part 1: Determination of acute toxicity to Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Part 2: Determination of effects on reproduction of Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations
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ISO 11268-2:2012(E)
Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in soil and are
[34] [35]
proposed to complement conventional chemical analysis (see ISO 15799 and ISO 17616 ). ISO 15799
includes a list and short characterization of recommended and standardized test systems and ISO 17616 gives
guidance on the choice and evaluation of the bioassays. Aquatic test systems with soil eluate are applied to
obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching the groundwater by the water path
(retention function of soils), whereas terrestrial test systems are used to assess the habitat function of soils. As
standardized test systems using earthworms as indicator organisms for the habitat function of soil, an acute
test for survival and a chronic test for reproduction are available.
This part of ISO 11268 describes a method that is based on the determination of sublethal effects of contaminated
soils on adult earthworms of the species Eisenia fetida (Savigny 1826) and Eisenia andrei (André 1963).
Optionally, the method can be used for testing chemicals added to standard soils (e.g. artificial soil) for their
sublethal hazard potential to earthworms. Finally, information is provided on how to use this method for testing
chemicals under tropical conditions (see Annex A).
Eisenia fetida and Eisenia andrei are considered to be representatives of soil fauna and earthworms in
particular. Background information on the ecology of earthworms and their use in ecotoxicological testing is
available. Other species, e.g. Aporrectodea caliginosa, Lumbricus rubellus and Lumbricus terrestris, have also
been used as test organisms. These or other species have not been proven to be more sensitive in general,
[16][17]
and the database and experience in testing soils is small .
This part of ISO 11268 has been drawn up taking into consideration test procedures adopted by the Organization
[27][28] [11]
for Economic Cooperation and Development and by the European Union .
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11268-2:2012(E)
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms —
Part 2:
Determination of effects on reproduction of Eisenia fetida/
Eisenia andrei
WARNING — Contaminated soils may contain unknown mixtures of toxic, mutagenic, or otherwise harmful
chemicals or infectious microorganisms. Occupational health risks may arise from dust or evaporated
chemicals during handling and incubation. Precautions should be taken to avoid skin contact.
1 Scope
This part of ISO 11268 specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining
the effects of soil contaminants and chemicals on the reproduction of Eisenia fetida/Eisenia andrei by dermal and
alimentary uptake. This chronic test is applicable to soils and soil materials of unknown quality, e.g. from contaminated
sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites concerned, and waste materials.
Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For
contaminated soils, the effects are determined in the test soil and in a control soil. According to the objective of the
study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) should be either an uncontaminated
soil comparable to the soil sample to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g. artificial soil).
Information is provided on how to use this method for testing chemicals under temperate as well as under
tropical conditions.
The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry’s constant) or the
air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at 25 °C.
This method does not take into account the persistence of the substance during the test.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document
(including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under
aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level using
barium chloride solution
ISO 11268-1, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms — Part 1: Determination of acute toxicity to
Eisenia fetida/Eisenia andrei
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric method
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ISO 11268-2:2012(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
[ISO 15176:2002]
3.2
growth
increase in biomass (i.e. the fresh mass of organisms)
NOTE It is expressed as a percentage of the fresh mass of organisms at the start of the test.
3.3
reproduction
mean number of offspring per test vessel after eight weeks’ incubation under the specified test conditions
3.4
ER (effective rate) or EC (effective concentration)
x x
x % effect rate or concentration of the test sample or test substance at which reproduction is reduced by x %
compared to the control
3.5
limit test
single concentration test consisting of at least four replicates each, the test sample without any dilution or the
highest concentration of test substance mixed into the control soil and the control
3.6
lowest observed effect rate (LOER) or effect concentration (LOEC)
lowest tested percentage of a test sample in a control soil or concentration of a substance at which a statistically
significant effect is observed
NOTE The LOEC is expressed as a percentage of test-soil dry mass per test-mixture dry mass. All test mixtures
above the LOEC have a harmful effect equal to or greater than that observed at the LOEC. If this condition cannot be
satisfied, an explanation should be given for how the LOEC and NOEC (3.7) have been selected.
3.7
NOER (no observed effective rate) or NOEC (no observed effect concentration)
test soil percentage immediately below the LOER/LOEC or, highest tested concentration of a test substance
which, when compared to the control, has no statistically significant lethal or other effect such as reduced
reproduction or mass alteration (error probability: p < 0,05)
NOTE The NOEC is expressed as a percentage of test-soil dry mass per test-mixture dry mass.
3.8
reference soil
uncontaminated site-specific soil (e.g. collected in the vicinity of a contaminated site) with similar properties
(nutrient concentrations, pH, organic carbon content and texture) to the test soil
3.9
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (e.g. pH, texture, organic matter content) are within
a known range
[11] [27] [23]
EXAMPLE Euro-Soils , artificial soil , LUFA standard soil .
NOTE The properties of standard soils can differ from those of the test soil.
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ISO 11268-2:2012(E)
3.10
control soil
reference or standard soil used as a control and as a medium for preparing dilution series with test samples or
a reference substance, which fulfils the validity criteria
NOTE In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving the test
validity criteria before using the soil in a definitive test.
3.11
test mixture
mixture of contaminated soil or the test substance with a control soil (3.10)
NOTE Test mixtures are given in percent of contaminated soil based on soil dry mass.
3.12
test mixture ratio
ratio of test soil to control soil in a test mixture
NOTE Different ratios may be applied in a dilution series to establish a dose-response relationship.
4 Principle
The effects on reproduction of adult earthworms (species: Eisenia fetida or Eisenia andrei) exposed to the test
soil are compared to those observed for samples exposed to a control soil. If appropriate, effects based on
exposure to a dilution range of contaminated soil or range of concentrations of a test substance are determined.
In addition, observations on growth and survival of adult earthworms are recorded. Test mixtures are prepared
at the start of the test and are not renewed within the test period.
After four weeks, adult worms are removed from the test containers and effects on mortality and biomass are
measured by counting and weighing. The effect on reproduction as the definitive end point is measured by
counting the number of offspring hatched from the cocoons after an additional period of four weeks. The results
obtained from the tests are compared with a control soil or, if appropriate, are used to determine the dilutions or
concentrations which cause no effects on biomass, mortality and reproduction (NOER/NOEC) and the dilution
(concentration) resulting in x % reduction of juveniles hatched from cocoons compared to the control (ER /EC ,
x x
56 d), respectively.
If testing a dilution or concentration series, all test dilutions/concentrations above the LOER/LOEC shall have a
harmful effect equal to, or greater than, that observed at the LOER/LOEC. Where there is no prior knowledge
of the dilution/concentration of the test soil/test substance likely to have an effect, then it is useful to conduct
the test in two steps:
— a preliminary test carried out, in accordance with ISO 11268-1, to give an indication of the effect
dilution/concentration and of the dilution/concentration giving no mortality (NOER/NOEC).
Dilutions/concentrations to be used in the definitive test can then be selected.
— the definitive test to determine sublethal effects of (dilutions of) contaminated soil or the concentration of
a chemical which, when evenly mixed into the standard soil, causes no significant effects on numbers of
offspring hatched from cocoons compared with the control (NOER/NOEC), and the lowest concentration
causing effects (LOER/LOEC).
NOTE The use of a reference soil is an essential requirement to demonstrate the present status of the test population,
and to avoid misinterpretation of results.
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ISO 11268-2:2012(E)
5 Reagents and material
[15], [19],
5.1 Biological material, consists of adult earthworms of the species Eisenia fetida or Eisenia andrei
[20],
which are between two months and one year old, with a clitellum, and a wet mass between 300 mg and
600 mg (E. fetida) and between 250 mg and 600 mg (E. andrei).
Select worms used for the test to form, as far as is practicable, a homogeneous population from the standpoint
of age, size and mass. Worms should preferably be selected from a synchronized culture with a relatively
homogeneous age structure. Before the test, wash them with potable water.
NOTE An example of culturing Eisenia fetida/Eisenia andrei is given in Annex B.
Condition the selected worms for one day to seven days in standard or control soil before use. The food, which
is also used as a food source in the test (see 5.3), shall be given in sufficient amount (see 7.4).
5.2 Test sample, may consist of field-collected soil or control soil amended by the test mixture.
5.2.1 Field-collected soils, soil or waste materials
The sample(s) can be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern, or waste
materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed material, or
manure) under consideration for possible land disposal.
Test samples shall be sieved by 4 mm mesh and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air-dried without
heating before sieving. Storage of test samples should be as short as possible. Store the soil in accordance
with ISO 10381-6 using containers that minimize losses of soil contaminants by volatilization and sorption to
the container walls. Soil pH should not be corrected as it can influence bioavailability of soil contaminants.
For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled from
a field site:
— pH in accordance with ISO 10390,
— texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277
— water content in accordance with ISO 11465,
— water holding capacity according to Annex C,
— cationic exchange capacity in accordance with ISO 11260,
— organic carbon in accordance with ISO 10694.
NOTE It is important to measure the water holding capacity of all mixtures used in the test.
5.2.2 Control soil, either a) reference soil (3.8) or b) standard soil (3.9) that allows the presence of earthworms.
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should be treated
and characterized like the test samples. If a toxic contamination or unusual soil properties cannot be ruled
out, standard control soils should be preferred.
b) For testing the effects of substances mixed into soil or making dilutions of the test sample, standard soils
shall be used to prepare the test sample. The properties of the field-collected standard soil shall be reported.
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ISO 11268-2:2012(E)
The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:
Percentage expressed
on a dry-mass basis
— Sphagnum peat finely ground and with no visible plant remains 10 %
— Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
— Industrial quartz sand (dominant fine sand with more 69 %
than 50 % of particle sizes 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverized, analytical grade) are necessary to get a
3
pH of 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Taking the properties of highly non-polar (log K > 2, where K is the octanol/water coefficient) or ionizing
ow ow
substances into account, 5 % of peat have proven to be sufficient for maintaining the desired structure of the artificial soil.
NOTE 2 It has been demonstrated that Eisenia fetida can comply with the validity criteria, even as regards reproduction,
[18]
when tested in field soils with lower organic carbon content (e.g. 2,7 %) , and experience shows that this can be achieved in
artificial soil with 5 % peat. It is therefore not necessary, before using such a soil in a definitive test, to demonstrate the suitability
[28].
of the artificial soil in complying with the validity criteria, unless the peat contents lowered more than specified above
Prepare the artificial soil at least three days prior to starting the test, by mixing the dry constituents listed above
thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required is added while mixing is
continued. Allowance should be made for any water that is used for introducing the test mixture into the soil.
The amount of calcium carbonate required can vary, depending on the properties of the individual batch of
sphagnum peat and should be determined by measuring sub-samples immediately before the test. Store the
mixed artificial soil at room temperature for at least two days to equilibrate acidity. To determine pH and the
maximum water holding capacity, the dry artificial soil is pre-moistened one or two days before starting the test
by adding deionized water to obtain approximately half of the required final water content of 40 % to 60 % of
the maximum water holding capacity.
The total water holding capacity is determined according to Annex C; the pH is determined according to ISO 10390.
5.3 Feeding, any food of a quality shown to be suitable for at least maintaining worm mass during the test is
[20]
considered acceptable. Experience has shown that oatmeal, mashed potato powder , cow or horse manure
is a suitable food. Checks should be made to ensure that cows or horses from which manure is obtained are not
subject to medication or treatment with substances, such as growth promoters, nematicides or similar veterinary
products that could adversely affect the worms during the test. Self-collected cow manure is recommended,
since experience has shown that commercially available cow manure used as garden fertilizer can have adverse
effects on the worms. The manure should be air-dried, finely ground and pasteurized before use.
Each fresh batch of food should be fed to a non-test worm culture before use in a test, to ensure that it is of
suitable quality. Growth and cocoon production should not be reduced compared to worms kept in a substrate
[27]
that does not contain the new batch of food (conditions as described in OECD 207 ).
5.4 Boric acid, as a reference substance.
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and the following.
6.1 Test containers, made of glass or another chemically inert material, of about one to two litres in capacity,
2
should be used. The containers should have a cross-sectional area of approximately 200 cm so that a moist
substrate depth of about 5 cm to 6 cm is achieved when 500 g dry mass of substrate are added. Test containers
shall permit gaseous exchange between the medium and the atmosphere and access of light (e.g. by means of
a perforated transparent cover), and shall have provisions to prevent earthworms from escaping (e.g. by using
a tape to fix the cover).
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ISO 11268-2:2012(E)
6.2 Apparatus to determine the dry mass of the substrate, in accordance with ISO 11465.
6.3 Large-scale laboratory mixer, for the preparation of the test sample (5.2).
6.4 Precision balance, with an accuracy of at least 1 mg.
6.5 Polyethylene-membrane, perforated with small holes allowing exchanges between the sample and
the atmosphere.
6.6 Test environment.
6.6.1 Enclosure, capable of being controlled at a temperature of (20 ± 2) °C.
6.6.2 Light source (e.g. white fluorescent tubes), capable of delivering a constant light intensity of 400 Ix to
800 Ix on the containers at a controlled light/dark cycle of between 12 h:12 h and 16 h:8 h.
7 Procedure
7.1 Experimental design
7.1.1 General
A sample of field-collected test soil can be tested at a single concentration (typically 100 %) or evaluated for
toxicity in a multi-concentration test, whereby a series of dilutions are prepared by mixing measured quantities
with a control soil (5.2.2). When testing substances, a series of concentrations is prepared by mixing quantities
of the test substance with a standard soil (e.g. artificial soil). The concentrations are expressed in milligrams of
test substance per kilogram of dried control soil.
Depending on the knowledge of relevant response levels, a preliminary test may precede the definitive test. Each
definitive test consists of a series of soil mixtures (treatments). Each treatment is replicated at least four times.
7.1.2 Preliminary test
A preliminary test to find the range of mixture ratios affecting earthworms is optional, e.g. 0 %, 1 %, 5 %, 25 %,
50 %, 75 %, 100 %, or of the test substance, e.g. 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg and 1 000 mg/kg.
The preliminary test is conducted without replication.
When no effects are observed, even at 100 % contaminated soil or at concentrations of 1 000 mg test
substance/kg standard soil (dry mass), the definitive test can be designed as a limit test.
7.1.3 Definitive test
The design of the definitive test depends on the test objectives. Typically, the habitat properties of samples of a
field-collected test soil are characterized by comparing the biological effects found in the test soil(s) with those
found in the control soil (3.10) (single-concentration tests). If a reference soil (3.8) to be used as a control is not
available or not appropriate due to toxicity or atypical physicochemical characteristics, effects are compared
to a standard soil instead. If a reference soil is available to be used as a control soil, it is recommended that a
standard soil exhibiting a typical known response be included, and that the results be used to judge the validity
[18]
and acceptability of the test . Results found for the standard soil assist in distinguishing contaminant effects
from non-contaminant effects caused by soil physicochemical properties of the test soil and/or the control soil.
If, for characterization purposes, a test design including a dilution series is required, three designs are possible
(the concentrations shall be spaced by a factor not exceeding 2):
— For the NOEC/NOER approach, at least five concentrations in a geometric series should be used. Four
replicates for each concentration plus eight controls are recommended.
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ISO 11268-2:2012(E)
— For the EC approach, 12 concentrations should be used. Two replicates for each concentration plus six
x
controls are recommended. The spacing factor can be variable: smaller at low concentrations and larger
at high concentrations.
— For the mixed approach, six to eight concentrations in a geometric series should be used. Four replicates
for each concentration plus eight controls are
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11268-2
Deuxième édition
2012-11-01
Qualité du sol — Effets des polluants vis-
à-vis des vers de terre —
Partie 2:
Détermination des effets sur la
reproduction de Eisenia fetida/Eisenia
andrei
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms —
Part 2: Determination of effects on reproduction of Eisenia fetida/
Eisenia andrei
Numéro de référence
ISO 11268-2:2012(F)
©
ISO 2012
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ISO 11268-2:2012(F)
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ISO 11268-2:2012(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Réactifs et matériaux . 4
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire . 6
7.1 Plan d’expérimentation . 6
7.2 Préparation des mélanges d’essai . 7
7.3 Introduction des vers de terre . 9
7.4 Conditions d’essai et mesurages . 9
7.5 Substance de référence . 9
8 Calcul et expression des résultats . 9
8.1 Calcul . 9
8.2 Expression des résultats . 9
9 Validité de l’essai .10
10 Analyse statistique .10
10.1 Généralités .10
10.2 Essais à une seule concentration .10
10.3 Essais à plusieurs concentrations . 11
11 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Détermination de la toxicité chronique des substances chimiques pour les vers
de terre dans des conditions tropicales .13
Annexe B (informative) Élevage d’Eisenia fetida et d’Eisenia andrei .15
Annexe C (informative) Détermination de la capacité de rétention d’eau d’un sol artificiel .16
Annexe D (informative) Techniques de comptage des vers juvéniles éclos des cocons .17
Annexe E (informative) Performance de la méthode .18
Bibliographie .20
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ISO 11268-2:2012(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 11268-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11268-2:1998), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
L’ISO 11268 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Effets des
polluants vis-à-vis des vers de terre:
— Partie 1: Détermination de la toxicité aiguë vis-à-vis de Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction de Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Partie 3: Lignes directrices relatives à la détermination des effets sur site
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ISO 11268-2:2012(F)
Introduction
Des systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les effets des
contaminants présents dans le sol et sont proposés en complément d’une analyse chimique conventionnelle
[34] [35]
(voir l’ISO 15799 et l’ISO 17616 ). L’ISO 15799 comprend une liste et une brève caractérisation des
systèmes d’essai recommandés et normalisés et l’ISO 17616 donne des lignes directrices pour le choix et
l’évaluation des essais biologiques. Les systèmes d’essais aquatiques sur éluat de sol sont mis en œuvre pour
obtenir des informations sur la fraction des contaminants susceptibles d’atteindre les eaux souterraines par le
mouvement de l’eau (fonction de rétention des sols), alors que les systèmes d’essais terrestres sont utilisés
pour évaluer la fonction d’habitat des sols. En tant que systèmes d’essais normalisés utilisant des vers de terre
comme organismes indicateurs pour la fonction d’habitat du sol, un essai de toxicité aiguë pour la survie et un
essai de toxicité chronique pour la reproduction sont disponibles.
La présente partie de l’ISO 11268 décrit une méthode basée sur la détermination des effets sublétaux des sols
contaminés pour des vers de terre adultes des espèces Eisenia fetida (Savigny 1826) et Eisenia andrei (André
1963). La méthode peut éventuellement être utilisée pour évaluer le potentiel toxique aigu pour les vers de terre
de produits chimiques ajoutés à un sol standard (par exemple un sol artificiel). En dernier lieu, des informations
sont fournies sur la manière d’utiliser cette méthode pour évaluer des produits chimiques dans des conditions
tropicales (voir l’Annexe A).
Eisenia fetida et Eisenia andrei sont considérés comme étant représentatifs de la faune du sol et des vers de
terre en particulier. Des informations de base sur l’écologie des vers de terre et leur utilisation en écotoxicologie
sont disponibles. D’autres espèces, par exemple Aporrectodea caliginosa, Lumbricus rubellus et Lumbricus
terrestris, ont également été utilisés comme organismes d’essai. En général, ces espèces ou d’autres ne se
sont pas avérées être plus sensibles, et les bases de données et l’expérience dans l’évaluation des sols sont
[16][17]
également réduites .
La présente partie de l’ISO 11268 a été élaborée en tenant compte des modes opératoires d’essai adoptés par
[27][28] [11]
l’Organisation de coopération et de développement économiques et par l’Union européenne .
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NORME INTERNATIONALE ISO 11268-2:2012(F)
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre —
Partie 2:
Détermination des effets sur la reproduction de Eisenia fetida/
Eisenia andrei
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de produits
chimiques toxiques, mutagènes ou nocifs d’une autre manière ou des micro-organismes infectieux.
Des risques pour la santé au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l’évaporation de
produits chimiques pendant la manipulation et l’incubation. Il convient de prendre des mesures pour
éviter tout contact avec la peau.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 11268 spécifie l’une des méthodes permettant d’évaluer la fonction d’habitat des
sols et de déterminer les effets de contaminants du sol et de produits chimiques sur la reproduction d’Eisenia
fetida/Eisenia andrei par absorption cutanée et ingestion. Cet essai chronique s’applique aux sols et aux
matériaux de type sol de qualité inconnue, provenant par exemple de sites contaminés, de sols amendés, de
sols après remédiation, de sols agricoles ou autres sites d’intérêt et de déchets.
Les effets des substances sont évalués à l’aide d’un sol standard, de préférence un substrat de sol artificiel
défini. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol témoin.
Selon l’objectif de l’étude, le substrat témoin et de dilution (gamme de dilutions d’un sol contaminé) peut être
soit un sol non contaminé comparable à l’échantillon de sol à évaluer (sol de référence), soit un sol standard
(par exemple un sol artificiel).
Des informations sont fournies sur la manière d’utiliser cette méthode pour évaluer des produits chimiques
dans des conditions tempérées ainsi que dans des conditions tropicales.
La méthode ne s’applique pas aux substances volatiles, c’est-à-dire aux substances pour lesquelles H
(constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de
vapeur à 25 °C excède 0,013 3 Pa.
Cette méthode ne tient pas compte de la stabilité de la substance pendant l’essai.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d’échange cationique effective et du taux de
saturation en bases échangeables à l’aide d’une solution de chlorure de baryum
ISO 11268-1, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre — Partie 1: Détermination de la
toxicité aiguë vis-à-vis de Eisenia fetida/Eisenia andrei
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ISO 11268-2:2012(F)
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des sols —
Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol et résultant de l’activité humaine
[ISO 15176:2002]
3.2
croissance
augmentation de la biomasse (c’est-à-dire la masse fraîche des organismes)
NOTE Elle est exprimée en pourcentage de la masse fraîche des organismes au début de l’essai.
3.3
reproduction
nombre moyen de jeunes produits par récipient d’essai après huit semaines d’incubation dans des conditions
d’essai spécifiées
3.4
RE (taux efficace) ou CE (concentration efficace)
x x
taux ou concentration de l’échantillon pour essai ou de la substance d’essai auquel ou à laquelle la reproduction
est réduite de x % par rapport au témoin
3.5
essai limite
essai à une seule concentration comprenant au moins quatre réplicats pour chacun, l’échantillon pour essai
sans dilution ou la plus forte concentration de substances d’essai mélangées dans le sol témoin et le témoin
3.6
plus faible taux (RMEO) ou concentration ayant un effet observé (CMEO)
pourcentage le plus faible d’un échantillon pour essai dans un sol témoin, ou concentration la plus faible d’une
substance, pour lequel (laquelle) un effet statistiquement significatif est observé
NOTE La CMEO est exprimée en pourcentage de masse sèche de sol d’essai par masse sèche de mélange d’essai.
Tous les mélanges d’essai supérieurs à la CMEO ont un effet dommageable supérieur ou égal à celui observé à la CMEO.
Si cette condition ne peut pas être satisfaite, il convient d’expliquer comment la CMEO et la CSEO (3.7) ont été choisies.
3.7
RSEO (taux sans effet observé) ou CSEO (concentration sans effet observé)
pourcentage de sol d’essai immédiatement inférieur à la RMEO/CMEO ou concentration d’essai la plus élevée
d’une substance soumise à essai qui, comparée au témoin, n’a aucun effet létal ou autre effet statistiquement
significatif, tel qu’une réduction de la reproduction ou une modification de la masse (probabilité d’erreur p < 0,05)
NOTE La CSEO est exprimée en pourcentage de masse sèche du sol d’essai par masse sèche du mélange d’essai.
3.8
sol de référence
sol non contaminé spécifique au site (par exemple prélevé au voisinage d’un site contaminé) ayant des
propriétés similaires (concentrations d’éléments nutritifs, pH, teneur en carbone organique et texture) à celles
du sol soumis à essai
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3.9
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les principales propriétés (par exemple pH, texture, teneur en
matières organiques) se situent dans une gamme connue
[11] [27] [23]
EXEMPLE Euro-Soils , sol artificiel , sol standard LUFA .
NOTE Les propriétés des sols standards peuvent différer de celles du sol d’essai.
3.10
sol témoin
sol de référence ou sol standard utilisé comme témoin et comme milieu pour préparer une gamme de dilutions
avec les échantillons pour essai ou une substance de référence qui satisfait les critères de validité
NOTE Pour un sol naturel, il est recommandé de démontrer sa capacité à être utilisé pour un essai et à atteindre les
critères de validité de l’essai avant de l’utiliser dans un essai définitif.
3.11
mélange d’essai
mélange d’un sol contaminé ou de la substance soumise à essai avec un sol témoin (3.10)
NOTE Les mélanges d’essai sont donnés en pourcentage de sol contaminé sur la base de la masse sèche du sol.
3.12
ratio de mélange d’essai
rapport entre le sol soumis à essai et le sol témoin dans un mélange d’essai
NOTE Différents ratios peuvent être appliqués dans une gamme de dilutions afin de déterminer une relation dose-réponse.
4 Principe
Les effets sur la reproduction de vers de terre adultes (espèce Eisenia fetida ou Eisenia andrei) exposés au
sol soumis à essai sont comparés à ceux observés pour des échantillons exposés à un sol témoin. Le cas
échéant, les effets sont déterminés sur la base de l’exposition à une gamme de dilutions du sol contaminé
ou à une gamme de concentrations de la substance soumise à essai. De plus, les observations relatives à la
croissance et à la survie des vers de terre adultes sont consignées. Les mélanges d’essai sont préparés au
début de l’essai et ne sont pas renouvelés au cours de la période d’essai.
Au bout de quatre semaines, les vers adultes sont retirés des récipients d’essai et les effets sur la mortalité et
la biomasse sont mesurés par comptage et pesée. L’effet sur la reproduction, qui constitue le critère d’effet final,
est mesuré en comptant le nombre de jeunes éclos des cocons après une période supplémentaire de quatre
semaines. Les résultats obtenus lors des essais sont comparés à ceux obtenus avec un sol témoin ou, le cas
échéant, sont utilisés pour déterminer respectivement les dilutions ou les concentrations qui ne provoquent pas
d’effet sur la biomasse, la mortalité et la reproduction (RMEO/CMEO) ainsi que la dilution (concentration) entraînant
une réduction de x % du nombre de juvéniles éclos des cocons par rapport au témoin (RE /CE , 56 jours).
x x
Lorsqu’une gamme de dilutions ou de concentrations est soumise à essai, toutes les dilutions/concentrations
d’essai supérieures à la RMEO/CMEO) doivent avoir un effet dommageable supérieur ou égal à celui observé
à la RMEO/CMEO. Lorsqu’on ne connaît pas la dilution/concentration à laquelle le sol soumis à essai/la
substance d’essai est susceptible de produire un effet, il est utile de conduire l’essai en deux étapes.
— Un essai préliminaire est réalisé conformément à l’ISO 11268-1 pour obtenir une indication de la
dilution/concentration produisant un effet et de la dilution/concentration ne provoquant pas de mortalité
(RSEO/CSEO). Les dilutions/concentrations à utiliser au cours de l’essai définitif peuvent ensuite être choisies.
— Un essai définitif pour déterminer les effets sublétaux du (des dilutions de) sol contaminé ou la concentration
de la substance chimique qui, lorsqu’il (elle) est uniformément réparti(e) dans le sol standard, n’a pas
d’effet significatif sur le nombre de jeunes éclos des cocons comparé au témoin (RSEO/CSEO) et la plus
faible concentration produisant un effet (RMEO/CMEO).
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ISO 11268-2:2012(F)
NOTE L’utilisation d’un sol de référence est une exigence essentielle pour démontrer l’état actuel de la population
soumise à essai et éviter toute mauvaise interprétation des résultats.
5 Réactifs et matériaux
[15][19]
5.1 Réactif biologique, constitué de vers de terre adultes de l’espèce Eisenia fetida ou Eisenia andrei
[20]
, âgés de deux mois à un an, possédant un clitellum et dont la masse humide est comprise entre 300 mg et
600 mg (E. fetida) ou entre 250 mg et 600 mg (E. andrei).
Sélectionner les vers à utiliser pour l’essai de manière à obtenir, dans la mesure du possible, une population
homogène du point de vue de l’âge, de la taille et de la masse. Il convient de préférence de sélectionner les
vers dans un élevage synchrone ayant une structure d’âge relativement homogène. Laver les vers à l’eau
potable avant l’essai.
NOTE Un exemple de technique d’élevage d’Eisenia fetida/Eisenia andrei est donné dans l’Annexe B.
Avant l’utilisation, conditionner les vers sélectionnés pendant 1 jour à 7 jours dans un sol standard ou un
sol témoin. La nourriture, qui est également utilisée comme source d’alimentation dans le cadre de l’essai
(voir 5.3), doit être dispensée en quantité suffisante (voir 7.4).
5.2 Échantillon soumis à essai, qui peut être constitué d’un sol prélevé sur le terrain ou d’un sol témoin
amendé par le mélange d’essai.
5.2.1 Sols prélevés sur le terrain, sol ou déchets
Le ou les échantillons peuvent être un sol prélevé sur un site industriel, agricole ou autre site d’intérêt, ou des
déchets (par exemple matériau de dragage, boues provenant d’une station d’épuration des eaux urbaines,
matériau composite ou fumier) pour lesquels une éventuelle mise en dépôt terrestre est envisagée.
Les échantillons pour essai doivent être tamisés à 4 mm et soigneusement mélangés. Si nécessaire, le sol
peut être séché à l’air sans chauffage avant le tamisage. Il convient que la conservation des échantillons pour
essai soit aussi courte que possible. Conserver le sol conformément à l’ISO 10381-6 en utilisant des récipients
qui réduisent au minimum les pertes de contaminants du sol par volatilisation et sorption sur les parois des
récipients. Il convient de ne pas corriger le pH du sol car il peut avoir une incidence sur la biodisponibilité des
contaminants du sol.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées pour chaque
échantillon de sol prélevé sur le terrain:
— pH conformément à l’ISO 10390;
— texture (sable, limon, vase) conformément à l’ISO 11277;
— teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
— capacité de rétention d’eau conformément à l’Annexe C;
— capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260;
— carbone organique conformément à l’ISO 10694.
NOTE Il est important de mesurer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai.
5.2.2 Sol témoin, soit a) sol de référence (3.8) soit b) sol standard (3.9) permettant la présence de vers de terre.
a) Si des sols de référence provenant de zones non contaminées voisines d’un site contaminé sont disponibles,
il convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les échantillons soumis à essai. S’il
est impossible d’exclure une contamination toxique ou des propriétés inhabituelles du sol, il convient de
préférer des sols témoins standards.
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b) Pour évaluer les effets de substances mélangées au sol ou pour préparer les dilutions de l’échantillon
soumis à essai, des sols standards doivent être utilisés pour préparer l’échantillon pour essai. Les
propriétés du sol standard prélevé sur le terrain doivent être consignées dans le rapport.
Le substrat appelé «sol artificiel» peut être utilisé comme un sol standard et a la composition suivante:
Pourcentage exprimé
en masse sèche
— Tourbe de sphaignes, finement moulue, exempte de tout résidu 10 %
végétal visible
— Argile kaolinique contenant au moins 30 % de kaolinite 20 %
— Sable de quartz industriel (contenant en majorité du sable fin, 69 %
constitué à plus de 50 % de grains de granulométrie comprise entre
0,05 mm et 0,2 mm)
Environ 0,3 % à 1,0 % de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) sont nécessaires
3
pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Afin de prendre en compte les propriétés des substances fortement non polaires [log K > 2, où K est le
ow ow
coefficient de partage (octanol/eau)] ou ionisantes, 5 % de tourbe se sont avérés suffisants pour maintenir la structure
souhaitée du sol artificiel.
NOTE 2 Il a été démontré qu’Eisenia fetida peut respecter les critères de validité, même en ce qui concerne la reproduction,
[18]
lorsqu’il est soumis à essai dans des sols ayant une plus faible teneur en carbone organique (par exemple 2,7 %) , et des
expériences prouvent que cette teneur peut être obtenue dans un sol artificiel avec 5 % de tourbe. Par conséquent, avant
d’utiliser un tel sol dans un essai définitif, il n’est pas nécessaire de démontrer que le sol artificiel permet de respecter les
[28]
critères de validité, sauf si la teneur en tourbe est inférieure à la valeur spécifiée ci-dessus .
Préparer le sol artificiel au moins trois jours avant le début de l’essai, en mélangeant soigneusement les
constituants secs indiqués ci-dessus dans un mélangeur de laboratoire de grandes dimensions. Une partie
de l’eau déionisée nécessaire est ajoutée pendant le mélange. Il convient de tenir compte de l’eau qui est
utilisée pour introduire le mélange d’essai dans le sol. La quantité de carbonate de calcium nécessaire peut
varier selon les propriétés du lot particulier de tourbe de sphaignes et il convient qu’elle soit déterminée par
des mesurages effectués sur des sous-échantillons immédiatement avant l’essai. Conserver le sol artificiel
mélangé à température ambiante pendant au moins deux jours pour équilibrer l’acidité. Pour déterminer le pH
et la capacité maximale de rétention d’eau, le sol artificiel sec est pré-humidifié un jour ou deux jours avant le
début de l’essai en ajoutant de l’eau déionisée de manière à atteindre approximativement la moitié de la teneur
finale en eau requise correspondant de 40 % à 60 % de la capacité maximale de rétention d’eau.
La capacité totale de rétention d’eau est déterminée conformément à l’Annexe C; le pH est déterminé
conformément à l’ISO 10390.
5.3 Alimentation. Est considéré comme acceptable tout aliment dont la qualité s’est avérée appropriée pour
le maintien, au minimum, de la masse des vers pendant l’essai. L’expérience a montré que la farine d’avoine, la
[20]
poudre de pomme de terre écrasée , la bouse de vache ou le crottin de cheval constitue un aliment adéquat.
Il convient de procéder à des contrôles afin de s’assurer que les vaches ou les chevaux produisant ce fumier
ne sont pas traités par des médicaments ou d’autres substances, tels que des activateurs de croissance,
des nématicides ou des produits vétérinaires comparables pouvant avoir un effet nocif sur les vers pendant
l’essai. Le fumier recueilli en milieu naturel est recommandé, car l’expérience a montré que la bouse de vache
disponible dans le commerce, utilisée comme engrais dans les jardins, peut avoir des effets nocifs sur les vers.
Il convient que le fumier soit séché à l’air, finement broyé et pasteurisé avant l’emploi.
Avant utilisation, il convient de contrôler la qualité de chaque lot de nourriture fraîche en le donnant à un
élevage de vers non soumis à essai. Il convient que la croissance et la production de cocons ne diminuent pas
par rapport à celles de vers élevés dans un substrat ne contenant pas le nouveau lot de nourriture (conditions
[27]
telles que décrites dans l’OCDE 207 ).
5.4 Acide borique, utilisé comme substance de référence.
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ISO 11268-2:2012(F)
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et ce qui suit.
6.1 Récipients d’essai, en verre ou autre matériau chimiquement inerte, de capacité comprise environ entre
2
1 l et 2 l. Il convient que les récipients aient une section transversale d’environ 200 cm de manière à atteindre
une hauteur de substrat humide d’environ 5 cm à 6 cm lorsque 500 g de substrat équivalent sec sont ajoutés. Les
récipients d’essai doivent permettre les échanges gazeux entre le milieu et l’atmosphère ainsi que le passage
de la lumière (par exemple au moyen d’un couvercle transparent perforé). Ils doivent être conçus de manière à
empêcher les vers de terre de s’échapper (par exemple en fixant le couvercle à l’aide de ruban adhésif).
6.2 Appareillage permettant de déterminer la masse sèche du substrat, conformément à l’ISO 11465.
6.3 Mélangeur de laboratoire de grandes dimensions, pour la préparation de l’échantillon soumis à essai (5.2).
6.4 Balance, ayant une précision d’au moins 1 mg.
6.5 Membrane de polyéthylène, perforée de petits trous pour permettre les échanges entre l’échantillon et
l’atmosphère.
6.6 Environnement d’essai.
6.6.1 Enceinte, thermostatée à (20 ± 2) °C.
6.6.2 Source lumineuse (par exemple tubes fluorescents blancs), per
...
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