ISO 29981:2024

Milk products - Enumeration of bifidobacteria - Colony-count technique

This document specifies a method for the selective enumeration of bifidobacteria in milk products by using a colony-count technique at 37 °C under anaerobic conditions. The method is applicable to milk products, such as fermented (e.g. yoghurts) and non-fermented milks (e.g. pasteurized milks, skim milks, whey protein concentrates), milk powders and formulae (e.g. infant formulae, follow-up formulae for older infants, products for young children) where these microorganisms are present and viable, in combination with other lactic acid bacteria or alone. The method is also applicable to starter and probiotic cultures. For proposed quality criteria of dairy products, see, for example, CXS 243-2003. Bifidobacteria used in milk products usually belong to the following species (e.g. References [7] and [10]): - Bifidobacterium adolescentis; - B. animalis subsp. animalis; - B. animalis subsp. lactis; - B. bifidum; - B. breve; - B. longum subsp. infantis; - B. longum subsp. longum.

Produits laitiers — Dénombrement des bifidobacteria présumés — Technique par comptage des colonies

Le présent document spécifie une méthode de dénombrement sélectif des bifidobacteria dans les produits laitiers en utilisant une technique par comptage des colonies à 37 °C dans des conditions anaérobies. La méthode est applicable aux produits laitiers tels que les laits fermentés (par exemple, le yaourt) et non fermentés (par exemple, les laits pasteurisés, les laits écrémés, les concentrés de protéines de lactosérum), les poudres de lait et les préparations (par exemple, les préparations pour nourrissons, les préparations de suite pour nourrissons plus âgés, produits pour enfants en bas âge) où ces micro-organismes sont présents et viables, en combinaison avec d’autres bactéries lactiques ou seuls. La méthode s’applique également aux ferments et cultures probiotiques. Pour les critères de qualité proposés pour les produits laitiers, voir, par exemple, CXS 243-2003. Les bifidobacteria utilisés dans les produits laitiers appartiennent généralement aux espèces suivantes (par exemple, Références [7] et [10]): — Bifidobacterium adolescentis; — B. animalis subsp. animalis; — B. animalis subsp. lactis; — B. bifidum; — B. breve; — B. longum subsp. infantis; — B. longum subsp. longum.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 25-Nov-2024
• ICS: 67.100.01 - Milk and milk products in general
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 6060 - International Standard published
• Start Date: 26-Nov-2024
• Due Date: 06-Oct-2024
• Completion Date: 26-Nov-2024

Relations

• Revises: ISO 29981:2010 - Milk products - Enumeration of presumptive bifidobacteria - Colony count technique at 37 degrees C
• Effective Date: 23-Apr-2020

Overview

ISO 29981:2024 / IDF 220:2024 specifies a standardized colony‑count technique for the selective enumeration of bifidobacteria in milk products. The method uses incubation at 37 °C under anaerobic conditions and is applicable to fermented (e.g., yoghurts) and non‑fermented milks, milk powders and formulae (including infant and follow‑up formulas), whey protein concentrates, and starter/probiotic cultures where bifidobacteria are present and viable.

The standard targets commonly used species such as B. adolescentis, B. animalis (subsp. animalis and lactis), B. bifidum, B. breve and B. longum (subsp. infantis and longum), and provides a validated, reproducible approach for routine dairy microbiology and probiotic labelling.

Key technical topics and requirements

• Selective culture media: use of TOS‑MUP agar (with mupirocin) and the newly introduced TOS agar for selective growth of bifidobacteria.
• Incubation conditions: incubation at 37 °C in anaerobic conditions to promote bifidobacterial colony formation.
• Sample preparation: procedures for preparation of initial suspension and decimal dilutions, with added guidance for dried milk products (e.g., infant formulae).
• Three‑stage method flow: suspension/dilution → inoculation/incubation → colony counting and confirmation (microscopy and selective tests).
• Counting and expression of results: colony counting, calculation and expression of results in accordance with ISO 7218.
• Validation and performance: method validation in line with ISO 17468, performance characteristics, and interlaboratory study results provided in Annex C.
• Supporting requirements: specifications for culture media and reagents, equipment, sampling, storage of incubated plates, quality assurance and reporting.

Practical applications and users

Who benefits from ISO 29981:2024:

• Dairy industry quality control and microbiology laboratories performing routine bifidobacteria enumeration.
• Manufacturers of probiotic and starter cultures validating product counts for labelling and specification compliance.
• Infant formula and milk powder producers ensuring viable bifidobacterial counts in finished products.
• Regulatory and food safety authorities assessing microbiological quality of dairy products.
• Research labs studying probiotic viability, formulation stability and strain quantification.

Practical uses:

• Verifying probiotic label claims and shelf‑life performance.
• Routine QC testing during production and before release.
• Comparative studies of culture media or strain recovery in dairy matrices.

Related standards

• ISO 6887‑1 and ISO 6887‑5 - sample preparation and dilutions for food and milk products.
• ISO 7218 - general requirements and guidance for microbiological examinations.
• ISO 11133 - production and performance testing of culture media.
• ISO 19036:2019 - estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations.
• ISO 17468 - validation framework referenced for major technical changes.

Keywords: ISO 29981:2024, bifidobacteria enumeration, milk products, colony‑count technique, TOS‑MUP agar, anaerobic incubation, dairy microbiology, probiotic enumeration, infant formula testing.

Standards Content (Sample)

International
Standard
ISO 29981
IDF 220
Second edition
Milk products — Enumeration of
2024-11
bifidobacteria — Colony-count
technique
Produits laitiers — Dénombrement des bifidobacteria présumés
— Technique par comptage des colonies
Reference numbers
IDF 220:2024:2024(en) © ISO and IDF 2024

IDF 220:2024:2024(en)
© ISO and IDF 2024
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or ISO’s member body in the country of the requester.
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Website: www.iso.org Website: www.fil-idf.org
Published in Switzerland
ii
IDF 220:2024:2024(en)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 2
4.1 General .2
4.2 Preparation of initial suspension and decimal dilutions .2
4.3 Isolation and selection for confirmation .2
4.4 Confirmation .2
4.5 Calculation .3
5 Culture media and reagents . 3
6 Equipment and consumables . 3
7 Sampling . 4
8 Preparation of test sample . 4
9 Procedure . 4
9.1 General .4
9.2 Preparation of the test portion and primary dilution .4
9.2.1 Dried milk products (e.g. infant milk formulae) including dehydrated starter
and probiotic cultures .4
9.2.2 Non-dried fermented (e.g. yoghurt) and non-fermented milk-based products
(e.g. pasteurized milks) .4
9.3 Microscopic examination of initial suspension or primary dilution (optional) .5
9.4 Preparation of decimal dilution series .5
9.5 Inoculation and incubation.5
9.6 Counting of colonies .5
9.7 Confirmation .6
10 Expression of results . 6
11 Validation of the method . 6
11.1 Validation in accordance with ISO 17468 .6
11.2 Performance characteristics .6
12 Test report . 7
13 Quality assurance . 7
Annex A (normative) Flow diagram of the procedure . 8
Annex B (normative) Culture media and reagents . 9
Annex C (informative) Performance characteristics of the method .13
Bibliography .15

iii
IDF 220:2024:2024(en)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk
and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and IDF.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 29981 | IDF 220:2010), which has been
technically revised.
The main changes are as follows:
— diluents which can be used have been added;
— preparation of the test portion and primary dilution in cases of dried milk products has been added;
— a new culture medium, TOS agar, has been introduced;
— storage of incubated plates has been included;
— expression of results has been changed to be in accordance with ISO 7218;
— performance testing of the culture media has been introduced;
— performance characteristics, with the results of an interlaboratory study, which are based on the method
of this second edition, have been included as Annex C.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.

iv
IDF 220:2024:2024(en)
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national interest
groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and governments/
food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis and
sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International Standards
using the logos and reference numbers of both organizations.
IDF draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). IDF takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, IDF had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by IDF Standing Committee on Methods for Dairy Microbiology and ISO Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly
by ISO and IDF.
The work was carried out by the IDF/ISO Action Team (D09) of the Standing Committee on Methods for Dairy
Microbiology under the aegis of its project leader Masamichi Muto (JP).

v
IDF 220:2024:2024(en)
Introduction
Bifidobacteria are non-acid-fast, non-spore-forming, Gram-positive, non-motile and catalase-negative
chemoorganotrophs bacilli, which produce acetic acid, lactic acid and formic acid. Glucose is degraded
exclusively and characteristically by the fructose-6-phosphate shunt in which fructose-6-phosphate
phosphoketolase (F6PPK, EC 4.1.2.22) cleaves fructose-6-phosphate into acetyl phosphate and erythrose-4-
phosphate.
Many reports show that bifidobacteria have various physiological functions and bifidobacteria are widely
applied to foods in milk products such as yoghurt, infant formula and milk powders, and also in non-milk
products such as starter and probiotic cultures. Many bifidobacteria-containing products describe the
bacterial cell counts on the product label which is an important indicator of the functionality. An accurate
bifidobacteria enumeration method, such as the one given in this document, is important to guarantee the
bacterial cell counts.
The main technical changes listed in the Foreword, introduced in this document compared to ISO 29981 | IDF
220:2010, are considered as major (see ISO 17468). These technical changes have a major impact on the
performance characteristics of the method.

vi
International Standard
IDF 220:2024:2024(en)
Milk products — Enumeration of bifidobacteria — Colony-
count technique
1 Scope
This document specifies a method for the selective enumeration of bifidobacteria in milk products by using
a colony-count technique at 37 °C under anaerobic conditions.
The method is applicable to milk products, such as fermented (e.g. yoghurts) and non-fermented milks
(e.g. pasteurized milks, skim milks, whey protein concentrates), milk powders and formulae (e.g. infant
formulae, follow-up formulae for older infants, products for young children) where these microorganisms
are present and viable, in combination with other lactic acid bacteria or alone. The method is also applicable
to starter and probiotic cultures. For proposed quality criteria of dairy products, see, for example, CXS 243-
[6]
2003 .
Bifidobacteria used in milk products usually belong to the following species (e.g. References [7] and [10]):
— Bifidobacterium adolescentis;
— B. animalis subsp. animalis;
— B. animalis subsp. lactis;
— B. bifidum;
— B. breve;
— B. longum subsp. infantis;
— B. longum subsp. longum.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887-1, Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and decimal
dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension
and decimal dilutions
ISO 6887-5, Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and decimal
dilutions for microbiological examination — Part 5: Specific rules for the preparation of milk and milk products
ISO 7218, Microbiology of the food chain — General requirements and guidance for microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and performance
testing of culture media
ISO 19036:2019, Microbiology of the food chain — Estimation of measurement uncertainty for quantitative
determinations
IDF 220:2024:2024(en)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
bifidobacteria
anaerobic microorganisms of the family Bifidobacteriaceae, usually capable of growth in/on TOS-MUP agar
or TOS agar by forming typical colonies and displaying certain characteristics in microscopic examination
Note 1 to entry: The morphology of typical colonies of bifidobacteria in/on TOS-MUP agar and TOS agar is described in
9.6. The microscopic examination and other confirmation test are described in 9.7.
4 Principle
4.1 General
The enumeration of bifidobacteria requires three successive stages as specified in Annex A.
TOS-MUP agar contains the antibiotic mupirocin lithium salt (MUP), which inhibits the growth of most lactic
acid bacteria commonly used in products, such as fermented and non-fermented milks (e.g. pasteurized
milks, skim milk, whey protein concentrate), milk powders and infant formulae, as well as starter and
probiotic cultures (see Reference [8]).
Owing to the proven selectivity of the MUP antibiotic when added to the base medium, usually there is no
growth of typical yoghurt bacteria (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus),
mesophilic cultures (e.g. Lactococcus lactis), Lactobacillus acidophilus, Lacticaseibacillus casei and
Lacticaseibacillus rhamnosus on the medium specified. This property has been tested with a representative
number of reference strains and isolates.
For the enumeration of bifidobacteria from samples containing only bifidobacteria, TOS agar with or without
the antibiotic MUP can be used.
4.2 Preparation of initial suspension and decimal dilutions
An initial dilution and decimal dilutions are prepared from the test sample.
4.3 Isolation and selection for confirmation
TOS-MUP agar or TOS agar is inoculated with a specified quantity of the test sample if the product is liquid, or
of the initial suspension in the case of other products. Other plates are prepared under the same conditions,
using decimal dilutions of the test sample or of the initial suspension.
The dishes are incubated anaerobically at 37 °C for 72 h. Alternatively, if the colony size is large enough to
count accurately, the dishes can be examined after 48 h incubation.
4.4 Confirmation
Colonies of presumptive bifidobacteria can be confirmed by microscopic examination and/or appropriate
tests (e.g. F6PPK-assay, see References [11] and [14]).
Confirmation of presumptive bifidobacteria by microscopic examination is required, but is optional in the
case of test samples containing only bifidobacteria.

IDF 220:2024:2024(en)
4.5 Calculation
The number of bifidobacteria per millilitre or gram of the test sample is calculated from the number of
confirmed typical colonies per dish.
5 Culture media and reagents
Follow current laboratory practices in accordance with ISO 7218. The composition of culture media and
reagents and their preparation are specified in Annex B. For performance testing of culture media, follow
the procedures in accordance with Clause B.5 and ISO 11133.
6 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications. The
usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following shall be used.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave), as specified in ISO 7218.
6.2 Autoclave, capable of operating at a temperature of 115 °C ± 3 °C and equipped with short heating and
cooling cycles.
6.3 Equipment for culture in an anaerobic atmosphere, as specified in ISO 7218, capable of operating
at a temperature of 37 °C ± 1 °C, providing an anaerobic atmosphere of volume fraction 5 % to 20 % of
carbon dioxide; a volume fraction of approximately 70 % to 90 % of nitrogen; with a volume fraction of
approximately 10 % of hydrogen (not obligatory). The gas mixture should not contain more than a volume
fraction of 1 % of oxygen.
6.4 Refrigerator (optional), capable of operating at 5 °C ± 3 °C.
6.5 Water baths, one capable of being maintained at 37 °C ± 1 °C and another capable of being maintained
between 44 °C and 47 °C.
6.6 Sterile test tubes or flasks, of appropriate capacity. Bottles or flasks with non-toxic metallic or
plastic screwcaps may be used.
6.7 pH meter, accuracy to within ±0,1 pH unit at 25 °C.
6.8 Sterile graduated pipettes or automatic pipettes, of nominal capacities 25 ml, 10 ml, 1 ml and 0,1 ml.
6.9 Sterile Petri dishes, vented, with a diameter of approximately 90 mm.
6.10 Peristaltic blender (stomacher), with sterile bags, possibly with a device for adjusting speed and
time, as specified in ISO 7218.
6.11 Microscope (optional), preferably with phase-contrast, and with slides and cover slips, as specified by
ISO 7218.
6.12 Colony-counting equipment with a magnifying lens (optional), e.g. 8 times to 10 times, as specified
in ISO 7218.
IDF 220:2024:2024(en)
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. Follow the specific International Standard
dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing with the sampling
of the product concerned, it is recommended that the parties concerned come to an agreement on this
subject.
Recommended sampling techniques are given in ISO 707 | IDF 50 for milk and milk products.
It is important that the laboratory receives a sample that is representative of the product under consideration.
The sample should not have been damaged or changed during transport or storage.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with the specific International Standard
dealing with the product concerned: follow the procedures specified in ISO 6887-1 and ISO 6887-5. If there
is no specific International Standard available, it is recommended that the parties concerned come to an
agreement on this subject.
9 Procedure
9.1 General
Take all necessary precautions to ensure sample preparation and examination in the laboratory are
conducted under aseptic conditions (see ISO 7218).
Perform the procedures specified in 9.2 to 9.5 by gentle mixing, to limit exposure to aerobic conditions such
as air bubbles.
9.2 Preparation of the test portion and primary dilution
9.2.1 Dried milk products (e.g. infant milk formulae) including dehydrated starter and probiotic
cultures
Follow the procedures specified in ISO 6887-5 and the mentioned steps bel
...

Norme
internationale
ISO 29981
FIL 220
Deuxième édition
Produits laitiers — Dénombrement
2024-11
des bifidobacteria présumés —
Technique par comptage des
colonies
Milk products — Enumeration of bifidobacteria — Colony-count
technique
Numéros de référence
FIL 220:2024:2024(fr) © ISO et FIL 2024

FIL 220:2024:2024(fr)
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8 Silver Building • Bd Auguste Reyers 70/B
CH-1214 Vernier, Genève B-1030 Brussels
Tél.: [phone] Tél.: + 32 2 325 67 40
Fax: + 32 2 325 67 41
E-mail: [e-mail] E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org Web: www.fil-idf.org
Publié en Suisse
© ISO et FIL 2024 – Tous droits réservés
ii
FIL 220:2024:2024(fr)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 2
4.1 Généralités .2
4.2 Préparation de la suspension mère et des dilutions décimales .2
4.3 Isolement et sélection pour confirmation .2
4.4 Confirmation .3
4.5 Calcul .3
5 Milieux de culture et réactifs . 3
6 Matériel et consommables . 3
7 Échantillonnage . 4
8 Préparation de l’échantillon d’essai . 4
9 Mode opératoire . 4
9.1 Généralités .4
9.2 Préparation de la prise d’essai et de la dilution primaire .4
9.2.1 Produits laitiers en poudre (par exemple, préparations pour nourrissons), y
compris ferments et cultures probiotiques déshydratées .4
9.2.2 Produits à base de lait fermenté non séché (par exemple, yaourt) et non
fermenté (par exemple, laits pasteurisés) .4
9.3 Examen microscopique de la suspension mère ou de la dilution primaire (facultatif) .5
9.4 Préparation des séries de dilution décimale.5
9.5 Inoculation et incubation .5
9.6 Comptage des colonies.5
9.7 Confirmation .6
10 Expression des résultats . 6
11 Validation de la méthode . 6
11.1 Validation conformément à l’ISO 17468 .6
11.2 Caractéristiques de performance .6
12 Rapport d’essai . 7
13 Assurance qualité . 8
Annexe A (normative) Logigramme du mode opératoire . 9
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs . 10
Annexe C (informative) Caractéristiques de performance de la méthode . 14
Bibliographie .16

© ISO et FIL 2024 – Tous droits réservés
iii
FIL 220:2024:2024(fr)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et par la Fédération internationale du lait (FIL). Il est publié conjointement par
l’ISO et la FIL.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 29981 | FIL 220:2010), qui a fait l’objet
d’une révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— des diluants utilisables ont été ajoutés;
— la préparation de la prise d’essai et la dilution primaire dans le cas de produits laitiers en poudre ont été
ajoutées;
— un nouveau milieu de culture, la gélose TOS, a été introduit;
— le stockage des plaques incubées a été inclus;
— l’expression des résultats a été modifiée afin d’être conforme à l’ISO 7218;
— des essais de performance des milieux de culture ont été introduits;
— les caractéristiques de performance, avec les résultats d’une étude interlaboratoires basés sur la méthode
de cette deuxième édition, ont été incluses en tant qu’Annexe C.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse https://www.iso.org/fr/members.html.

© ISO et FIL 2024 – Tous droits réservés
iv
FIL 220:2024:2024(fr)
La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente les
intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont organisés
en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de groupes d’intérêt
nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des acteurs de l’industrie
de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des universitaires et des
représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
La FIL attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. La FIL ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, la FIL n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie
de tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent sur d’analyse de la microbiologie laitière de la FIL
et le comité technique de l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Il est
publié conjointement par l’ISO et la FIL.
L’ensemble des travaux a été confié au groupe de projet mixte ISO/FIL (D09) du Comité permanent sur les
méthodes de microbiologie laitière, sous la conduite de son chef de projet Masamichi Muto (JP).

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v
FIL 220:2024:2024(fr)
Introduction
Les bifidobacteria sont des bacilles chimio-organotrophes non acido-résistants, non sporulés, à Gram positif,
non mobiles et catalase-négatifs, qui produisent de l’acide acétique, de l’acide lactique et de l’acide formique.
Le glucose est dégradé exclusivement et de manière caractéristique par le shunt fructose-6-phosphate
dans lequel la fructose-6-phosphate phosphocétolase (F6PPK, EC 4.1.2.22) clive le fructose-6-phosphate en
acétylphosphate et érythrose-4-phosphate.
De nombreux rapports montrent que les bifidobacteria ont diverses fonctions physiologiques et qu’ils
sont largement utilisés dans les aliments, dans les produits laitiers tels que les yaourts, les préparations
pour nourrissons et les laits en poudre, ainsi que dans les produits non laitiers tels que les ferments et
cultures probiotiques. De nombreux produits contenant des bifidobacteria décrivent le nombre de cellules
bactériennes sur l’étiquette du produit, ce qui constitue un indicateur majeur de la fonctionnalité. Une
méthode précise de dénombrement des bifidobacteria, telle que celle présentée dans le présent document,
est importante pour garantir le nombre de cellules bactériennes.
Les principales modifications techniques répertoriées dans l’Avant-propos, introduites dans le présent
document par rapport à l’ISO 29981 | l’FIL 220:2010, sont considérées comme majeures (voir l’ISO 17468).
Ces modifications techniques ont un impact majeur sur les caractéristiques de performance de la méthode.

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Norme internationale
FIL 220:2024:2024(fr)
Produits laitiers — Dénombrement des bifidobacteria
présumés — Technique par comptage des colonies
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de dénombrement sélectif des bifidobacteria dans les produits
laitiers en utilisant une technique par comptage des colonies à 37 °C dans des conditions anaérobies.
La méthode est applicable aux produits laitiers tels que les laits fermentés (par exemple, le yaourt) et non
fermentés (par exemple, les laits pasteurisés, les laits écrémés, les concentrés de protéines de lactosérum),
les poudres de lait et les préparations (par exemple, les préparations pour nourrissons, les préparations de
suite pour nourrissons plus âgés, produits pour enfants en bas âge) où ces micro-organismes sont présents
et viables, en combinaison avec d’autres bactéries lactiques ou seuls. La méthode s’applique également aux
ferments et cultures probiotiques. Pour les critères de qualité proposés pour les produits laitiers, voir, par
[6]
exemple, CXS 243-2003 .
Les bifidobacteria utilisés dans les produits laitiers appartiennent généralement aux espèces suivantes (par
exemple, Références [7] et [10]):
— Bifidobacterium adolescentis;
— B. animalis subsp. animalis;
— B. animalis subsp. lactis;
— B. bifidum;
— B. breve;
— B. longum subsp. infantis;
— B. longum subsp. longum.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887-1, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de la
suspension mère et des dilutions décimales
ISO 6887-5, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 5: Règles spécifiques pour la préparation du
lait et des produits laitiers
ISO 7218, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences générales et recommandations pour les examens
microbiologiques
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture

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ISO 19036:2019, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Estimation de l’incertitude de mesure pour les
déterminations quantitatives
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
bifidobacteria
micro-organismes anaérobies de la famille des Bifidobacteriaceae, généralement capables de se développer
dans/sur la gélose TOS-MUP ou la gélose TOS en formant des colonies types et en présentant certaines
caractéristiques à l’examen microscopique
Note 1 à l'article: La morphologie des colonies types de bifidobacteria dans/sur la gélose TOS-MUP et la gélose TOS est
décrite en 9.6. L’examen microscopique et les autres essais de confirmation sont décrits en 9.7.
4 Principe
4.1 Généralités
Le dénombrement des bifidobacteria exige trois étapes successives telles que spécifiées à l’Annexe A.
La gélose TOS-MUP contient l’antibiotique sel de lithium de mupirocine (MUP), qui inhibe la croissance de
la plupart des bactéries lactiques couramment utilisées dans les produits tels que les laits fermentés et non
fermentés (par exemple, les laits pasteurisés, le lait écrémé, le concentré de protéines de lactosérum), les
laits en poudre et les préparations pour nourrissons, ainsi que les ferments et cultures probiotiques (voir
Référence [8]).
En raison de la sélectivité prouvée de l’antibiotique MUP lorsqu’il est ajouté au milieu de base, il n’y a
généralement pas de croissance des bactéries types du yaourt (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus), des cultures mésophiles (par exemple, Lactococcus lactis), de Lactobacillus
acidophilus, de Lacticaseibacillus casei et de Lacticaseibacillus rhamnosus sur le milieu spécifié. Cette propriété
a été soumise à essai avec un nombre représentatif de souches et d’isolats de référence.
Pour le dénombrement des bifidobacteria à partir d’échantillons contenant uniquement des bifidobacteria,
la gélose TOS avec ou sans l’antibiotique MUP peut être utilisée.
4.2 Préparation de la suspension mère et des dilutions décimales
Une dilution initiale et des dilutions décimales sont préparées à partir de l’échantillon d’essai.
4.3 Isolement et sélection pour confirmation
La gélose TOS-MUP ou la gélose TOS est ensemencée avec une quantité déterminée de l’échantillon d’essai si le
produit est liquide, ou de la suspension mère dans le cas d’autres produits. D’autres boîtes sont préparées dans
les mêmes conditions, en utilisant des dilutions décimales de l’échantillon d’essai ou de la suspension mère.
Les boîtes sont incubées en anaérobiose à 37 °C pendant 72 h. Alternativement, si la taille de la colonie est
suffisamment grande pour être comptée avec précision, elles peuvent être examinées après une incubation
de 48 h.
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4.4 Confirmation
Les colonies de bifidobacteria présumés peuvent être confirmées par un examen microscopique et/ou des
essais appropriés (par exemple, test F6PPK, voir Références [11] et [14]).
La confirmation des bifidobacteria présumés par un examen microscopique est requise, mais est facultative
dans le cas d’échantillons d’essai contenant uniquement des bifidobacteria.
4.5 Calcul
Le nombre de bifidobacteria par millilitre ou gramme de l’échantillon d’essai est calculé à partir du nombre
de colonies types confirmées par boîte.
5 Milieux de culture et réactifs
Suivre les pratiques de laboratoire courantes conformément à l’ISO 7218. La composition des milieux de
culture et des réactifs et leur préparation sont spécifiées à l’Annexe B. Pour les essais de performance des
milieux de culture, suivre les procédures conformément à l’article B.5 et à l’ISO 11133.
6 Matériel et consommables
Le matériel jetable est une alternative acceptable à la verrerie réutilisable s’il possède des spécifications
appropriées. Le matériel de laboratoire microbiologique habituel (voir ISO 7218) et, en particulier, le
matériel suivant, doivent être utilisés.
6.1 Appareil de stérilisation à sec (étuve) ou de stérilisation humide (autoclave), tel que spécifié
dans l’ISO 7218.
6.2 Autoclave, capable de fonctionner à une température de 115 °C ±3 °C et équipé de cycles courts de
chauffage et de refroidissement.
6.3 Matériel pour culture en atmosphère anaérobie, tel que spécifié dans l’ISO 7218, capable de
fonctionner à une température de 37 °C ±1 °C, fournissant une atmosphère anaérobie de fraction volumique
de 5 % à 20 % de dioxyde de carbone; une fraction volumique d’environ 70 % à 90 % d’azote; avec une
fraction volumique d’environ 10 % d’hydrogène (non obligatoire). Il convient que le mélange gazeux ne
contienne pas plus d’une fraction volumique de 1 % d’oxygène.
6.4 Réfrigérateur (facultatif), capable de fonctionner à 5 °C ±3 °C.
6.5 Bains-marie, l’un pouvant être maintenu à 37 °C ±1 °C et l’autre pouvant être maintenu entre 44 °C
et 47 °C.
6.6 Tubes à essai ou fioles stériles, de capacité appropriée. Des bouteilles ou des fioles avec des bouchons
à vis en métal ou en plastique non toxiques peuvent être utilisées.
6.7 pH-mètre, précision à ±0,1 unité de pH à 25 °C.
6.8 Pipettes stériles graduées ou pipettes automatiques, de capacités nominales de 25 ml, 10 ml, 1 ml
et 0,1 ml.
6.9 Boîtes de Pétri-stériles, ventilées, d’un diamètre d’environ 90 mm.
6.10 Mélangeur péristaltique (stomacher), avec sacs stériles, éventuellement avec un dispositif de réglage
de la vitesse et du temps, comme spécifié dans l’ISO 7218.

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6.11 Microscope (facultatif), de préférence avec contraste de phase, et avec lames et lamelles,
conformément à l’ISO 7218.
6.12 Matériel de comptage de colonies avec une loupe (facultatif), par exemple 8 fois à 10 fois, comme
spécifié dans l’ISO 7218.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Suivre la Norme
internationale spécifique traitant du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique
traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties concernées se mettent
d’accord à ce sujet.
Les techniques d’échantillonnage recommandées sont données dans l’ISO 707 | FIL 50 pour le lait et les
produits laitiers.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif du produit à l’étude. Il convient que
l’échantillon n’ait été ni endommagé ni modifié au cours du transport ou du stockage.
8 Préparation de l’échantillon d’essai
Préparer l’échantillon d’essai à partir de l’échantillon de laboratoire conformément à la Norme internationale
spécifique traitant du produit concerné: suivre les procédures spécifiées dans l’ISO 6887-1 et l’ISO 6887-5.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique disponible, il est recommandé que les parties concernées
se mettent d’accord à ce sujet.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
Prendre toutes les précautions nécessaires pour garantir que la préparation et l’examen des échantillons en
laboratoire soient effectués dans des conditions aseptiques (voir l’ISO 7218).
Effectuer les procédures spécifiées de 9.2 à 9.5 mélangeant doucement, pour limiter l’exposition aux
conditions aérobies telles que les bulles d’air.
9.2 Préparation de la prise d’essai et de la dilution primaire
9.2.1 Produits laitiers en poudre (par exemple, préparations pour nourrissons), y compris
ferments et cultures probiotiques déshydratées
Suivre les procédures spécifiées dans l’ISO 6887-5 et les étapes mentionnées ci-dessous.
Chauffer les bouteilles de diluant au bain-marie (6.5) à 37 °C.
Masser le sac (à la main) pour dissoudre la prise d’essai. Puis mélanger dans un mélangeur péristaltique
(6.10) pendant 2 min.
9.2
...