ISO 16212:2017
(Main)Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould
Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould
ISO 16212:2017 gives general guidelines for enumeration of yeast and mould present in cosmetics by counting the colonies on selective agar medium after aerobic incubation. In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate microbiological risk analysis to determine the types of cosmetic products to which ISO 16212:2017 is applicable. Products considered to present a low microbiological risk (see ISO 29621) include those with low water activity or extreme pH values, hydro-alcoholic products, etc. Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method might not be suited to some products in every detail (e.g. certain water-immiscible products). Other methods (e.g. automated) can be substituted for the tests presented here provided that their equivalence has been demonstrated or the method has been otherwise shown to be suitable. Yeast enumerated can be identified using suitable identification tests, for example, tests described in the standards listed in the Bibliography. Mould enumerated can be identified by other appropriate methods, if necessary.
Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des levures et des moisissures
L'ISO 16212:2017 donne des lignes directrices générales pour le dénombrement des levures et des moisissures présentes dans les cosmétiques par dénombrement des colonies en milieu gélosé sélectif après une incubation aérobie. Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d'effectuer une analyse de risque microbiologique appropriée, afin de déterminer les types de produits cosmétiques qui relèvent de l'ISO 16212:2017. Les produits considérés comme présentant un faible risque microbiologique (voir l'ISO 29621) comprennent ceux ayant une faible activité de l'eau ou des valeurs de pH extrêmes, les produits hydro-alcooliques, etc. En raison de la grande variété de produits cosmétiques entrant dans ce domaine d'application, la présente méthode pourrait ne pas être applicable en tout point à certains produits (par exemple à certains produits non miscibles à l'eau). Il est possible de remplacer les essais présentés ici par d'autres méthodes (par exemple des méthodes automatisées) sous réserve que leur équivalence ait été démontrée ou que la méthode ait été par ailleurs indiquée comme adéquate. Les levures dénombrées peuvent être identifiées à l'aide d'essais d'identification appropriés, par exemple ceux décrits dans les normes indiquées dans la Bibliographie. Les moisissures dénombrées peuvent être identifiées en utilisant d'autres méthodes appropriées, si nécessaire.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16212
Second edition
2017-06
Cosmetics — Microbiology —
Enumeration of yeast and mould
Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des levures et des
moisissures
Reference number
ISO 16212:2017(E)
©
ISO 2017
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ISO 16212:2017(E)
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ISO 16212:2017(E)
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principles . 2
4.1 General . 2
4.2 Plate count . 2
4.3 Membrane filtration . 2
5 Diluents, neutralizers and culture media . 3
5.1 General . 3
5.2 Neutralizing diluents and diluents . 3
5.3 Diluent for yeast suspension (tryptone sodium chloride solution) . 4
5.4 Culture media . 4
6 Apparatus and glassware . 5
7 Strain of microorganisms . 5
8 Handling of cosmetic products and laboratory samples . 6
9 Procedure. 6
9.1 General recommendation . 6
9.2 Preparation of the initial suspension . 6
9.2.1 General. 6
9.2.2 Water-miscible products. 6
9.2.3 Water-immiscible products . 6
9.3 Counting methods . 6
9.3.1 Dilutions for counting methods . 6
9.3.2 Plate-count methods . 7
10 Counting of colonies (plate counts and membrane filtration methods) .7
11 Expression of results . 8
11.1 Method of calculation for plate count . 8
11.2 Interpretation . 9
12 Neutralization of the antifungicidal properties of the product .10
12.1 General .10
12.2 Preparation of inoculum .11
12.3 Suitability of counting methods .11
12.3.1 Principle .11
12.3.2 Suitability test of the pour-plate method .11
12.3.3 Suitability of the surface spread method .11
12.3.4 Suitability of the membrane filtration method .11
13 Test report .12
Annex A (informative) Other neutralizing diluents .13
Annex B (informative) Other diluents .15
Annex C (informative) Other culture media .16
Annex D (informative) Neutralizers of antifungicidal activity of preservatives and
rinsing liquids .18
Bibliography .19
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ISO 16212:2017(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
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Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
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on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 217, Cosmetics.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 16212:2008), of which it constitutes a
minor revision. The changes compared to the previous edition are as follows:
— in the Scope, “see ISO 29621” has been added and the reference has been added to the Bibliography;
— in the Scope, “used” has been changed to “substituted” and “validated” has been changed to “shown
to be suitable”;
— in 4.1, “validated” has been changed to “demonstrated”;
— in 4.3, “by a valid method” has been changed to “as described in Clause 12” and “validated procedure”
has been replaced by “described procedure”;
— in 5.1, “specifications” has been changed to “instructions”;
— in 5.2.3.1.2, “peptone” has been changed to “peptic digest of animal tissue”;
— in Clause 7, “validation” has been changed to “suitability”;
— in 9.3.2.1, “validated” has been changed to “demonstrated to be suitable”;
— in 9.3.2.3, “prepared as validated” has been changed to “demonstrated to be suitable”;
— in 11.2.1, “validated according to” has been changed to “demonstrated to be suitable for”;
— in 12.3, “validation” has been changed to “suitability”;
— in 12.3.2, instances of “validation” have been changed to “suitability test” and “validated” has been
changed to “satisfactory”;
— in 12.3.3, the first instance of “validation” has been changed to “suitability” and the second instance
has been changed to “suitability test”; “validated” has been changed to “satisfactory”;
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ISO 16212:2017(E)
— in 12.3.4, the first instance of “validation” has been changed to “suitability” and the second instance
has been changed to “suitability test”; “validated” has been changed to “satisfactory”;
— in Clause 13 f), “validation” has been changed to “suitability”;
— in A.1, B.1 and C.1, “validated” has been changed to “demonstrated to be suitable”.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16212:2017(E)
Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and
mould
1 Scope
This document gives general guidelines for enumeration of yeast and mould present in cosmetics by
counting the colonies on selective agar medium after aerobic incubation.
In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate
microbiological risk analysis to determine the types of cosmetic products to which this document is
applicable. Products considered to present a low microbiological risk (see ISO 29621) include those
with low water activity or extreme pH values, hydro-alcoholic products, etc.
Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method might not
be suited to some products in every detail (e.g. certain water-immiscible products). Other methods (e.g.
automated) can be substituted for the tests presented here provided that their equivalence has been
demonstrated or the method has been otherwise shown to be suitable.
Yeast enumerated can be identified using suitable identification tests, for example, tests described
in the standards listed in the Bibliography. Mould enumerated can be identified by other appropriate
methods, if necessary.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 21148, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination
EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics — Preservation of test organisms used for the
determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal
(including bacteriophages) activity
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
yeast
single-cell fungus, which multiplies mainly vegetatively by budding, able to grow under the test
conditions specified in this document
3.2
mould
mycelium forming microfungus, including spores and conidia, able to grow under the test conditions
specified in this document
© ISO 2017 – All rights reserved 1
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ISO 16212:2017(E)
3.3
product
portion of an identified cosmetic product received in the laboratory for testing
3.4
sample
portion of the product (3.3) (at least 1 g or 1 ml) that is used in the test to prepare the initial suspension
3.5
initial suspension
suspension (or solution) of the sample (3.4) in a defined volume of an appropriate enrichment broth
3.6
sample dilution
dilution of the initial suspension (3.5)
4 Principles
4.1 General
This method involves enumeration of colonies on a selective agar medium. The possible inhibition of
[5]
fungal growth by the sample shall be neutralized to allow the detection of viable microorganisms .
In all cases and whatever the methodology, the neutralization of the antifungicidal properties of the
[6][8][9]
product shall be checked and demonstrated .
4.2 Plate count
Plate count consists of the following steps.
— Preparation of poured plates, or spread plates, using a specified culture medium, and inoculation of
the plates using a defined quantity of the initial suspension or dilution of the product.
— Aerobic incubation of the plates at 25 °C ± 2,5 °C for 3 d to 5 d.
— Counting of the number of colony-forming units (CFU) and calculation of the amount of yeast and
mould per millilitre or per gram of product.
NOTE An alternative condition for incubation is 22,5 °C ± 2,5 °C for 5 d to 7 d using the culture medium
without antibiotic.
4.3 Membrane filtration
Membrane filtration consists of the following steps.
— Transfer a suitable amount of the sample, prepared as described in Clause 12, in the filtration
apparatus, wetted with a small volume of an appropriate sterile diluent. Filter immediately and
wash according to the described procedure (see 12.3.4). Transfer the membrane filter onto the
surface of the specified agar medium as specified in ISO 21148.
— Aerobic incubation of the membranes at 25 °C ± 2,5 °C for 3 d to 5 d.
— Counting of the number of colony-forming units (CFU) and calculation of the amount of yeast and
mould per millilitre or per gram of product.
NOTE An alternative condition for incubation is 22,5 °C ± 2,5 °C for 5 d to 7 d using the culture medium
without antibiotic.
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ISO 16212:2017(E)
5 Diluents, neutralizers and culture media
5.1 General
General instructions are given in ISO 21148. When water is mentioned in this document, use distilled
water or purified water as specified in ISO 21148.
The following diluents, neutralizers and culture media are suitable for enumeration of yeasts and
moulds. Other diluents, neutralizers and culture media may be used if they have been demonstrated to
be suitable for use.
5.2 Neutralizing diluents and diluents
5.2.1 General
The diluent is used to disperse the sample. It may contain neutralizers if the sample to be tested
has antifungicidal properties. The efficacy of the neutralization shall be demonstrated before the
determination of the count (see Clause 12). Information relative to suitable neutralizers is given in
Annex D.
5.2.2 Neutralizing diluent
5.2.2.1 Fluid casein digest–soy lecithin–polysorbate 20 medium (SCDLP 20 broth)
5.2.2.1.1 Composition
Pancreatic digest of casein 20,0 g
Soy lecithin 5,0 g
Polysorbate 20 40 ml
Water 960 ml
5.2.2.1.2 Preparation
Dissolve the polysorbate 20 in 960 ml of water by mixing while heating in a water bath at 49 °C ± 2 °C.
Add pancreatic digest of casein and soy lecithin. Heat for about 30 min to effect solution. Mix and
dispense the medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After
sterilization, the pH shall be equivalent to 7,3 ± 0,2 when measured at room temperature.
5.2.2.2 Other neutralizing diluents
Other neutralizing diluents may be used as appropriate (see Annex A and Annex D).
5.2.3 Diluent
5.2.3.1 Fluid A
5.2.3.1.1 Composition
Peptic digest of animal tissue 1,0 g
Water 1 000 ml
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ISO 16212:2017(E)
5.2.3.1.2 Preparation
Dissolve 1 g of peptic digest of animal tissue in water to make 1 l. Heat with frequent agitation. Dispense
into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall
be equivalent to 7,1 ± 0,2 when measured at room temperature.
5.2.3.2 Other diluents
Other diluents may be used as appropriate (see Annex B).
5.3 Diluent for yeast suspension (tryptone sodium chloride solution)
5.3.1 Composition
Tryptone, pancreatic digest of casein 1,00 g
Sodium chloride 8,50 g
Water 1 000 ml
5.3.2 Preparation
Dissolve the components in the water by mixing while heating. Dispense into suitable containers.
Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2
when measured at room temperature.
5.4 Culture media
5.4.1 General
Culture media may be prepared as follows or from dehydrated culture media according to the
manufacturer’s instructions. Ready-to-use media may be used when their composition and/or growth
yields are comparable to those of the formulae given herein.
5.4.2 Sabouraud dextrose chloramphenicol agar medium (SDCA)
5.4.2.1 Composition
Dextrose 40,0 g
Peptic digest of animal tissue 5,0 g
Pancreatic digest of casein 5,0 g
Chloramphenicol 0,050 g
Agar 15,0 g
Water 1 000 ml
5.4.2.2 Preparation
Dissolve the components (including the chloramphenicol) or the dehydrated complete medium in the
water by mixing while heating. Dispense the medium into suitable containers. Sterilize in an autoclave
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at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall be equivalent to 5,6 ± 0,2 when measured at room
temperature.
NOTE For known and non-contaminated products (with bacteria), the media are used without
chloramphenicol.
5.4.3 Other media
Other media may be used as appropriate (see Annex C).
5.4.4 Agar medium for cultivation of reference strain: Sabouraud dextrose agar medium (SDA)
5.4.4.1 Composition
Dextrose 40,0 g
Peptic digest of animal tissue 5,0 g
Pancreatic digest of casein 5,0 g
Agar 15,0 g
Water 1 000 ml
5.4.4.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by mixing while heating.
Dispense the medium into suitable containers. Sterilize in an autoclave at 121 °C for 15 min. After
sterilization, the pH shall be equivalent to 5,6 ± 0,2 when measured at room temperature.
6 Apparatus and glassware
The laboratory equipment, apparatus and glassware are described in ISO 21148.
7 Strain of microorganisms
For testing the efficacy of neutralizers, one yeast reference strain is used:
1) 2) 3) 4)
— Candida albicans ATCC 10231 or equivalent strain (IP 48.72 or NCPF 3179 or NBRC 1594 or
5) 6)
KCTC 17205 or TISTR 5779) or other equivalent national collection strain.
The selected yeast strain being considered more susceptible to antifungicidal activity than moulds
may be accepted as representative of fungi (yeast and mould) for the suitability of the methodology.
However, in case of specific needs, the test for the efficacy of neutralizers may be performed with an
additional mould reference strain, using a suitable protocol for the preparation of a calibrated inoculum
[3]
(e.g. see EN 13624:2013, 5.4.1.4 ).
The culture should be reconstituted according to the procedures provided by the supplier of the
reference strain.
1) ATCC = American Type Culture Collection.
2) IP = Institut Pasteur.
3) NCPF = National Collection of Pathogenic Fungi.
4) NBRC = Biological Resource Center, NITE.
5) KCTC = Korean Collection for Type Cultures.
6) TISTR = Thailand Institute of Scientific and Technological Research.
© ISO 2017 – All rights reserved 5
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ISO 16212:2017(E)
The strain may be kept in the laboratory in accordance with EN 12353.
8 Handling of cosmetic products and laboratory samples
If necessary, store products to be tested at room temperature.
Do not incubate, refrigerate or freeze products (3.3) and samples (3.4) before or after analysis.
Sampling of cosmetic products to be analysed should be carried out as described in ISO 21148. Analyse
samples as described in ISO 21148 and according to the procedure described in Clause 9.
9 Procedure
9.1 General recommendation
Use sterile material, equipment and aseptic techniques to prepare the sample, initial suspension and
dilutions. In the case of the preparation of the initial suspension, the time that elapses between the end
of the preparation and the moment the inoculum comes into contact with the culture medium shall not
exceed 45 min, unless specifically mentioned in the established protocols or documents.
9.2 Preparation of the initial suspension
9.2.1 General
The initial suspension is prepared from a sample of at least 1 g or 1 ml of the well-mixed product
under test.
Note S, the exact mass or volume of the sample.
The initial suspension is usually a 1:10 dilution. Larger volumes of diluent may be required if high levels
of contamination are expected and/or if antifungicidal properties are still present in the 1:10 dilution.
9.2.2 Water-miscible products
Transfer the sample, S, of product to an appropriate volume (e.g. 9 ml) of neutralizing diluent (5.2.2) or
diluent (5.2.3).
Note d, the dilution factor.
9.2.3 Water-immiscible products
Transfer the sample, S, of product to a suitable container containing a suitable quantity of solubilizing
agent (e.g. polysorbate 80 solution). Disperse the sample within the solubilizing agent and add an
appropriate volume (e.g. 9 ml) of neutralizing diluent (5.2.2) or diluent (5.2.3).
Note d, the dilution factor.
9.3 Counting methods
9.3.1 Dilutions for counting methods
Usually, the initial suspension is the first counted dilution. If needed, additional serial dilutions (e.g.
1:10 dilution) may be performed from the initial suspension using the same diluent (according to the
expected level of contamination of the product).
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ISO 16212:2017(E)
Generally, counting is performed using at least two Petri dishes, but it is possible to use only one Petri
dish in case of routine testing, or if counts are performed on successive dilutions of the same sample or
according to previous results.
9.3.2 Plate-count methods
9.3.2.1 Pour-plate method
In Petri dishes 85 mm to 100 mm in diameter, add 1 ml of the initial suspension and/or sample dilution
prepared as demonstrated to be suitable (see Clause 12) and pour 15 ml to 20 ml of the melted agar
medium (5.4.2) kept in a water bath at no more than 48 °C. If larger Petri dishes are used, the amount of
agar medium is increased accordingly.
Mix the initial suspension and/or sample dilution with the medium, carefully rotating or tilting the
plates sufficiently to disperse them. Allow the mixture in the Petri dishes to solidify on a horizontal
surface at room temperature.
9.3.2.2 Surface spread method
In Petri dishes 85 mm to 100 mm in diameter, put 15 ml to 20 ml of the melted agar medium (5.4.2) kept
in a water bath at no more than 48 °C. If larger Petri dishes are used, the volume of the agar is increased
accordingly.
Allow plates to cool and solidify, for example, in a microbiological cabinet or in an incubator. Spread
over the surface of the medium a measured volume of not less than 0,1 ml of the initial suspension
and/or sample dilution prepared as described in Clause 12.
9.3.2.3 Membrane filtration method
Use a membrane having a nominal pore size ≤ 0,45 µm.
Transfer a suitable amount of the initial suspension or of the sample dilution demonstrated to be
suitable (preferably representing at least 1 g or 1 ml of the product) onto the membrane.
Filter immediately and wash the membrane (follow the suitability test procedure; see Clause 12).
Transfer the membrane onto the surface of the agar medium (5.4.2).
9.3.2.4 Incubation
Unless otherwise stated, invert the inoculated dishes and place them in the incubator set at 25 °C ± 2,5 °C
for 3 d to 5 d or use the alternative condition (see Notes in 4.2 and 4.3). After incubation, the dishes shall,
if possible, be examined immediately. Alternatively, they may be stored, unless otherwise specified, for
up to a maximum of 24 h in the refrigerator at 5 °C ± 3 °C.
NOTE 1 In certain cases, where there is a potential for confusing particles from the product with counted
colonies, it can be useful to prepare duplicate dishes containing the same sample dilutions and agar medium
which are stored in the refrigerator for comparison with incubated dishes.
NOTE 2 An intermediate check can be performed where both yeast and mould are suspected.
10 Counting of colonies (plate counts and membrane filtration methods)
After incubation, count the colonies
— in Petri dishes containing 15 colonies to 150 colonies; if less than 15 colonies are counted, see 11.2.3;
— on membranes containing 15 colonies to 150 colonies; if less than 15 colonies are counted, see 11.2.3.
© ISO 2017 – All rights reserved 7
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11 Expression of results
11.1 Method of calculation for plate count
Calculate the number, N, of microorganisms present in the sample, S, using
— m, the arithmetic mean of the counts obtained from the duplicates [Formula (1)],
— c, the number of colonies counted on a single plate [Formula (2)], or
— wm, the weighted mean of the counts obtained from two successive dilutions [Formula (3)],
according to the following formulae:
N = m/(V · d) (1)
N = c/(V · d) (2)
N = wm/(V · d) (3)
where
m is the arithmetic mean of the counts obtained from the duplicates;
V is the volume of inoculum applied to
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16212
Deuxième édition
2017-06
Cosmétiques — Microbiologie —
Dénombrement des levures et des
moisissures
Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould
Numéro de référence
ISO 16212:2017(F)
©
ISO 2017
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ISO 16212:2017(F)
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principes . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Dénombrement sur gélose en boîtes de Petri . 2
4.3 Filtration sur membrane . 2
5 Diluants, agents neutralisants et milieux de culture . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Diluants neutralisants et diluants . 3
5.3 Diluant pour la suspension de levure (solution tryptone sel) . 4
5.4 Milieux de culture . 4
6 Matériel et verrerie. 5
7 Souches de micro-organismes . 6
8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire .6
9 Mode opératoire. 6
9.1 Recommandations générales. 6
9.2 Préparation de la suspension initiale . 6
9.2.1 Généralités . 6
9.2.2 Produits miscibles dans l’eau. 7
9.2.3 Produits non miscibles dans l’eau . 7
9.3 Méthodes de dénombrement . 7
9.3.1 Dilutions pour les méthodes de dénombrement . 7
9.3.2 Méthodes de dénombrement sur gélose en boîtes de Petri . 7
10 Dénombrement des colonies (méthodes de dénombrement sur gélose en boîtes de
Petri et par filtration sur membrane) . 8
11 Expression des résultats. 8
11.1 Méthode de calcul pour le dénombrement sur gélose en boîtes de Petri . 8
11.2 Interprétation . 9
12 Neutralisation des propriétés fongicides du produit .11
12.1 Généralités .11
12.2 Préparation de l’inoculum .11
12.3 Applicabilité des méthodes de dénombrement .11
12.3.1 Principes .11
12.3.2 Essai d’applicabilité de la méthode par ensemencement en profondeur .12
12.3.3 Applicabilité de la méthode par étalement en surface.12
12.3.4 Applicabilité de la méthode par filtration sur membrane .12
13 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Autres diluants neutralisants .14
Annexe B (informative) Autres diluants .16
Annexe C (informative) Autres milieux de culture .17
Annexe D (informative) Neutralisants de l’activité fongicide des
conservateurset des liquides de rinçage .19
Bibliographie .21
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ISO 16212:2017(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 16212:2008), qui a fait l’objet d’une
révision mineure. Les modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:
— dans le domaine d’application, «voir l’ISO 29621» a été ajouté et la référence a été ajoutée à la
Bibliographie;
— dans le domaine d’application, «validée» a été remplacé par «indiquée comme adéquate»;
— en 4.1, «validée» a été remplacé par «démontrée»;
— en 4.3, «selon une méthode validée» a été remplacé par «tel que décrit dans l’Article 12» et «opératoire
validé» a été remplacé par «opératoire décrit»;
— en 5.1, «spécifications» a été remplacé par «instructions»;
— en 5.2.3.1.2, «de peptone» a été remplacé par «d’hydrolysat pepsique de tissus animaux»;
— dans l’Article 7, «validation» a été remplacé par «applicabilité»;
— en 9.3.2.1, «validé» a été remplacé par «démontré comme étant applicable»;
— en 9.3.2.3, «validée» a été remplacé par «démontrée comme étant applicable»;
— en 11.2.1, «validées selon» a été remplacé par «démontrées comme étant applicables pour»;
— en 12.3, «validation» a été remplacé par «applicabilité»;
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ISO 16212:2017(F)
— en 12.3.2, les occurrences de «validation» ont été remplacées par «essai d’applicabilité» et «validés»
a été remplacé par «satisfaisants»;
— en 12.3.3, la première occurrence de «validation» a été remplacée par «applicabilité» et la deuxième
occurrence a été remplacée par «essai d’applicabilité»; «validés» a été remplacé par «satisfaisants»;
— en 12.3.4, la première occurrence de «validation» a été remplacée par «applicabilité» et la deuxième
occurrence a été remplacée par «essai d’applicabilité»; «validés» a été remplacé par «satisfaisants»;
— dans l’Article 13 f), «validation» a été remplacé par «applicabilité»;
— en A.1, B.1, C.1, «validé» a été remplacé par «démontré comme étant applicable».
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NORME INTERNATIONALE ISO 16212:2017(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des
levures et des moisissures
1 Domaine d’application
Le présent document donne des lignes directrices générales pour le dénombrement des levures et des
moisissures présentes dans les cosmétiques par dénombrement des colonies en milieu gélosé sélectif
après une incubation aérobie.
Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d’effectuer une
analyse de risque microbiologique appropriée, afin de déterminer les types de produits cosmétiques
qui relèvent du présent document. Les produits considérés comme présentant un faible risque
microbiologique (voir l’ISO 29621) comprennent ceux ayant une faible activité de l’eau ou des valeurs de
pH extrêmes, les produits hydro-alcooliques, etc.
En raison de la grande variété de produits cosmétiques entrant dans ce domaine d’application, la
présente méthode pourrait ne pas être applicable en tout point à certains produits (par exemple
à certains produits non miscibles à l’eau). Il est possible de remplacer les essais présentés ici par
d’autres méthodes (par exemple des méthodes automatisées) sous réserve que leur équivalence ait été
démontrée ou que la méthode ait été par ailleurs indiquée comme adéquate.
Les levures dénombrées peuvent être identifiées à l’aide d’essais d’identification appropriés, par
exemple ceux décrits dans les normes indiquées dans la Bibliographie. Les moisissures dénombrées
peuvent être identifiées en utilisant d’autres méthodes appropriées, si nécessaire.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 21148, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques
EN 12353, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des microorganismes d’essai utilisés
pour la détermination de l’activité bactéricide (Legionella incluses), mycobactéricide, sporicide, fongicide et
virucide (bactériophages inclus)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
levure
champignon unicellulaire qui se multiplie principalement de manière végétative en bourgeonnant,
capable de se développer dans les conditions d’essais spécifiées dans le présent document
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ISO 16212:2017(F)
3.2
moisissure
mycélium formant des micromycètes, y compris les spores et les conidies, capable de se développer
dans les conditions d’essai spécifiées dans le présent document
3.3
produit
portion d’un produit cosmétique identifié reçue au laboratoire pour essais
3.4
échantillon
portion du produit (3.3) (au moins 1 g ou 1 ml) utilisée dans l’essai pour préparer la suspension initiale
3.5
suspension initiale
suspension (ou solution) de l’échantillon (3.4) dans un volume défini d’un bouillon d’enrichissement
approprié
3.6
dilution de l’échantillon
dilution de la suspension initiale (3.5)
4 Principes
4.1 Généralités
La présente méthode implique le dénombrement des colonies dans un milieu gélosé sélectif. L’inhibition
possible du développement fongique par l’échantillon doit être neutralisée pour permettre la détection
[5]
des micro-organismes viables . Dans tous les cas et quelle que soit la méthodologie, la neutralisation
[6] [8] [9]
des propriétés fongicides du produit doit être vérifiée et démontrée .
4.2 Dénombrement sur gélose en boîtes de Petri
Le dénombrement sur gélose en boîtes de Petri comprend les étapes suivantes.
— Préparation des boîtes de géloses pour ensemencement en profondeur ou pour étalement en surface,
au moyen d’un milieu de culture défini, et ensemencement des boîtes de gélose avec une quantité
définie de la suspension initiale ou d’une dilution du produit.
— Incubation aérobie des géloses de 3 jours à 5 jours à 25 °C ± 2,5 °C.
— Dénombrement du nombre d’unités formant colonie (UFC) et dénombrement du nombre de levures
et de moisissures par millilitre ou par gramme de produit.
NOTE Une condition d’incubation de 5 jours à 7 jours à 22,5 °C ± 2,5 °C en utilisant un milieu de culture sans
antibiotique est également possible.
4.3 Filtration sur membrane
La filtration sur membrane comprend les étapes suivantes.
— Transfert d’une quantité adaptée d’échantillon préparé tel que décrit dans l’Article 12 dans l’appareil
de filtration humidifié à l’aide d’un faible volume de diluant approprié stérile, filtration immédiate
et lavage selon le mode opératoire décrit (voir 12.3.4). Transfert de la membrane de filtration à la
surface du milieu gélosé spécifié, comme indiqué dans l’ISO 21148;
— Incubation aérobie des membranes de 3 jours à 5 jours à 25 °C ± 2,5 °C.
— Dénombrement du nombre d’unités formant colonie (UFC) et dénombrement du nombre de levures
et de moisissures par millilitre ou par gramme de produit.
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ISO 16212:2017(F)
NOTE Une condition d’incubation de 5 jours à 7 jours à 22,5 °C ± 2,5 °C en utilisant un milieu de culture sans
antibiotique est également possible.
5 Diluants, agents neutralisants et milieux de culture
5.1 Généralités
Les instructions générales sont indiquées dans l’ISO 21148. Lorsque de l’eau est mentionnée dans ce
document, utiliser de l’eau distillée ou purifiée tel qu’indiqué dans l’ISO 21148.
Les diluants, agents neutralisants et milieux de culture suivants conviennent pour le dénombrement
des levures et des moisissures. D’autres diluants, agents neutralisants et milieux de culture peuvent
être utilisés s’il a été démontré qu’ils sont applicables pour cet emploi.
5.2 Diluants neutralisants et diluants
5.2.1 Généralités
Le diluant est utilisé pour disperser l’échantillon. Il peut contenir des agents neutralisants si l’échantillon
à soumettre à essai a des propriétés fongicides. L’efficacité de la neutralisation doit être démontrée
avant la détermination de la concentration en micro-organismes (voir Article 12). Des informations
relatives à des agents neutralisants appropriés sont fournies dans l’Annexe D.
5.2.2 Diluant neutralisant
5.2.2.1 Milieu aux hydrolysats de caséine-lécithine de soja-polysorbate 20 (bouillon SCDLP 20)
5.2.2.1.1 Composition
Hydrolysat pancréatique de caséine 20,0 g
Lécithine de soja 5,0 g
Polysorbate 20 40 ml
Eau 960 ml
5.2.2.1.2 Préparation
Dissoudre le polysorbate 20 dans 960 ml d’eau en mélangeant pendant le chauffage au bain-marie à
49 °C ± 2 °C. Ajouter l’ hydrolysat pancréatique de caséine et la lécithine de soja. Chauffer pendant
environ 30 min pour obtenir une solution. Mélanger et répartir le milieu dans des récipients appropriés.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, le
mesurage étant effectué à température ambiante.
5.2.2.2 Autres diluants neutralisants
D’autres diluants neutralisants peuvent être utilisés s’ils sont appropriés (voir Annexe A et Annexe D).
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ISO 16212:2017(F)
5.2.3 Diluant
5.2.3.1 Liquide A
5.2.3.1.1 Composition
Hydrolysat pepsique de tissus animaux 1,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.3.1.2 Préparation
Dissoudre 1 g d’hydrolysat pepsique de tissus animaux dans l’eau pour obtenir 1 l. Chauffer en agitant
fréquemment. Répartir dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
Après la stérilisation, le pH doit être de 7,1 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.
5.2.3.2 Autres diluants
D’autres diluants peuvent être utilisés s’ils sont appropriés (voir Annexe B).
5.3 Diluant pour la suspension de levure (solution tryptone sel)
5.3.1 Composition
Tryptone, hydrolysat pancréatique de caséine 1,00 g
Chlorure de sodium 8,50 g
Eau 1 000 ml
5.3.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau en mélangeant tout en chauffant. Répartir dans des récipients
appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être
de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
5.4 Milieux de culture
5.4.1 Généralités
Les milieux de culture peuvent être préparés comme indiqué ci-dessous ou à partir de milieux de
culture déshydratés conformément aux instructions du fabricant. Des milieux prêts à l’emploi peuvent
être utilisés si leur composition et/ou leur rendement de croissance sont comparables à ceux des
formulations indiquées ci-après.
5.4.2 Milieu gélosé Sabouraud au dextrose et chloramphénicol (SDCA)
5.4.2.1 Composition
Dextrose 40,0 g
Hydrolysat pepsique de tissus animaux 5,0 g
Hydrolysat pancréatique de caséine 5,0 g
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ISO 16212:2017(F)
Chloramphénicol 0 050 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.4.2.2 Préparation
Dissoudre les composants (y compris le chloramphénicol) ou le milieu complet déshydraté dans l’eau,
en mélangeant pendant le chauffage. Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à
l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de 5,6 ± 0,2, le mesurage étant
effectué à température ambiante.
NOTE Pour les produits connus et non contaminés (par des bactéries) le milieu sera utilisé sans
chloramphénicol.
5.4.3 Autres médias
D’autres milieux peuvent être utilisés s’ils sont appropriés (voir Annexe C).
5.4.4 Milieu gélosé pour la culture de la souche de référence: Milieu gélosé Sabouraud au
dextrose (SDA)
5.4.4.1 Composition
Dextrose 40,0 g
Hydrolysat pepsique de tissus animaux 5,0 g
Hydrolysat pancréatique de caséine 5,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.4.4.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau en mélangeant tout en chauffant.
Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après
la stérilisation, le pH doit être de 5,6 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.
6 Matériel et verrerie
Les équipements, le matériel et la verrerie de laboratoire sont décrits dans l’ISO 21148.
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ISO 16212:2017(F)
7 Souches de micro-organismes
Pour soumettre à essai l’efficacité des agents neutralisants, une souche de levure de référence est
utilisée:
1) 2) 3)
— Candida albicans ATCC 10231 ou toute autre souche équivalente (IP 48.72 ou NCPF 3179 ou
4) 5) 6)
NBRC 1594 ou KCTC 17205 ou TISTR 5779) ou toute autre souche équivalente issue d’une
collection nationale.
La souche de levure sélectionnée considérée comme étant plus sensible à l’activité fongicide que les
moisissures peut être acceptée comme représentative des champignons (levures et moisissures) pour
l’applicabilité de la méthode. Cependant, en cas de besoins spécifiques, l’essai d’efficacité des agents
neutralisants peut être réalisé avec une souche de référence supplémentaire de moisissure, en utilisant
[3]
un protocole approprié pour la préparation d’un inoculum calibré (par exemple, voir l’EN 13624:2013,
5.4.1.4).
Il convient de reconstituer la culture conformément aux méthodes indiquées par le fournisseur de la
souche de référence.
La souche peut être conservée au laboratoire, conformément à l’EN 12353.
8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire
Si nécessaire, conserver les produits à soumettre à essai à température ambiante.
Ne pas incuber, réfrigérer ou congeler les produits (3.3) et les échantillons (3.4) avant ou après analyse.
Il convient d’effectuer l’échantillonnage des produits cosmétiques à analyser tel que décrit dans
l’ISO 21148. Analyser les échantillons tel que décrit dans l’ISO 21148 et conformément au mode
opératoire décrit dans l’Article 9.
9 Mode opératoire
9.1 Recommandations générales
Utiliser du matériel et des équipements stériles ainsi que des techniques aseptiques pour préparer
l’échantillon, la suspension initiale et les dilutions. En cas de préparation d’une suspension initiale,
le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation et le moment où l’inoculum entre en contact avec
le milieu de culture ne doit pas dépasser 45 min, sauf indications particulières mentionnées dans les
protocoles ou documents établis.
9.2 Préparation de la suspension initiale
9.2.1 Généralités
La suspension initiale est préparée à partir d’un échantillon d’au moins 1 g ou 1 ml du produit d’essai
mélangé avec soin.
1) ATCC = American Type Culture Collection (Collection américaine de cultures types).
2) IP = Institut Pasteur.
3) NCPF = National Collection of Pathogenic Fungi (Collection nationale de champignons pathogènes).
4) NBRC = National Biological Resource Centre, NITE (Centre national de ressources biologiques).
5) KCTC = Korean Collection for Type Culture (Collection coréenne de cultures types).
6) TISTR = Thailand Institute of Scientific and Technological Research (Institut thaïlandais de recherche scientifique
et technologique).
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ISO 16212:2017(F)
Noter S la masse ou le volume exact de l’échantillon.
La suspension initiale est généralement une dilution 1:10. Des volumes plus importants de diluant
peuvent être exigés si des niveaux de contamination élevés sont attendus et/ou si des propriétés
fongicides persistent dans la dilution 1:10.
9.2.2 Produits miscibles dans l’eau
Transférer l’échantillon de produit, S, dans un volume approprié (par exemple 9 ml) de diluant
neutralisant (5.2.2) ou de diluant (5.2.3).
Noter d, le facteur de dilution.
9.2.3 Produits non miscibles dans l’eau
Transférer l’échantillon de produit, S, dans un récipient approprié contenant une quantité adéquate
d’agent solubilisant (par exemple solution polysorbate 80). Disperser l’échantillon dans l’agent
solubilisant et ajouter un volume approprié (par exemple 9 ml) de diluant neutralisant (5.2.2) ou de
diluant (5.2.3).
Noter d, le facteur de dilution.
9.3 Méthodes de dénombrement
9.3.1 Dilutions pour les méthodes de dénombrement
La suspension initiale est généralement la première dilution dénombrée. Au besoin, d’autres dilutions
en série (dilution 1:10, par exemple) peuvent être réalisées à partir de la suspension initiale en utilisant
le même diluant (en fonction du niveau de contamination attendu pour le produit).
Le dénombrement est généralement effectué en utilisant au moins deux boîtes de Petri. Il est cependant
possible d’utiliser une seule boîte de Petri dans le cas d’un essai de routine, ou si les dénombrements
sont réalisés sur des dilutions successives du même échantillon ou en fonction des résultats antérieurs.
9.3.2 Méthodes de dénombrement sur gélose en boîtes de Petri
9.3.2.1 Méthode par ensemencement en profondeur
Ajouter 1 ml de la suspension initiale et/ou de la dilution d’échantillon préparée telle qu’elle a été
démontrée comme étant applicable (voir Article 12) dans des boîtes de Petri de 85 mm à 100 mm de
diamètre et verser de 15 ml à 20 ml du milieu gélosé (5.4.2) maintenu en surfusion dans un bain-marie
à une température ne dépassant pas 48 °C. Si des boîtes de Petri plus grandes sont utilisées, augmenter
la quantité de milieu gélosé en conséquence.
Mélanger la suspension initiale et/ou la dilution d’échantillon avec le milieu en faisant soigneusement
tourner ou en inclinant suffisamment les géloses de manière à assurer la dispersion. Laisser le mélange
se solidifier dans les boîtes de Petri sur une surface horizontale à température ambiante.
9.3.2.2 Méthode par étalement en surface
Verser, dans des boîtes de Petri de 85 mm à 100 mm de diamètre, de 15 ml à 20 ml de milieu gélosé (5.4.2)
maintenu en surfusion dans un bain-marie à une température ne dépassant pas 48 °C. Si des boîtes de
Petri plus
...
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