Water quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations - Part 1: Shake-flask batch test with surface water or surface water/sediment suspensions

This part of ISO 14592 specifies a test method for evaluating the biodegradability of organic test compounds by aerobic microorganisms by means of a shake-flask batch test. It is applicable to natural surface water, free from coarse particles to simulate a pelagic environment (“pelagic test”) or to surface water with suspended sediments added to obtain a level of 0,1 g/l to 1 g/l dry mass to simulate a water body with suspended sediment (“suspended sediment test”). This part of ISO 14592 is applicable to organic test compounds present in lower concentrations (normally below 100 µg/l) than those of natural carbon substrates also present in the system. Under these conditions, the test compounds serve as a secondary substrate and the kinetics for biodegradation would be expected to be first order (“non-growth” kinetics). This test method is not recommended for use as proof of ultimate biodegradation which is better assessed using other standardized tests (see ISO/TR 15462). It is also not well suited to studies on metabolite formation and accumulation which require higher test concentrations.

Qualité de l'eau - Évaluation de la biodégradabilité aérobie des composés organiques présents en faibles concentrations - Partie 1: Essai en lots de flacons agités avec des eaux de surface ou des suspensions eaux de surface/sédiments

L'ISO 14592-1:2002 spécifie une méthode d'essai pour l'évaluation de la biodégradabilité de composés d'essai organiques par des micro-organismes aérobies au moyen d'un essai en lots de flacons agités. Elle s'applique à des eaux de surface naturelles exemptes de particules grossières pour simuler un environnement pélagique (essai pélagique), ou à des eaux de surface avec des sédiments en suspension ajoutés pour obtenir des concentrations de 0,1 g/l à 1 g/l en masse sèche, pour simuler une pièce d'eau avec sédiments en suspension (essai avec suspension de sédiments).  
L'ISO 14592-1:2002 s'applique aux composés d'essai organiques présents en concentrations plus faibles (normalement inférieures à 100 microgrammes/l) que celles des substrats carbonés naturels également présents dans le système. Dans ces conditions, les composés d'essai ont la fonction de substrat secondaire, et il est attendu que la cinétique de biodégradation soit du premier ordre (cinétique sans croissance).  
L'utilisation de cette méthode d'essai n'est pas recommandée comme preuve de la biodégradation ultime, qui peut s'évaluer de manière plus fiable en utilisant d'autres essais normalisés. Elle n'est pas recommandée non plus pour étudier la formation et l'accumulation de métabolites, ce qui requiert des concentrations d'essai plus élevées.

Kakovost vode - Vrednotenje aerobne biorazgradljivosti organskih spojin pri nizkih koncentracijah - 1. del: Šaržni preskus s stresanjem steklenic s površinsko vodo ali suspenzijami površinske vode in usedlin

Ta del ISO 14592 določa preskusno metodo za vrednotenje biorazgradljivosti organskih preskusnih spojin z aerobnih mikroorganizmov s šaržnim preskusom s stresanjem steklenic. Velja za naravno površinsko vodo brez grobih delcev za simulacijo pelagičnega okolja (»pelagični preskus«) ali za površinsko vodo z dodanimi odloženimi usedlinami za doseganje stopnje od 0.1 g/l do 1 g/l suhe mase za simulacijo vodnega telesa z odloženo usedlino (»preskus z odloženo usedlino»). Ta del ISO 14592 velja za organske preskusne spojine, prisotne pri nižjih koncentracijah (običajno pod 100 µg/l), kot so koncentracije naravnih substratov ogljika, ki so tudi prisotni v sistemu. Pod temi pogoji preskusne spojine služijo kot substrat drugotnega pomena, za kinetiko biorazgradljivosti pa se pričakuje, da je le-ta prva na vrsti (kinetika »ne rasti«). Ta preskusna metoda se ne priporoča za uporabo pri dokazovanju končne biorazgradljivosti, ki se jo lažje določi z drugimi standardiziranimi preskusi (glej ISO/TR 15462). Prav tako ni primerna za študije tvorbe in kopičenja metabolita, ki zahtevajo višje preskusne koncentracije.

General Information

Status
Published
Public Enquiry End Date
19-Jul-2009
Publication Date
16-Jun-2010
Technical Committee
Current Stage
6060 - National Implementation/Publication (Adopted Project)
Start Date
12-May-2010
Due Date
17-Jul-2010
Completion Date
17-Jun-2010

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Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14592-1
First edition
2002-11-15
Corrected version
2003-08-01


Water quality — Evaluation of the aerobic
biodegradability of organic compounds at
low concentrations —
Part 1:
Shake-flask batch test with surface water or
surface water/sediment suspensions
Qualité de l'eau — Évaluation de la biodégradabilité aérobie des composés
organiques présents en faibles concentrations —
Partie 1: Essai en lots de flacons agités avec des eaux de surface ou
des suspensions eaux de surface/sédiments




Reference number
ISO 14592-1:2002(E)
©
ISO 2002

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ISO 14592-1:2002(E)
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E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland

ii © ISO 2002 – All rights reserved

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ISO 14592-1:2002(E)
Contents Page
Foreword . iv
Introduction. v
1 Scope. 1
2 Normative reference. 1
3 Terms, definitions and symbols . 1
4 Principle . 4
5 Reagents and media . 5
6 Apparatus. 7
7 Test environment and conditions. 7
8 Procedure. 8
9 Calculation . 11
10 Validity of the test . 13
11 Test report. 13
14
Annex A (informative) Guidance on the use of C-labelled compounds . 14
Bibliography. 22


© ISO 2002 – All rights reserved iii

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ISO 14592-1:2002(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards adopted
by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this part of ISO 14592 may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 14592-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological
methods.
ISO 14592 consists of the following parts, under the general title Water quality — Evaluation of the aerobic
biodegradability of organic compounds at low concentrations:
 Part 1: Shake-flask batch test with surface water or surface water/sediment suspensions
 Part 2: Continuous flow river model with attached biomass
This corrected version of ISO 14592-1:2002 incorporates corrections to
 the reference given in the third item of the list in 8.2.1;
 the reference given in the penultimate line of 8.2.1;
 the reference given in the last line of the second paragraph of 8.4.1.

iv © ISO 2002 – All rights reserved

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ISO 14592-1:2002(E)
Introduction
This International Standard consists of two parts. Part 1 describes a die-away batch test for either surface water
with or without added sediment in suspension simulating either a pelagic aquatic environment or a
water-to-sediment interface. Part 2 describes a continuous flow system simulating a river with biomass attached to
stationary surfaces.
This test has been specifically designed to provide information on the biodegradation behaviour and kinetics of test
compounds present in low concentrations, i.e. sufficiently low to ensure that they simulate the biodegradation
kinetics which would be expected to occur in natural environmental systems.
Before conducting this test, it is necessary to have information on the biodegradability behaviour of the test
compound at higher concentrations (e.g. in standard biodegradation tests), and, if possible, on abiotic degradability
or elimination from water, as well as relevant physico-chemical data. This information is necessary for proper
experimental planning and interpretation of results.
When this test method is used with a single environmental sample of surface water (either with or without the
addition of sediment), a laboratory-derived first-order biodegradation rate can be estimated for one single point in
time and space. The test system may be more consistent and provide more reliable biodegradation results if it is
adapted to the test compound at a specifically maintained concentration. This may be achieved using the optional
semi-continuous procedural variant of the method.



© ISO 2002 – All rights reserved v

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 14592-1:2002(E)

Water quality — Evaluation of the aerobic biodegradability
of organic compounds at low concentrations —
Part 1:
Shake-flask batch test with surface water or surface
water/sediment suspensions
WARNING AND SAFETY PRECAUTIONS — Activated sludge, sewage and effluent contain potentially
pathogenic organisms. Therefore appropriate precautions should be taken when handling them. Toxic and
dangerous test compounds and those whose properties are unknown should be handled with care.
Radiolabelled compounds, if used, should be handled respecting existing rules and legislation.
1 Scope
This part of ISO 14592 specifies a test method for evaluating the biodegradability of organic test compounds by
aerobic microorganisms by means of a shake-flask batch test. It is applicable to natural surface water, free from
coarse particles to simulate a pelagic environment (“pelagic test”) or to surface water with suspended sediments
added to obtain a level of 0,1 g/l to 1 g/l dry mass to simulate a water body with suspended sediment (“suspended
sediment test”).
This part of ISO 14592 is applicable to organic test compounds present in lower concentrations (normally below
100 µg/l) than those of natural carbon substrates also present in the system. Under these conditions, the test
compounds serve as a secondary substrate and the kinetics for biodegradation would be expected to be first order
(“non-growth” kinetics).
This test method is not recommended for use as proof of ultimate biodegradation which is better assessed using
other standardized tests (see ISO/TR 15462). It is also not well suited to studies on metabolite formation and
accumulation which require higher test concentrations.
2 Normative reference
The following normative document contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this part of ISO 14592. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these publications
do not apply. However, parties to agreements based on this part of ISO 14592 are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For undated
references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO/TR 15462, Water quality — Selection of tests for biodegradability
3 Terms, definitions and symbols
3.1 Terms and definitions
For the purpose of this part of ISO 14592, the following terms and definitions apply.
© ISO 2002 – All rights reserved 1

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ISO 14592-1:2002(E)
3.1.1
ultimate aerobic biodegradation
breakdown of a chemical compound or organic matter by microorganisms, in the presence of oxygen, to carbon
dioxide (CO ), water and mineral salts of any other elements present (mineralization) and the production of new
2
biomass
NOTE Total mineralization may be different from ultimate aerobic biodegradation in that total mineralization includes
secondary mineralization of biosynthesis products. The kinetics may therefore deviate from first-order kinetics in particular
towards the end of the experiment. In this part of ISO 14592, primary aerobic biodegradation is determined when using
substance specific analysis and total mineralization when using radiolabelled compounds.
3.1.2
primary biodegradation
structural change (transformation) of a chemical compound by microorganisms resulting in the loss of a specific
property of that compound
3.1.3
dissolved organic carbon
DOC
part of the organic carbon in a sample of water which cannot be removed by specified phase separation
2
NOTE Phase separation may be obtained, for example, by centrifugation of the sample of test water at 40 000 m/s for
15 min or by membrane-filtration using membranes with pores of 0,45 µm diameter.
3.1.4
lag phase
t
lag
time from the start of a test until significant biodegradation (about 10 % of the maximum level) can be measured
NOTE Lag phase is expressed in days (d).
3.1.5
maximum level of biodegradation
degree of biodegradation of a chemical compound or organic matter in a test above which no further
biodegradation takes place during the test
NOTE The maximum level of biodegradation is expressed as a percentage.
3.1.6
primary substrate
major carbon and energy source which is essential for growth or maintenance of microorganisms
3.1.7
secondary substrate
substrate component present at such low concentrations, that by its degradation, only insignificant amounts of
carbon and energy are supplied to the competent microorganisms, as compared to the carbon and energy supplied
by their degradation of primary substrates
3.1.8
degradation rate constant
k
rate constant for first-order or pseudo first-order kinetics which indicates the rate at which degradation processes
occur
−1
NOTE 1 The degradation rate constant is expressed in inverse days (d ).
NOTE 2 For a batch experiment, k is estimated from the initial part of the degradation curve obtained after the end of the lag
phase. For a continuously operating test system, k can be estimated from a mass balance for the reactor using data collected
under steady-state conditions.
2 © ISO 2002 – All rights reserved

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ISO 14592-1:2002(E)
3.1.9
degradation half-life
T
1/2
characteristic of the rate of a first-order reaction and corresponds to the time interval necessary for the
concentration to decrease by a factor of two
NOTE 1 The degradation half-life is expressed in days (d).
NOTE 2 The degradation half-life and the degradation rate constant are related by the following equation:
T = ln2/k
1/2
NOTE 3 The degradation half-life T for first-order reactions should not be confused with the half-life time, T , which is
1/2 50
often used to describe the environmental behaviour of pesticides and which is simply the time to reach 50 % of total
biodegradation. The half-life time T may be derived from degradation curves without making assumptions about the kinetics.
50
3.2 Symbols
Symbol Description Units
1) 14
A activity of the C-radiolabelled test compound becquerels(Bq)
14 14
A inorganic C-activity ( CO evolved as a result of biodegradation) becquerels(Bq)
I 2
14
A total organic C-activity of the residual test compound, becquerels(Bq)
TO
metabolites, particulate microbial biomass and dissolved cell
14
constituents, measured in the liquid phase after stripping off CO
2
14
A dissolved organic C-activity of the residual test compound, becquerels(Bq)
DO
metabolites and dissolved cell constituents, measured in the
14
liquid phase after stripping off CO and separation of particles
2
by membrane filtration or centrifugation
14 14
A particulate organic C-activity of the sorbed C of the test becquerels(Bq)
PO
14
compound and particulate C-biomass measured in the particulate
residue after filtration or centrifugation
2)
a specific activity of the test compound or of a mixture becquerels per microgram
of radiolabelled and “cold” test compound (Bq/µg)
3)
c residual molar concentration of the test compound micromoles per litre (µmol/l)
c initial molar concentration of the test compound micromoles per litre (µmol/l)
0

1) A is the symbol for activity, expressed in bequerels, as specified in ISO 31-9-33:1992.
2) In accordance with ISO 31-9-34:1992, a is defined as the symbol for specific activity, expressed in bequerels per kilogram. It
may be common practice sometimes to use the symbol σ for specific activity, but this is not in accordance with
ISO 31-10-3:1992 where “σ ” is defined as the cross-section for a specified target entity and for a specified reaction or process
produced by incident charged or uncharged particles of specified type and energy.
3) In ISO 31-8-13:1992, c is defined as the symbol for “molar concentration”, expressed in moles per litre and in
ISO 31-8-11.2:1992, ρ is defined as the symbol for “mass concentration”, expressed in kilograms per litre. Note that in ISO 31,
“concentration” of the test compound in solution is expressed in two ways:
 “ρ” refers to the mass of the test compound per unit volume;
 “c” is specifically used to mean the number of moles of the test compound per unit volume.
© ISO 2002 – All rights reserved 3

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ISO 14592-1:2002(E)
4)
c residual activity concentration becquerels per millilitre
A
 (Bq/ml)
c initially added activity concentration becquerels per millilitre
A
0
 (Bq/ml)
c activity concentration at the plateau of the transition becquerels per millilitre
A
plateau
between the degradation curve and the subsequent “tailing” (Bq/ml)
F flasks containing the test compound examined
T
F flasks containing the blank sample
B
F flasks for check the test performance with a reference compound
C
F sterile flask for checking possible abiotic degradation or
S
other non-biological removal
−1
k biodegradation rate constant inverse days (d )
∗ −1
k pseudo first-order rate constant for disappearance of activity inverse days (d )
−1
k first-order rate constants and associated half-lives derived from inverse days (d )
non-adapted
portions of the curve showing no significant growth
−1
k pseudo first-order rate constants representing adapted environments inverse days (d )
adapted
t time days (d)
t lag phase days (d)
lag
T degradation half-life days (d)
1/2
V reaction volume in the reactor litres (l)
14 14
α fraction of C converted to CO
2
3)
ρ residual mass concentration of the test compound micrograms per litre (µg/l)
ρ initial mass concentration of the test compound micrograms per litre (µg/l)
0
4 Principle
The test is carried out by batch-wise incubation of the test compound with a sample of either surface water or
surface water and sediment. When surface water alone is used, the test is referred to as a “pelagic test” and when
sediment is added to obtain a suspension, the test is referred to as a “suspended sediment test”. Incubation takes
place at an environmental temperature under agitation by means of a system of flasks on a mechanical shaker.
Test compounds, present in lower concentrations than the natural carbon substrates also present in the system,
will serve as secondary substrates. Biodegrading microorganisms obtain the major part of their energy and carbon
from primary substrates and not from secondary substrates. Under these conditions, the kinetics for biodegradation
would be expected to be first order (“non-growth kinetics”). First-order kinetics implies that the specific rate of
degradation is constant and independent of the concentration of the test compound.

4) c is the symbol for volumetric activity, expressed in bequerels per cubic metre, as specified in ISO 31-9-35. a is sometimes
A
used for volumetric activity, but is not in accordance with ISO 31.
4 © ISO 2002 – All rights reserved

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ISO 14592-1:2002(E)
The test compound is added at two different concentration levels. The concentrations are chosen to be within the
microgram-per-litre range (preferably < 100 µg/l) so as to obtain first-order degradation kinetics and an estimated
half-life independent of the test concentration. Concentrations should normally be chosen to be as low as
practically possible with respect to the sensitivity of the available measurement techniques. These concentrations
need not be as low as those expected in the environment to ensure the same type of degradation kinetics.
The test mixture is transferred to closed flasks with an air headspace. Flasks are incubated in the dark or in diffuse
light at either the field temperature or at a temperature of 20 °C to 25 °C as commonly used in biodegradation tests.
Agitation by means of continuous shaking or stirring is provided to maintain particles, including microorganisms, in
free suspension.
The time-course of degradation is followed by the determination of the residual concentration of test compound at
appropriate intervals. The incubation time should be sufficiently long to be able to evaluate the degradation
behaviour. If the degradation is found to be significant, the extent of degradation should be sufficiently high
(normally greater than 15 % to 20 % degradation) to be able to estimate the first-order rate constant.
Measurement of the degradation of the test compound is carried out either by a radiotracer technique, normally
14
using C-labelling and liquid scintillation counting, or by specific chemical analysis, if a sufficiently sensitive
14
analytical method is available. Using the C technique and labelling the most persistent part of the molecule with
14
C, total mineralization or ultimate biodegradation can be assessed, while only primary biodegradation can be
measured with specific analysis.
5 Reagents and media
5.1 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade and radiolabelled compounds of high radiochemical purity.
5.1.1 Deionized water, for preparing stock solutions of the test compound and the reference substance.
This water shall have a DOC content of no more than 1 mg/l DOC (use e.g. ISO 8245 for determination) and be
free from inhibitory concentrations of toxic substances.
5.1.2 Volatile organic solvent (optional), for dissolving test compounds of low solubility.
5.1.3 Mercury(II) chloride (HgCl ) (optional), added to a mass concentration of 100 mg/l in the sample of test
2
water containing the test or reference compound and used for stopping all biological activity.
5.1.4 Sodium azide (NaN ), (optional), added to a mass concentration of 10 g/l in the sample of test water
3
containing the test or reference compound and used for stopping all biological activity.
5.2 Media
5.2.1 Surface water, for use in the “pelagic test”.
Collect a sample of suitable surface water in a thoroughly cleansed container. Remove coarse particles, for
example, by filtration through a nylon filter of about 100 µm mesh size, a coarse paper filter, or by sedimentation.
Keep the sample of surface water in an aerobic environment (e.g. by keeping sufficient headspace in the flask)
during the transport and until the start of the test in the laboratory. Start the test preferably within 1 d after
collection. During transportation and storage, the temperature of the sample of surface water should not be
permitted to exceed significantly the temperature to be used in the test. Cool to 4 °C if transportation times exceed
a few hours. Ensure this water does not freeze.
© ISO 2002 – All rights reserved 5

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ISO 14592-1:2002(E)
Identify the sampling location precisely and describe it in terms of its pollution and nutrient status. Provide the
following minimum information for the surface water taken for the test:
a) date and time of collection and delay between collection and use in the laboratory test;
b) depth of collection;
c) appearance of sample (e.g. turbidity);
d) temperature and pH at the place and time of collection;
e) in the case of sea water and brackish water, salinity or conductivity;
f) in the case of a turbid sample, the amount of suspended solids;
g) number of colony-forming microorganisms determined on a suitable growth medium according to standard
methods;
and optionally, in addition:
h) DOC and TOC concentration;
i) inorganic nutrients such as total phosphorus, dissolved orthophosphate, total nitrogen, nitrate, nitrite or
ammonium nitrogen;
j) chlorophyll-a concentration;
k) total microbial number using staining (e.g. by acridine orange) and epifluorescence microscopy after ultrasonic
treatment or dispersion by other means;
l) other characteristics relating to the microbial biomass and activity such as ATP (adenosine triphosphate),
protein, heterotrophic carbon assimilation activity, and determination of the number of organisms capable of
degrading the test compound (e.g. determined using a most probable number method).
5.2.2 Surface water and sediment, for use in the “suspended sediment test”.
Collect a sample of surface water as described in 5.2.1. In addition, collect a grab sample of aerobic surface
sediment using an appropriate sampling method. Sample, for example, a number of sediment cores using a tube of
transparent plastic and slice off the upper aerobic layer immediately after sampling. Transport the sample in a
container with sufficient air headspace to keep the sediment aerobic, and aerate the sample of surface water
following arrival at the laboratory until use. First determine the level of suspended solids in the sediment sample,
then choose a mass concentration level between 100 mg/l and 1 000 mg/l and adjust the level of suspended solids
of the sample to this predetermined level.
Identify the sampling location precisely and describe it in terms of its pollution and nutrient status. Provide the same
information for the sample of water medium as described for the pelagic test (5.2.1) and provide the following
information for the sediment:
a) date and time of collection and delay between collection and use in the laboratory test;
b) depth of collection;
c) appearance of the sample, such as coloured, muddy, silty, or sandy;
d) dry mass in grams per litre of the suspended solids;
e) TOC concentration or loss of ignition as a measure of the content of organic matter;
6 © ISO 2002 – All rights reserved

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ISO 14592-1:2002(E)
and optionally:
f) sediment particulate characteristics (fractions of silt and sand);
g) inorganic nutrients such as total phosphorus, dissolved orthophosphate, total nitrogen, nitrate, nitrite, or
ammonium nitrogen in the pore water;
h) microbial colony count on an appropriate growth medium as obtained after gentle treatment with ultrasound;
i) total microbial number using staining (e.g. by acridine orange) and epifluorescence microscopy after treatment
with ultrasonic or dispersion by other means;
j) any other characteristic relating to the microbial biomass and activity.
A preliminary dry mass determination can conveniently be carried out by drying a portion of this sediment in a
microwave oven, e.g. for 15 min. The estimate so obtained can be used for the purpose of calculating the amount
of sediment to be added to the surface water in order to obtain a suspension with the desired content of solids dry
mass. The accurate solid content is calculated subsequently using a more precise dry mass determination, e.g.
obtained after drying overnight at 105 °C in a conventional oven.
6 Apparatus
Ordinary laboratory equipment and the following.
6.1 Conical or cylindrical flasks, of appropriate capacity, for example 0,5 l or 1 l, with silicone or rubber
stoppers, or serum flasks with CO -tight lids (e.g. with butyl rubber septa).
2
For non-volatile test compounds that are not radiolabelled, gas-tight stoppers or lids are not required. Thoroughly
clean test flasks and stoppers before use and ensure they contain no traces of detergents. To be sure that no
bacterial contamination occurs, the flasks may be sterilized by heating or autoclaving.
6.2 Shaking table or magnetic stirrers, for continuous agitation of the test flasks.
2
6.3 Centrifuge, capable of rotating at a rate of 40 000 m/s .
6.4 pH meter.
6.5 Oven or microwave oven, for dry-mass determinations.
6.6 Membrane filtration apparatus.
6.7 Autoclave or oven (optional), for heat-sterilization of glassware and for stopping all biological activity in the
aqueous media.
14
6.8 Radiotracer facilities and equipment, for handling and measuring C-labelled compounds if used, (see
also annex A).
6.9 Analytical equipment, for the determination of organic test compounds if specific chemical analysis is used
(e.g. gas chromatograph, high pressure liquid chromatograph).
7 Test environment and conditions
7.1 Semi-continuous incubation (optional)
Very long incubation times (several months) may be necessary if long lag times occur before significant
degradation can be measured. In such cases, the microbial community of the sample of surface water may
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ISO 14592-1:2002(E)
deteriorate and the similarity of the test system to natural environmental conditions decreases. Such deterioration
may affect the degradation of the test compound causing it to cease or to slow down. A likely explanation is the
disappearance of slowly growing competent microorganisms from the test system. These may die out due to
various loss processes, i.e. before degradation effectively starts or at a later stage if the pressure of selection
exerted by the test compound, present at a low concentration, is insufficient. The problem of sample deterioration is
greatest for pelagic tests. It can be remedied, however, by including a pre-adaptation period with semi-continuous
operation prior to the batch test. The basic principle of the semi-continuous pre-ad
...

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 14592-1:2010
01-september-2010
Kakovost vode - Vrednotenje aerobne biorazgradljivosti organskih spojin pri
nizkih koncentracijah - 1. del: Šaržni preskus s stresanjem steklenic s površinsko
vodo ali suspenzijami površinske vode in usedlin
Water quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low
concentrations - Part 1: Shake-flask batch test with surface water or surface
water/sediment suspensions
Qualité de l'eau - Évaluation de la biodégradabilité aérobie des composés organiques
présents en faibles concentrations - Partie 1: Essai en lots de flacons agités avec des
eaux de surface ou des suspensions eaux de surface/sédiments
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 14592-1:2002
ICS:
13.060.10 Voda iz naravnih virov Water of natural resources
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 14592-1:2010 en,fr
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 14592-1:2010

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SIST ISO 14592-1:2010

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14592-1
First edition
2002-11-15
Corrected version
2003-08-01


Water quality — Evaluation of the aerobic
biodegradability of organic compounds at
low concentrations —
Part 1:
Shake-flask batch test with surface water or
surface water/sediment suspensions
Qualité de l'eau — Évaluation de la biodégradabilité aérobie des composés
organiques présents en faibles concentrations —
Partie 1: Essai en lots de flacons agités avec des eaux de surface ou
des suspensions eaux de surface/sédiments




Reference number
ISO 14592-1:2002(E)
©
ISO 2002

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SIST ISO 14592-1:2010
ISO 14592-1:2002(E)
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ii © ISO 2002 – All rights reserved

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SIST ISO 14592-1:2010
ISO 14592-1:2002(E)
Contents Page
Foreword . iv
Introduction. v
1 Scope. 1
2 Normative reference. 1
3 Terms, definitions and symbols . 1
4 Principle . 4
5 Reagents and media . 5
6 Apparatus. 7
7 Test environment and conditions. 7
8 Procedure. 8
9 Calculation . 11
10 Validity of the test . 13
11 Test report. 13
14
Annex A (informative) Guidance on the use of C-labelled compounds . 14
Bibliography. 22


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SIST ISO 14592-1:2010
ISO 14592-1:2002(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards adopted
by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this part of ISO 14592 may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 14592-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological
methods.
ISO 14592 consists of the following parts, under the general title Water quality — Evaluation of the aerobic
biodegradability of organic compounds at low concentrations:
 Part 1: Shake-flask batch test with surface water or surface water/sediment suspensions
 Part 2: Continuous flow river model with attached biomass
This corrected version of ISO 14592-1:2002 incorporates corrections to
 the reference given in the third item of the list in 8.2.1;
 the reference given in the penultimate line of 8.2.1;
 the reference given in the last line of the second paragraph of 8.4.1.

iv © ISO 2002 – All rights reserved

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SIST ISO 14592-1:2010
ISO 14592-1:2002(E)
Introduction
This International Standard consists of two parts. Part 1 describes a die-away batch test for either surface water
with or without added sediment in suspension simulating either a pelagic aquatic environment or a
water-to-sediment interface. Part 2 describes a continuous flow system simulating a river with biomass attached to
stationary surfaces.
This test has been specifically designed to provide information on the biodegradation behaviour and kinetics of test
compounds present in low concentrations, i.e. sufficiently low to ensure that they simulate the biodegradation
kinetics which would be expected to occur in natural environmental systems.
Before conducting this test, it is necessary to have information on the biodegradability behaviour of the test
compound at higher concentrations (e.g. in standard biodegradation tests), and, if possible, on abiotic degradability
or elimination from water, as well as relevant physico-chemical data. This information is necessary for proper
experimental planning and interpretation of results.
When this test method is used with a single environmental sample of surface water (either with or without the
addition of sediment), a laboratory-derived first-order biodegradation rate can be estimated for one single point in
time and space. The test system may be more consistent and provide more reliable biodegradation results if it is
adapted to the test compound at a specifically maintained concentration. This may be achieved using the optional
semi-continuous procedural variant of the method.



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SIST ISO 14592-1:2010

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SIST ISO 14592-1:2010
INTERNATIONAL STANDARD ISO 14592-1:2002(E)

Water quality — Evaluation of the aerobic biodegradability
of organic compounds at low concentrations —
Part 1:
Shake-flask batch test with surface water or surface
water/sediment suspensions
WARNING AND SAFETY PRECAUTIONS — Activated sludge, sewage and effluent contain potentially
pathogenic organisms. Therefore appropriate precautions should be taken when handling them. Toxic and
dangerous test compounds and those whose properties are unknown should be handled with care.
Radiolabelled compounds, if used, should be handled respecting existing rules and legislation.
1 Scope
This part of ISO 14592 specifies a test method for evaluating the biodegradability of organic test compounds by
aerobic microorganisms by means of a shake-flask batch test. It is applicable to natural surface water, free from
coarse particles to simulate a pelagic environment (“pelagic test”) or to surface water with suspended sediments
added to obtain a level of 0,1 g/l to 1 g/l dry mass to simulate a water body with suspended sediment (“suspended
sediment test”).
This part of ISO 14592 is applicable to organic test compounds present in lower concentrations (normally below
100 µg/l) than those of natural carbon substrates also present in the system. Under these conditions, the test
compounds serve as a secondary substrate and the kinetics for biodegradation would be expected to be first order
(“non-growth” kinetics).
This test method is not recommended for use as proof of ultimate biodegradation which is better assessed using
other standardized tests (see ISO/TR 15462). It is also not well suited to studies on metabolite formation and
accumulation which require higher test concentrations.
2 Normative reference
The following normative document contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this part of ISO 14592. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these publications
do not apply. However, parties to agreements based on this part of ISO 14592 are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For undated
references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO/TR 15462, Water quality — Selection of tests for biodegradability
3 Terms, definitions and symbols
3.1 Terms and definitions
For the purpose of this part of ISO 14592, the following terms and definitions apply.
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SIST ISO 14592-1:2010
ISO 14592-1:2002(E)
3.1.1
ultimate aerobic biodegradation
breakdown of a chemical compound or organic matter by microorganisms, in the presence of oxygen, to carbon
dioxide (CO ), water and mineral salts of any other elements present (mineralization) and the production of new
2
biomass
NOTE Total mineralization may be different from ultimate aerobic biodegradation in that total mineralization includes
secondary mineralization of biosynthesis products. The kinetics may therefore deviate from first-order kinetics in particular
towards the end of the experiment. In this part of ISO 14592, primary aerobic biodegradation is determined when using
substance specific analysis and total mineralization when using radiolabelled compounds.
3.1.2
primary biodegradation
structural change (transformation) of a chemical compound by microorganisms resulting in the loss of a specific
property of that compound
3.1.3
dissolved organic carbon
DOC
part of the organic carbon in a sample of water which cannot be removed by specified phase separation
2
NOTE Phase separation may be obtained, for example, by centrifugation of the sample of test water at 40 000 m/s for
15 min or by membrane-filtration using membranes with pores of 0,45 µm diameter.
3.1.4
lag phase
t
lag
time from the start of a test until significant biodegradation (about 10 % of the maximum level) can be measured
NOTE Lag phase is expressed in days (d).
3.1.5
maximum level of biodegradation
degree of biodegradation of a chemical compound or organic matter in a test above which no further
biodegradation takes place during the test
NOTE The maximum level of biodegradation is expressed as a percentage.
3.1.6
primary substrate
major carbon and energy source which is essential for growth or maintenance of microorganisms
3.1.7
secondary substrate
substrate component present at such low concentrations, that by its degradation, only insignificant amounts of
carbon and energy are supplied to the competent microorganisms, as compared to the carbon and energy supplied
by their degradation of primary substrates
3.1.8
degradation rate constant
k
rate constant for first-order or pseudo first-order kinetics which indicates the rate at which degradation processes
occur
−1
NOTE 1 The degradation rate constant is expressed in inverse days (d ).
NOTE 2 For a batch experiment, k is estimated from the initial part of the degradation curve obtained after the end of the lag
phase. For a continuously operating test system, k can be estimated from a mass balance for the reactor using data collected
under steady-state conditions.
2 © ISO 2002 – All rights reserved

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SIST ISO 14592-1:2010
ISO 14592-1:2002(E)
3.1.9
degradation half-life
T
1/2
characteristic of the rate of a first-order reaction and corresponds to the time interval necessary for the
concentration to decrease by a factor of two
NOTE 1 The degradation half-life is expressed in days (d).
NOTE 2 The degradation half-life and the degradation rate constant are related by the following equation:
T = ln2/k
1/2
NOTE 3 The degradation half-life T for first-order reactions should not be confused with the half-life time, T , which is
1/2 50
often used to describe the environmental behaviour of pesticides and which is simply the time to reach 50 % of total
biodegradation. The half-life time T may be derived from degradation curves without making assumptions about the kinetics.
50
3.2 Symbols
Symbol Description Units
1) 14
A activity of the C-radiolabelled test compound becquerels(Bq)
14 14
A inorganic C-activity ( CO evolved as a result of biodegradation) becquerels(Bq)
I 2
14
A total organic C-activity of the residual test compound, becquerels(Bq)
TO
metabolites, particulate microbial biomass and dissolved cell
14
constituents, measured in the liquid phase after stripping off CO
2
14
A dissolved organic C-activity of the residual test compound, becquerels(Bq)
DO
metabolites and dissolved cell constituents, measured in the
14
liquid phase after stripping off CO and separation of particles
2
by membrane filtration or centrifugation
14 14
A particulate organic C-activity of the sorbed C of the test becquerels(Bq)
PO
14
compound and particulate C-biomass measured in the particulate
residue after filtration or centrifugation
2)
a specific activity of the test compound or of a mixture becquerels per microgram
of radiolabelled and “cold” test compound (Bq/µg)
3)
c residual molar concentration of the test compound micromoles per litre (µmol/l)
c initial molar concentration of the test compound micromoles per litre (µmol/l)
0

1) A is the symbol for activity, expressed in bequerels, as specified in ISO 31-9-33:1992.
2) In accordance with ISO 31-9-34:1992, a is defined as the symbol for specific activity, expressed in bequerels per kilogram. It
may be common practice sometimes to use the symbol σ for specific activity, but this is not in accordance with
ISO 31-10-3:1992 where “σ ” is defined as the cross-section for a specified target entity and for a specified reaction or process
produced by incident charged or uncharged particles of specified type and energy.
3) In ISO 31-8-13:1992, c is defined as the symbol for “molar concentration”, expressed in moles per litre and in
ISO 31-8-11.2:1992, ρ is defined as the symbol for “mass concentration”, expressed in kilograms per litre. Note that in ISO 31,
“concentration” of the test compound in solution is expressed in two ways:
 “ρ” refers to the mass of the test compound per unit volume;
 “c” is specifically used to mean the number of moles of the test compound per unit volume.
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SIST ISO 14592-1:2010
ISO 14592-1:2002(E)
4)
c residual activity concentration becquerels per millilitre
A
 (Bq/ml)
c initially added activity concentration becquerels per millilitre
A
0
 (Bq/ml)
c activity concentration at the plateau of the transition becquerels per millilitre
A
plateau
between the degradation curve and the subsequent “tailing” (Bq/ml)
F flasks containing the test compound examined
T
F flasks containing the blank sample
B
F flasks for check the test performance with a reference compound
C
F sterile flask for checking possible abiotic degradation or
S
other non-biological removal
−1
k biodegradation rate constant inverse days (d )
∗ −1
k pseudo first-order rate constant for disappearance of activity inverse days (d )
−1
k first-order rate constants and associated half-lives derived from inverse days (d )
non-adapted
portions of the curve showing no significant growth
−1
k pseudo first-order rate constants representing adapted environments inverse days (d )
adapted
t time days (d)
t lag phase days (d)
lag
T degradation half-life days (d)
1/2
V reaction volume in the reactor litres (l)
14 14
α fraction of C converted to CO
2
3)
ρ residual mass concentration of the test compound micrograms per litre (µg/l)
ρ initial mass concentration of the test compound micrograms per litre (µg/l)
0
4 Principle
The test is carried out by batch-wise incubation of the test compound with a sample of either surface water or
surface water and sediment. When surface water alone is used, the test is referred to as a “pelagic test” and when
sediment is added to obtain a suspension, the test is referred to as a “suspended sediment test”. Incubation takes
place at an environmental temperature under agitation by means of a system of flasks on a mechanical shaker.
Test compounds, present in lower concentrations than the natural carbon substrates also present in the system,
will serve as secondary substrates. Biodegrading microorganisms obtain the major part of their energy and carbon
from primary substrates and not from secondary substrates. Under these conditions, the kinetics for biodegradation
would be expected to be first order (“non-growth kinetics”). First-order kinetics implies that the specific rate of
degradation is constant and independent of the concentration of the test compound.

4) c is the symbol for volumetric activity, expressed in bequerels per cubic metre, as specified in ISO 31-9-35. a is sometimes
A
used for volumetric activity, but is not in accordance with ISO 31.
4 © ISO 2002 – All rights reserved

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SIST ISO 14592-1:2010
ISO 14592-1:2002(E)
The test compound is added at two different concentration levels. The concentrations are chosen to be within the
microgram-per-litre range (preferably < 100 µg/l) so as to obtain first-order degradation kinetics and an estimated
half-life independent of the test concentration. Concentrations should normally be chosen to be as low as
practically possible with respect to the sensitivity of the available measurement techniques. These concentrations
need not be as low as those expected in the environment to ensure the same type of degradation kinetics.
The test mixture is transferred to closed flasks with an air headspace. Flasks are incubated in the dark or in diffuse
light at either the field temperature or at a temperature of 20 °C to 25 °C as commonly used in biodegradation tests.
Agitation by means of continuous shaking or stirring is provided to maintain particles, including microorganisms, in
free suspension.
The time-course of degradation is followed by the determination of the residual concentration of test compound at
appropriate intervals. The incubation time should be sufficiently long to be able to evaluate the degradation
behaviour. If the degradation is found to be significant, the extent of degradation should be sufficiently high
(normally greater than 15 % to 20 % degradation) to be able to estimate the first-order rate constant.
Measurement of the degradation of the test compound is carried out either by a radiotracer technique, normally
14
using C-labelling and liquid scintillation counting, or by specific chemical analysis, if a sufficiently sensitive
14
analytical method is available. Using the C technique and labelling the most persistent part of the molecule with
14
C, total mineralization or ultimate biodegradation can be assessed, while only primary biodegradation can be
measured with specific analysis.
5 Reagents and media
5.1 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade and radiolabelled compounds of high radiochemical purity.
5.1.1 Deionized water, for preparing stock solutions of the test compound and the reference substance.
This water shall have a DOC content of no more than 1 mg/l DOC (use e.g. ISO 8245 for determination) and be
free from inhibitory concentrations of toxic substances.
5.1.2 Volatile organic solvent (optional), for dissolving test compounds of low solubility.
5.1.3 Mercury(II) chloride (HgCl ) (optional), added to a mass concentration of 100 mg/l in the sample of test
2
water containing the test or reference compound and used for stopping all biological activity.
5.1.4 Sodium azide (NaN ), (optional), added to a mass concentration of 10 g/l in the sample of test water
3
containing the test or reference compound and used for stopping all biological activity.
5.2 Media
5.2.1 Surface water, for use in the “pelagic test”.
Collect a sample of suitable surface water in a thoroughly cleansed container. Remove coarse particles, for
example, by filtration through a nylon filter of about 100 µm mesh size, a coarse paper filter, or by sedimentation.
Keep the sample of surface water in an aerobic environment (e.g. by keeping sufficient headspace in the flask)
during the transport and until the start of the test in the laboratory. Start the test preferably within 1 d after
collection. During transportation and storage, the temperature of the sample of surface water should not be
permitted to exceed significantly the temperature to be used in the test. Cool to 4 °C if transportation times exceed
a few hours. Ensure this water does not freeze.
© ISO 2002 – All rights reserved 5

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SIST ISO 14592-1:2010
ISO 14592-1:2002(E)
Identify the sampling location precisely and describe it in terms of its pollution and nutrient status. Provide the
following minimum information for the surface water taken for the test:
a) date and time of collection and delay between collection and use in the laboratory test;
b) depth of collection;
c) appearance of sample (e.g. turbidity);
d) temperature and pH at the place and time of collection;
e) in the case of sea water and brackish water, salinity or conductivity;
f) in the case of a turbid sample, the amount of suspended solids;
g) number of colony-forming microorganisms determined on a suitable growth medium according to standard
methods;
and optionally, in addition:
h) DOC and TOC concentration;
i) inorganic nutrients such as total phosphorus, dissolved orthophosphate, total nitrogen, nitrate, nitrite or
ammonium nitrogen;
j) chlorophyll-a concentration;
k) total microbial number using staining (e.g. by acridine orange) and epifluorescence microscopy after ultrasonic
treatment or dispersion by other means;
l) other characteristics relating to the microbial biomass and activity such as ATP (adenosine triphosphate),
protein, heterotrophic carbon assimilation activity, and determination of the number of organisms capable of
degrading the test compound (e.g. determined using a most probable number method).
5.2.2 Surface water and sediment, for use in the “suspended sediment test”.
Collect a sample of surface water as described in 5.2.1. In addition, collect a grab sample of aerobic surface
sediment using an appropriate sampling method. Sample, for example, a number of sediment cores using a tube of
transparent plastic and slice off the upper aerobic layer immediately after sampling. Transport the sample in a
container with sufficient air headspace to keep the sediment aerobic, and aerate the sample of surface water
following arrival at the laboratory until use. First determine the level of suspended solids in the sediment sample,
then choose a mass concentration level between 100 mg/l and 1 000 mg/l and adjust the level of suspended solids
of the sample to this predetermined level.
Identify the sampling location precisely and describe it in terms of its pollution and nutrient status. Provide the same
information for the sample of water medium as described for the pelagic test (5.2.1) and provide the following
information for the sediment:
a) date and time of collection and delay between collection and use in the laboratory test;
b) depth of collection;
c) appearance of the sample, such as coloured, muddy, silty, or sandy;
d) dry mass in grams per litre of the suspended solids;
e) TOC concentration or loss of ignition as a measure of the content of organic matter;
6 © ISO 2002 – All rights reserved

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SIST ISO 14592-1:2010
ISO 14592-1:2002(E)
and optionally:
f) sediment particulate characteristics (fractions of silt and sand);
g) inorganic nutrients such as total phosphorus, dissolved orthophosphate, total nitrogen, nitrate, nitrite, or
ammonium nitrogen in the pore water;
h) microbial colony count on an appropriate growth medium as obtained after gentle treatment with ultrasound;
i) total microbial number using staining (e.g. by acridine orange) and epifluorescence microscopy after treatment
with ultrasonic or dispersion by other means;
j) any other characteristic relating to the microbial biomass and activity.
A preliminary dry mass determination can conveniently be carried out by drying a portion of this sediment in a
microwave oven, e.g. for 15 min. The estimate so obtained can be used for the purpose of calculating the amount
of sediment to be added to the surface water in order to obtain a suspension with the desired content of solids dry
mass. The accurate solid content is calculated subsequently using a more precise dry mass determination, e.g.
obtained after drying overnight at 105 °C in a conventional oven.
6 Apparatus
Ordinary laboratory equipment and the following.
6.1 Conical or cylindrical flasks, of appropriate capacity, for example 0,5 l or 1 l, with silicone or rubber
stoppers, or serum flasks with CO -tight lids (e.g. with butyl rubber septa).
2
For non-volatile test compounds that are not radiolabelled, gas-tight stoppers or lids are not required. Thoroughly
clean test flasks and stoppers before use and ensure they contain no traces of detergents. To be sure that no
bacterial contamination occurs, the flasks may be sterilized by heating or autoclaving.
6.2 Shaking table or magnetic stirrers, for continuous agitation of the test flasks.
2
6.3 Centrifuge, capable of rotating at a rate of 40 000 m/s .
6.4 pH meter.
6.5 Oven or microwave oven, for dry-mass determinations.
6.6 Membrane filtration apparatus.
6.7 Autoclave or oven (optional), for heat-steri
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 14592-1
Première édition
2002-11-15


Qualité de l'eau — Évaluation de la
biodégradabilité aérobie des composés
organiques présents en faibles
concentrations —
Partie 1:
Essai en lots de flacons agités avec des
eaux de surface ou des suspensions
eaux de surface/sédiments
Water quality — Evaluation of the aerobic biodegradability of organic
compounds at low concentrations —
Part 1: Shake-flask batch test with surface water or surface water
sediment suspensions




Numéro de référence
ISO 14592-1:2002(F)
©
ISO 2002

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ISO 14592-1:2002(F)
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ISO 14592-1:2002(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Référence normative. 1
3 Termes, définitions et symboles . 2
4 Principe . 5
5 Réactifs et milieux. 5
6 Appareillage. 7
7 Environnement et conditions d'essai . 8
8 Mode opératoire . 9
9 Calculs. 12
10 Validité de l'essai . 14
11 Rapport d'essai . 14
14
Annexe A (informative) Guide sur l'utilisation de composés marqués au C. 16
Bibliographie . 24

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ISO 14592-1:2002(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres
pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente partie de l'ISO 14592 peuvent faire
l'objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 14592-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau,
sous-comité SC 5, Méthodes biologiques.
L'ISO 14592 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l'eau — Évaluation
de la biodégradabilité aérobie des composés organiques présents en faibles concentrations:
— Partie 1: Essai en lots de flacons agités avec des eaux de surface ou des suspensions eaux de
surface/sédiments
— Partie 2: Modèle de cours d'eau à courant continu avec biomasse associée
L'annexe A est donnée uniquement à titre d'information.
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ISO 14592-1:2002(F)
Introduction
La présente Norme internationale comprend deux parties. La Partie 1 décrit un essai de disparition par lots
avec des eaux de surface avec ou sans suspension de sédiments ajoutés, simulant soit un environnement
aquatique pélagique, soit une interface eau/sédiment. La Partie 2 décrit un système à courant continu
simulant un cours d'eau avec une biomasse associée à des surfaces stationnaires.
L'essai a été spécifiquement mis au point pour fournir des informations sur le comportement de
biodégradation et les cinétiques de dégradation de composés d'essai présents en faibles concentrations,
c'est-à-dire suffisamment basses pour assurer qu'elles simulent des cinétiques de biodégradation que l'on
rencontrerait dans des systèmes environnementaux naturels.
Avant de procéder à cet essai, il est nécessaire de disposer d'informations sur le comportement de
biodégradabilité du composé d'essai à des concentrations plus élevées (par exemple dans le cadre d'essais
normalisés de biodégradation) ainsi que, si possible, d'informations sur sa dégradabilité abiotique ou sur son
élimination dans l'eau, et des données physico-chimiques correspondantes. Ces informations sont
nécessaires afin de planifier l'expérience et d'interpréter les résultats convenablement.
Lorsque cette méthode d'essai est utilisée avec un échantillon unique d'eau de surface (avec ou sans
sédiment ajouté), elle peut fournir une estimation de laboratoire d'une vitesse de dégradation de premier ordre
pour un point spatio-temporel unique. Le système d'essai peut être plus cohérent et fournir des résultats de
biodégradation plus fiables s'il est adapté au composé d'essai maintenu à une concentration spécifique. Ceci
peut être obtenu en utilisant une variante facultative en semi-continu du mode opératoire de la présente
méthode.

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NORME INTERNATIONALE ISO 14592-1:2002(F)

Qualité de l'eau — Évaluation de la biodégradabilité aérobie des
composés organiques présents en faibles concentrations —
Partie 1:
Essai en lots de flacons agités avec des eaux de surface
ou des suspensions eaux de surface/sédiments
AVERTISSEMENT ET PRÉCAUTIONS DE SÉCURITÉ — Les boues activées, les eaux usées et les
effluents contiennent des organismes potentiellement pathogènes. C'est pourquoi il convient de
prendre les mesures de précaution appropriées lors de leur manipulation. Il est recommandé de faire
preuve de prudence lors de la manipulation de composés d'essai toxiques et dangereux et de ceux
dont les propriétés sont inconnues. Il convient de respecter les règles et réglementations en vigueur
en cas de manipulation de composés radio-marqués.
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 14592 spécifie une méthode d'essai pour l'évaluation de la biodégradabilité de
composés d'essai organiques par des micro-organismes aérobies au moyen d'un essai en lots de flacons
agités. Elle s'applique à des eaux de surface naturelles exemptes de particules grossières pour simuler un
environnement pélagique («essai pélagique»), ou à des eaux de surface avec des sédiments en suspension
ajoutés pour obtenir des concentrations de 0,1 g/l à 1 g/l en masse sèche, pour simuler une pièce d'eau avec
sédiments en suspension («essai avec suspension de sédiments»).
La présente partie de l'ISO 14592 s'applique aux composés d'essai organiques présents en concentrations
plus faibles (normalement inférieures à 100 µg/l) que celles des substrats carbonés naturels également
présents dans le système. Dans ces conditions, les composés d'essai ont la fonction de substrat secondaire,
et il est attendu que la cinétique de biodégradation soit du premier ordre (cinétique «sans croissance»).
L'utilisation de cette méthode d'essai n'est pas recommandée comme preuve de la biodégradation ultime, qui
peut s'évaluer de manière plus fiable en utilisant d'autres essais normalisés (voir l'ISO/TR 15462). Elle n'est
pas recommandée non plus pour étudier la formation et l'accumulation de métabolites, ce qui requiert des
concentrations d'essai plus élevées.
2 Référence normative
Le document normatif suivant contient des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente partie de l'ISO 14592. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s'appliquent pas. Toutefois, les parties
prenantes aux accords fondés sur la présente partie de l'ISO 14592 sont invitées à rechercher la possibilité
d'appliquer l'édition la plus récente du document normatif indiqué ci-après. Pour les références non datées, la
dernière édition du document normatif en référence s'applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent
le registre des Normes internationales en vigueur.
ISO/TR 15462 , Qualité de l'eau — Sélection d'essais de biodégradabilité
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ISO 14592-1:2002(F)
3 Termes, définitions et symboles
3.1 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente partie de l'ISO 14592, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1.1
biodégradation aérobie ultime
décomposition d'un composé chimique ou d'une matière organique par des micro-organismes, en présence
d'oxygène, en dioxyde de carbone (CO ), eau et sels minéraux des autres éléments éventuellement présents
2
(minéralisation), et production d'une nouvelle biomasse
NOTE La minéralisation totale peut être différente de la biodégradation aérobie ultime car la minéralisation totale
inclut la minéralisation secondaire des produits de biosynthèse. En conséquence, la cinétique peut dévier de la cinétique
du premier ordre, en particulier vers la fin de l'essai. Dans la présente partie de l'ISO 14592, la biodégradation aérobie
primaire est déterminée lorsqu'une analyse spécifique de la substance est utilisée, et la minéralisation totale est
déterminée lorsque des composés radio-marqués sont utilisés.
3.1.2
biodégradation primaire
modification structurelle (transformation) d'un composé chimique par des micro-organismes résultant en la
perte d'une propriété spécifique de ce composé
3.1.3
carbone organique dissous
COD
partie du carbone organique présent dans un échantillon d'eau qui ne peut être éliminée par une séparation
spécifiée des phases
NOTE La séparation des phases peut être obtenue, par exemple, par centrifugation de l'échantillon d'eau à
2
40 000 m/s pendant 15 min ou par filtration sur membrane dont le diamètre des pores est de 0,45 µm.
3.1.4
phase de latence
t
latence
période entre le début d'un essai et le moment où une dégradation significative (environ 10 % du niveau
maximum de dégradation) peut être mesurée
NOTE La phase de latence est exprimée en jours (j).
3.1.5
niveau maximal de biodégradation
taux maximal de biodégradation d'un composé chimique ou d'une matière organique au cours d'un essai au-
delà duquel aucune biodégradation ne survient plus pendant l'essai
NOTE Le niveau maximal de biodégradation est exprimé en pourcentage.
3.1.6
substrat primaire
source majeure de carbone et d'énergie essentielle à la croissance ou au maintien des micro-organismes
3.1.7
substrat secondaire
élément de substrat présent à des concentrations si faibles que, par sa dégradation, seules des quantités
insignifiantes de carbone et d'énergie sont fournies aux micro-organismes, par comparaison avec le carbone
et l'énergie fournis par la dégradation des substrats primaires
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ISO 14592-1:2002(F)
3.1.8
constante de vitesse de dégradation
k
constante de vitesse pour cinétique de premier ordre ou de pseudo-premier ordre, qui indique la vitesse à
laquelle se produisent les processus de dégradation
−1
NOTE 1 La constante de vitesse de dégradation est exprimée en inverse de jours (j ).
NOTE 2 Dans le cadre d'une expérience par lots, k est estimée à partir de la partie initiale de la courbe de dégradation
obtenue après la fin de la phase de latence. Dans le cadre de systèmes d'essai fonctionnant en continu, k peut être
estimée à partir d'un bilan massique sur le réacteur en utilisant les données recueillies en conditions d'état permanent.
3.1.9
demi-vie de dégradation
T
1/2
caractéristique de la vitesse d'une réaction du premier ordre: intervalle de temps nécessaire à une réduction
de la concentration par un facteur de deux
NOTE 1 La demi-vie de dégradation est exprimée en jours (j).
NOTE 2 La demi-vie de dégradation et la constante de vitesse de dégradation sont liées par l'équation suivante:
T = ln2/k
1/2
NOTE 3 Il convient de ne pas confondre la demi-vie de dégradation T pour les réactions du premier ordre avec la
1/2
durée de demi-vie, T , qui est souvent utilisée pour décrire le comportement environnemental des pesticides, et qui
50
correspond simplement au temps nécessaire pour atteindre 50 % de la biodégradation totale. La durée de demi-vie T
50
peut être dérivée de courbes de dégradation sans faire d'hypothèses sur les cinétiques.
3.2 Symboles
Symbole Description Unité
1) 14
A activité du composé d'essai radio-marqué au C becquerels (Bq)
14 14
A activité du C inorganique ( CO dégagé suite à la becquerels (Bq)
I 2
biodégradation)
14
A activité du C organique total du composé d'essai résiduel, becquerels (Bq)
TO
des métabolites, de la biomasse microbienne particulaire
et des constituants cellulaires dissous, mesurée dans la phase
14
liquide après élimination du CO par entraînement
2
14
A activité du C organique dissous du composé d'essai résiduel, becquerels (Bq)
DO
des métabolites et des constituants cellulaires dissous,
14
mesurée dans la phase liquide après élimination du CO
2
par entraînement et séparation des particules par filtration
sur membrane ou centrifugation
14 14
A activité du C organique particulaire du C sorbé du becquerels (Bq)
PO
14
composé d'essai et de la biomasse du C particulaire,
mesurée dans le résidu particulaire après filtration ou
centrifugation

1) A est le symbole pour l'activité, exprimée en becquerels, comme spécifié dans l'ISO 31-9-33:1992.
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ISO 14592-1:2002(F)
2)
a activité spécifique du composé d'essai ou d'un mélange de becquerels par microgramme
composé d'essai radio-marqué et de composé d'essai «froid» (Bq/µg)
3)
c concentration molaire résiduelle du composé d'essai micromoles par litre (µmol/l)
c concentration molaire initiale du composé d'essai micromoles par litre (µmol/l)
0
4)
c concentration d'activité résiduelle becquerels par millilitre
A
 (Bq/ml)
c concentration d'activité ajoutée initialement becquerels par millilitre
A
0
 (Bq/ml)
c concentration d'activité au plateau de la transition entre la becquerels par millilitre
A
plateau
courbe de dégradation et la «queue résiduelle» qui la suit (Bq/ml)
F flacons contenant le composé d'essai analysé
T
F flacons contenant l'échantillon à blanc
B
F flacons pour contrôler la performance de l'essai avec une
C
substance de référence
F flacon stérile pour contrôler une éventuelle dégradation abiotique
S
ou toute autre forme d'élimination non biologique
−1
k constante de vitesse de biodégradation inverse de jours (j )
∗ −1
k constante de vitesse de pseudo-premier ordre pour  inverse de jours (j )
la disparition de l'activité
−1
k constantes de vitesse du premier ordre et demi-vies associées, inverse de jours (j )
non adapté
dérivées de parties de la courbe sans croissance significative
−1
k constantes de vitesse de pseudo-premier ordre représentant inverse de jours (j )
adapté
des environnements adaptés
t temps jours (j)
t phase de latence jours (j)
latence
T demi-vie de dégradation jours (j)
1/2

2) Conformément à l'ISO 31-9-34:1992, a est défini comme le symbole pour l'activité spécifique, exprimée en becquerels
par kilogramme. Il peut parfois être d'usage courant d'utiliser le symbole σ pour l'activité spécifique, mais cela n'est pas
conforme à l'ISO 31-10-3:1992 où «σ» est défini comme la coupe transversale pour une entité cible spécifiée et pour une
réaction ou un processus spécifié produit par des particules incidentes chargées ou non chargées d'un type et d'une
énergie spécifiés.
3) Dans l'ISO 31-8-13:1992, c est défini comme le symbole pour la «concentration molaire» exprimée en moles par litre,
et dans l'ISO 31-8-11.2:1992, ρ est défini comme le symbole pour la «concentration massique» exprimée en kilogrammes
par litre. On remarque que dans l'ISO 31, la «concentration» du composé d'essai dans la solution est exprimée de deux
manières:
 «ρ» est la masse du composé d'essai par unité de volume;
 «c» est utilisé spécifiquement pour le nombre de moles du composé d'essai par unité de volume.
4) cA est le symbole pour l'activité volumétrique, exprimée en becquerels par mètre cube, comme spécifié dans l'ISO 31-
9-35. a est parfois utilisé pour l'activité volumétrique, mais n'est pas conforme à l'ISO 31.
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ISO 14592-1:2002(F)
V volume réactionnel dans le réacteur litres (l)
14 14
α fraction de C convertie en CO
2
3)
ρ concentration massique résiduelle du composé d'essai microgrammes par litre (µg/l)
ρ concentration massique initiale du composé d'essai microgrammes par litre (µg/l)
0
4 Principe
L'essai est conduit en procédant par incubation de lots du composé d'essai avec un échantillon d'eau de
surface avec ou sans sédiments. Lorsque de l'eau de surface seule est utilisée, l'essai est dit «essai
pélagique»; lorsque des sédiments sont ajoutés pour obtenir une suspension, l'essai est dit «essai avec
suspension de sédiments». L'incubation a lieu sous agitation à température ambiante, en utilisant en pratique
un système de flacons placés sur un agitateur.
Les composés d'essai, présents en concentrations plus faibles que celles des substrats carbonés naturels
également présents dans le système, ont la fonction de substrats secondaires. Les micro-organismes de
dégradation reçoivent la majeure partie de leur énergie et du carbone des substrats primaires et non des
substrats secondaires. Dans ces conditions, il est attendu que la cinétique de biodégradation soit du premier
ordre (cinétique «sans croissance»). Une cinétique du premier ordre implique que la vitesse spécifique de
dégradation est constante et indépendante de la concentration du composé d'essai.
Le composé d'essai est ajouté à deux concentrations différentes. Les concentrations sont choisies de l'ordre
du µg/l (de préférence < 100 µg/l) afin d'obtenir une cinétique de dégradation du premier ordre et une demi-vie
estimée indépendante de la concentration d'essai. Normalement, il convient de choisir les concentrations les
plus faibles possible en tenant compte de la sensibilité des techniques de mesurage disponibles. Il n'est pas
nécessaire que ces concentrations soient aussi faibles que celles escomptées dans l'environnement pour
assurer le même type de cinétique de dégradation.
Le mélange d'essai est transféré dans des flacons fermés avec un espace de tête constitué d'air. Les flacons
sont incubés à l'abri de la lumière ou sous éclairage diffus à la température environnementale ambiante ou à
une température comprise entre 20 °C et 25 °C, comme couramment utilisée pour les essais de
biodégradation. Une agitation est assurée en secouant ou en remuant en continu les flacons afin de maintenir
les particules, y compris les micro-organismes, à l'état de suspension libre.
La dégradation est suivie au cours du temps par la détermination de la concentration résiduelle du composé
d'essai à une fréquence appropriée. Il convient que la durée d'incubation soit suffisamment longue pour
pouvoir évaluer le comportement de dégradation. Si la dégradation est considérée comme significative, le
niveau devrait être suffisant (normalement supérieur à environ 15 % à 20 % de dégradation) pour permettre
l'estimation de la constante de vitesse du premier ordre.
Le mesurage de la dégradation du composé d'essai s'effectue soit par la technique du traceur radioactif, en
14
utilisant normalement le C marqué et le comptage de scintillations en phase liquide, soit par analyse
14
chimique spécifique si une méthode suffisamment sensible est disponible. En utilisant la technique au C et
14
le marquage au C de la partie la plus persistante de la molécule, la minéralisation totale ou la
biodégradation ultime peut être évaluée, tandis qu'une analyse spécifique permet uniquement de mesurer la
biodégradation primaire.
5 Réactifs et milieux
5.1 Réactifs
Utiliser exclusivement des réactifs de qualité analytique reconnue et des composés radio-marqués de grande
pureté radiochimique.
5.1.1 Eau déionisée, pour préparer les solutions mères du composé d'essai et de la substance de
référence.
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ISO 14592-1:2002(F)
Cette eau doit avoir une teneur en COD d'au plus 1 mg/l (utiliser par exemple l'ISO 8245 pour sa
détermination), et être exempte de concentrations inhibitrices de substances toxiques.
5.1.2 Solvant organique volatil (facultatif), pour dissoudre les composés d'essai peu solubles.
5.1.3 Chlorure mercurique (HgCl ) (facultatif), ajouté à une concentration massique de 100 mg/l à
2
l'échantillon d'eau d'essai contenant le composé d'essai ou la substance de référence afin de stopper toute
activité biologique.
5.1.4 Azoture de sodium (NaN ) (facultatif), ajouté à une concentration massique de 10 g/l à l'échantillon
3
d'eau d'essai contenant le composé d'essai ou la substance de référence afin de stopper toute activité
biologique.
5.2 Milieux
5.2.1 Eau de surface pour l'«essai pélagique».
Prélever un échantillon d'eau de surface appropriée et le transférer dans un récipient parfaitement propre.
Éliminer les particules grossières, par exemple en procédant par filtration sur un filtre nylon d'environ 100 µm
d'ouverture de maille, un filtre papier à gros grain, ou encore par sédimentation. Conserver l'échantillon d'eau
de surface dans des conditions aérobies (par exemple en laissant un espace de tête suffisant dans le flacon)
durant le transport et jusqu'au démarrage de l'essai en laboratoire. Commencer l'essai de préférence dans les
24 h qui suivent le prélèvement. Pendant le transport et le stockage, il convient que la température de
l'échantillon d'eau de surface ne dépasse pas de manière significative la température à utiliser pour l'essai.
Refroidir à 4 °C si le temps de transport dépasse quelques heures. S'assurer que l'eau ne gèle pas.
Identifier précisément le lieu d'échantillonnage et le décrire en termes de pollution et d'état nutritif. Fournir au
minimum les informations suivantes pour l'eau de surface prélevée pour l'essai:
a) la date et l'heure du prélèvement et le délai entre le prélèvement et l'utilisation dans le cadre de l'essai en
laboratoire;
b) la profondeur du prélèvement;
c) l'aspect de l'échantillon (turbidité, par exemple);
d) la température et le pH sur le lieu et à l'heure de prélèvement;
e) en cas de prélèvement d'eau de mer ou d'eau saumâtre, la salinité ou la conductivité;
f) en cas de prélèvement d'échantillon turbide, la quantité de matières solides en suspension;
g) le nombre de micro-organismes formant colonies déterminé sur un milieu de croissance approprié selon
des méthodes normalisées;
et, facultativement:
h) les concentrations en COD et en carbone organique total (COT);
i) les nutriments inorganiques, comme le phosphore total, les orthophosphates dissous, l'azote total, le
nitrate, le nitrite ou l'azote ammoniacal;
j) la concentration de chlorophylle-a;
k) le nombre microbien total, déterminé par coloration (avec de l'acridine orange, par exemple) et par
microscopie à épifluorescence après traitement par ultrasons ou dispersion par d'autres moyens;
l) les autres caractéristiques se rapportant à la biomasse et à l'activité microbiennes, comme l'ATP
(adénosine triphosphate), les protéines, l'activité d'assimilation du carbone hétérotrophe, et la
détermination du nombre d'organismes capables de dégrader le composé d'essai (en utilisant la méthode
du nombre le plus probable, par exemple).
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ISO 14592-1:2002(F)
5.2.2 Eau de surface et sédiments pour l'«essai avec suspension de sédiments».
Prélever un échantillon d'eau de surface comme décrit au 5.2.1. Prélever de plus un échantillon de sédiments
de surface aérobie en appliquant une méthode d'échantillonnage appropriée. Prélever, par exemple, plusieurs
carottes de sédiments à l'aide d'un tube de plastique transparent et trancher la couche aérobie supérieure
immédiatement après le prélèvement. Transporter l'échantillon dans un récipient avec un espace de tête
suffisant pour maintenir l'état aérobie du sédiment, et, une fois arrivé au laboratoire, aérer l'échantillon d'eau
de surface jusqu'à son utilisation. Déterminer d'abord la quantité de matières solides en suspension dans
l'échantillon de sédiment, puis choisir une concentration massique entre 100 mg/l et 1 000 mg/l et ajuster la
quantité de matières solides en suspension de l'échantillon de manière à atteindre cette concentration
prédéterminée.
Identifier précisément le lieu d'échantillonnage et le décrire en termes de pollution et d'état nutritif. Pour
l'échantillon de milieu aqueux, fournir les mêmes informations que celles décrites pour l'essai pélagique
(5.2.1) et, pour le sédiment, indiquer les informations suivantes:
a) la date et l'heure du prélèvement et le délai entre le prélèvement et l'utilisation dans le cadre de l'essai en
laboratoire;
b) la profondeur du prélèvement;
c) l'aspect de l'échantillon (coloré, fangeux, vaseux ou sableux);
d) la masse sèche, en grammes de matières solides en suspension par litre;
e) la concentration en COT ou la perte à la calcination comme mesure de la teneur en matière organique;
et, facultativement:
f) les caractéristiques des particules sédimentaires (fractions de limon et de sable);
g) les nutriments inorganiques comme le phosphore total, les orthophosphates dissous, l'azote total, le
nitrate, le nitrite ou l'azote ammoniacal de l'eau interstitielle;
h) le comptage de colonies microbiennes sur un milieu de croissance approprié obtenu après un traitement
modéré par ultrasons;
i) le nombre microbien total, déterminé par coloration (avec de l'acridine orange, par exemple) et par
microscopie à épifluorescence après traitement par ultraso
...

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