Dried milk, dried ice-mixes and processed cheese — Determination of lactose content — Part 2: Enzymatic method utilizing the galactose moiety of the lactose

ISO 5765-2|IDF 79-2:2002 specifies an enzymatic method for the determination of the lactose content of all types of dried milk, of ice-mixes in dry form in the presence of other carbohydrates and reducing substances, and of processed cheese.

Lait sec, mélanges secs pour crèmes glacées et fromages fondus — Détermination de la teneur en lactose — Partie 2: Méthode enzymatique par la voie galactose

L'ISO 5765-2|FIL 79-2:2002 spécifie une méthode enzymatique pour à la détermination de la teneur en lactose dans tous les types de laits secs et de mélanges secs pour crèmes glacées en présence d'autres hydrates de carbone et de substances réductrices, ainsi que dans les fromages fondus.

General Information

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Published
Publication Date
25-Sep-2002
Current Stage
9093 - International Standard confirmed
Completion Date
28-Aug-2020
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ISO 5765-2:2002 - Dried milk, dried ice-mixes and processed cheese -- Determination of lactose content
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ISO 5765-2:2002 - Lait sec, mélanges secs pour cremes glacées et fromages fondus -- Détermination de la teneur en lactose
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Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 5765-2
IDF
79-2
First edition
2002-09-01


Dried milk, dried ice-mixes and processed
cheese — Determination of lactose
content —
Part 2:
Enzymatic method utilizing the galactose
moiety of the lactose
Lait sec, mélanges secs pour crèmes glacées et fromages fondus —
Détermination de la teneur en lactose —
Partie 2: Méthode enzymatique par la voie galactose




Reference numbers
ISO 5765-2:2002(E)
IDF 79-2:2002(E)
©
 ISO and IDF 2002

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ISO 5765-2:2002(E)
IDF 79-2:2002(E)
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or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO or IDF at the respective address below.
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Printed in Switzerland

ii © ISO and IDF 2002 – All rights reserved

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ISO 5765-2:2002(E)
IDF 79-2:2002(E)
Contents
Foreword . iv
Foreword . v
Introduction. vi
1 Scope. 1
2 Terms and definitions. 1
3 Principle . 1
4 Reagents . 1
5 Apparatus. 3
6 Sampling . 4
7 Procedure. 4
7.1 Test to check the procedure . 4
7.2 Preparation of test sample . 4
7.3 Test portion. 5
7.4 Reagent blank test . 5
7.5 Deproteination . 5
7.6 Determination . 6
8 Calculation and expression of results . 7
8.1 Calculation . 7
8.2 Expression of results. 8
9 Precision . 8
9.1 Interlaboratory trial . 8
9.2 Repeatability . 8
9.3 Reproducibility . 8
10 Test report. 9
Annex A (normative) Good Laboratory Practice (GLP) rules for the performance of enzymatic analyses . 10
Bibliography. 14

© ISO 2002 – All rights reserved iii

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ISO 5765-2:2002(E)
IDF 79-2:2002(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards adopted
by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this part of ISO 5765IDF 79 may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 5765-2IDF 79-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food Products, Subcommittee SC 5, Milk
and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with AOAC International. It is being
published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
ISO 5765IDF 79 consists of the following parts, under the general title Dried milk, dried ice-mixes and processed
cheese — Determination of lactose content:
 Part 1: Enzymatic method utilizing the glucose moiety of the lactose
 Part 2: Enzymatic method utilizing the galactose moiety of the lactose
Annex A forms a normative part of this part of ISO 5765IDF 79.
iv © ISO 2002 – All rights reserved

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ISO 5765-2:2002(E)
IDF 79-2:2002(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National Committee in
every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF Standing Committees
carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO and AOAC International in the development of standard
methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the National
Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of National
Committees casting a vote.
ISO 5765-2IDF 79-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk
and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with AOAC International. It is being
published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
ISO 5765IDF 79 consists of the following parts, under the general title Dried milk, dried ice-mixes and processed
cheese — Determination of lactose content:
 Part 1: Enzymatic method utilizing the glucose moiety of the lactose
 Part 2: Enzymatic method utilizing the galactose moiety of the lactose
All work was carried out by the Joint ISO/IDF/AOAC Action Team Lactose and lactate determination, of the
Standing Committee on Main components of milk, under the aegis of its project leader, Mr J. Labrijn (NL).
© ISO 2002 – All rights reserved v

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ISO 5765-2:2002(E)
IDF 79-2:2002(E)

Introduction
This part of ISO 5765IDF 79 describes the enzymatic method for the determination of lactose utilizing the
galactose moiety of the lactose. It is complementary to ISO 5765-1IDF 79-1 which utilizes the glucose moiety of
the lactose.
The choice of whether to use the method described in part 1 or part 2 of ISO 5765IDF 79 depends from the
amount of glucose or galactose present in the sample to be analysed. If the glucose content of a sample is
considerably higher than its lactose content, it is recommended to use the method described in this part of
ISO 5765IDF 79. Conversely, for a sample with a considerably higher galactose content than its lactose content, it
is recommended to use the method described in ISO 5765-1IDF 79-1.
For samples with a low content of both glucose and galactose, either method may be used without preference. For
samples with a high content of both glucose and galactose, the accuracy of the lactose determination is
considerably reduced for both methods.
In heat-treated milk and milk products, a proportion of lactose may have been converted to lactulose. Lactulose
cannot be determined by applying the method described in ISO 5765-1IDF 79-1. If, however, the method in this
part of ISO 5765IDF 79 is applied, the lactulose will partially be determined as lactose. Moreover, in intensively
heat-treated milk (e.g. sterilized milk) or milk products, a proportion of the lactose may be bound to protein because
of a Maillard reaction. In such cases the bound lactose cannot be determined by the method described either in
part of ISO 5765IDF 79.
Only when the good laboratory practice (GLP) rules for enzymatic analyses have been applied strictly, will reliable
results be obtained. The GLP rules are stated in annex A.
vi © ISO 2002 – All rights reserved

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ISO 5765-2:2002(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 79-2:2002(E)

Dried milk, dried ice-mixes and processed cheese —
Determination of lactose content —
Part 2:
Enzymatic method utilizing the galactose moiety of the lactose
1 Scope
This part of ISO 5765IDF 79 specifies an enzymatic method for the determination of the lactose content of all
types of dried milk, of ice-mixes in dry form in the presence of other carbohydrates and reducing substances, and
of processed cheese.
2 Terms and definitions
For the purposes of this part of ISO 5765IDF 79, the following term and definition applies.
2.1
lactose content
mass fraction of substances determined by the procedure in this part of ISO 5765IDF 79
NOTE  The lactose content is expressed as a percentage by mass.
3 Principle
3.1 A solution or suspension of the test portion is deproteinated to obtain a pure extract.
3.2 The purified extract of the test portion is reacted with the following enzymes and biochemical substances:
a) β-galactosidase, to split the lactose into glucose and galactose;
+
b) β-galactosidase dehydrogenase in the presence of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAD ) to
+
catalyse the oxidation of galactose into galactonic acid, the NAD being reduced to NADH.
3.3 The amount of NADH is determined from the absorbance of the test solution at 340 nm.
3.4 The lactose content is calculated, which is proportional to the amount of NADH if a correction is made for the
galactose present in the test sample at the start of the analysis.
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade unless otherwise specified. The water used for the preparation of
the enzyme solutions shall be of at least doubly glass-distilled purity. The water used for other purposes shall be
glass-distilled or of at least equivalent purity.
© ISO 2002 – All rights reserved 1

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ISO 5765-2:2002(E)
IDF 79-2:2002(E)
Take note of the production and expiry dates of the reagents given by the manufacturer.
If an enzyme suspension is applied with other than the prescribed activity, the volume of the suspension as stated
in the pipetting scheme (7.6.1) should be increased or decreased proportionally.
NOTE The reagents described in 4.4 and in 4.6 to 4.8 inclusive may be obtained commercially as a test combination, for
1)
example, Boehringer test kit.
4.1 Potassium hexacyanoferrate(II) solution, K [Fe(CN) ]
4 6
Dissolve 3,6 g of potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate in water. Dilute with water to 100 ml and mix.
4.2 Zinc sulfate solution, ZnSO
4
Dissolve 7,2 g of zinc sulfate heptahydrate in water. Dilute with water to 100 ml and mix.
4.3 Sodium hydroxide solution, c(NaOH) = 0,1 mol/l
Dissolve 4,0 g of sodium hydroxide in water. Dilute with water to 1 000 ml and mix.
4.4 Citrate buffer solution, pH 6,6 ±±±± 0,1
Dissolve 2,8 g of trisodium citrate dihydrate (C H O Na ⋅2H O), 0,042 g of citric acid monohydrate (C H O ⋅H O),
6 5 7 3 2 6 8 7 2
and 0,625 g of magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ⋅7H O) in about 40 ml of water.
4 2
Adjust the pH to 6,6 ± 0,1 at 20 °C with sulfuric acid (2 mol/l) or sodium hydroxide solution (0,1 mol/l). Dilute with
water to 50 ml and mix.
This solution may be kept for 3 months if stored in a refrigerator set at between 0 °C and 5 °C.
4.5 Phosphate (KH PO ) buffer solution, pH 8,6 ±±±± 0,1
2 4
Dissolve 16,6 g of potassium dihydrogen phosphate in about 80 ml of water. Adjust the pH to 8,6 ± 0,1 at 20 °C
with sodium hydroxide solution (1 mol/l). Dilute with water to 100 ml and mix.
This solution may be kept for 8 weeks if stored in a refrigerator set at between 0 °C and 5 °C.
++++
4.6 NAD /citrate buffer solution
Dissolve 25 mg of nicotinamide adenine dinucleotide (C H N O P ; approximately 98 % assay) in 5 ml of citrate
21 27 7 17 2
buffer solution (4.4).
This solution may be kept for 3 weeks if stored in a refrigerator set at between 0 °C and 5 °C.
4.7 ββββ-Galactosidase suspension (from Escherichia coli), suspension in 3,2 mol/l ammonium sulfate solution, of
pH 6 ± 0,1.
[5]
The activity of the suspension of β-galactosidase (EC 3.2.1.23) shall be at least 60 units/ml (lactose as substrate,
at 25 °C). The suspension may be kept for about 12 months if stored in a refrigerator set at between 0 °C and 5 °C.
When using the suspension, the vessel containing the suspension shall be kept immersed in crushed ice.
NOTE  A β-galactosidase suspension which contains not more than 0,001 % each of β-fructosidase, α-galactosidase,
glucose dehydrogenase, α-glucosidase and NADH-oxidase, calculated in terms of the specific activity of β-galactosidase, has
been found to be suitable.

1) Boehringer test kit is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience
of users of this part of ISO 5765IDF 79 and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
2 © ISO 2002 – All rights reserved

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ISO 5765-2:2002(E)
IDF 79-2:2002(E)
4.8 ββββ-Galactose dehydrogenase suspension (from Pseudomonas fluorescens), suspension in 3,2 mol/l of
ammonium sulfate solution, of pH 6 ± 0,1.
[5]
The activity of the suspension of β-galactosidase dehydrogenase (EC 1.1.1.48) shall be at least 8 units/ml.
The suspension may be kept for at least 6 months if stored in a refrigerator set at between 0 °C and 5 °C. When
using the suspension, the vessel containing the suspension shall be kept immersed in crushed ice.
NOTE  A β-galactosidase dehydrogenase suspension which contains not more than 0,01 % each of alcohol dehydrogenase
and β-galactosidase, not more than 0,1 % of NADH-oxidase and glucose-reacting enzymes, and not more than 0,5 % of lactate
dehydrogenase has been found to be suitable.
4.9 Lactose standard solution, c(C H O ⋅H O) = 0,8 mg/ml.
12 22 11 2
Before use, dry the lactose monohydrate to a constant mass in a drying oven set at 87 °C.
Dissolve 400 mg of dried lactose monohydrate in water. Dilute with water to 500 ml and mix. The solution may be
kept for 2 days if stored in a refrigerator set at between 0 °C and 5 °C. Warm the solution to about 20 °C just before
use.
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 1 mg and a readability to 0,1 mg.
5.2 Glass beakers, of capacities 50 ml, 100 ml and 250 ml.
5.3 Graduated pipettes, capable of delivering 5 ml and 10 ml, graduated in 0,1 ml divisions.
5.4 Pipettes, capable of delivering 10 ml, 5 ml, 1 ml, 0,2 ml, and 0,05 ml.
5.5 One-mark volumetric flasks, of capacity 100 ml.
5.6 Filter paper, medium grade, of diameter about 15 cm.
5.7 Filter funnels, of diameter about 7 cm.
5.8 Spectrometer, suitable for measuring at 340 nm, equipped with cells of optical path length 1 cm.
5.9 Plastic paddles, suitable for mixing the sample/enzyme mixture in the spectrometer cells.
5.10 Glass rods, of diameter approximately 6 mm and length 150 mm, for macerating the sample.
5.11 Water bath, capable of being maintained at between 20 °C and 25 °C, with rack suitable for holding the
spectrometer cells (5.8) (optional; see 7.6).
NOTE  Incubation of the cells in the water bath is only necessary if the room temperature is below 20 °C.
5.12 Blending apparatus, suitable for preparing suspensions of test portions of processed cheese (e.g. Ultra
2)
Turrax ).
5.13 Drying oven, thermostatically controlled, capable of maintaining a temperature of 87 °C ± 2 °C.
5.14 Grinding or grating device, capable of grinding or grating cheese and of being easily cleaned.

2) Ultra Turrax is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this part of ISO 5765IDF 79 and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
© ISO 2002 – All rights reserved 3

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ISO 5765-2:2002(E)
IDF 79-2:2002(E)
6 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 5765IDF 79. A recommended sampling method is
given in ISO 707.
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
7 Procedure
7.1 Test to check the procedure
7.1.1 Carry out the following test to check the recovery of lactose if one or more of the following conditions apply:
+
a) if using a new batch of the NAD /citrate buffer solution (4.6), the β-galactosidase suspension (4.7) or the
β-galactosidase dehydrogenase suspension (4.8),
+
b) if the NAD /citrate buffer solution (4.6) and/or the β-galactosidase suspension (4.7) and/or the β-galactosidase
dehydrogenase suspension (4.8) have been stored in a refrigerator for more than 2 weeks without being used;
c) if restarting the analytical work after a period of analytical inactivity;
d) if circumstances justify carrying out such a test.
7.1.2 Pipette 5,0 ml and 10,0 ml respectively of the lactose standard solution (4.9) in each of two 100 ml
volumetric flasks (5.5). Add about 50 ml of water to each flask. Proceed as specified in 7.5 and 7.6.
7.1.3 Calculate the lactose monohydrate content of the lactose standard solution (4.9) according to equation (3)
(see 8.1), but using the following values:
V is the volume of the lactose standard s
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 5765-2
FIL
79-2
Première édition
2002-09-01

Lait sec, mélanges secs pour crèmes
glacées et fromages fondus —
Détermination de la teneur en lactose —

Partie 2:
Méthode enzymatique par la voie
galactose
Dried milk, dried ice-mixes and processed cheese — Determination of
lactose content —

Part 2:
Enzymatic method utilizing the galactose moiety of the lactose




Numéros de référence
ISO 5765-2:2002(F)
FIL 79-2:2002(F)
©
ISO et FIL 2002

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 5765-2:2002(F)
FIL 79-2:2002(F)
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©  ISO et FIL 2002
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
soit de l'ISO soit de la FIL à l'adresse respective ci-après.
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E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Version française parue en 2003
Publié en Suisse

ii © ISO et IDF 2002 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 5765-2:2002(F)
FIL 79-2:2002(F)
Sommaire Page
Avant-propos ISO. iv
Avant-propos FIL . v
Introduction . vi
1 Domaine d'application. 1
2 Terme et définition. 1
3 Principe . 1
4 Réactifs . 1
5 Appareillage. 3
6 Échantillonnage . 4
7 Mode opératoire . 4
7.1 Essai de vérification . 4
7.2 Préparation de l'échantillon pour essai. 5
7.3 Prise d'essai . 5
7.4 Essai à blanc des réactifs . 6
7.5 Défécation. 6
7.6 Dosage . 6
8 Calcul et expression des résultats. 8
8.1 Calcul. 8
8.2 Expression des résultats . 9
9 Fidélité. 9
9.1 Essai interlaboratoires . 9
9.2 Répétabilité. 9
9.3 Reproductibilité. 10
10 Rapport d'essai . 10
Annex A (normative) Règles de bonne pratique de laboratoire (BPL) relatives aux analyses
enzymatiques . 11
Bibliographie . 15

© ISO et IDF 2002 – Tous droits réservés iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 5765-2:2002(F)
FIL 79-2:2002(F)
Avant-propos ISO
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 3.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente partie de l'ISO 5765FIL 79
peuvent faire l'objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue
pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 5765-2FIL 79-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en collaboration avec l'AOAC
International. Elle est publiée conjointement par l'ISO et la FIL, et séparément par l'AOAC International.
L'ISO 5765FIL 79 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait sec, mélanges secs
pour crèmes glacées et fromages fondus — Détermination de la teneur en lactose:
 Partie 1: Méthode enzymatique par la voie glucose
 Partie 2: Méthode enzymatique par la voie galactose
L'Annexe A constitue un élément normatif de la présente partie de l'ISO 5765FIL 79.
iv © ISO et IDF 2002 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 5765-2:2002(F)
FIL 79-2:2002(F)
Avant-propos FIL
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité
National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités
permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l'ISO et avec
l'AOAC International pour l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et d'échantillonnage pour le lait et
les produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d'Action et les Comités permanents sont
soumis aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux votants.
L'ISO 5765-2FIL 79-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en collaboration avec l'AOAC
International. Elle est publiée conjointement par l'ISO et la FIL, et séparément par l'AOAC International.
L'ISO 5765FIL 79 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait sec, mélanges secs
pour crèmes glacées et fromages fondus — Détermination de la teneur en lactose:
 Partie 1: Méthode enzymatique par la voie glucose
 Partie 2: Méthode enzymatique par la voie galactose
L'ensemble des travaux a été confié à l'Équipe d'Action mixte ISO/FIL/AOAC, Détermination de lactose et de
lactate du Comité permanent Composants principaux du lait, sous la conduite de son chef de projet,
M. J. Labrijn (NL).
© ISO et IDF 2002 – Tous droits réservés v

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 5765-2:2002(F)
FIL 79-2:2002(F)
Introduction
La présente partie de l'ISO 5765FIL 79 décrit la méthode enzymatique destinée à la détermination de la
teneur en lactose par la voie galactose. Elle est complémentaire à l'ISO 5765-1FIL 79-1, qui traite de la
détermination de la teneur en lactose par la voie glucose.
Le choix d'utiliser la méthode décrite dans la partie 1 ou celle décrite dans la partie 2 de l'ISO 5765FIL 79 se
fera en fonction de la quantité de glucose ou de galactose que contient le produit à analyser. Si la teneur en
glucose de l'échantillon est considérablement plus élevée que sa teneur en lactose, il est recommandé
d'utiliser la méthode décrite dans la présente partie de l'ISO 5765FIL 79. À l'inverse, en présence d'un
échantillon dont la teneur en galactose est considérablement plus élevée que la teneur en lactose, il est
recommandé d'utiliser la méthode décrite dans l'ISO 5765-1FIL 79-1.
Si les quantités de glucose et de galactose contenues dans les échantillons sont toutes les deux faibles, on
peut utiliser au choix l'une ou l'autre méthode. Si les quantités de glucose et de galactose contenues dans les
échantillons sont toutes les deux élevées, la précision de la détermination de la teneur en lactose sera
considérablement réduite, quelle que soit la méthode utilisée.
Dans le lait et les produits laitiers ayant subi un traitement thermique, une certaine quantité de lactose peut
avoir été convertie en lactulose. La teneur en lactulose ne peut pas être déterminée par l'application de la
méthode décrite dans l'ISO 5765-1FIL 79-1. Toutefois, si la méthode décrite dans la présente partie de
l'ISO 5765FIL 79 est appliquée, la teneur en lactulose sera partiellement déterminée en tant que lactose. En
outre, dans le lait ou les produits laitiers ayant subi un traitement thermique intense (par exemple le lait
stérilisé), une certaine quantité du lactose peut s'être liée aux protéines à la suite de réactions de Maillard.
Dans de pareils cas, la teneur en lactose lié ne peut être déterminée par aucune des méthodes décrites dans
les deux parties de l'ISO 5765FIL 79.
Des résultats valables ne peuvent être obtenus que dans la mesure où les règles de bonne pratique de
laboratoire (BPL) relatives aux analyses enzymatiques auront été strictement appliquées. Ces règles figurent
dans l'Annexe A.

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NORME INTERNATIONALE
FIL 79-2:2002(F)

Lait sec, mélanges secs pour crèmes glacées et fromages
fondus — Détermination de la teneur en lactose —
Partie 2:
Méthode enzymatique par la voie galactose
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 5765FIL 79 spécifie une méthode enzymatique pour la détermination de la teneur
en lactose dans tous les types de laits secs et de mélanges secs pour crèmes glacées en présence d'autres
hydrates de carbone et de substances réductrices, ainsi que dans les fromages fondus.
2 Terme et définition
Pour les besoins de la présente partie de l'ISO 5765FIL 79, le terme et la définition suivants s'appliquent.
2.1
teneur en lactose
fraction massique de substances, déterminée par la méthode spécifiée dans la présente partie de
l'ISO 5765FIL 79
NOTE La teneur en lactose est exprimée en pourcentage massique.
3 Principe
3.1 Défécation de la solution ou de la suspension de l'échantillon pour obtenir un extrait purifié.
3.2 Traitement d'un extrait purifié de l'échantillon au moyen des enzymes et substances biochimiques
suivantes:
 b-galactosidase, destinée à scinder le lactose en glucose et en galactose;
+
 b-galactosidase-déshydrogénase en présence de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD ) pour
+
catalyser l'oxydation du galactose en acide galactonique, le NAD étant réduit au NADH.
3.3 Détermination de la teneur en NADH en mesurant l'absorbance de la solution d'essai à 340 nm.
3.4 Calcul de la teneur en lactose, qui est proportionnelle à la teneur en NADH, à condition d'appliquer une
correction pour tenir compte du galactose contenu dans l'échantillon pour essai au début de l'analyse.
4 Réactifs
Sauf indication contraire, tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue. L'eau utilisée pour la
préparation des solutions d'enzymes doit être d'une pureté au moins égale à celle de l'eau bidistillée dans le
verre. L'eau utilisée pour les autres usages doit être de l'eau distillée dans le verre ou d'une pureté au moins
égale à celle-ci.
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Tenir compte des dates de production et d'expiration des réactifs données par le fabricant.
Si une suspension d'enzyme est appliquée avec une activité autre que celle prescrite, le volume de la
suspension, comme indiqué dans le programme de dosage (7.6.1), doit être augmenté ou diminué
proportionnellement.
NOTE Les réactifs décrits en 4.4 et en 4.6 à 4.8 inclus peuvent être obtenus dans le commerce en tant que
1)
combinaison pour essai, par exemple le «Boehringer Test Kit» .
4.1 Solution d'hexacyanoferrate(II) de potassium, K [Fe(CN) ].
4 6
Dissoudre 3,6 g d'hexacyanoferrate(II) de potassium trihydraté dans de l'eau. Compléter à 100 ml avec de
l'eau et mélanger.
4.2 Solution de sulfate de zinc, ZnSO .
4
Dissoudre 7,2 g de sulfate de zinc heptahydraté dans de l'eau. Compléter à 100 ml avec de l'eau et mélanger.
4.3 Solution d'hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 0,1 mol/l.
Dissoudre 4,0 g d'hydroxyde de sodium dans de l'eau. Compléter à 1 000 ml avec de l'eau et mélanger.
4.4 Solution tampon de citrate, pH 6,6 ±±±± 0,1.
Dissoudre 2,8 g de citrate trisodique dihydraté (C H O Na ,2H O), 0,042 g d'acide citrique monohydraté
6 5 7 3 2
(C H O ,H O) et 0,625 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ,7H O) dans environ 40 ml d'eau.
6 8 7 2 4 2
Ajuster le pH à 6,6 ± 0,1 à 20 °C au moyen d'une solution d'acide sulfurique (2 mol/l) ou d'une solution
d'hydroxyde de sodium (0,1 mol/l). Compléter à 50 ml avec de l'eau et mélanger.
Cette solution peut se conserver pendant 3 mois, à condition d'être entreposée dans un réfrigérateur réglé à
une température comprise entre 0 °C et 5 °C.
4.5 Solution tampon de phosphate (KH PO ), pH 8,6 ±±±± 0,1.
2 4
Dissoudre 16,6 g de dihydrogénophosphate de potassium dans environ 80 ml d'eau.
Ajuster le pH à 8,6 ± 0,1 à 20 °C au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium (1 mol/l). Compléter à
100 ml avec de l'eau et mélanger.
Cette solution peut se conserver pendant 8 semaines, à condition d'être entreposée dans un réfrigérateur
réglé à une température comprise entre 0 °C et 5 °C.
+
4.6 Solution tampon de NAD /citrate.
Dissoudre 25 mg de nicotinamide-adénine dinucléotide (C H N O P , d'une pureté de 98 % environ) dans
21 27 7 17 2
5 ml de solution tampon de citrate (4.4).
Cette solution peut se conserver pendant 3 semaines, à condition d'être entreposée dans un réfrigérateur
réglé à une température comprise entre 0 °C et 5 °C.

1) Le «Boehringer Test Kit» est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée
à l'intention des utilisateurs de la présente partie de l'ISO 5765FIL 79 et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL
approuvent ou recommandent l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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4.7 Suspension de bbbb-galactosidase (provenant d'Escherichia coli) dans une solution de sulfate
d'ammonium à 3,2 mol/l, de pH 6 ± 0,1.
[5]
L'activité de la suspension de b-galactosidase (EC 3.2.1.23) doit être d'au moins 60 unités/ml (lactose
comme substrat à 25 °C).
La suspension peut être conservée pendant 12 mois environ, à condition d'être entreposée dans un
réfrigérateur réglé à une température comprise entre 0 °C et 5 °C. En cours d'utilisation, le récipient qui
contient la suspension doit être maintenu dans de la glace pilée.
NOTE Une suspension de b-galactosidase qui ne contient pas plus de 0,001 % de, respectivement, b-fructosidase,
a-galactosidase, glucose-déshydrogénase, a-glucosidase et NADH-oxydase, calculés en termes d'activité spécifique de
b-galactosidase, est jugée satisfaisante.
4.8 Suspension de bbbb-galactosidase-déshydrogénase (provenant de Pseudonomas fluorescens) dans
une solution de sulfate d'ammonium à 3,2 mol/l, de pH 6 ± 0,1.
[5]
L'activité de la suspension de b-galactosidase-déshydrogénase (EC 1.1.1.48) doit être d'au moins
8 unités/ml.
La suspension peut être conservée pendant 6 mois au moins, à condition d'être entreposée dans un
réfrigérateur réglé à une température comprise entre 0 °C et 5 °C. En cours d'utilisation, le récipient qui
contient la suspension doit être maintenu dans de la glace pilée.
NOTE Une suspension de b-galactosidase-déshydrogénase qui ne contient pas plus de 0,01 % d'alcool
déshydrogénase et de b-galactosidase, pas plus de 0,1 % de NADH-oxydase et d'enzyme réagissant avec le glucose, et
pas plus de 0,5 % de lactate déshydrogénase est jugée satisfaisante.
4.9 Solution étalon de lactose, c(C H O ,H O) = 0,8 mg/ml.
12 22 11 2
Avant utilisation, sécher le lactose monohydraté jusqu'à masse constante dans une étuve (5.13) à 87 °C.
Dissoudre dans de l'eau 400 mg de lactose monohydraté séché. Compléter à 500 ml avec de l'eau et
mélanger. La solution peut se conserver pendant 2 jours, à condition d'être entreposée dans un réfrigérateur
réglé à une température comprise entre 0 °C et 5 °C. Immédiatement avant emploi, réchauffer la solution à
une température d'environ 20 °C.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Balance analytique, capable de peser à 1 mg près et avec une précision d'indication de 0,1 mg.
5.2 Béchers en verre, de 50 ml, 100 ml et 250 ml de capacité.
5.3 Pipettes graduées, permettant de délivrer 5 ml et 10 ml, graduées en 0,1 ml.
5.4 Pipettes, permettant de délivrer 10 ml, 5 ml, 1 ml, 0,2 ml et 0,05 ml.
5.5 Fioles jaugées à un trait, de 100 ml de capacité.
5.6 Papier-filtre, de qualité moyenne, d'environ 15 cm de diamètre.
5.7 Entonnoirs pour filtre, d'environ 7 cm de diamètre.
5.8 Spectromètre, permettant de mesurer à 340 nm et équipé de cellules de 1 cm de trajet optique.
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5.9 Spatules en matière plastique, permettant de mélanger, dans les cellules du spectromètre,
l'échantillon avec les enzymes.
5.10 Baguettes en verre, d'environ 6 mm de diamètre et de 150 mm de longueur, destinées à la macération
de l'échantillon.
5.11 Bain d'eau, si nécessaire (voir 7.6), pouvant être maintenu à une température comprise entre 20 °C et
25 °C et muni d'un support adéquat pour maintenir les cellules du spectromètre (5.8).
NOTE L'incubation des cellules dans le bain d'eau n'est nécessaire que si la température ambiante est inférieure à
20 °C.
2)
5.12 Homogénéiseur (par exemple Ultra Turrax ), capable de mettre en suspension des prises d'essai de
fromage fondu.
5.13 Étuve, réglée par thermostat, capable de maintenir une température de 87 °C ± 2 °C.
5.14 Appareil moulinant ou râpant, capable de mouliner ou de râper du fromage et facile à nettoyer.
6 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l'ISO 5765FIL 79. Une
méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 707.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif et n'ayant subi aucun
dommage ni aucune altération au cours du transport ou du stockage.
7 Mode opératoire
7.1 Essai de vérification
7.1.1 Effectuer l'essai suivant pour vérifier la récupération de lactose lorsqu'une ou plusieurs des conditions
suivantes s'appliquent:
+
a) utilisation d'un nouveau lot de la solution tampon de NAD /citrate (4.6), de la suspension de
b-galactosidase (4.7) ou de la suspension de b-galactosidase-déshydrogénase (4.8);
+
b) la solution tampon de NAD /citrate (4.6) et/ou la suspension de b-galactosidase (4.7) et/ou la suspension
de b-galactosidase-déshydrogénase (4.8) a/ont été entreposée(s) dans un réfrigérateur sans être
utilisée(s) pendant plus de deux semaines;
c) reprise de l'analyse après une période d'inactivité analytique;
d) circonstances justifiant un tel essai.
7.1.2 Dans chacune de deux fioles de 100 ml (5.5), introduire, au moyen d'une pipette, respectivement
5,0 ml et 10,0 ml de la solution étalon de lactose (4.9). Ajouter environ 50 ml d'eau dans chaque fiole.
Procéder comme décrit en 7.5 et 7.6.

2) Ultra Turrax est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention
des utilisateurs de la présente partie de l'ISO 5765FIL 79 et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou
recommandent l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.

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7.1.3 Calculer la teneur en lactose monohydraté de la solution étalon de lactose (4.9) à l'aide de
l'équation (3) (voir 8.1), mais en utilisant les valeurs suivantes:
V est le volume de la solution étalon de lactose (4.9), V = 500 ml;
3 3
V est le volume de la solution étalon de lactose utilisée (7.1.2), V = 5 ml et 10 ml respectivement;
4 4
V est le volume total de la solution étalon diluée (7.1.2), V = 100 ml.
5 5
7.1.4 Compte tenu du degré de pureté du lactose monohydraté, la détermination doit permettre de
récupérer une teneur de (100 ± 2) % dans chacune des deux dilutions (7.1.2).
Si la teneur obtenue ne se situe pas dans cette étendue, procéder à une vérification des réactifs, du mode
opératoire, de la précision des pipettes et de l'état du spectromètre. Prendre toute mesure nécessaire pour
obtenir des résultats convenables. Répéter l'essai de vérification jusqu'à obtention de résultats satisfaisants.
7.2 Préparation de l'échantillon pour essai
7.2.1 Lait sec et mélanges secs pour crèmes glacées
Introduire l'échantillon pour essai dans un récipient pourvu d'un couvercle hermétique, et dont la capacité est
d'environ deux fois le volume de l'échantillon. Fermer le récipient immédiatement. Bien mélanger l'échantillon
par agitations et retournements successifs du récipient.
7.2.2 Fromage fondu
Enlever l'écorce ou la couche poisseuse ou moisie du fromage afin de fournir un échantillon pour essai
représentatif du fromage tel qu'il est consommé d'habitude. Mouliner ou râper l'échantillon pour essai en
utilisant un appareil moulinant ou râpant (5.14). Mélanger rapidement la masse moulinée ou râpée et, si
possible, mouliner ou râper une seconde fois. Mélanger de nouveau fermement. Si l'échantillon pour essai ne
peut pas être mouliné ou râpé, mélanger fermement en remuant et en pétrissant.
Dans le cas où un retard est inévitable, transférer l'échantillon pour essai, en attente des analyses, dans un
récipient pourvu d'un couvercle hermétique, et dont la capacité est d'environ deux fois le volume de
l'échantillon. Fermer le récipient immédiatement. Prendre toutes les précautions pour assurer la conservation
appropriée de l'échantillon pour essai et pour empêcher la condensation d'humidité sur la surface intérieure
du récipient.
Aussitôt que possible après le moulinement, le râpage ou le pétrissage ou après le retard forcé, transférer
l'échantillon pour essai dans un bécher de verre de 250 ml (5.2). Ajoutez la même quantité d'eau et mettre en
suspension le mélange avec un homogénéiseur (5.12).
7.3 Prise d'essai
Peser, à 1 mg près, 1 g ou davantage (voir ci-dessous) de l'échantillon pour essai (7.2.1) ou d'une suspension
d'échantillon pour essai (7.2.2) et l'introduire dans un bécher (5.2). Dissoudre ou mettre en suspension cette
prise d'essai dans au moins 20 ml d'eau préchauffée à une température comprise entre 40 °C et 50 °C, en
utilisant, respectivement, une baguette en verre (5.10) ou un homogénéiseur (5.12). Transvaser
quantitativement le contenu du bécher dans une fiole jaugée de 100 ml (5.5). Compléter avec de l'eau jusqu'à
approximativement 60 ml et mélanger.
Tenir compte des indications suivantes lors de la détermination de la masse de la prise d'essai à prélever:
 il convient que la prise d'essai soit représentative de l'échantillon pour essai;
 il convient que la quantité de lactose présente dans la cellule du spectromètre soit, de préférence,
comprise entre 5 µg et 10 µg;
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 il convient que l'absorbance (A ) de la solution présente dans la cellule du spectromètre, mesurée pour la
2
prise d'essai de glucose (voir 8.1) soit, de préférence, comprise entre 0,1 et 0,4;
 si la fraction massique de l'échantillon est inférieure à 0,2 %, une prise d'essai supérieure à 1 g sera
nécessaire. Dans ce cas, le volume de matière grasse, de protéines et d'autres substances précipitées
en 7.5.1 peut avoir une influence significative sur le volume de la solution (voir V en 8.1).
3
7.4 Essai à blanc des réactifs
Effectuer un double essai à blanc. Procéder comme décrit en 7.5 et 7.6 en utilisant tous les réactifs, mais
sans la prise d'essai.
7.5 Défécation
7.5.1 Ajouter à la solution ou à la suspension de l'échantillon (7.3) qui a été mise dans la fiole jaugée de
100 ml les quantités suivantes, en respectant l'ordre indiqué, et en remuant bien après chaque addition:
 5,0 ml de la solution d'hexacyanoferrate(II) de potassium (4.1),
 5,0 ml de la solution de sulfate de zinc (4.2), et
 10,0 ml de la solution d'hydroxyde de sodium (4.3).
Compléter à 100 ml avec de l'eau et mélanger intimement. Laisser se reposer le mélange pendant 30 min. Ne
plus agiter le contenu de la fiole avant filtration.
7.5.2 Filtrer le liquide surnageant au moyen de papier-filtre (5.6), en éliminant la première fraction du filtrat.
7.6 Dosage
7.6.1 Programme de dosage
Effectuer le dosage conformément au mode opératoire donné dans le Tableau 1, en veillant, juste avant
+
emploi, à amener à température ambiante (20 °C à 25 °C) la solution tampon de NAD /citrate (4.6), la solution
tampon de phosphate (4.5) ainsi que l'eau qui sera utilisée.
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Tableau 1 — Programme de dosage
Échantillon ou essai témoin Essai à blanc du réactif

lactose et glucose lactose et glucose
glucose glucose
À l'aide d'une pipette (5.4), introduire dans les cellules
du spectromètre les volumes
...

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