ISO 27105:2016

Milk and cheese — Determination of hen's egg white lysozyme content by high performance liquid chromatography

ISO 27105:2016 specifies a method for the quantitative determination of hen's egg white lysozyme content in milk and cheese. The method is suitable for measuring low levels of hen's egg white lysozyme with a quantification limit of 10 mg/kg.

Lait et fromages — Détermination de la teneur en lysozyme de blanc d'oeuf par chromatographie liquide haute performance

ISO 27105:2016 spécifie une méthode pour la détermination quantitative de la teneur en lysozyme de blanc d'?uf dans le lait et les fromages. La méthode est adaptée au mesurage de faibles niveaux de lysozyme de blanc d'?uf, avec une limite de quantification de 10 mg/kg.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 23-Mar-2016
• ICS: 67.100.01 - Milk and milk products in general
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 08-Nov-2022

Relations

• Revises: ISO/TS 27105:2009 - Milk and milk products — Determination of hen's egg white lysozyme by HPLC
• Effective Date: 20-Jul-2013
• Consolidated By: ISO 6412-1:2017 - Technical product documentation — Simplified representation of pipelines — Part 1: General rules and orthogonal representation
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 27105
IDF
216
First edition
2016-04-01
Milk and cheese — Determination
of hen’s egg white lysozyme
content by high performance liquid
chromatography
Lait et fromages — Détermination de la teneur en lysozyme de blanc
d’oeuf par chromatographie liquide haute performance
Reference numbers
ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
©
ISO and IDF 2016

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ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO and IDF 2016, Published in Switzerland
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
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written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office International Dairy Federation
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401 Silver Building • Bd Auguste Reyers 70/B • B-1030 Brussels
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ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
Contents Page
Forewords .iv
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Terms and definitions . 1
3 Principle . 1
4 Reagents and reference substances . 1
4.1 Reagents and materials . 1
4.2 Lysozyme . 2
5 Apparatus . 2
6 Sampling . 3
7 Procedure. 3
7.1 Preparation of lysozyme standard solution . 3
7.1.1 Lysozyme standard stock solution . 3
7.1.2 Lysozyme standard working solution . 3
7.2 Test portion . 3
7.2.1 Milk . 3
7.2.2 Cheese . 3
7.2.3 Preparation of test solution . 3
7.3 HPLC determination . 4
7.3.1 Chromatographic conditions . 4
8 Calculation and expression of results . 5
8.1 Single-point calibration . 5
8.2 Expression of results . 6
9 Precision . 6
9.1 Interlaboratory test. 6
9.2 Repeatability . 6
9.3 Reproducibility . 6
10 Test report . 6
Annex A (informative) Verification by LC/MS. 8
Annex B (informative) Interlaboratory test .10
Bibliography .11
© ISO and IDF 2016 – All rights reserved iii

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ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
Forewords
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and
milk products and the International Dairy Federation (IDF) and it is being published jointly by ISO and IDF.
This first edition of ISO 27105|IDF 216 cancels and replaces ISO/TS 27105|IDF/RM 216:2009, which has
been technically revised.
iv © ISO and IDF 2016 – All rights reserved

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ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
ISO 27105|IDF 216 was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Additives and
contaminants and ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk
products.
All work was carried out by the ISO/IDF Project Group on Determination of hen’s egg white lysozyme content
by high performance liquid chromatography of the Standing Committee on Analytical Methods for Additives
and Contaminants under the aegis of the project leaders, T. Berger (CH) and Prof. L. Pellegrino (IT).
This first edition of ISO 27105|IDF 216 cancels and replaces ISO/TS 27105|IDF/RM 216:2009, which has
been technically revised.
© ISO and IDF 2016 – All rights reserved v

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ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
Introduction
Lysozyme (EC 3.2.1.17, muramidase) is an enzyme widely dispersed in nature; it appears, e.g. in hen’s
egg white (approximately 3 % to 4 %), saliva and in tear liquid. Lysozyme has a preservative effect
because of the lytic activity on the cell wall of some bacteria. Hen’s egg white lysozyme is used in cheese
making to prevent late blowing of semi-hard and hard cheeses.
vi © ISO and IDF 2016 – All rights reserved

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ISO 27105:2016(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 216:2016(E)
Milk and cheese — Determination of hen’s egg
white lysozyme content by high performance liquid
chromatography
1 Scope
This International Standard specifies a method for the quantitative determination of hen’s egg white
lysozyme content in milk and cheese.
The method is suitable for measuring low levels of hen’s egg white lysozyme with a quantification limit
of 10 mg/kg.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
hen’s egg white lysozyme content
mass fraction of substance determined by the procedure specified
Note 1 to entry: The lysozyme content is expressed as milligram per kilogram.
3 Principle
Casein and denatured whey proteins from milk and cheese are precipitated isoelectrically at pH 4,3
(cheese) or at pH 2,2 (milk). Acid-soluble hen’s egg white lysozyme is then determined by reversed-
phase high-performance liquid chromatography (HPLC) and fluorescence detection. The lysozyme
peak can be verified by LC/MS (see Annex A).
4 Reagents and reference substances
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and only distilled water
or water of equivalent purity.
4.1 Reagents and materials
4.1.1 Sodium chloride solution, c(NaCl) = 1 mol/l.
Dissolve 58,44 g of sodium chloride in 1 l water.
4.1.2 Hydrochloric acid, c(HCl) = 1 mol/l.
Dissolve 4,0 ml of hydrochloric acid with mass fraction 37 % in a 50 ml one-mark volumetric flask.
Dilute to the mark with water.
4.1.3 Sodium hydroxide, c(NaOH) = 1 mol/l.
Dissolve 2,6 ml of sodium hydroxide with a mass fraction of 50 % in a 50 ml one-mark volumetric flask.
Dilute to the mark with water.
4.1.4 Trifluoracetic acid (CF COOH), analytical grade.
3
© ISO and IDF 2016 – All rights reserved 1

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ISO 27105:2016(E)
IDF 216:2016(E)
4.1.5 Acetonitrile (CH CN), HPLC grade.
3
4.1.6 Water, HPLC grade.
4.2 Lysozyme
1)
Pure hen’s egg white lysozyme . Sufficiently pure and characterized lysozyme is difficult to obtain. A
control on lot-to-lot variability is needed.
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 pH-meter, accurate to 0,1 unit.
2)
5.2 Fluted filter, diameter 15 cm .
3)
5.3 Membrane filter, pore size 0,22 μm .
5.4 Balance, capable of weighing to the nearest 100 mg, with a readability of 10 mg.
5.5 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,1 mg, with a readability of 0,01 mg.
5.6 Magnetic stirrer.
4)
5.7 Homogenizer , capable of spinning at a rotational frequency of 3 000 rpm to 3 500 rpm.
5.8 HPLC equipment.
5.8.1 Gradient pumping system, capable of operating with a speed of 1,0 ml/min.
5.8.2 Manual or automatic injector, capable of injecting amounts of 50 μl.
5.8.3 Column heater, c
...

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 27105
ISO/TC 34/SC 5 Secretariat: NEN
Voting begins on: Voting terminates on:
2014-10-29 2015-01-29
Milk and cheese — Determination of hen’s egg white
lysozyme content by
high performance liquid chromatography
Lait et fromages — Détermination de la teneur en lysozyme du blanc d’oeuf par chromatographie liquide à
haute performance
ICS: 67.100.01
THIS DOCUMENT IS A DRAFT CIRCULATED
FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS
THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
NOT BE REFERRED TO AS AN INTERNATIONAL
STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
USER PURPOSES, DRAFT INTERNATIONAL
STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO
BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
Reference number
NATIONAL REGULATIONS.
ISO/DIS 27105:2014(E)
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED
TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
NOTIFICATION OF ANY RELEVANT PATENT
RIGHTS OF WHICH THEY ARE AWARE AND TO
©
PROVIDE SUPPORTING DOCUMENTATION. ISO 2014

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/DIS 27105:2014(E)

Copyright notice
This ISO document is a Draft International Standard and is copyright-protected by ISO. Except as
permitted under the applicable laws of the user’s country, neither this ISO draft nor any extract
from it may be reproduced, stored in a retrieval system or transmitted in any form or by any means,
electronic, photocopying, recording or otherwise, without prior written permission being secured.
Requests for permission to reproduce should be addressed to either ISO at the address below or ISO’s
member body in the country of the requester.
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E-mail [e-mail]
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Violators may be prosecuted.
ii © ISO 2014 – All rights reserved

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ISO/CD 27105
Contents Page
Forew ord .3
Forew ord .4
1  Scope .5
2  Terms and definitions .5
3  Principle .5
4  Reagents and reference substances .5
5  Apparatus .6
6  Sampling .6
7  Procedure .7
8  Calculation and expression of results .9
9  Precision .9
10  Test report .10
Annex A (informative) Verification by LC/MS .11
Annex B (informative) Interlaboratory trial .13
Bibliography .14


2 © ISO 2013 – All rights reserved

---------------------- Page: 3 ----------------------
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 27105 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and
milk products.
This edition cancels and replaces the ISO/TS 27105|IDF/RM 216:2009, which has been technically revised.
ISO 27105 | IDF 216 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and
IDF.


© ISO 2013 – All rights reserved 3

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/CD 27105
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) ) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national interest
groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and governments/food
control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis and sampling
for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International Standards using the
logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any patent
rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on the ISO list of
patent declarations received (see www.iso.org/patents).
This International Standard was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Dairy
Microorganisms and the ISO Technical Committee 34 on Food products, Subcommittee 5 on Milk and milk
products (ISO/TC 34/SC 5).
All work was carried out by the ISO-IDF Project Group on Determination of hen’s egg white lysozyme content
by high performance liquid chromatography of the Standing Committee on Analytical Methods for Additives
and Contaminants under the aegis of the project leaders, T. Berger (CH) and Prof. L. Pellegrino (IT).
4 © ISO 2013 – All rights reserved

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Milk and cheese– Determination of hen’s egg white lysozyme by
HPLC
1 Scope
This standard specifies a method for the quantitative determination of hen's egg white lysozyme content in
milk and cheese.
The method is suitable for measuring low levels of hen's egg white lysozyme with a quantification limit of
10 mg per kilogram.
NOTE Lysozyme (EC 3.2.1.17, muramidase) is an enzyme widely dispersed in nature, it appears e.g. in hen's egg
white (approximately 3 % - 4 %), saliva and in tear liquid. Lysozyme has a preservative effect because of the lytic activity
on the cell wall of some bacteria. Hen's egg white lysozyme is used in cheese making to prevent late blowing of semi-hard
and hard cheeses.
2 Terms and definitions
For the purpose of this document, the following term and definition applies.
2.1 Hen's egg white lysozyme content

Mass fraction of substance determined by the procedure specified in this standard.
NOTE The lysozyme content is expressed as milligram per kilogram.
3 Principle
Casein and denatured whey proteins from milk and cheese are precipitated isoelectrically at pH 4,3 (cheese)
or at pH 2,2 (milk). Acid-soluble hen's egg white lysozyme is then determined by reversed-phase HPLC and
fluorescence detection. The lysozyme peak can be verified by LC/MS (see annex A).
4 Reagents and reference substances
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and only distilled water or water
of equivalent purity.
4.1 Reagents
4.1.1 Sodium chloride solution, c(NaCl) = 1 mol/l.
Dissolve 58,44 g of sodium chloride in 1 l water.
4.1.2 Hydrochloric acid, c(HCl) = 1 mol/l.
Dissolve 4,0 ml of hydrochloric acid with mass fraction 37 % in a 50 ml one-mark volumetric flask. Dilute to the
50 ml mark with water.
4.1.3 Sodium hydroxide, c(NaOH) = 1 mol/l.
Dissolve 2,6 ml of sodium hydroxide with a mass fraction of 50 % in a 50 ml one-mark volumetric flask. Dilute
to the 50 ml mark with water.
© ISO 2013 – All rights reserved 5

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/CD 27105
4.1.4 Trifluoracetic acid (CF COOH), analytical grade.
3
4.1.5 Acetonitrile (CH CN), HPLC grade.
3
4.1.6 Water, HPLC grade.
4.2 Lysozyme
1)
Pure hen's egg white lysozyme, e.g. Lysozyme, SIGMA L-6876 . It has to be noted that sufficient pure and
characterized lysozyme is difficult to obtain. A control on lot-to-lot variability is needed.
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 pH-Meter, accurate to 0,1 unit
1
)
5.2 Fluted filter, e.g. Schleicher&Schuell 595½, Ø 15 cm .
1
)
5.3 Membrane filter, pore size 0,22 m, e.g. Millipore Millex-GV PVDF 0,22 m . Filters of other
producers need to be tested for applicability.
5.4 Balance, capable of weighing to the nearest 100 mg, with a readability of 10 mg.
5.5 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,1 mg, with a readability of 0,01 mg.
5.6 Magnetic stirrer
1)
5.7 Homogenizer, Ultra turrax® or another giving equivalent results and capable of spinning at a
rotational frequency of 3000 to 3500 rpm.
5.8 HPLC equipment
5.8.1 Gradient pumping system, capable of operating with a speed of 1,0 ml/min.
5.8.2 Manual or automatic injector, capable of injecting amounts of 50 μl.
5.8.3 Column heater, capable of maintaining a column temperature of 45 °C ± 2 °C.
1)
5.8.4 Column, reversed phase, e.g. PLRP-S 300 Å , 5 µm, 250 mm x 4,6 mm
5.8.5 Fluorescence detector, capable of operating at 280 nm excitation and at 340 nm emission.


6 Sampling

1) SIGMA L-6876, Schleicher&Schuell 595½, Millipore Millex-GV PVDF 0,22 m, Ultra Turrax®, PLRP-S 300 Å
(Polymer Laboratories, UK) are products available commercially. This information is given for the convenience of users of
this standard and does not constitute an endorsement by either ISO or IDF of these products.
6 © ISO 2013 – All rights reserved

---------------------- Page: 7 ----------------------
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
[1]
is given in ISO 707 | IDF 50 .
It is important that the laboratory receives a sample, which is representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
7 Procedure
7.1 Preparation of lysozyme standard solution
7.1.1 Lysozyme standard stock solution
Weigh to the nearest 0,01 mg, 10 mg of lysozyme (4.2) into a 10 ml one-mark volumetric flask and wait for
complete dissolution. Dilute to the 10 ml mark with sodium chloride solution (4.1.1).
Prepare fresh the standard stock solutions daily.
7.1.2 Lysozyme
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 27105
FIL
216
Première édition
2016-04-01
Lait et fromages — Détermination de
la teneur en lysozyme de blanc d’oeuf
par chromatographie liquide haute
performance
Milk and cheese — Determination of hen’s egg white lysozyme
content by high performance liquid chromatography
Numéros de référence
ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
©
ISO et FIL 2016

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO et FIL 2016, Publié en Suisse
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office International Dairy Federation
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ii © ISO et FIL 2016 – Tous droits réservés

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ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Termes et définitions . 1
3 Principe . 1
4 Réactifs et substances de référence . 1
4.1 Réactifs et matériaux . 1
4.2 Lysozyme . 2
5 Appareillage . 2
6 Échantillonnage . 3
7 Mode opératoire. 3
7.1 Préparation de la solution étalon de lysozyme . 3
7.1.1 Solution étalon mère de lysozyme . 3
7.1.2 Solution étalon de travail de lysozyme . 3
7.2 Prise d’essai . 3
7.2.1 Lait . 3
7.2.2 Fromage . 3
7.2.3 Préparation de la solution pour essai . 3
7.3 Détermination par CLHP . 4
7.3.1 Conditions chromatographiques . 4
8 Calcul et expression des résultats . 5
8.1 Étalonnage à un seul point. 5
8.2 Expression des résultats . 6
9 Fidélité . 6
9.1 Essai interlaboratoires . 6
9.2 Répétabilité . 6
9.3 Reproductibilité . 6
10 Rapport d’essai . 6
Annexe A (informative) Vérification par chromatographie liquide couplée à la
spectrométrie de masse (CL-SM) . 8
Annexe B (informative) Essai interlaboratoires .10
Bibliographie .11
© ISO et FIL 2016 – Tous droits réservés iii

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ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers ainsi que la Fédération Internationale du Lait (FIL). Il est publié
conjointement par l’ISO et la FIL.
Cette première édition de l’ISO 27105|FIL 216 annule et remplace l’ISO/TS 27105|FIL/MR 216:2009, qui
a fait l’objet d’une révision technique.
iv © ISO et FIL 2016 – Tous droits réservés

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ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente
les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont
organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de
groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des
acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des
universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
L’ISO 27105|FIL 216 a été élaborée par le Comité permanent de la FIL chargé des Méthodes d’analyse des
additifs et contaminants et par le Comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5,
Lait et produits laitiers.
L’ensemble des travaux a été confié au groupe de projet mixte ISO/FIL, Détermination de la teneur en
lysozyme de blanc d’œuf par chromatographie liquide haute performance du Comité permanent chargé
des Méthodes d’analyse des additifs et contaminants, sous la conduite de leurs chefs de projet, T. Berger
(CH) et Prof. L. Pellegrino (IT).
Cette première édition de l’ISO 27105|FIL 216 annule et remplace l’ISO/TS 27105|FIL/MR 216:2009, qui
a fait l’objet d’une révision technique.
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ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
Introduction
Le lysozyme (EC 3.2.1.17, muramidase) est une enzyme très répandue dans la nature; elle est présente,
par exemple, dans le blanc d’œuf (environ 3 % à 4 %), la salive et les larmes. Le lysozyme a un effet
conservateur en raison de l’activité lytique sur la paroi de la cellule de certaines bactéries. Le lysozyme
de blanc d’œuf est utilisé dans la fabrication du fromage afin d’empêcher le gonflement tardif des
fromages à pâte demi-dure ou dure.
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ISO 27105:2016(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 216:2016(F)
Lait et fromages — Détermination de la teneur en
lysozyme de blanc d’oeuf par chromatographie liquide
haute performance
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour la détermination quantitative de la teneur
en lysozyme de blanc d’œuf dans le lait et les fromages.
La méthode est adaptée au mesurage de faibles niveaux de lysozyme de blanc d’œuf, avec une limite de
quantification de 10 mg/kg.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
2.1
teneur en lysozyme de blanc d’œuf
fraction massique de substance, déterminée selon le mode opératoire spécifié
Note 1 à l’article: La teneur en lysozyme est exprimée en milligrammes par kilogramme.
3 Principe
Précipitation isoélectrique de la caséine et des protéines de lactosérum dénaturé provenant du lait
et du fromage à pH 4,3 (fromage) ou à pH 2,2 (lait), puis détermination du lysozyme de blanc d’œuf
soluble dans l’acide par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse et
détection par fluorescence. Le pic du lysozyme peut être vérifié par chromatographie liquide couplée à
la spectrométrie de masse (CL-SM) (voir Annexe A).
4 Réactifs et substances de référence
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, et
uniquement de l’eau distillée ou de pureté équivalente.
4.1 Réactifs et matériaux
4.1.1 Solution de chlorure de sodium, c(NaCl) = 1 mol/l.
Dissoudre 58,44 g de chlorure de sodium dans 1 l d’eau.
4.1.2 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l.
Dissoudre 4,0 ml d’acide chlorhydrique de fraction massique 37 % dans une fiole jaugée à un trait de
50 ml. Compléter au trait de jauge avec de l’eau.
4.1.3 Hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l.
Dissoudre 2,6 ml d’hydroxyde de sodium de fraction massique 50 % dans une fiole jaugée à un trait de
50 ml. Compléter au trait de jauge avec de l’eau.
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ISO 27105:2016(F)
FIL 216:2016(F)
4.1.4 Acide trifluoroacétique (CF COOH), qualité analytique.
3
4.1.5 Acétonitrile, (CH CN), qualité CLHP.
3
4.1.6 Eau, qualité CLHP.
4.2 Lysozyme
1)
Lysozyme de blanc d’œuf pur . Un lysozyme suffisamment pur et caractérisé est difficile à obtenir. Il
est nécessaire de contrôler la variabilité d’un lot à l’autre.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, les matériels suivants:
5.1 pH-mètre, ayant une précision de 0,1 unité.
2)
5.2 Filtre cylindrique, de diamètre 15 cm .
3)
5.3 Membrane filtrante, de taille de pore 0,22 μm .
5.4 Balance, capable de peser à 100 mg près et d’une résolution de 10 mg.
5.5 Balance analytique, capable de peser à 0,1 mg près et d’une résolution de 0,01 mg.
5.6 Agitateur magnétique.
4)
5.7 Homogénéisateur , capable de tourner à une fréquence de rotation de 3 000 tr/min à
3 500 tr/min.
5.8 Matériel de CLHP.
5.8.1 Système de pompage permettant de réaliser une élution par gradient, capable de
fonctionner à une vitesse de 1,0 ml/min.
5.8.2 Injecteur manuel ou automatique, capable d’injecter des quantités de 50 μl.
5.8.3 Four à colonne, capable de maintenir une température de 45 °C ± 2 °C.
1) Lysozyme SIGMA L-6876 est un exemple de produit disponible sur le marché. Cette information est donnée par
souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de
l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit.

2) Fluted filter Schleich
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE
ISO/DIS 27105
ISO/TC 34/SC 5 Secrétariat: NEN
Début de vote: Vote clos le:
2014-10-29 2015-01-29
Lait et fromages — Détermination de la teneur en
lysozyme de blanc d’oeuf par chromatographie liquide
haute performance
Milk and cheese — Determination of hen’s egg white lysozyme content by high performance liquid
chromatography
ICS: 67.100.01
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR
OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC
SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE
AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES
FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR
POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES
POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
Numéro de référence
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
ISO/DIS 27105:2014(F)
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
©
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE. ISO 2014

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ISO/DIS 27105:2014(F)

Notice de droit d’auteur
Ce document de l’ISO est un projet de Norme internationale qui est protégé par les droits d’auteur
de l’ISO. Sauf autorisé par les lois en matière de droits d’auteur du pays utilisateur, aucune partie de
ce projet ISO ne peut être reproduite, enregistrée dans un système d’extraction ou transmise sous
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Web www.iso.org
Toute reproduction est soumise au paiement de droits ou à un contrat de licence.
Les contrevenants pourront être poursuivis.
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ISO/DIS 27105
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Avant-propos . v
1 Domaine d'application . 1
2 Termes et définitions . 1
3 Principe. 1
4 Réactifs et substances de référence . 1
5 Appareillage . 2
6 Échantillonnage . 3
7 Mode opératoire . 3
8 Calcul et expression des résultats . 5
9 Fidélité . 6
10 Rapport d'essai . 6
Annexe A (informative) Vérification par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de
masse (CL-SM) . 7
Annexe B (informative) Essai interlaboratoires . 9
Bibliographie . 10

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ISO/DIS 27105
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 27105 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait
et produits laitiers.
Cette édition annule et remplace l'ISO/TS 27105 | FIL/RM 216:2009, qui a fait l'objet d'une révision technique.
L'ISO 27105 | FIL 216 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération Internationale du Lait (FIL). Elle est publiée conjointement par
l’ISO et la FIL.
iv © ISO 2014 – Tous droits réservés

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ISO/DIS 27105
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente les
intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont organisés
en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de groupes d’intérêt
nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des acteurs de l'industrie de
transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des universitaires et des
représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d'analyse et d'échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les références
aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l'élaboration du document
sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par l’ISO (voir
www.iso.org/brevets).
La présente Norme internationale a été élaborée par le Comité permanent de la FIL chargé des Méthodes
d'analyse des additifs et contaminants et par le comité technique ISO/TC 34 Produits alimentaires, sous-
comité SC 5 Lait et produits laitiers (ISO/TC 34/SC 5).
L'ensemble des travaux a été confié au groupe de projet mixte ISO/FIL, Détermination de la teneur en
lysozyme de blanc d'œuf par chromatographie liquide haute performance du Comité permanent chargé des
Méthodes d'analyse des additifs et contaminants, sous la conduite de leurs chefs de projet, T. Berger (CH) et
Prof. L. Pellegrino (IT).
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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 27105

Lait et fromage — Détermination de la teneur en lysozyme de
blanc d’œuf par chromatographie liquide haute performance
1 Domaine d'application
La présente Norme spécifie une méthode pour la détermination quantitative de la teneur en lysozyme de
blanc d'œuf dans le lait et les fromages.
La méthode est adaptée au mesurage de faibles niveaux de lysozyme de blanc d'œuf, avec une limite de
quantification de 10 mg par kilogramme.
NOTE Le lysozyme (EC 3.2.1.17, muramidase) est une enzyme très répandue dans la nature ; elle est présente par
exemple dans le blanc d’œuf (environ 3 % à 4 %), la salive et les larmes. Le lysozyme a un effet conservateur en raison
de l’activité lytique sur la paroi de la cellule de certaines bactéries. Le lysozyme de blanc d'œuf est utilisé dans la
fabrication du fromage afin d’empêcher le gonflement tardif des fromages à pâte demi-dure ou dure.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
teneur en lysozyme de blanc d'œuf
fraction massique de substance, déterminée selon le mode opératoire spécifié dans la présente Norme
NOTE La teneur en lysozyme est exprimée en milligrammes par kilogramme.
3 Principe
Précipitation isoélectrique de la caséine et des protéines de lactosérum dénaturé provenant du lait et du
fromage à pH 4,3 (fromage) ou à pH 2,2 (lait), puis détermination du lysozyme de blanc d'œuf soluble dans
l’acide par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse et détection par
fluorescence. Le pic du lysozyme peut être vérifié par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de
masse (CL-SM) (voir Annexe A).
4 Réactifs et substances de référence
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, et uniquement de
l’eau distillée ou de pureté équivalente.
4.1 Réactifs
4.1.1 Solution de chlorure de sodium, c(NaCl) = 1 mol/l.
Dissoudre 58,44 g de chlorure de sodium dans 1 l d’eau.
4.1.2 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l.
Dissoudre 4,0 ml d’acide chlorhydrique de fraction massique 37 % dans une fiole jaugée à un trait de 50 ml.
Diluer avec de l’eau et compléter à 50 ml.
© ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 27105
4.1.3 Hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l.
Dissoudre 2,6 ml d’hydroxyde de sodium de fraction massique 50 % dans une fiole jaugée à un trait de 50 ml.
Diluer avec de l’eau et compléter à 50 ml.
4.1.4 Acide trifluoroacétique (CF COOH), qualité analytique.
3
4.1.5 Acétonitrile, (CH CN), qualité CLHP.
3
4.1.6 Eau, qualité CLHP.
4.2 Lysozyme
1)
Lysozyme de blanc d'œuf pur, par exemple Lysozyme, SIGMA L-6876 . Il est à noter qu'il est difficile
d'obtenir un lysozyme suffisamment pur et caractérisé. Il est nécessaire de contrôler la variabilité d'un lot à
l'autre.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier :
5.1 pH-mètre, ayant une précision de 0,1 unité
1
)
5.2 Filtre cylindrique, par exemple Schleicher & Schuell 595½, Ø 15 cm .
1
)
5.3 Membrane filtrante, de taille de pore 0,22 m, par exemple Millipore Millex-GV PVDF 0,22 m . Les
filtres d'autres fabricants doivent être soumis à des essais d'applicabilité.
5.4 Balance, capable de peser à 100 mg près et d'une résolution de 10 mg.
5.5 Balance analytique, capable de peser à 0,1 mg près et d'une résolution de 0,01 mg.
5.6 Agitateur magnétique
1)
5.7 Homogénéisateur, Ultra turrax® ou un autre appareil donnant des résultats équivalents, et capable
de tourner à une fréquence de rotation de 3000 tr/min à 3500 tr/min.
5.8 Matériel de CLHP
5.8.1 Système de pompage permettant de réaliser une élution par gradient, capable de fonctionner à
une vitesse de 1,0 ml/min.
5.8.2 Injecteur manuel ou automatique, capable d’injecter des quantités de 50 μl.
5.8.3 Four à colonne, capable de maintenir une température de 45 °C ± 2 °C.
1)
5.8.4 Colonne, phase inverse, par exemple PLRP-S 300 Å , 5 µm, 250 mm x 4,6 mm
5.8.5 Détecteur de fluorescence, capable de fonctionner à une longueur d’onde d’excitation de 280 nm et
une longueur d’onde d’émission de 340 nm.

1 )
SIGMA L-6876, Schleicher&Schuell 595½, Millipore Millex-GV PVDF 0,22 m, Ultra Turrax®, PLRP-S 300 Å
(Polymer Laboratories, Royaume Uni) sont des produits disponibles sur le marché. Cette information est donnée par souci
de commodité à l’intention des utilisateurs de la présente Norme et ne saurait constituer un engagement de l’ISO ou de la

FIL à l’égard de ces produits.
© ISO 2014 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 27105
6 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
[1]
méthode d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 707 | FIL 50 .
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif, n’ayant été ni endommagé, ni modifié
lors du transport ou du stockage.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation de la solution étalon de lysozyme
7.1.1 Solution étalon mère de lysozyme
Peser, à 0,01 mg près, 10 mg de lysozyme (4.2) dans une fiole jaugée à un trait de 10 ml et attendre la
dissolution complète. Diluer avec la
...