ISO 5543:2004
(Main)Caseins and caseinates — Determination of fat content — Gravimetric method (Reference method)
Caseins and caseinates — Determination of fat content — Gravimetric method (Reference method)
ISO 5543|IDF 127:2004 specifies the reference method for the determination of the fat content of all types of caseins and caseinates.
Caséines et caséinates — Détermination de la teneur en matière grasse — Méthode gravimétrique (Méthode de référence)
L'ISO 5543|FIL 127:2004 spécifie la méthode de référence pour la détermination de la teneur en matière grasse de tous les types de caséines et de caséinates.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 5543
IDF
127
Second edition
2004-12-01
Caseins and caseinates — Determination
of fat content — Gravimetric method
(Reference method)
Caséines et caséinates — Détermination de la teneur en matière
grasse — Méthode gravimétrique (Méthode de référence)
Reference numbers
ISO 5543:2004(E)
IDF 127:2004(E)
©
ISO and IDF 2004
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ISO 5543:2004(E)
IDF 127:2004(E)
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IDF 127:2004(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . vi
1 Scope. 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 1
6 Apparatus and materials . 2
7 Sampling . 3
8 Procedure. 3
8.1 Preparation of test sample. 4
8.2 Test portion . 4
8.3 Blank test . 4
8.4 Preparation of fat-collecting vessel . 4
8.5 Determination . 4
9 Calculation and expression of results . 7
10 Precision . 8
10.1 Interlaboratory test . 8
10.2 Repeatability. 8
10.3 Reproducibility . 8
11 Notes on procedure . 8
11.1 Blank test to check the reagents. 8
11.2 Blank test carried out simultaneously with the determination . 9
11.3 Test for peroxides in diethyl ether . 9
11.4 Diethyl ether containing antioxidants. 9
12 Test report. 10
Annex A (informative) Alternative procedure using fat-extraction tubes with siphon or wash-
bottle fittings . 11
Bibliography . 14
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IDF 127:2004(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 5543IDF 127 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with AOAC International.
It is being published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
This edition of ISO 5543IDF 127 cancels and replaces ISO 5543:1986, of which it constitutes a minor
revision. Only editorial changes have been made.
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ISO 5543:2004(E)
IDF 127:2004(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National
Committee in every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF
Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO and AOAC International in
the development of standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the
National Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of
the National Committees casting a vote.
ISO 5543IDF 127 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with AOAC International.
It is being published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
All work was carried out by the Joint ISO/IDF/AOAC Group of Experts, Fat determination (E31), under the
aegis of its project leader, Mr J. Eisses (NL).
This edition of ISO 5543IDF 127 cancels and replaces IDF 127A:1988. Only editorial changes have been
made.
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ISO 5543:2004(E)
IDF 127:2004(E)
Introduction
This International Standard has been prepared within the framework of producing a series of methods, which
are harmonized to the greatest possible extent, for the gravimetric determination of the fat content of milk, milk
products and milk-based food.
A method based on the principle of Schmid-Bondzynski-Ratzlaff (SBR), involving digestion with hydrochloric
acid, has been chosen for the following reasons:
a) many caseins do not readily dissolve in ammonia, either because they contain or consist of hard lumps,
or because they are not soluble, or are only poorly soluble (e.g. rennet casein), and therefore cannot be
examined according to the method based on the Röse-Gottlieb (RG) principle as used for milk and most
milk products;
b) all caseins and caseinates, due to their low lactose content [less than 5 % (mass fraction) of dry matter],
can be examined according to the SBR principle; this has the advantage over the Weibull method in that
the method can be carried out using the same apparatus as that specified for the RG method and, at the
same time, is less time consuming;
c) methods based on the SBR principle have already found wide application in many countries as official or
standardized methods for the examination of all caseins and caseinates.
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ISO 5543:2004(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 127:2004(E)
Caseins and caseinates — Determination of fat content —
Gravimetric method (Reference method)
1 Scope
This International Standard specifies the reference method for the determination of the fat content of all types
of caseins and caseinates.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 565, Test sieves — Metal wire cloth, perforated metal plate and electroformed sheet — Nominal sizes of
openings
ISO 3889, Milk and milk products — Determination of fat content — Mojonnier-type fat extraction flasks
ISO 5550, Caseins and caseinates — Determination of water content (Reference method)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
fat content of caseins and caseinates
all the substances determined by the method specified in this International Standard
NOTE It is expressed as a mass fraction in percent.
4 Principle
A test portion is digested with hydrochloric acid, then ethanol is added. The acid-ethanolic solution is
subsequently extracted with diethyl ether and light petroleum, then the solvents are removed by distillation or
evaporation.The mass of the substances extracted, which are soluble in light petroleum, is determined. (This
is usually known as the Schmid-Bondzynski-Ratzlaff principle.)
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized
water or water of equivalent purity.
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ISO 5543:2004(E)
IDF 127:2004(E)
To test the quality of the reagents, carry out a blank test as specified in 8.3. Use an empty fat-collecting vessel,
prepared as specified in 8.4, for mass control purposes (see 11.1). The reagents shall leave no residue
greater than 0,5 mg.
If the residue of the complete reagent blank test is greater than 0,5 mg, determine the residue of the solvents
separately by distilling 100 ml of the diethyl ether and light petroleum respectively. Use an empty control
vessel to obtain the real mass of residue, which shall not exceed 0,5 mg.
Replace unsatisfactory reagents or solvents, or redistil solvents.
5.1 Dilute hydrochloric acid solution, ρ (HCl) ≈ 1,125 g/ml. (See also Note in 8.5.1.)
20
Dilute 675 ml of hydrochloric acid [ρ (HCl) = 1,18 g/ml] to 1 000 ml with water.
20
5.2 Ethanol (C H OH) or methanol (CH OH), at least 94 % (volume fraction).
2 5 3
Ethanol denatured otherwise than by methanol may be used provided that the denaturant does not affect the
result of the determination.
5.3 Diethyl ether (C H OC H ), free from peroxides (see 11.3) and containing none or not more than
2 5 2 5
2 mg/kg of antioxidants, and complying with the requirements for the blank test (see the introductory
paragraphs to this clause, and also 11.1 and 11.4).
5.4 Light petroleum, having any boiling range between 30 °C and 60 °C.
5.5 Mixed solvent, prepared shortly before use by mixing equal volumes of the diethyl ether (5.3) and the
light petroleum (5.4).
5.6 Congo red solution.
Dissolve 1 g of Congo red in water and dilute to 100 ml.
NOTE The use of this solution, which allows the interface between the solvent and aqueous layers to be seen more
clearly, is optional (see 8.5.4) and only useful with products giving colourless or only slightly coloured digests. Other
aqueous colour solutions may be used provided that they do not affect the result of the determination.
6 Apparatus and materials
WARNING — Since the determination involves the use of volatile flammable solvents, electrical
apparatus employed may be required to comply with legislation relating to the hazards in using such
solvents.
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
6.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 1 mg, with a readability of 0,1 mg.
6.2 Centrifuge, in which the stoppered fat-extraction flasks or tubes (6.6) can be spun at a rotational
−1 −1
frequency of 500 min to 600 min to produce a gravitational field of 80g and 90g at the outer end of the
flasks or tubes.
NOTE The use of the centrifuge is optional but recommended (see 8.5.7).
6.3 Distillation or evaporation apparatus, to enable the solvents and ethanol to be distilled from the fat-
collecting flasks or to be evaporated from beakers and dishes (see 8.5.10 and 8.5.12) at a temperature not
exceeding 100 °C.
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IDF 127:2004(E)
6.4 Drying oven, electrically heated, with ventilation port(s) fully open, capable of being maintained at
102 °C ± 2 °C throughout the working space, and fitted with a suitable thermometer; or vacuum drying oven,
capable of being maintained at 70 °C to 75 °C, at a pressure less than 600 mbar (50 mmHg).
6.5 Boiling water bath or hotplate (see 8.5.2).
6.6 Mojonnier-type fat-extraction flasks, as specified in ISO 3889 (but see the Note in 8.5.2).
NOTE It is also possible to use fat-extraction tubes (or flasks) with siphon or wash-bottle fittings, but the
procedure is then different and is specified in Annex A. The long inner limb of the fitting may have a hooked end if desired.
The flasks (or tubes, see Note) shall be provided with good quality bark corks or stoppers of another material
[e.g. silicone rubber or polytetrafluoroethylene (PTFE)] unaffected by the reagents used. Bark corks shall be
washed with the diethyl ether (5.3), kept in water at 60 °C or more for at least 15 min, and shall then be
allowed to cool in the water so that they are saturated when used.
6.7 Rack, to hold the fat-extraction flasks (or tubes) (see 6.6).
6.8 Wash bottle, suitable for use with the mixed solvent (5.5). A plastic wash bottle shall not be used.
6.9 Fat-collecting vessels, for example boiling flasks (flat-bottomed) of capacity 125 ml to 250 ml, conical
beakers of capacity 250 ml or metal dishes.
If metal dishes are used, they shall preferably be of stainless steel, and shall be flat-bottomed, preferably with
a spout, and shall have a diameter of 80 mm to 100 mm and a height of approximately 50 mm.
6.10 Boiling aids, fat-free, of non-porous porcelain or silicon carbide, or glass beads (optional in the case of
metal dishes).
6.11 Measuring cylinders, of capacities 5 ml and 25 ml.
6.12 Pipettes, graduated, of capacity 10 ml.
6.13 Tongs, made of metal, suitable for holding flasks, beakers or dishes.
6.14 Grinding device, for grinding the laboratory sample if necessary. This device should be such that no
undue heat will be developed and no loss of moisture occurs. A hammer mill shall not be used.
6.15 Test sieve, of woven wire cloth, diameter 200 mm, nominal size of opening 500 µm, with receiver,
complying with the requirements of ISO 565.
6.16 Container with lid, airtight, of capacity such that the test sample can be mixed by shaking.
7 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage. The laboratory sample shall be stored in a securely closed airtight
container.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
[1]
is given in ISO 707 .
8 Procedure
NOTE The alternative procedure using fat-extraction tubes with siphon or wash-bottle fittings (see Note in 6.6) is
described in the Annex A.
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ISO 5543:2004(E)
IDF 127:2004(E)
8.1 Preparation of test sample
8.1.1 Thoroughly mix the laboratory sample (Clause 7), if necessary after transferring all of it to an airtight
container of suitable capacity, by repeatedly shaking and inverting the container.
8.1.2 Transfer 50 g of the laboratory sample to the test sieve (6.15). If it does not pass completely through
the sieve, use the grinding device to achieve this condition. Immediately transfer all the sieved sample to the
container (6.16) and mix thoroughly in the closed container. During these operations, take precautions to
avoid any change in the water content of the product.
8.1.3 After the test sample has been prepared, proceed with the determination (8.5) as soon as possible.
If the 50 g portion directly passes through the sieve, or nearly completely passes, use the prepared test
sample (see 8.1.1) for the determination.
8.2 Test portion
Mix the test sample (8.1) by gently stirring, or by rotating and inverting the container. Immediately weigh, to
the nearest 1 mg, directly or by difference, into a fat-extraction flask (6.6) or into a 100 ml beaker or flask, 2 g
to 3 g of the test sample.
The test portion shall be delivered as completely as possible into the lower (small) bulb of the extraction flask.
8.3 Blank test
Carry out a blank test simultaneously with the determination, using the same procedure and same reagents,
but omitting the test portion as in 8.5.1 (see 11.2).
8.4 Preparation of fat-collecting vessel
Dry a vessel (6.9) containing a few boiling aids (6.10) in the oven (6.4) for 1 h.
NOTE Boiling aids are desirable to promote gentle boiling during the subsequent removal of solvent, especially in the
case of glass vessels; their use is optional in the case of metal dishes.
Allow the vessel to cool (protected from dust) to the temperature of the weighing room (glass vessel for at
least 1 h, metal dish for at least 0,5 h). The vessel should not be placed in a desiccator to avoid insufficient
cooling or unduly long cooling times.
Using tongs (6.13) (to avoid, in particular, temperature variations), place the vessel on the balance and weigh
to the nearest 1 mg, recording the mass to four decimal places.
8.5 Determination
8.5.1 Add 7,5 ml to 10 ml, depending on the shape of the extraction apparatus, of the dilute hydrochloric
acid (5.1) so as to wash the test portion into the small bulb of the extraction flask or onto the bottom of the
beaker or flask, and mix.
NOTE Some laboratories prefer to use 7,5 ml to 8,5 ml of 1,15 g/ml hydrochloric acid instead of 7,5 ml to 10 ml of
dilute hydrochloric acid (5.1).
8.5.2 Heat by gently moving the vessel in a boiling water bath, or over a flame or on a hotplate, until all the
particles are entirely dissolved.
NOTE Mojonnier-type flasks (6.6) with a spheri
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 5543
FIL
127
Deuxième édition
2004-12-01
Caséines et caséinates — Détermination
de la teneur en matière grasse —
Méthode gravimétrique (Méthode de
référence)
Caseins and caseinates — Determination of fat content — Gravimetric
method (Reference method)
Numéros de référence
ISO 5543:2004(F)
FIL 127:2004(F)
©
ISO et FIL 2004
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ISO 5543:2004(F)
FIL 127:2004(F)
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Publié en Suisse
ii © ISO et FIL 2004 – Tous droits réservés
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ISO 5543:2004(F)
FIL 127:2004(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . vi
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 1
6 Appareillage. 2
7 Échantillonnage . 3
8 Mode opératoire . 4
8.1 Préparation de l'échantillon pour essai. 4
8.2 Prise d'essai . 4
8.3 Essai à blanc . 4
8.4 Préparation du récipient de récupération de la matière grasse. 4
8.5 Détermination . 4
9 Calculs et expression des résultats. 8
10 Fidélité. 8
10.1 Essai interlaboratoires . 8
10.2 Répétabilité. 8
10.3 Reproductibilité. 9
11 Notes sur le mode opératoire . 9
11.1 Essai à blanc pour contrôler les réactifs. 9
11.2 Essai à blanc effectué en même temps que la détermination. 9
11.3 Contrôle pour vérifier la présence de peroxydes dans l'éther diéthylique. 9
11.4 Éther diéthylique contenant des antioxydants . 10
12 Procès-verbal d'essai . 10
Annexe A (informative) Autre mode opératoire utilisant les tubes d'extraction de la matière grasse
munis d'un siphon ou d'un système d'aspiration par le vide. 11
Bibliographie . 14
© ISO et FIL 2004 – Tous droits réservés iii
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ISO 5543:2004(F)
FIL 127:2004(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 5543FIL 127 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en collaboration avec l'AOAC
International. Elle est publiée conjointement par l'ISO et la FIL, et séparément par l'AOAC International.
Cette édition de l'ISO 5543FIL 127 annule et remplace l'ISO 5543:1986, dont elle constitue une révision
mineure. Seuls des changements éditoriaux ont été faits.
iv © ISO et FIL 2004 – Tous droits réservés
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ISO 5543:2004(F)
FIL 127:2004(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité
National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités
permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l'ISO et avec
l'AOAC International pour l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et d'échantillonnage pour le lait et
les produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d'Action et les Comités permanents sont
soumis aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux votants.
L'ISO 5543FIL 127 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en collaboration avec l'AOAC
International. Elle est publiée conjointement par l'ISO et la FIL, et séparément par l'AOAC International.
L'ensemble des travaux a été confié à l'Équipe d'Action mixte ISO/FIL/AOAC du Comité permanent chargé de
la Détermination des matières grasses (E31), sous la conduite de son chef de projet, Monsieur J. Eisses (NL).
Cette édition de l'ISO 5543FIL 127 annule et remplace la FIL 127A:1988. Seuls des changements éditoriaux
ont été faits.
© ISO et FIL 2004 – Tous droits réservés v
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ISO 5543:2004(F)
FIL 127:2004(F)
Introduction
La présente Norme internationale a été établie en vue de préparer une série de méthodes, harmonisées le
mieux possible, pour la détermination de la matière grasse du lait, des produits laitiers et des aliments à base
de lait.
Une méthode fondée sur le principe de Schmid-Bondzynski-Ratzlaff (SBR), comprenant l'attaque par de
l'acide chlorhydrique, a été retenue pour les raisons suivantes:
a) de nombreuses caséines ne se dissolvent pas dans l'hydroxyde d'ammonium parce qu'elles contiennent
des grumeaux ou qu’elles en sont composées, ou parce qu’elles sont peu ou pas solubles en tant que
telles (par exemple, caséine-présure). Elles ne peuvent donc pas être examinées selon la méthode Röse-
Gottlieb (RG) utilisée pour le lait et la plupart des produits laitiers;
b) étant donné leur faible teneur en lactose [moins de 5 % (fraction massique) de matière sèche], toutes les
caséines et les caséinates peuvent être examinés selon la méthode SBR. Celle-ci a l'avantage, par
rapport à la méthode de Weibull, d'utiliser le même appareillage que la méthode RG et demande moins
de temps;
c) les méthodes fondées sur le principe SBR sont largement appliquées dans beaucoup de pays en tant
que méthodes officielles, ou sont normalisées pour l'examen de l'ensemble des caséines et des
caséinates.
vi © ISO et FIL 2004 – Tous droits réservés
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ISO 5543:2004(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 127:2004(F)
Caséines et caséinates — Détermination de la teneur en matière
grasse — Méthode gravimétrique (Méthode de référence)
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie la méthode de référence pour la détermination de la teneur en
matière grasse de tous les types de caséines et de caséinates.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 565, Tamis de contrôle — Tissus métalliques, tôles métalliques perforées et feuilles électroformées —
Dimensions nominales des ouvertures
ISO 3889, Lait et produits laitiers — Détermination de la teneur en matière grasse — Fioles d'extraction, type
Mojonnier
ISO 5550, Caséines et caséinates — Détermination de la teneur en eau (Méthode de référence)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
teneur en matière grasse des caséines et des caséinates
toutes les substances déterminées selon la méthode décrite dans la présente Norme internationale
NOTE Elle est exprimée en fraction massique.
4 Principe
Minéralisation d'une prise d'essai avec de l'acide chlorhydrique puis, après addition d'éthanol, extraction d'une
solution ammoniaco-éthanolique au moyen d'éther diéthylique et d'éther de pétrole, élimination des solvants
par distillation ou évaporation, et détermination de la masse des substances extraites qui sont solubles dans
l'éther de pétrole. (Méthode habituellement dite de Schmid-Bondzynski-Ratzlaff.)
5 Réactifs
Sauf indication différente, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distillée
ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
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Pour vérifier la qualité des réactifs, effectuer un essai à blanc comme mentionné en 8.3. Pour les contrôles de
masse (voir 11.1), utiliser un récipient vide de récupération de la matière grasse, préparé comme mentionné
en 8.4. Les réactifs ne doivent pas laisser de résidus supérieurs à 0,5 mg lorsque la détermination est
effectuée selon la méthode décrite.
Si les résidus des réactifs de l'essai à blanc complet sont supérieurs à 0,5 mg, déterminer les résidus des
solvants séparément en distillant respectivement 100 ml d'éther diéthylique et d'éther de pétrole. Utiliser un
récipient de contrôle vide pour obtenir la masse réelle de résidus qui ne doit pas être supérieure à 0,5 mg.
Remplacer les réactifs ou solvants non satisfaisants, ou redistiller les solvants.
5.1 Solution diluée d'acide chlorhydrique, ρ (HCl) ≈ 1,125 g/ml. (Voir également la Note en 8.5.1.)
20
Diluer 675 ml d'acide chlorhydrique concentré [ρ (HCl) = 1,18 g/ml] à 1 000 ml avec de l'eau.
20
5.2 Éthanol (C H OH) ou méthanol (CH OH), à au moins 94 % (fraction volumique).
2 5 3
L'éthanol dénaturé autrement que par le méthanol peut être utilisé pourvu que cela n'affecte pas les résultats
de la détermination.
5.3 Éther diéthylique (C H OC H ), exempt de peroxydes (voir 11.3), ne contenant pas d'antioxydants ou
2 5 2 5
n’en contenant pas plus de 2 mg/kg et conforme aux prescriptions de l'essai à blanc (voir les paragraphes
d'introduction du présent article, ainsi que 11.1 et 11.4).
5.4 Éther de pétrole, ayant un point d'ébullition entre 30 °C et 60 °C.
5.5 Mélange de solvants, préparé peu de temps avant emploi par mélange égal d'éther diéthylique (5.3) et
d'éther de pétrole (5.4).
5.6 Solution de rouge Congo.
Dissoudre dans l'eau 1 g de rouge Congo et diluer à 100 ml.
NOTE L'utilisation de cette solution, qui permet de mieux voir l'interface entre le solvant et la couche aqueuse, est
facultative (voir 8.5.4) et seulement utile pour les produits donnant une attaque non ou faiblement colorée. D'autres
solutions aqueuses de colorants peuvent être utilisées pourvu qu'elles ne modifient pas le résultat de la détermination.
6 Appareillage
AVERTISSEMENT — Les déterminations requérant l'utilisation de solvants volatils inflammables,
l'appareillage électrique utilisé devra satisfaire, le cas échéant, à la législation en matière de risques
liés à l'utilisation de ces solvants.
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Balance analytique, capable de peser à 1 mg près, avec une précision de lecture de 0,1 mg.
6.2 Centrifugeuse, dans laquelle les fioles ou les tubes (6.6) d'extraction peuvent être centrifugés à une
fréquence de rotation de 500 r/min à 600 r/min, afin d'obtenir une accélération de 80g à 90g à l'extrémité
extérieure des fioles ou des tubes.
NOTE L'utilisation d'une centrifugeuse est facultative mais recommandée (voir 8.5.7).
6.3 Appareil de distillation ou d'évaporation, permettant de distiller les solvants et l'éthanol des fioles de
récupération de la matière grasse, ou de les évaporer des béchers et des capsules (voir 8.5.10 et 8.5.12) à
une température n'excédant pas 100 °C.
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6.4 Étuve à dessiccation, à chauffage électrique, munie d'ouïes de ventilation complètement ouvertes,
réglable à une température de 102 °C ± 2 °C uniforme en tous points et munie d'un thermomètre approprié;
ou étuve à pression réduite, réglable à une température de 70 °C à 75 °C sous une pression inférieure à
66 mbar (50 mm Hg).
6.5 Bain d'eau bouillante ou plaque chauffante (voir 8.5.2).
6.6 Fioles d'extraction de la matière grasse, type Mojonnier, telles que décrites dans l'ISO 3889 (voir la
Note en 8.5.2).
NOTE On peut également utiliser des tubes (ou des fioles) d'extraction de la matière grasse munis d'un siphon
ou d'un système d'aspiration par le vide, mais le mode opératoire est alors différent et est décrit dans l'Annexe A. La
longue tubulure à l'intérieur de la fiole peut présenter une extrémité recourbée en crochet, si on le désire.
Les fioles (ou les tubes, voir la Note) doivent être munis de bouchons en liège de bonne qualité ou de
bouchons en une autre matière [par exemple caoutchouc siliconé ou polytétrafluoroéthylène (PTFE)]
inaltérable aux réactifs utilisés. Les bouchons en liège doivent être lavés à l'éther diéthylique (5.3), maintenus
dans l'eau à 60 °C ou plus pendant au moins 15 min et ensuite mis à refroidir dans l'eau de façon qu’ils en
soient imprégnés au moment de l'emploi.
6.7 Support, pour maintenir les fioles (ou les tubes) d'extraction de la matière grasse (voir 6.6).
6.8 Flacon de lavage, pour le mélange de solvants (5.5). Ne pas utiliser de flacon de lavage en plastique.
6.9 Récipients de récupération de la matière grasse, par exemple fioles à ébullition (fioles à fond plat)
de capacité 125 ml à 250 ml, fioles coniques de capacité 250 ml ou capsules métalliques.
Lorsqu'on utilise des capsules métalliques, elles doivent être de préférence en acier inoxydable, à fond plat,
avec un bec, et doivent avoir un diamètre de 80 mm à 100 mm, avec une hauteur d'environ 50 mm.
6.10 Régulateurs d'ébullition, exempts de matière grasse, en porcelaine non poreuse ou en carbure de
silicium ou billes de verre (facultatif dans le cas des capsules métalliques).
6.11 Éprouvettes graduées, de 5 ml et 25 ml de capacité.
6.12 Pipettes graduées, de 10 ml de capacité.
6.13 Pinces métalliques, appropriées pour tenir les fioles, les béchers ou les capsules.
6.14 Appareil de broyage, pour broyer, si nécessaire, l'échantillon pour laboratoire. Il est recommandé que
cet appareil ne développe ni un échauffement excessif, ni ne provoque une perte d'humidité. Ne pas utiliser
un mortier.
6.15 Tamis pour essai, en toile métallique tissée, de 200 mm de diamètre, ouverture nominale de maille
500 µm, avec réservoir, conforme à l'ISO 565.
6.16 Récipient muni d'un couvercle, hermétique à l'air, de capacité telle que l'échantillon pour essai puisse
être mélangé en étant secoué.
7 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié
lors du transport et de l'entreposage. Conserver l'échantillon pour laboratoire dans un récipient fermé
hermétiquement.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
[1]
méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 707 .
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8 Mode opératoire
NOTE Un autre mode opératoire utilisant des tubes d'extraction de la matière grasse munis d’un siphon ou d'un
système d'aspiration par le vide (voir la Note en 6.6) est donné dans l'Annexe A.
8.1 Préparation de l'échantillon pour essai
8.1.1 Mélanger soigneusement l'échantillon (Article 7), si nécessaire après avoir transvasé le tout dans un
récipient hermétique à l'air, de capacité appropriée, par rotations et retournements répétés du récipient.
8.1.2 Transvaser 50 g de l'échantillon pour laboratoire à travers le tamis pour essai (6.15). S'il ne passe pas
complètement à travers le tamis, utiliser l'appareil de broyage pour permettre cette opération. Transvaser
immédiatement tout l'échantillon tamisé dans le récipient (6.16) et mélanger soigneusement dans le récipient
fermé. Pendant cette opération, prendre des précautions pour éviter tout changement de la teneur en eau du
produit.
8.1.3 Procéder à la détermination (8.5) aussitôt que possible, dès que l'échantillon pour essai est prêt.
Si la portion de 50 g passe directement ou presque complètement à travers le tamis, utiliser l'échantillon pour
essai (voir 8.1.1) pour la détermination.
8.2 Prise d'essai
Mélanger doucement l'échantillon pour essai (8.1) par retournements et rotations du récipient. Peser
immédiatement, à 1 mg près, directement ou par différence, 2 g à 3 g de l'échantillon pour essai; dans une
fiole d'extraction de la matière grasse (6.6) ou dans un bécher ou une fiole de 100 ml.
La prise d'essai doit être placée aussi complètement que possible dans le bulbe inférieur (étroit) de la fiole
d'extraction.
8.3 Essai à blanc
Effectuer un essai à blanc simultanément à la détermination, en utilisant le même mode opératoire et les
mêmes réactifs, mais en supprimant la prise d'essai comme en 8.5.1 (voir 11.2).
8.4 Préparation du récipient de récupération de la matière grasse
Sécher le récipient (6.9) avec quelques régulateurs d'ébullition (6.10) pendant 1 h dans l'étuve (6.4).
NOTE Les régulateurs d'ébullition sont nécessaires pour permettre une ébullition modérée au cours de l'élimination
ultérieure du solvant, spécialement dans le cas des récipients en verre; leur emploi est facultatif dans le cas des capsules
métalliques.
Laisser refroidir le récipient (à l'abri de la poussière) à la température de la salle des balances (récipients en
verre pendant au moins 1 h, capsules métalliques pendant au moins 0,5 h). Ne pas placer le récipient dans un
dessiccateur, afin d'éviter un refroidissement insuffisant ou des temps de refroidissement excessifs.
À l'aide des pinces (6.13), placer le récipient sur la balance (pour éviter, en particulier, des variations de
température), peser à 1 mg près et enregistrer la masse avec quatre décimales.
8.5 Détermination
8.5.1 Ajouter 7,5 ml à 10 ml de solution diluée d'acide chlorhydrique (5.1), selon la forme de l'appareil
d'extraction, de façon à laver la prise d'essai dans le bulbe étroit de la fiole d'extraction ou dans le fond du
bécher ou de la fiole, et mélanger.
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NOTE Certains laboratoires préfèrent utiliser de 7,5 ml à 8,5 ml d'acide chlorhydrique, ayant une densité de 1,15 g/ml,
à la place de 7,5 ml à 10 ml d'acide chlorhydrique dilué (5.1).
8.5.2 Chauffer le récipient en le remuant doucement dans un bain d'eau à l'ébullition ou au-dessus d'une
flamme ou sur une plaque chauffante, jusqu'à ce que toutes les particules soient entièrement dissoutes.
NOTE Les fioles type Mojonnier (6.6) munies d'un bulbe inférieur sphérique (formes B et C dans l'ISO 3889) sont
particulièrement appropriées pour le chauffage direct à la flamme ou sur une plaque chauffante.
8.5.3 Laisser le récipient debout pendant 20 min à 60 min dans le bain d'eau bouillante en secouant de
temps en temps pendant les 15 premières minutes, ou le maintenir au-dessus d'une flamme modérée ou sur
la plaque chauffante pendant 10 min. Refroidir, par exemple sous l'eau courante.
Si, à une étape ultérieure du mode opératoire, des difficultés sont rencontrées à cause de la viscosité de la
phase aqueuse, répéter la détermination avec une prise d'essai plus petite et un temps de chauffage ou
d'ébullition plus long.
8.5.4 Si la minéralisation a été effectuée dans l'appareil d'extraction, ajouter 10 ml d'éthanol (5.2). Mélanger
doucement, mais vigoureusement, le contenu de la fiole en lui imprimant un mouvement de va-et-vient entre
les deux bulbes; éviter d'amener le liquide trop près du col de la fiole. On peut ajouter deux gouttes de la
solution de rouge Congo (5.6) si on le désire.
Si la minéralisation a été effectuée dans un récipient autre que la fiole d'extraction, verser le contenu de la
fiole dans la fiole d'extraction. Rincer successivement avec 10 ml d'éthanol (5.2), 25 ml d'éther diéthylique
(5.3) et 25 ml d'éther de pétrole (5.4), en versant à chaque fois le solvant dans la fiole d'extraction. Mélanger
après l'addition de l'éthanol comme décrit ci-dessus et secouer la fiole d'extraction après l'addition d'éther
diéthylique et l'éther de pétrole, comme décrit respectivement en 8.5.5 et 8.5.6.
8.5.5 Ajouter 25 ml d'éther diéthylique (5.3), boucher la fiole avec un bouchon en liège (voir 6.6) saturé
d'eau, ou un autre dispositif de fermeture imprégné d'eau, et agiter la fiole vigoureusement mais sans excès
(de façon à éviter la formation d'émulsions persistantes), pendant 1 min en position horizontale, le bulbe étroit
en haut, en laissant de temps en temps le liquide du bulbe large passer dans le bulbe étroit. Si nécessaire,
refroidir la fiole sous l'eau courante, puis retirer avec précaution le bouchon de liège ou le dispositif de
fermeture et le rincer, ainsi que le col de la fiole, avec une petite quantité de mélange de solvants (5.5), en se
servant du flacon de lavage (6.8), de façon que les liquides de rinçage coulent dans la fiole ou le récipient
préparé pour la récupération de la matière grasse (voir 8.4).
8.5.6 Ajouter 25 ml d'éther de pétrole (5.4), boucher la fiole avec le bouchon en liège humidifié à nouveau,
ou le dispositif de fermeture réhumidifié (par trempage dans l'eau), et agiter doucement la fiole pendant 30 s
comme décrit en 8.5.5.
8.5.7 Centrifuger la fiole bouchée pendant 1 min à 5 min à une fréquence de rotation de 500 r/min à
600 r/min (voir 6.2). Si l'on ne dispose pas de centrifugeuse, laisser la fiole bouchée reposer sur le support
(6.7) pendant au moins 30 min, jusqu'à ce que la couche surnageante soit claire et nettement séparée de la
couche aqueuse. Si nécessaire, refroidir la fiole sous l'eau courante.
8.5.8 Enlever avec précaution le bouchon en liège ou le dispositif de fermeture et le rincer ainsi que
l'intérieur du col de la fiole avec un peu de mélange de solvants, de sorte que les liquides de rinçage coulent
dans la fiole ou le récipient de récupération de la matière grasse.
Si l'interface se situe au-dessous du fond du col de la fiole, le faire monter à ce niveau en ajoutant doucement
de l'eau par le côté de la fiole (voir Figure 1), afin de faciliter la décantation du solvant.
NOTE Dans les Figures 1 et 2, l'un des trois types de fioles spécifiées dans l'ISO 3889 a été choisi, mais aucune
préférence n'est donnée à ce type particulier (voir cependant la Note en 8.5.2).
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Légende
1 solvant
2 interface
3 couche aqueuse
a
À la deuxième et à la troisième extraction.
b
À la première extraction.
Figure 1 — Avant décantation (8.5.8, 8.5.11)
Légende
1 interface
2 couche aqueuse
a
À la deuxième et à la troisième extraction.
b
À la première extraction.
Figure 2 — Après décantation (8.5.9, 8.5.11)
8.5.9 En tenant la fiole d'extraction par le bulbe étroit, décanter avec soin le plus possible de la couche
surnageante dans le récipient préparé, destiné à la récupération de la matière grasse (voir 8.4), contenant
quelques régulateurs d'ébullition (6.10) dans le cas des fioles (facultatif avec les capsules métalliques), en
évitant de décanter une partie quelconque de la couche aqueuse (voir Figure 2).
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8.5.10 Rincer l'extérieur du col de la fiole d'extraction avec un peu de mélange de solvants, en recueillant les
liquides de rinçage dans le récipient de récupération de la matière grasse et en prenant soin que le mélange
de solvants ne soit pas projeté sur l'extérieur de la fiole d'extraction.
Si on le désire, les solvants ou une partie des solvants peuvent être éliminés du récipient par distillation ou
évaporation comme décrit en 8.5.12.
8.5.11 Effectuer une seconde extraction en recommençant les opérations décrites de 8.5.5 à 8.5.9 inclus,
mais en utilisant seulement 15 ml d'éther diéthylique (5.3) et 15 ml d'éther de pétrole (5.4); utiliser l'éther
diéthylique pour rincer l'intérieur du col de la fiole d'extraction.
Si nécessaire, faire monter l'interface lé
...
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