Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of Cronobacter spp.

ISO 22964:2017 specifies a horizontal method for the detection of Cronobacter spp. Subject to the limitations discussed in the introduction, this document is applicable to - food products and ingredients intended for human consumption and the feeding of animals, and - environmental samples in the area of food production and food handling.

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp.

ISO 22964:2017 spécifie une méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp. Sous réserve des restrictions exposées dans l'introduction, le présent document est applicable aux: - produits et ingrédients alimentaires destinés à la consommation humaine et à l'alimentation animale; - échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la manutention des aliments.

General Information

Status
Published
Publication Date
03-Apr-2017
Technical Committee
Current Stage
9093 - International Standard confirmed
Completion Date
26-Sep-2022
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ISO 22964:2017 - Microbiology of the food chain -- Horizontal method for the detection of Cronobacter spp.
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REDLINE ISO 22964:2017 - Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of Cronobacter spp. Released:4/4/2017
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ISO 22964:2017 - Microbiologie de la chaîne alimentaire -- Méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp.
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Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22964
First edition
2017-04
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection
of Cronobacter spp.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche de Cronobacter spp.
Reference number
ISO 22964:2017(E)
©
ISO 2017

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ISO 22964:2017(E)

COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2017, Published in Switzerland
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
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Fax +41 22 749 09 47
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www.iso.org
ii © ISO 2017 – All rights reserved

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ISO 22964:2017(E)

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Abbreviated terms . 2
5 Principle . 2
5.1 Non-selective pre-enrichment in BPW . 2
5.2 Enrichment in a selective medium (CSB) . 2
5.3 Plating out and identification on chromogenic agar (CCI agar) . 2
5.4 Confirmation . 2
6 Culture media and reagents . 2
7 Equipment and consumables . 2
8 Sampling . 3
9 Preparation of test sample . 3
10 Procedure (as shown in Annex A) . 3
10.1 Test portion . 3
10.2 Pre-enrichment . 4
10.3 Enrichment . 4
10.4 Isolation of presumptive Cronobacter spp. 4
10.5 Confirmation . 4
10.5.1 General. 4
10.5.2 Purification of colonies . . 5
10.5.3 Biochemical confirmation . 5
10.6 Interpretation of biochemical results. 6
11 Expression of results . 6
12 Performance characteristics of the method . 7
12.1 Interlaboratory study . 7
12.2 Sensitivity . 7
12.3 Specificity . 7
12.4 LOD .
50 7
13 Test report . 7
Annex A (normative) Diagram of the test procedure . 8
Annex B (normative) Composition, preparation and performance testing of culture media
and reagents . 9
Annex C (informative) Distinction of Cronobacter spp. from other genera .17
Annex D (informative) Method validation studies and performance characteristics .19
Bibliography .22
© ISO 2017 – All rights reserved iii

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ISO 22964:2017(E)

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/275, Food Analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the
agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This first edition cancels and replaces ISO/TS 22964:2006, which has been technically revised with the
following changes:
— the scope has been extended to Cronobacter spp. detection in food products for humans and feeding
animals and environmental samples and the title changed accordingly;
— the enrichment broth, modified lauryl sulfate tryptose broth (mLST), has been replaced by
Cronobacter selective broth (CSB);
— the isolation agar, Enterobacter sakazakii isolation agar (ESIA) has been replaced by chromogenic
Cronobacter isolation (CCI) agar;
— several confirmation tests have been replaced by other tests according to Table 1 of this document.
iv © ISO 2017 – All rights reserved

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ISO 22964:2017(E)

Introduction
This document describes a horizontal method for the detection of Cronobacter spp. in food, in animal
feed and in environmental samples. The main changes, listed in the foreword, introduced in this
[2]
document compared to ISO/TS 22964:2006 are considered as major (see ISO 17468 ).
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate
in every detail for certain products. In this case, different methods, which are specific to these products,
may be used if absolutely necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every attempt should
be made to apply this horizontal method as far as possible.
When this document is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from this
method in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain groups of products,
International Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this
horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply
with this document so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will
be those necessary for well-established technical reasons.
© ISO 2017 – All rights reserved v

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 22964:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection of Cronobacter spp.
1 Scope
This document specifies a horizontal method for the detection of Cronobacter spp.
Subject to the limitations discussed in the introduction, this document is applicable to
— food products and ingredients intended for human consumption and the feeding of animals, and
— environmental samples in the area of food production and food handling.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www.e lectropedia. org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www. iso. org/o bp
3.1
Cronobacter spp.
[10]
microorganisms which form typical colonies on chromogenic Cronobacter isolation (CCI) agar and
which display the biochemical characteristics described, when tests are carried out in accordance with
this document
3.2
detection of Cronobacter spp.
determination of Cronobacter spp. (3.1) in a particular mass or volume of product or surface area when
tests are carried out in accordance with this document
© ISO 2017 – All rights reserved 1

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ISO 22964:2017(E)

4 Abbreviated terms
For the purposes of this document, the following abbreviations apply.
BPW buffered peptone water
CCI chromogenic Cronobacter isolation
CSB Cronobacter selective broth
TSA tryptone soya agar
5 Principle
5.1 Non-selective pre-enrichment in BPW
A test portion is inoculated into BPW, then incubated between 34 °C and 38 °C for 18 h ± 2 h.
NOTE Cronobacter spp. can be present in small numbers accompanied by other Enterobacteriaceae such as
E. cloacae that could interfere with their detection.
5.2 Enrichment in a selective medium (CSB)
The selective enrichment medium is inoculated with the culture obtained in 5.1 and incubated at
41,5 °C ± 1 °C for 24 h ± 2 h.
5.3 Plating out and identification on chromogenic agar (CCI agar)
The chromogenic agar is streaked for isolation with the enrichment culture obtained in 5.2 and
incubated at 41,5 °C ± 1 °C for 24 h ± 2 h.
5.4 Confirmation
Typical colonies are selected from the chromogenic agar, purified on a non-selective agar such as TSA
and biochemically characterized.
6 Culture media and reagents
For current laboratory practice, see ISO 7218 and ISO 11133.
Composition of culture media and reagents and their preparation are described in Annex B.
For performance testing of culture media see ISO 11133 and/or Annex B.
7 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
7.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave).
As specified in ISO 7218.
7.2 Incubators, capable of operating in the range 34 °C to 38 °C, 37 °C ± 1 °C and 41,5 °C ± 1 °C.
2 © ISO 2017 – All rights reserved

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ISO 22964:2017(E)

7.3 Sterile loops, of approximate diameter 3 mm (10 μl volume), and of 1 µl volume, and inoculation
needle or wire.
7.4 pH meter, having an accuracy of calibration of ± 0,1 pH unit at 25 °C.
7.5 Flasks and bottles, with closures, of suitable capacities for use in the preparation of enrichment
broths and agars and their storage.
7.6 Sterile graduated pipettes or automatic pipettes, of nominal capacities 10 ml, 1 ml and 0,1 ml.
7.7 Tubes (plugged or with caps) or culture bottles, of appropriate capacity, with non-toxic metallic
caps with liners or plastic disposable caps (see ISO 7218).
7.8 Petri dishes, of diameter approximately 90 mm.
7.9 Spectrophotometer, capable of measuring absorption of light with a wavelength of 405 nm.
7.10 Pestle and mortar.
7.11 Refrigerators, capable of operating at 5 °C ± 3 °C
7.12 Water baths, capable of operating between 47 °C and 50 °C and at 37 °C ± 1 °C.
7.13 Drying cabinet (or oven ventilated by convection), capable of being maintained between 25 °C
and 50 °C.
8 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. See the specific International Standard
dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing with sampling
of the product concerned, it is recommended that the interested parties come to an agreement on this
subject.
[3] [4]
A recommended sampling method is given in ISO/TS 17728 for food and animal feed, and ISO 18593
for sampling of surfaces.
It is important that the laboratory receives a sample which is truly representative and which has not
been damaged or changed during transport or storage (see ISO 7218).
9 Preparation of test sample
Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with the specific International
Standard dealing with the product concerned: see ISO 6887 (all parts). If there is no specific
International Standard, it is recommended that the parties concerned come to an agreement on this
subject.
10 Procedure (as shown in Annex A)
10.1 Test portion
In general, to prepare the primary dilution, add 10 g or 10 ml of the test sample (Clause 9) to 90 ml of pre-
enrichment medium (B.1) (BPW), to yield a tenfold dilution. Pre-warm the BPW to room temperature
© ISO 2017 – All rights reserved 3

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ISO 22964:2017(E)

before use. For specific products, follow the procedures specified in ISO 6887 (all parts). For dry milk,
follow ISO 6887-5.
This document has been validated for test portions of 10 g. A smaller size of the test portion may be
used without the need of additional validation/verification providing that the same ratio between pre-
enrichment broth and test portion is maintained. A larger test portion than that initially validated may
be used, if a validation/verification study has shown that there are no negative effects on the detection
of Cronobacter spp.
NOTE 1 Validation can be conducted in accordance with the appropriate documents of ISO 16140 (all parts).
Verification for pooling samples can be conducted in accordance with the protocol described in ISO 6887-1:2017,
Annex D (verification protocol for pooling samples for qualitative tests).
NOTE 2 Large sample sizes can compromise the recovery of stressed Cronobacter spp. when interfering
[5[,[6]
microflora are present, such as probiotics.
For preparing quantities larger than 10 g, BPW should be pre-warmed between 34 °C and 38 °C (7.2)
before inoculated with the test portion.
10.2 Pre-enrichment
Incubate the inoculated pre-enrichment medium prepared in accordance with 10.1 between 34 °C and
38 °C (7.2) for 18 h ± 2 h.
10.3 Enrichment
After incubation of the inoculated pre-enrichment medium, mix well and transfer 0,1 ml of the obtained
culture 10.2 into 10 ml of CSB (B.2) and mix well. Incubate at 41,5 °C (7.2) for 24 h ± 2 h.
10.4 Isolation of presumptive Cronobacter spp.
Allow the CCI (B.3) plates to equilibrate at room temperature if they are stored at a lower temperature.
If necessary, dry the surface of the plates (7.13) following the procedure given in ISO 11133.
From enrichment culture, mix well and inoculate, by means of a 10 µl loop (7.3), the surface of the CCI
agar (B.3) to obtain well-separated colonies. Incubate the plate at 41,5 °C (7.2) for 24 h ± 2 h.
After incubation, examine the chromogenic plate for the presence of typical colonies of presumptive
Cronobacter.
Typical Cronobacter colonies on CCI are small to medium-sized (1 mm to 3 mm) and blue to blue-green
in colour. Non-Cronobacter colonies are often white or white with a green centre, grey or black. Some
naturally pigmented colonies of non-Cronobacter can appear yellow or red.
10.5 Confirmation
10.5.1 General
For confirmation, sub-culture from the selective medium CCI (see 10.4) five marked typical or suspect
colonies. In the case that colonies are not well separated, it might be necessary to streak a typical colony
first on the selective agar (B.3) again.
If on the dish there are fewer than five typical or suspect colonies, take all the marked colonies for
confirmation.
Use pure cultures for biochemical confirmation.
4 © ISO 2017 – All rights reserved

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ISO 22964:2017(E)

10.5.2 Purification of colonies
Streak the selected colonies onto the surface of a non-selective agar such as TSA (B.4) so as to gain well-
isolated colonies.
Incubate the plates inverted between 34 °C and 38 °C (7.2) for 21 h ± 3 h.
If the cultures on the non-selective agar are mixed, sub-culture the suspect colony onto a further plate
of the non-selective agar and incubate between 34 °C and 38 °C (7.2) for 21 h ± 3 h to obtain a pure
culture.
It is possible to first test the most characteristic colony from the selective agar plate. If positive, it is not
necessary to test other colonies. If negative, progress through the other selected colonies until either all
are negative or a positive is found.
Strains can be kept on the non-selective agar at 5 °C (7.11), but cannot be stored for more than seven
days. Fresh subcultures of the colonies should be obtained before performing confirmation tests.
10.5.3 Biochemical confirmation
10.5.3.1 General
Carry out the confirmation tests listed in Table 1.
Table 1 — Confirmation tests for Cronobacter spp.
Oxidase Acid from:
Hydrolysis of 4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside substrate D-Arabitol
L-Lysine decarboxylase D-Sorbitol
L-Ornithine decarboxylase D-Sucrose
Methyl Red (optional) α-Methyl-D-glucoside (optional)
Voges-Proskauer (optional)
NOTE 1 If shown to be reliable, miniaturized galleries for the biochemical identification of Cronobacter spp.,
can be used (see ISO 7218).
NOTE 2 Other alternative procedures can be used to confirm the isolate as Cronobacter spp., provided that the
suitability of the alternative procedure has been verified (see also ISO 7218).
10.5.3.2 Oxidase
Using a platinum-iridium or plastic loop (7.3), take a portion of a well-isolated colony from each
individual plate (10.5.2) and streak it on to a filter paper moistened with the oxidase reagent (B.5.1);
the appearance of a mauve, violet or deep blue colour within 10 s indicates a positive reaction. If a
commercially available oxidase test kit is used, follow the manufacturer’s instructions.
10.5.3.3 Hydrolysis of 4 Nitrophenyl (PNP) α-D-glucopyranoside substrate
Using a loop or wire (7.3), suspend an individual colony grown on the non-selective agar such as TSA
(10.5.2) in 2 ml of physiological salt solution, 0,85 % NaCl (B.5.2.4). Add 2 ml of the α-Glucosidase
enzymatic assay solution (B.5.2). Incubate in a water bath at 37 °C (7.12) for 4 h and measure the
formation of yellow colouration in a spectrophotometer (7.9) at 405 nm. A minimal absorption of 0,3 at
405 nm after 4 h, equivalent to 16 mM PNP, can be considered positive.
© ISO 2017 – All rights reserved 5

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ISO 22964:2017(E)

10.5.3.4 L-Lysine decarboxylase
Using a loop or wire (7.3), inoculate the L-lysine decarboxylation medium (B.5.3) with each of the
selected colonies (10.5.2) just below the surface of the medium. Incubate the tubes at 37 °C (7.2) for
24 h ± 2 h.
A violet colour after incubation indicates a positive reaction. A yellow colour indicates a negative
reaction.
10.5.3.5 L-Ornithine decarboxylase
Using a loop or wire (7.3), inoculate the L-ornithine decarboxylation medium (B.5.4) with each of the
selected colonies (10.5.2) just below the surface of the medium. Incubate the tubes at 37 °C (7.2) for
24 h ± 2 h.
A violet colour after incubation indicates a positive reaction. A yellow colour indicates a negative
reaction.
10.5.3.6 Fermentation of various carbohydrates
Using a loop or wire (7.3), inoculate the carbohydrate fermentation medium (B.5.5) with each of the
selected colonies (10.5.2) just below the surface of the medium. Incubate the tubes at 37 °C (7.2) for
48 h ± 2 h.
A yellow colour after incubation indicates a positive reaction. A red colour indicates a negative reaction.
10.5.3.7 Methyl red (MR) (optional)
Using a loop or wire (7.3), inoculate a tube of MR-VP broth (B.5.6) with each of the selected colonies
(10.5.2) just below the surface of the medium. Incubate the tubes at 37 °C (7.2) for 48 h ± 2 h. Add five
drops of methyl red solution (B.5.6.2) to each tube. A distinct red colour indicates a positive reaction. A
yellow colour indicates a negative reaction.
10.5.3.8 Voges-Proskauer (VP) (optional)
Using a loop or wire (7.3), inoculate a tube of MR-VP broth (B.5.6) with each of the selected colonies
(10.5.2) just below the surface of the medium. Incubate the tubes at 37 °C (7.2) for 24 h ± 2 h. Add 0,2 ml
40 % KOH (B.5.6.3.1) and 0,6 ml 1−naphthol solution (B.5.6.3.2). Let stand 1 h ± 0,5 h. An eosin pink
colour around the surface of the medium indicates a positive reaction.
10.6 Interpretation of biochemical results
Cronobacter spp. are oxidase negative and are able to hydrolyse 4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside
substrate and to produce acid from sucrose. They are unable to decarboyxlate L-lysine and to produce
acid from D-sorbitol. Only very few Cronobacter strains give a positive methyl red reaction, and a
negative Voges Proskauer test is also very uncommon. Cronobacter spp. can be distinguished from
closely related species by the characteristics listed in Annex C.
NOTE Cronobacter spp. refers to the descriptions found in References [9] and [11].
11 Expression of results
In accordance with the results of the biochemical tests and their interpretation, indicate if Cronobacter
spp. is detected or not detected in a test portion of x g or x ml of product (see ISO 7218).
6 © ISO 2017 – All rights reserved

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ISO 22964:2017(E)

12 Performance characteristics of the method
12.1 Interlaboratory study
The accuracy (precision) of the method was determined in an interlaboratory study to determine
the specificity, sensitivity and, when possible, the LOD of the method. The data are summarized in
50
Annex D. The values derived from the interlaboratory study may not be applicable to food types other
than those given in Annex D.
12.2 Sensitivity
The sensitivity is defined as the number of samples found positive divided by the number of samples
tested at a given level of contamination. The results are thus dependent on the level of contamination of
the sample.
12.3 Specificity
The specificity is defined as the number of samples found negative divided by the number of blank
samples tested.
12.4 LOD
50
The LOD is the concentration (cfu/sample) for which the probability of detection is 50 %.
50
13 Test report
The test report shall contain at least the following information:
a) the sampling method used, if known;
b) the method used, with reference to this document, i.e. ISO 22964;
c) test results obtained;
d) all operating details not specified in this document or regarded as optional, together with details of
any incidents which may have influenced the test results;
e) all information necessary for the complete identification of the sample.
© ISO 2017 – All rights reserved 7

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ISO 22964:2017(E)

Annex A
(normative)

Diagram of the test procedure
Figure A.1 — Flow diagram of the procedure for detection of Cronobacter spp. in food, animal
feed and environmental samples from the food production area
8 © ISO 2017 – All rights reserved

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ISO 22964:2017(E)

Annex B
(normative)

Composition, preparation and performance testing of culture
media and reagents
B.1 Buffered peptone water (BPW)
B.1.1 Composition
a
Peptone 10,0 g
Sodium chloride (NaCl) 5,0 g
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate 9,0
...

ISO/TC 34/SC 9
Deleted: 02‐09
Date:  2017-04
Deleted: /FDIS
ISO 22964:2017(F)
ISO/TC 34/SC 9
Secrétariat:  AFNOR
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche
de Cronobacter spp.
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of
Cronobacter spp.

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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le
droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet
de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails
concernant les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés
lors de l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations
de brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles Deleted: l'OMC
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant‐propos.html.
Le présent document a été élaboré(e) par le comité technique CEN/TC 275 Analyse des produits Deleted: Comité européen de normalisation
(CEN),
alimentaires — Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration
avec le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, Sous‐comité SC 9, Microbiologie,
conformément à l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne). Deleted: l’Accord
Cette première édition annule et remplace l’ISO/TS 22964:2006, qui a fait l’objet d’une révision
technique avec les modifications suivantes:
— le domaine d’application a été étendu à la recherche de Cronobacter spp. dans les produits
alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale, ainsi qu’aux
échantillons environnementaux et le titre changé en conséquence;
— le bouillon d’enrichissement, bouillon lauryl sulfate tryptose modifié (mLST), a été remplacé par le
bouillon sélectif Cronobacter (CSB);
— la gélose d’isolement, gélose d’isolement Enterobacter sakazakii (ESIA), a été remplacée par la
gélose d’isolement chromogène pour Cronobacter (CCI);
— plusieurs essais de confirmation ont été remplacés par d’autres essais, conformément au Tableau 1
du présent document.

---------------------- Page: 2 ----------------------
Introduction
Le présent document décrit une méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp. dans les
produits alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale et dans les
échantillons environnementaux. Les principales modifications, énumérées dans l’avant‐propos,
introduites dans le présent document par rapport à l’ISO/TS 22964:2006, sont considérées comme
[2]
majeures (voir l’ISO 17468 ). Deleted: ).
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible que la présente méthode
horizontale ne convienne pas exactement, dans tous ses détails, à certains d’entre eux. Dans ce cas, des
méthodes différentes, spécifiques de ces produits, peuvent être utilisées, si cela est absolument
nécessaire et pour des raisons techniques justifiées. Néanmoins, il convient de faire tous les efforts
envisageables afin d’appliquer, dans la mesure du possible, la présente méthode horizontale.
À la prochaine révision du présent document, il sera tenu compte de toutes les informations collectées
depuis sa publication, indiquant dans quelle mesure la présente méthode horizontale aura été suivie et
les raisons pour lesquelles on y aura dérogé dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être immédiate et, pour certains groupes de produits, Deleted: instantanée
des Normes internationales et/ou nationales ne concordant pas avec la présente méthode horizontale
existent peut‐être déjà. Lors de la révision de ces normes, il serait souhaitable de les aligner sur le
présent document de sorte qu’à terme, les seules divergences restantes par rapport à la présente
méthode horizontale se limiteront à celles qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien
établies.

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Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche de Cronobacter spp.
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp.
Sous réserve des restrictions exposées dans l’introduction, le présent document est applicable aux:
— produits et ingrédients alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation
animale;
— échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la manutention
des aliments.
2 Références normatives
Les documents ci‐après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/.
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http://www.iso.org/obp.
3.1
Cronobacter spp.
microorganismes formant des colonies caractéristiques sur une gélose d’isolement chromogène pour
[10]
9][
Cronobacter (CCI) et possédant les caractéristiques biochimiques décrites lorsque les essais sont
Deleted:
réalisés conformément au présent document
3.2
recherche des Cronobacter spp.
détermination de Cronobacter spp. (3.1) dans une masse, un volume ou une surface donné(e) de
produit, lorsque les essais sont réalisés conformément au présent document

---------------------- Page: 4 ----------------------
4 Termes abrégés
Pour les besoins du présent document, les abréviations suivantes s’appliquent.
Deleted: BPW
EPT eau peptonée tamponnée (buffered peptone water)
CCI isolement chromogène de Cronobacter (chromogenic Cronobacter isolation)
CSB bouillon sélectif pour Cronobacter (Cronobacter selective broth)
TSA gélose tryptone soja (tryptone soya agar)
5 Principe
5.1 Pré-enrichissement non sélectif dans de l’eau peptonée tamponnée (EPT)
Ensemencement d’une prise d’essai dans de l’eau peptonée tamponnée, puis incubation à une
température comprise entre 34 °C et 38 °C, pendant 18 h ± 2 h.
NOTE Des Cronobacter spp. peuvent être présentes en petit nombre accompagnées d’autres
Enterobacteriaceae telles que E. cloacae, pouvant interférer avec leur détection.
5.2 Enrichissement dans un milieu sélectif (CSB)
Ensemencement du milieu d’enrichissement sélectif avec la culture obtenue en 5.1 et incubation à
41,5 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 2 h.
5.3 Ensemencement et identification sur une gélose chromogène (gélose CCI)
Ensemencement de la gélose chromogène à partir de la culture d’enrichissement obtenue en 5.2 et
incubation à 41,5 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 2 h.
5.4 Confirmation
Des colonies caractéristiques sont isolées à partir de la gélose chromogène, purifiées sur une gélose non
sélective comme la TSA et caractérisées sur le plan biochimique.
6 Milieux de culture et réactifs
Pour les pratiques en vigueur de laboratoire voir l’ISO 7218 et l’ISO 11133. Deleted: courantes
La composition et la préparation des milieux de culture et des réactifs sont décrites à l’Annexe B.
Pour consulter les essais de performance des milieux de culture, voir l’ISO 11133 et/ou l’Annexe B.
7 Matériel et consommables
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications
sont appropriées. Deleted: similaires
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
7.1 Appareil pour la stérilisation par chaleur sèche (four) ou par chaleur humide (autoclave).
Comme spécifié dans l’ISO 7218.
7.2 Étuves, réglables de 34 °C à 38 °C, à 37 °C ± 1 °C et à 41,5 °C ± 1 °C.

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7.3 Anses bouclées stériles, d’environ 3 mm de diamètre (10 µl de volume), et de 1 µl de volume, et
fil droit (ose).
7.4 pH-mètre, d’une exactitude d’étalonnage de ± 0,1 unité de pH à 25 °C.
7.5 Fioles et flacons, avec bouchons, d’une capacité permettant de les utiliser pour la préparation
des bouillons d’enrichissement et des géloses, ainsi que leur stockage.
7.6 Pipettes graduées ou pipettes automatiques stériles, de capacités nominales 10 ml, 1 ml et
0,1 ml.
7.7 Tubes (bouchés ou avec capsules), ou flacons de culture, d’une capacité appropriée, à capsules
métalliques non toxiques avec revêtement ou capsules en plastique jetables (voir l’ISO 7218).
7.8 Boîtes de Petri, d’environ 90 mm de diamètre.
7.9 Spectrophotomètre, pouvant mesurer l’absorption de la lumière d’une longueur d’onde de
405 nm.
7.10 Pilon et mortier
7.11 Réfrigérateur, réglable à 5 °C ± 3 °C
7.12 Bains d’eau, réglables entre 47 °C et 50 °C et à 37 °C ± 1 °C.
7.13 Enceinte de séchage (ou four ventilé par convection), pouvant être maintenue à une
température comprise entre 25 °C et 50 °C.
8 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Voir la Norme
internationale spécifique du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique
traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties concernées se
mettent d’accord à ce sujet.
[3]
Une méthode d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO/TS 17728 pour les denrées
[4]
alimentaires et les aliments pour animaux et dans l’ISO 18593 pour l’échantillonnage des surfaces.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé, ni
altéré lors du transport ou du stockage (voir l’ISO 7218).
9 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon de laboratoire conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné: voir l’ISO 6887 (toutes les parties). S’il n’existe pas de
Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à ce
sujet.
10 Mode opératoire (comme représenté à l’Annexe A)
10.1 Prise d’essai
En général, pour préparer la suspension mère, ajouter 10 g ou 10 ml de l’échantillon pour essai
(Article 9) à 90 ml du milieu de pré‐enrichissement (B.1) (EPT), ce qui correspond à une dilution au
Deleted: BPW
e
1/10. Préchauffer l’eau peptonée tamponnée à température ambiante avant utilisation. Pour les
produits spécifiques, suivre les modes opératoires spécifiés dans l’ISO 6887 (toutes les parties). Pour le
lait sec, suivre l’ISO 6887‐5.

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Le présent document a été validé pour des prises d’essai de 10 g. Une prise d’essai de plus petite taille
peut être utilisée sans nécessiter de validation ou vérification supplémentaire, dans la mesure où le
rapport entre le bouillon de pré‐enrichissement et la prise d’essai demeure le même. Une prise d’essai
plus importante que celle validée à l’origine peut être utilisée, si une étude de validation/vérification a
démontré l’absence d’effets négatifs sur la détection de Cronobacter spp.
NOTE 1 Une validation peut être effectuée conformément aux documents appropriés de l’ISO 16140 (toutes les
parties). La vérification du regroupement d’échantillons peut être effectuée conformément au protocole décrit
dans l’ISO 6887‐1:2017, Annexe D (protocole de vérification du regroupement d’échantillons pour les essais
Deleted: 1999
qualitatifs).
NOTE 2 Des échantillons de taille importante peuvent compromettre la récupération des Cronobacter spp.
[5],[6]
][
stressés en présence d’une microflore interférente, comme des probiotiques .
Deleted:
Pour la préparation des quantités supérieures à 10 g, il convient de préchauffer l’eau peptonée
tamponnée entre 34 °C et 38 °C (7.2) avant ensemencement avec la prise d’essai.
10.2 Pré-enrichissement
Incuber le milieu de pré‐enrichissement ensemencé, préparé conformément à 10.1, à une température
comprise entre 34 °C et 38 °C (7.2) pendant 18 h ± 2 h.
10.3 Enrichissement
Après incubation du milieu de pré‐enrichissement ensemencé, bien mélanger et transférer 0,1 ml de la
culture obtenue en 10.2 dans 10 ml de bouillon CSB (B.2) et bien mélanger. Incuber à 41,5 °C (7.2)
pendant 24 h ± 2 h.
10.4 Isolement de colonies présumées de Cronobacter spp.
Laisser les boîtes de gélose CCI (B.3) se stabiliser à température ambiante si elles étaient stockées à une
température inférieure. Si nécessaire, sécher la surface des boîtes (7.13) en suivant le mode opératoire
fourni dans l’ISO 11133.
À partir de la culture d’enrichissement, bien mélanger et ensemencer, à l’aide d’une anse de 10 µl (7.3),
la surface de la gélose CCI (B.3) afin d’obtenir des colonies bien séparées. Incuber la boîte à 41,5 °C (7.2)
pendant 24 h ± 2 h.
Après incubation, examiner les boîtes de gélose chromogène afin de rechercher la présence de colonies
caractéristiques présumées de Cronobacter.
Les colonies caractéristiques de Cronobacter sur la gélose CCI sont de taille petite à moyenne (de 1 mm
à 3 mm), et présentent une coloration bleue à bleu‐vert. Les colonies autres que Cronobacter sont
souvent de couleur blanche, blanche avec un centre vert, grise ou noire. Certaines colonies
naturellement pigmentées ne contenant pas de Cronobacter peuvent être de couleur jaune ou rouge.
10.5 Confirmation
10.5.1 Généralités
Pour les essais de confirmation, repiquer cinq colonies identifiées comme caractéristiques ou suspectes
à partir de la gélose sélective CCI (voir 10.4). Si les colonies n’ont pas été correctement isolées, il peut
s’avérer nécessaire de d’abord ré‐ensemencer en stries la gélose sélective (B.3) avec une colonie
caractéristique.
Si, sur la boîte, moins de cinq colonies caractéristiques ou suspectes sont observées, prélever toutes les
colonies identifiées pour confirmation.

---------------------- Page: 7 ----------------------
Utiliser des cultures pures pour la confirmation biochimique.
10.5.2 Purification des colonies
Ensemencer en stries la surface d’une gélose non sélective, comme la gélose TSA (B.4), avec les colonies
sélectionnées, de façon à obtenir des colonies correctement isolées.
Retourner et incuber les boîtes entre 34 °C et 38 °C (7.2) pendant 21h ± 3h. Deleted: 18 h à 24 h
Si les cultures sur la gélose non sélective ne sont pas pures, repiquer les colonies suspectes dans une
autre boîte de gélose non sélective et incuber entre 34 °C et 38 °C (7.2) pendant 18 h à 24 h afin
d’obtenir une culture pure.
Il est possible de soumettre d’abord à essai la colonie la plus caractéristique de la boîte de gélose
sélective. Si le résultat est positif, il est inutile de soumettre à essai les autres colonies. Si le résultat est
négatif, soumettre à essai les autres colonies sélectionnées, les unes après les autres, jusqu’à ce qu’elles
soient toutes négatives ou qu’un résultat positif soit obtenu.
Les souches peuvent être conservées sur la gélose non sélective à 5 °C (7.11), mais elles ne peuvent pas
être stockées pendant plus de sept jours. Il convient de repiquer les colonies avant de procéder aux
essais de confirmation.
10.5.3 Confirmation biochimique
10.5.3.1 Généralités
Réaliser les essais de confirmation répertoriés dans le Tableau 1.
Tableau 1 — Essais de confirmation pour Cronobacter spp.
Oxydase Formation d’acide à partir de:
Hydrolyse du substrat 4‐nitrophényle α‐D‐glucopyranoside D‐arabitol
L‐lysine décarboxylase D‐sorbitol
L‐ornithine décarboxylase D‐saccharose
Rouge de méthyle (facultatif) α‐méthyl‐D‐glucoside (facultatif)
Voges‐Proskauer (facultatif)
NOTE 1 Il est possible d’utiliser des galeries d’identification miniaturisées pour l’examen biochimique des
Cronobacter spp., si leur fiabilité est démontrée (voir l’ISO 7218).
NOTE 2 D’autres modes opératoires peuvent être utilisés pour confirmer que l’isolat fait partie des Cronobacter
spp., à condition de vérifier que le mode opératoire alternatif est approprié (voir l’ISO 7218).
10.5.3.2 Oxydase
À l’aide d’une anse en platine iridié ou en plastique (7.3), prélever une partie d’une colonie
correctement isolée sur chacune des boîtes individuelles (10.5.2) et la déposer sur un papier filtre
imbibé de réactif de l’oxydase (B.5.1); l’apparition d’une coloration mauve, violette ou bleu foncé dans
les 10 s indique une réaction positive. Si un kit commercial d’essai pour la recherche de l’oxydase est
utilisé, suivre les instructions du fabricant.

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10.5.3.3 Hydrolyse du substrat 4-nitrophényle (PNP) α-D-glucopyranoside
À l’aide d’une anse ou d’un fil droit (7.3), mettre en suspension une colonie individuelle obtenue sur une
gélose non sélective, comme la TSA (10.5.2), dans 2 ml d’une solution saline physiologique, NaCl à
0,85 % (B.5.2.4). Ajouter 2 ml de la solution pour essai enzymatique à l’α‐glucosidase (B.5.2). Incuber
dans un bain d’eau à 37 °C (7.12) pendant 4 h, observer l’apparition d’une coloration jaune en mesurant
l’absorbance de la solution via un spectrophotomètre (7.9) réglé sur 405 nm. Une absorbance minimale
de 0,3 à 405 nm après 4 h, équivalant à 16 mM de PNP, peut être considérée comme un résultat positif.
10.5.3.4 L-lysine décarboxylase
À l’aide d’une anse ou d’un fil droit (7.3), ensemencer le milieu de décarboxylation à la L‐lysine (B.5.3)
avec chacune des colonies sélectionnées (10.5.2), juste au‐dessous de la surface du milieu. Incuber les
tubes à 37 °C (7.2) pendant 24 h ± 2 h.
Une couleur violette après incubation indique une réaction positive. Une couleur jaune indique une
réaction négative.
10.5.3.5 L-ornithine décarboxylase
À l’aide d’une anse ou d’un fil droit (7.3), ensemencer le milieu de décarboxylation à la L‐
ornithine (B.5.4) avec chacune des colonies sélectionnées (10.5.2), juste au‐dessous de la surface du
milieu. Incuber les tubes à 37 °C (7.2) pendant 24 h ± 2 h.
Une couleur violette après incubation indique une réaction positive. Une couleur jaune indique une
réaction négative.
10.5.3.6 Fermentation de différents hydrates de carbone Deleted: glucides
À l’aide d’une anse ou d’un fil droit (7.3), ensemencer le milieu de fermentation des hydrates de Deleted: glucides
carbone (B.5.5) avec chacune des colonies sélectionnées (10.5.2), juste au‐dessous de la surface du
milieu. Incuber les tubes à 37 °C (7.2) pendant 48 h ± 2 h.
Une couleur jaune après incubation indique une réaction positive. Une couleur rouge indique une
réaction négative.
10.5.3.7 Rouge de méthyle (RM) (facultatif) Deleted: MR
À l’aide d’une anse ou d’un fil droit (7.3), ensemencer un tube de bouillon RM‐VP (B.5.6) avec chacune Deleted: MR
des colonies sélectionnées (10.5.2), juste au‐dessous de la surface du milieu. Incuber les tubes à 37 °C
(7.2) pendant 48 h ± 2 h. Ajouter 5 gouttes de la solution de rouge de méthyle (B.5.6.2) à chaque tube.
Une couleur rouge prononcée indique une réaction positive. Une couleur jaune indique une réaction
négative.
10.5.3.8 Voges-Proskauer (VP) (facultatif)
À l’aide d’une anse ou d’un fil droit (7.3), ensemencer un tube de bouillon RM‐VP (B.5.6) avec chacune Deleted: MR
des colonies sélectionnées (10.5.2), juste au‐dessous de la surface du milieu. Incuber les tubes à
37 °C (7.2) pendant 24 h ± 2 h. Ajouter 0,2 ml de KOH à 40 % (B.5.6.3.1) et 0,6 ml d’une solution de 1‐
naphtol (B.5.6.3.2). Laisser reposer pendant 1 h ± 0,5 h. Une couleur rose (éosine) proche de la surface
du milieu indique une réaction positive.
10.6 Interprétation des résultats des essais biochimiques
Les espèces de Cronobacter spp. sont oxydase négatives et capables d’hydrolyser le substrat 4‐
nitrophényle α‐D‐glucopyranoside et de produire de l’acide à partir de saccharose. Elles ne peuvent pas
décarboxyler la L‐lysine ni produire de l’acide à partir du D‐sorbitol. Seules quelques rares souches de

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Cronobacter donnent une réaction positive au rouge de méthyle. Il est par ailleurs très rare d’obtenir un
résultat négatif à la réaction de Voges‐Proskauer. Les espèces de Cronobacter spp. peuvent être
différenciées des espèces étroitement apparentées par les caractéristiques énumérées à l’Annexe C.
NOTE Cronobacter spp. fait référence aux descriptions fournies dans les Références [9] et [11].
11 Expression des résultats
Selon les résultats de l’interprétation, indiquer la détection ou la non‐détection de Cronobacter spp.
dans une prise d’essai de x g ou de x ml de produit (voir l’ISO 7218).
12 Caractéristiques de performance de la méthode
12.1 Étude interlaboratoires
L’exactitude (la fidélité) de la méthode a été établie dans le cadre d’une étude interlaboratoires, afin de
déterminer la spécificité, la sensibilité et, dans la mesure du possible, la limite de détection
relative (LOD50) de la méthode. Les données sont résumées à l’Annexe D. Les valeurs dérivées de l’étude
interlaboratoires peuvent ne pas être applicables aux types d’aliments autres que ceux mentionnés à
l’Annexe D.
12.2 Sensibilité
La sensibilité correspond au nombre d’échantillons positifs divisé par le nombre d’échantillons soumis
à essai à un niveau donné de contamination. Les résultats dépendent donc du niveau de contamination
de l’échantillon.
12.3 Spécificité
La spécificité correspond au nombre d’échantillons négatifs divisé par le nombre de blancs soumis à
essai.
12.4 LOD
50
La LOD correspond à la concentration (ufc/échantillon) à laquelle la probabilité de détection est de
50
50 %.
13 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit au moins comporter les informations suivantes:
a) la méthode d’échantillonnage utilisée, si elle est connue;
b) la méthode utilisée, avec la référence au présent document, l’ISO 22964;
c) les résultats d’essai obtenus;
d) tous les détails opératoires non spécifiés dans le présent document, ou considérés comme
facultatifs, ainsi que les détails de tout incident susceptible d’avoir influé sur les résultats d’essai;
e) toutes les informations nécessaires à l’identification complète de l’échantillon.

---------------------- Page: 10 ----------------------
Annexe A
(normative)

Représentation schématique du mode opératoire d’essai
Deleted:

Figure A.1 — Représentation schématique du mode opératoire de recherche des Cronobacter
spp. dans les aliments, les aliments pour animaux et les échantillons environnementaux au stade
de la production d’aliments

---------------------- Page: 11 ----------------------
Annexe B
(normative)

Composition, préparation et essais de performance des milieux de culture
et des réactifs
B.1 Eau peptonée tamponnée (EPT) Deleted: BPW
B.1.1 Composition
a
Peptone 10,0 g

Chlorure de sodium (NaCl) 5,0 g

Hydrogénophosphate disodique dodécahydraté 9,0 g

(Na2HPO4·12 H2O)
Dihydrogénophosphate de potassium (KHPO) 1,5 g
2 4

Eau 1 000 ml

a
Par exemple, digestat enzymatique de caséine.
B.1.2 Préparation
Dissoudre les ingrédients dans l’eau, en chauffant si besoin. Ajuster le pH si nécessaire, de sorte
qu’après stérilisation, il soit de 7,0 ± 0,2 à 25 °C.
Répartir le milieu dans des flacons (7.5) de capacité appropriée afin d’obtenir les quantités nécessaires
à l’essai.
Stériliser à l’autoclave (7.1) réglé à 121 °C pendant 15 min. Conserver le milieu dans des flacons fermés
à 5 °C (7.11) pendant une durée maximale de 6 mois.
B.2 Bouillon sélectif pour Cronobacter (CSB)
B.2.1 Milieu de base
B.2.1.1 Composition
Digestat enzymatique de tissus animaux 10,0 g

Extrait de viande 3,0 g

Chlorure de sodium (NaCl) 5,0 g

Pourpre de bromocrésol 0,04 g

Saccharose (C12H22O11) 10,0 g

Eau 1 000 ml

B.2.1.2 Préparation

---------------------- Page: 12 ----------------------
Dissoudre chacun des constituants dans l’eau, en chauffant si besoin.
Ajuster le pH si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C. Répartir 10 ml de
milieu de base dans des tubes (7.7). Stériliser les tubes à 121 °C pendant 15 min (7.1). Conserver le
milieu à 5 °C (7.11) pendant une durée maximale de 6 mois.
B.2.2 Solution de vancomycine
B.2.2.1 Composition
Chlorhydrate de vancomycine (numéro CAS 1404‐93‐9) 10 mg
Deleted: Vancomycine

Eau 10 ml

B.2.2.2 Préparation
Dissoudre la vancomycine dans l’eau distillée. Mélanger et stériliser la vancomycine par filtration sur
Deleted: via un
filtre de 0,2 µm.
La solution de vancomycine peut être conservée à 5 °C (7.11) pendant 15 jours.
B.2.3 Milieu complet
Ajouter stérilement 0,1 ml de solution de vancomycine (B.2.2) à 10 ml de milieu de base (B.2.1) afin
d’obtenir une concentration finale de vancomycine de 10 mg par litre de bouillon CSB.
Le bouillon CSB complet peut être conservé à 5 °C (7.11) pendant 1 journée.
B.3 Gélose d’isolement chromogène pour Cronobacter (CCI)
B.3.1 Composition
Digestat trypsique de caséine 7,0 g

Extrait de levure 3,0 g

Chlorure de sodium (NaCl) 5,0 g

5‐bromo‐4‐chloro‐3‐indolyl‐α‐D‐glucopyranoside 0,15 g

Désoxycholate de sodium (C H NaO) 0,25 g
24 39 4

Citrate d’ammonium fer (III) (CHO Fe NH) 1 g
6 8 7 3

Thiosulfate de sodium (NaSO) 1 g
2 2 3

a
Gélose 9,0 g à 18,0 g

Eau 1 000 ml

a
Selon le pouvoir gélifiant de la gélose.
B.3.2 Préparation
Broyer le 5‐bromo‐4‐chloro‐3‐indolyl‐α‐D‐glucopyranoside avec le chlorure de sodium en utilisant un
pilon et un mortier (7.10), jusqu’à obtention d’une poudre fine et uniforme de 5‐bromo‐4‐chloro‐3‐
indolyl‐α‐D‐glucopyranoside. Dissoudre les autres constituants dans l’eau en portant à ébullition,

---------------------- Page: 13 ----------------------
retirer du feu et ajouter le mélange de sel et de 5‐bromo‐4‐chloro‐3‐indolyl‐α‐D‐glucopyranoside.
Deleted: sel:
Ajuster le pH (7.4) si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C.
Stériliser à l’autoclave (7.1) réglé à 121 °C pendant 15 min. Refroidir en ramenant la température entre
47 °C et 50 °C. Verser environ 18 ml à 20 ml de gélose CCI dans des boîtes de Petri (7.8) stériles vides et
laisser se solidifier sur une surface fraîche et plane.
Le milieu peut être conservé à 5 °C (7.11) pendant une durée maximale de 14 jours.
B.4 Gélose tryptone soja (TSA) (exemple de milieu non sélectif)
B.4.1 Composition
Digestat enzymatique de caséine 15,0 g

Digestat enzymatique de soja 5,0 g

Chlorure de sodium (NaCl) 5,0 g

a
Gélose 9,0 g à 18,0 g

Eau 1 000 ml

a
Selon le pouvoir gélifiant de la gélose.

B.4.2 Préparation
Dissoudre chacun des constituants dans l’eau en portant à ébullition. Ajuster le pH si nécessaire, de
sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C. Stériliser à l’autoclave (7.1) réglé à 121 °C
pendant 15 min. Refroidir en ramenant la température entre 47 °C et 50 °C. Verser environ 18 ml à
20 ml de TSA dans des boîtes de Petri stériles vides (7.8) et laisser se solidifier sur une surface fraîche
et plane.
Conserver le milieu conformément à l’ISO 11133.
B.5 Milieux et réactifs pour la caractérisation biochimique
B.5.1 Réactif pour la recherche de l’oxydase
B.5.1.1 Composition
Dichlorhydrate de N,N,N’,N’‐tétraméthyl‐ 1,0 g

p‐phénylène diamine (C H N·2HCl)
10 16 2
Eau 100 ml

B.5.1.2 Préparation
Dissoudre le constituant dans l’eau juste avant emploi.
B.5.2 Solution pour essai enzymatique à l’α-glucosidase
B.5.2.1 Tampon phosphate, 0,3 M (pH 7,0)
B.5.2.1.1 Composition

--
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 22964
Première édition
2017-04
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche de Cronobacter spp.
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection of Cronobacter spp.
Numéro de référence
ISO 22964:2017(F)
©
ISO 2017

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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Termes abrégés . 2
5 Principe . 2
5.1 Pré-enrichissement non sélectif dans de l’eau peptonée tamponnée (EPT) . 2
5.2 Enrichissement dans un milieu sélectif (CSB) . 2
5.3 Ensemencement et identification sur une gélose chromogène (gélose CCI) . 2
5.4 Confirmation . 2
6 Milieux de culture et réactifs . 2
7 Matériel et consommables . 2
8 Échantillonnage . 3
9 Préparation de l’échantillon pour essai . 3
10 Mode opératoire (comme représenté à l’Annexe A) . 3
10.1 Prise d’essai . 3
10.2 Pré-enrichissement . 4
10.3 Enrichissement . 4
10.4 Isolement de colonies présumées de Cronobacter spp. . 4
10.5 Confirmation . 4
10.5.1 Généralités . 4
10.5.2 Purification des colonies . 5
10.5.3 Confirmation biochimique . 5
10.6 Interprétation des résultats des essais biochimiques . 6
11 Expression des résultats. 7
12 Caractéristiques de performance de la méthode . 7
12.1 Étude interlaboratoires . 7
12.2 Sensibilité . 7
12.3 Spécificité . 7
12.4 LOD .
50 7
13 Rapport d’essai . 7
Annexe A (normative) Représentation schématique du mode opératoire d’essai.8
Annexe B (normative) Composition, préparation et essais de performance des milieux de
culture et des réactifs . 9
Annexe C (informative) Distinction entre Cronobacter spp. et d’autres genres .17
Annexe D (informative) Études de validation des méthodes et caractéristiques de performance .19
Bibliographie .22
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré(e) par le comité technique CEN/TC 275 Analyse des produits
alimentaires — Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, Sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette première édition annule et remplace l’ISO/TS 22964:2006, qui a fait l’objet d’une révision
technique avec les modifications suivantes:
— le domaine d’application a été étendu à la recherche de Cronobacter spp. dans les produits
alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale, ainsi qu’aux
échantillons environnementaux et le titre changé en conséquence;
— le bouillon d’enrichissement, bouillon lauryl sulfate tryptose modifié (mLST), a été remplacé par le
bouillon sélectif Cronobacter (CSB);
— la gélose d’isolement, gélose d’isolement Enterobacter sakazakii (ESIA), a été remplacée par la gélose
d’isolement chromogène pour Cronobacter (CCI);
— plusieurs essais de confirmation ont été remplacés par d’autres essais, conformément au Tableau 1
du présent document.
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ISO 22964:2017(F)

Introduction
Le présent document décrit une méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp. dans
les produits alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale et dans
les échantillons environnementaux. Les principales modifications, énumérées dans l’avant-propos,
introduites dans le présent document par rapport à l’ISO/TS 22964:2006, sont considérées comme
[2]
majeures (voir l’ISO 17468 ).
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible que la présente méthode
horizontale ne convienne pas exactement, dans tous ses détails, à certains d’entre eux. Dans ce cas,
des méthodes différentes, spécifiques de ces produits, peuvent être utilisées, si cela est absolument
nécessaire et pour des raisons techniques justifiées. Néanmoins, il convient de faire tous les efforts
envisageables afin d’appliquer, dans la mesure du possible, la présente méthode horizontale.
À la prochaine révision du présent document, il sera tenu compte de toutes les informations collectées
depuis sa publication, indiquant dans quelle mesure la présente méthode horizontale aura été suivie et
les raisons pour lesquelles on y aura dérogé dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être immédiate et, pour certains groupes de produits,
des Normes internationales et/ou nationales ne concordant pas avec la présente méthode horizontale
existent peut-être déjà. Lors de la révision de ces normes, il serait souhaitable de les aligner sur
le présent document de sorte qu’à terme, les seules divergences restantes par rapport à la présente
méthode horizontale se limiteront à celles qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien
établies.
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NORME INTERNATIONALE ISO 22964:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche de Cronobacter spp.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp.
Sous réserve des restrictions exposées dans l’introduction, le présent document est applicable aux:
— produits et ingrédients alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation
animale;
— échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la manutention
des aliments.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire— Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ .
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp.
3.1
Cronobacter spp.
microorganismes formant des colonies caractéristiques sur une gélose d’isolement chromogène pour
[10]
Cronobacter (CCI) et possédant les caractéristiques biochimiques décrites lorsque les essais sont
réalisés conformément au présent document
3.2
recherche des Cronobacter spp.
détermination de Cronobacter spp. (3.1) dans une masse, un volume ou une surface donné(e) de produit,
lorsque les essais sont réalisés conformément au présent document
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4 Termes abrégés
Pour les besoins du présent document, les abréviations suivantes s’appliquent.
EPT eau peptonée tamponnée (buffered peptone water)
CCI isolement chromogène de Cronobacter (chromogenic Cronobacter isolation)
CSB bouillon sélectif pour Cronobacter (Cronobacter selective broth)
TSA gélose tryptone soja (tryptone soya agar)
5 Principe
5.1 Pré-enrichissement non sélectif dans de l’eau peptonée tamponnée (EPT)
Ensemencement d’une prise d’essai dans de l’eau peptonée tamponnée, puis incubation à une
température comprise entre 34 °C et 38 °C, pendant 18 h ± 2 h.
NOTE Des Cronobacter spp. peuvent être présentes en petit nombre accompagnées d’autres
Enterobacteriaceae telles que E. cloacae, pouvant interférer avec leur détection.
5.2 Enrichissement dans un milieu sélectif (CSB)
Ensemencement du milieu d’enrichissement sélectif avec la culture obtenue en 5.1 et incubation à
41,5 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 2 h.
5.3 Ensemencement et identification sur une gélose chromogène (gélose CCI)
Ensemencement en stries de la gélose chromogène à partir de la culture d’enrichissement obtenue en
5.2 et incubation à 41,5 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 2 h.
5.4 Confirmation
Des colonies caractéristiques sont isolées à partir de la gélose chromogène, purifiées sur une gélose non
sélective comme la TSA et caractérisées sur le plan biochimique.
6 Milieux de culture et réactifs
Pour les pratiques en vigueur de laboratoire voir l’ISO 7218 et l’ISO 11133.
La composition et la préparation des milieux de culture et des réactifs sont décrites à l’Annexe B.
Pour consulter les essais de performance des milieux de culture, voir l’ISO 11133 et/ou l’Annexe B.
7 Matériel et consommables
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications
sont appropriées.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
7.1 Appareil pour la stérilisation par chaleur sèche (four) ou par chaleur humide (autoclave).
Comme spécifié dans l’ISO 7218.
7.2 Étuves, réglables de 34 °C à 38 °C, à 37 °C ± 1 °C et à 41,5 °C ± 1 °C.
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7.3 Anses bouclées stériles, d’environ 3 mm de diamètre (10 µl de volume), et de 1 µl de volume, et
fil droit (ose).
7.4 pH-mètre, d’une exactitude d’étalonnage de ± 0,1 unité de pH à 25 °C.
7.5 Fioles et flacons, avec bouchons, d’une capacité permettant de les utiliser pour la préparation des
bouillons d’enrichissement et des géloses, ainsi que leur stockage.
7.6 Pipettes graduées ou pipettes automatiques stériles, de capacités nominales 10 ml, 1 ml et 0,1 ml.
7.7 Tubes (bouchés ou avec capsules), ou flacons de culture, d’une capacité appropriée, à capsules
métalliques non toxiques avec revêtement ou capsules en plastique jetables (voir l’ISO 7218).
7.8 Boîtes de Petri, d’environ 90 mm de diamètre.
7.9 Spectrophotomètre, pouvant mesurer l’absorption de la lumière d’une longueur d’onde de 405 nm.
7.10 Pilon et mortier
7.11 Réfrigérateur, réglable à 5 °C ± 3 °C
7.12 Bains d’eau, réglables entre 47 °C et 50 °C et à 37 °C ± 1 °C.
7.13 Enceinte de séchage (ou four ventilé par convection), pouvant être maintenue à une
température comprise entre 25 °C et 50 °C.
8 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Voir la Norme
internationale spécifique du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique
traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties concernées se
mettent d’accord à ce sujet.
[3]
Une méthode d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO/TS 17728 pour les denrées
[4]
alimentaires et les aliments pour animaux et dans l’ISO 18593 pour l’échantillonnage des surfaces.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé, ni
altéré lors du transport ou du stockage (voir l’ISO 7218).
9 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon de laboratoire conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné: voir l’ISO 6887 (toutes les parties). S’il n’existe pas de
Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à
ce sujet.
10 Mode opératoire (comme représenté à l’Annexe A)
10.1 Prise d’essai
En général, pour préparer la suspension mère, ajouter 10 g ou 10 ml de l’échantillon pour essai
(Article 9) à 90 ml du milieu de pré-enrichissement (B.1) (EPT), ce qui correspond à une dilution au
e
1/10 . Préchauffer l’eau peptonée tamponnée à température ambiante avant utilisation. Pour les
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produits spécifiques, suivre les modes opératoires spécifiés dans l’ISO 6887 (toutes les parties). Pour le
lait sec, suivre l’ISO 6887-5.
Le présent document a été validé pour des prises d’essai de 10 g. Une prise d’essai de plus petite taille
peut être utilisée sans nécessiter de validation ou vérification supplémentaire, dans la mesure où le
rapport entre le bouillon de pré-enrichissement et la prise d’essai demeure le même. Une prise d’essai
plus importante que celle validée à l’origine peut être utilisée, si une étude de validation/vérification a
démontré l’absence d’effets négatifs sur la détection de Cronobacter spp.
NOTE 1 Une validation peut être effectuée conformément aux documents appropriés de l’ISO 16140 (toutes les
parties). La vérification du regroupement d’échantillons peut être effectuée conformément au protocole décrit
dans l’ISO 6887-1:2017, Annexe D (protocole de vérification du regroupement d’échantillons pour les essais
qualitatifs).
NOTE 2 Des échantillons de taille importante peuvent compromettre la récupération des Cronobacter spp.
[5],[6]
stressés en présence d’une microflore interférente, comme des probiotiques .
Pour la préparation des quantités supérieures à 10 g, il convient de préchauffer l’eau peptonée
tamponnée entre 34 °C et 38 °C (7.2) avant ensemencement avec la prise d’essai.
10.2 Pré-enrichissement
Incuber le milieu de pré-enrichissement ensemencé, préparé conformément à 10.1, à une température
comprise entre 34 °C et 38 °C (7.2) pendant 18 h ± 2 h.
10.3 Enrichissement
Après incubation du milieu de pré-enrichissement ensemencé, bien mélanger et transférer 0,1 ml de
la culture obtenue en 10.2 dans 10 ml de bouillon CSB (B.2) et bien mélanger. Incuber à 41,5 °C (7.2)
pendant 24 h ± 2 h.
10.4 Isolement de colonies présumées de Cronobacter spp.
Laisser les boîtes de gélose CCI (B.3) se stabiliser à température ambiante si elles étaient stockées à une
température inférieure. Si nécessaire, sécher la surface des boîtes (7.13) en suivant le mode opératoire
fourni dans l’ISO 11133.
À partir de la culture d’enrichissement, bien mélanger et ensemencer, à l’aide d’une anse de 10 µl (7.3),
la surface de la gélose CCI (B.3) afin d’obtenir des colonies bien séparées. Incuber la boîte à 41,5 °C (7.2)
pendant 24 h ± 2 h.
Après incubation, examiner les boîtes de gélose chromogène afin de rechercher la présence de colonies
caractéristiques présumées de Cronobacter.
Les colonies caractéristiques de Cronobacter sur la gélose CCI sont de taille petite à moyenne (de 1 mm à
3 mm), et présentent une coloration bleue à bleu-vert. Les colonies autres que Cronobacter sont souvent
de couleur blanche, blanche avec un centre vert, grise ou noire. Certaines colonies naturellement
pigmentées ne contenant pas de Cronobacter peuvent être de couleur jaune ou rouge.
10.5 Confirmation
10.5.1 Généralités
Pour les essais de confirmation, repiquer cinq colonies identifiées comme caractéristiques ou suspectes
à partir de la gélose sélective CCI (voir 10.4). Si les colonies n’ont pas été correctement isolées, il peut
s’avérer nécessaire de d’abord ré-ensemencer en stries la gélose sélective (B.3) avec une colonie
caractéristique.
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Si, sur la boîte, moins de cinq colonies caractéristiques ou suspectes sont observées, prélever toutes les
colonies identifiées pour confirmation.
Utiliser des cultures pures pour la confirmation biochimique.
10.5.2 Purification des colonies
Ensemencer en stries la surface d’une gélose non sélective, comme la gélose TSA (B.4), avec les colonies
sélectionnées, de façon à obtenir des colonies correctement isolées.
Retourner et incuber les boîtes entre 34 °C et 38 °C (7.2) pendant 21h ± 3h.
Si les cultures sur la gélose non sélective ne sont pas pures, repiquer les colonies suspectes dans une
autre boîte de gélose non sélective et incuber entre 34 °C et 38 °C (7.2) pendant 21h ± 3h afin d’obtenir
une culture pure.
Il est possible de soumettre d’abord à essai la colonie la plus caractéristique de la boîte de gélose
sélective. Si le résultat est positif, il est inutile de soumettre à essai les autres colonies. Si le résultat est
négatif, soumettre à essai les autres colonies sélectionnées, les unes après les autres, jusqu’à ce qu’elles
soient toutes négatives ou qu’un résultat positif soit obtenu.
Les souches peuvent être conservées sur la gélose non sélective à 5 °C (7.11), mais elles ne peuvent pas
être stockées pendant plus de sept jours. Il convient de repiquer les colonies avant de procéder aux
essais de confirmation.
10.5.3 Confirmation biochimique
10.5.3.1 Généralités
Réaliser les essais de confirmation répertoriés dans le Tableau 1.
Tableau 1 — Essais de confirmation pour Cronobacter spp.
Oxydase Formation d’acide à partir de:
Hydrolyse du substrat 4-nitrophényle α-D-glucopyranoside D-arabitol
L-lysine décarboxylase D-sorbitol
L-ornithine décarboxylase D-saccharose
Rouge de méthyle (facultatif) α-méthyl-D-glucoside (facultatif)
Voges-Proskauer (facultatif)
NOTE 1 Il est possible d’utiliser des galeries d’identification miniaturisées pour l’examen biochimique des
Cronobacter spp., si leur fiabilité est démontrée (voir l’ISO 7218).
NOTE 2 D’autres modes opératoires peuvent être utilisés pour confirmer que l’isolat fait partie des Cronobacter
spp., à condition de vérifier que le mode opératoire alternatif est approprié (voir l’ISO 7218).
10.5.3.2 Oxydase
À l’aide d’une anse en platine iridié ou en plastique (7.3), prélever une partie d’une colonie correctement
isolée sur chacune des boîtes individuelles (10.5.2) et la déposer sur un papier filtre imbibé de réactif
de l’oxydase (B.5.1); l’apparition d’une coloration mauve, violette ou bleu foncé dans les 10 s indique
une réaction positive. Si un kit commercial d’essai pour la recherche de l’oxydase est utilisé, suivre les
instructions du fabricant.
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10.5.3.3 Hydrolyse du substrat 4-nitrophényle (PNP) α-D-glucopyranoside
À l’aide d’une anse ou d’un fil droit (7.3), mettre en suspension une colonie individuelle obtenue sur
une gélose non sélective, comme la TSA (10.5.2), dans 2 ml d’une solution saline physiologique, NaCl à
0,85 % (B.5.2.4). Ajouter 2 ml de la solution pour essai enzymatique à l’α-glucosidase (B.5.2). Incuber
dans un bain d’eau à 37 °C (7.12) pendant 4 h, observer l’apparition d’une coloration jaune en mesurant
l’absorbance de la solution via un spectrophotomètre (7.9) réglé sur 405 nm. Une absorbance minimale
de 0,3 à 405 nm après 4 h, équivalant à 16 mM de PNP, peut être considérée comme un résultat positif.
10.5.3.4 L-lysine décarboxylase
À l’aide d’une anse ou d’un fil droit (7.3), ensemencer le milieu de décarboxylation à la L-lysine (B.5.3)
avec chacune des colonies sélectionnées (10.5.2), juste au-dessous de la surface du milieu. Incuber les
tubes à 37 °C (7.2) pendant 24 h ± 2 h.
Une couleur violette après incubation indique une réaction positive. Une couleur jaune indique une
réaction négative.
10.5.3.5 L-ornithine décarboxylase
À l’aide d’une anse ou d’un fil droit (7.3), ensemencer le milieu de décarboxylation à la L-ornithine (B.5.4)
avec chacune des colonies sélectionnées (10.5.2), juste au-dessous de la surface du milieu. Incuber les
tubes à 37 °C (7.2) pendant 24 h ± 2 h.
Une couleur violette après incubation indique une réaction positive. Une couleur jaune indique une
réaction négative.
10.5.3.6 Fermentation de différents hydrates de carbone
À l’aide d’une anse ou d’un fil droit (7.3), ensemencer le milieu de fermentation des hydrates de
carbone (B.5.5) avec chacune des colonies sélectionnées (10.5.2), juste au-dessous de la surface du
milieu. Incuber les tubes à 37 °C (7.2) pendant 48 h ± 2 h.
Une couleur jaune après incubation indique une réaction positive. Une couleur rouge indique une
réaction négative.
10.5.3.7 Rouge de méthyle (RM) (facultatif)
À l’aide d’une anse ou d’un fil droit (7.3), ensemencer un tube de bouillon RM-VP (B.5.6) avec chacune
des colonies sélectionnées (10.5.2), juste au-dessous de la surface du milieu. Incuber les tubes à 37 °C
(7.2) pendant 48 h ± 2 h. Ajouter 5 gouttes de la solution de rouge de méthyle (B.5.6.2) à chaque tube.
Une couleur rouge prononcée indique une réaction positive. Une couleur jaune indique une réaction
négative.
10.5.3.8 Voges-Proskauer (VP) (facultatif)
À l’aide d’une anse ou d’un fil droit (7.3), ensemencer un tube de bouillon RM-VP (B.5.6) avec chacune
des colonies sélectionnées (10.5.2), juste au-dessous de la surface du milieu. Incuber les tubes à
37 °C (7.2) pendant 24 h ± 2 h. Ajouter 0,2 ml de KOH à 40 % (B.5.6.3.1) et 0,6 ml d’une solution de
1-naphtol (B.5.6.3.2). Laisser reposer pendant 1 h ± 0,5 h. Une couleur rose (éosine) proche de la surface
du mil
...

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