ISO 20743:2007

Textiles - Determination of antibacterial activity of antibacterial finished products

ISO 20743:2007 specifies quantitative test methods to determine the antibacterial activity of antibacterial finished textile products including nonwovens. ISO 20743:2007 is applicable to all textile products, including cloth, wadding, thread and material for clothing, home furnishings and miscellaneous goods regardless of the type of antibacterial agent used (organic, inorganic, natural or man-made) or the method of application (built-in, after-treatment or grafting). Based on the intended application and on the environment in which the textile product is to be used, the user can select the most suitable of the following three methods on determination of antibacterial activity: a) absorption method (an evaluation method in which test bacterial suspension is inoculated directly onto samples); b) transfer method (an evaluation method in which test bacteria are placed on an agar plate and transferred onto samples); c) printing method (an evaluation method in which test bacteria are placed on a filter and printed onto samples). The colony plate count method and the ATP (Adenosine Tri-phosphate) luminescence method are also specified for measuring the enumeration of bacteria.

Textiles — Détermination de l'activité antibactérienne des produits finis antibactériens

L'ISO 20743:2007 spécifie des méthodes d'essai quantitatives permettant de déterminer l'activité antibactérienne des produits textiles finis antibactériens, y compris les non-tissés. L'ISO 20743:2007 s'applique à tous les produits textiles, y compris le tissu, le rembourrage, le fil et les matériaux utilisés dans la confection de vêtements, de tissus d'ameublements et d'articles divers, quel que soit le type d'agent antibactérien utilisé (organique, inorganique, naturel ou synthétique) ou quelle que soit la méthode d'application (intégration, post-traitement ou greffage). Tenant compte de l'application prévue et de l'environnement dans lequel le produit textile est destiné à être utilisé, l'utilisateur peut choisir la plus adaptée des trois méthodes suivantes de détermination de l'activité antibactérienne: a) méthode par absorption (méthode d'évaluation dans laquelle la suspension bactérienne à l'essai est ensemencée directement sur des échantillons); b) méthode par transfert (méthode d'évaluation dans laquelle les bactéries soumises à l'essai sont placées sur une boîte de milieu gélosé, puis transférées sur des échantillons); c) méthode par impression (méthode d'évaluation dans laquelle les bactéries soumises à l'essai sont placées sur un filtre, puis imprimées sur des échantillons); La technique de dénombrement et la méthode de mesure de luminescence ATP (triphosphate d'adénosine) sont également spécifiées pour le dénombrement des bactéries.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 30-May-2007
• Withdrawal Date: 30-May-2007
• ICS: 07.100.99 - Other standards related to microbiology
• ICS: 59.080.01 - Textiles in general
• Technical Committee: ISO/TC 38 - Textiles
• Drafting Committee: ISO/TC 38/WG 23 - Biological properties of textiles
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Start Date: 03-Jul-2013
• Completion Date: 13-Dec-2025

Relations

• Consolidates: ISO 8489-2:1995 - Textile machinery and accessories - Cones for cross winding - Part 2: Dimensions, tolerances and designation of cones with half angle 3 degrees 30'
• Effective Date: 06-Jun-2022
• Revised: ISO 20743:2013 - Textiles - Determination of antibacterial activity of textile products
• Effective Date: 09-Apr-2011

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20743
First edition
2007-06-01
Textiles — Determination of antibacterial
activity of antibacterial finished products
Textiles — Détermination de l'activité antibactérienne des produits finis
antibactériens
Reference number
©
ISO 2007
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Safety precaution. 2
5 Apparatus . 2
6 Reagents and culture media. 4
7 Reference strains. 8
7.1 Strains. 8
7.2 Storage of strains . 8
8 Quantitative measurement. 10
8.1 Plate count method. 10
8.2 Luminescence method. 11
9 Shaking method. 12
9.1 Shaking by vortex mixer . 12
9.2 Shaking by hand . 12
9.3 Shaking by Stomacher . 12
10 Test procedures . 12
10.1 Absorption method. 12
10.2 Transfer method. 17
10.3 Printing method . 21
Bibliography . 27

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 20743 was prepared by Technical Committee ISO/TC 38, Textiles.
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Introduction
These test methods were established in order to address the substantial need for an International Standard to
determine antibacterial activity for antibacterial finished textile products.

INTERNATIONAL STANDARD ISO 20743:2007(E)

Textiles — Determination of antibacterial activity of
antibacterial finished products
1 Scope
This International Standard specifies quantitative test methods to determine the antibacterial activity of
antibacterial finished textile products including nonwovens.
This International Standard is applicable to all textile products, including cloth, wadding, thread and material
for clothing, home furnishings and miscellaneous goods regardless of the type of antibacterial agent used
(organic, inorganic, natural or man-made) or the method of application (built-in, after-treatment or grafting).
Based on the intended application and on the environment in which the textile product is to be used, the user
can select the most suitable of the following three methods on determination of antibacterial activity:
a) absorption method (an evaluation method in which test bacterial suspension is inoculated directly onto
samples);
b) transfer method (an evaluation method in which test bacteria are placed on an agar plate and transferred
onto samples);
c) printing method (an evaluation method in which test bacteria are placed on a filter and printed onto
samples).
The colony plate count method and the ATP (ATP = Adenosine Tri-phosphate) luminescence method are
also specified for measuring the enumeration of bacteria.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 6330, Textiles — Domestic washing and drying procedures for textile testing
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
textile
fabric
general term employed for designating textile surfaces, woven fabrics, knitted fabrics, etc., formed by the
interlocking of textile materials having a certain cohesion and which are generally intended for clothing or
furniture applications
NOTE Often includes certain types of nonwovens.
3.2
control fabric
fabric used to validate the growth condition of test bacteria
NOTE The same fabric as the fabric to be tested but without antibacterial treatment. If this is not possible, then
100 % cotton fabric without fluorescent brighteners or other finish.
3.3
antibacterial agent
product designed to prevent or mitigate the growth of bacteria, to reduce the number of bacteria or to kill
bacteria
3.4
antibacterial finish
treatment designed to prevent or mitigate the growth of bacteria, to reduce the number of bacteria or to kill
bacteria
3.5
antibacterial activity
activity of an antibacterial finish used to prevent or mitigate the growth of bacteria, to reduce the number of
bacteria or to kill bacteria
3.6
plate count method
method in which the number of bacteria present after incubation is calculated by counting the number of
colonies according to a ten-time dilution method
NOTE The results are expressed in “CFU (Colony Forming Unit)”.
3.7
luminescence method
method in which the amount of ATP contained in bacterial cells is measured
NOTE The results are expressed in “mol of ATP”.
3.8
neutralizer
chemical agents used to inactivate, neutralize, or quench the antibacterial properties of antibacterial agents
4 Safety precaution
Test methods specified herein require the use of bacteria.
These tests should be carried out by persons with training and experience in the use of microbiological
techniques.
Appropriate safety precautions should be observed with due consideration given to country-specific
regulations.
5 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
5.1 Spectrophotometer, capable of measuring at a 620 nm to 660 nm wavelength, or McFarland’s
nephelometer.
5.2 Incubator, capable of maintaining a constant temperature of 37 °C ± 2 °C.
2 © ISO 2007 – All rights reserved

5.3 Water baths, one capable of maintaining a constant temperature of 46 °C ± 2 °C and another capable
of maintaining a temperature of 70 °C to 90 °C.
5.4 Mixer, producing a vortex shaking action.
5.5 Stomacher, capable of speeds of 6 blows/s to 8 blows/s, with the corresponding disposable containers.
5.6 Clean bench, for microbial test.
5.7 Washing machine, in accordance with the specifications of ISO 6330.
5.8 Humidity chamber, tropical chamber or other container capable of maintaining a high-humidity
atmospheric condition.
−13 −7
5.9 Luminescence photometer, capable of measuring ATP of 10 mol/l to 10 mol/l at 300 nm to
650 nm with a luminescence-measuring reagent.
5.10 Printing apparatus, capable of applying a 4 N load to a test piece and rotating the piece 180° in one
direction for a period of 3,0 s.
5.11 Refrigerator, capable of maintaining a temperature of between 2 °C and 8 °C.
5.12 Freezers, one adjustable to a temperature below −70 °C and another to a temperature below −20 °C.
5.13 Balance, which can be read to the nearest 0,01 g.
5.14 Filtering apparatus, consisting of an upper container equipped with a membrane filter and a lower
container equipped with a suction opening.
5.15 Pipette, having the most suitable volume for each use, with a tip made of glass or plastic, and with a
tolerance of 0,5 % or less.
5.16 Vials, 30 ml glass bottles, with screw openings, polytetrafluoroethylene or silicone packing and caps
made of polypropylene, polycarbonate, or other suitable material.
5.17 Petri dishes, that have been sterilized, made of glass or plastic, in diameter sizes of 90 mm to 100 mm
and 55 mm to 60 mm.
5.18 Glass rod, with a diameter of approximately 18 mm.
5.19 Anti-bumping granules (glass beads), with a diameter of 3 mm to 4 mm.
5.20 Erlenmeyer flask, capacity 100 ml.
5.21 Cutting template, made of a sterilizable material (stainless steel or glass) with a diameter of
3,8 cm ± 0,1 cm.
5.22 Disposable plastic bags, suitable for containing food products, to be used for storage of samples.
5.23 Tweezers, made of a material which can be sterilized.
5.24 Stainless steel cylinder, with a mass of 200 g ± 10 g and a diameter of 3,5 cm ± 0,1 cm.
5.25 Metal wire basket, for autoclaving.
5.26 Aluminium foil.
6 Reagents and culture media
Reagents used in tests shall be of analytical quality and/or suited for microbiological purposes.
Dehydrated products available on the commercial market are recommended for use in preparing the culture
media. The manufacturer’s instructions for the preparation of these products should be strictly followed.
6.1 Water.
Water used in tests shall be analytical-grade water for microbiological media preparation which is freshly
distilled and/or ion-exchanged and/or ultra-filtered and/or filtered with RO (reverse osmosis). It shall be free
from all toxic or bacteria inhibitory substances.
6.2 Tryptone soya broth (TSB).
This solution shall be used for the resuscitation of the freeze-dried bacterial strains.
Tryptone, pancreatic digest of casein 15 g
Soya peptone, papain digest of soya 5 g
Sodium chloride (NaCl) 5 g
Water 1 000 ml (final volume)
pH after sterilization
7,2 ± 0,2
6.3 Tryptone soya agar (TSA).
Tryptone, pancreatic digest of casein 15 g
Soya peptone, papain digest of soya 5 g
Sodium chloride (NaCl) 5 g
Agar 15 g
Water 1 000 ml (final volume)
pH after sterilization 7,2 ± 0,2
6.4 Agar for transfer.
Tryptone, pancreatic digest of casein 0,75 g
Soya peptone, papain digest of soya 0,25 g
Sodium chloride (NaCl) 5 g
Agar 15 g
Water 1 000 ml (final volume)
pH after sterilization
7,2 ± 0,2
4 © ISO 2007 – All rights reserved

6.5 Nutrient broth (NB).
Beef extract 3 g
Peptone 5 g
Water 1 000 ml (final volume)
pH after sterilization
6,9 ± 0,2
6.6 Peptone-salt solution.
Tryptone, pancreatic digest of casein 1 g
Sodium chloride (NaCl) 8,5 g
Water 1 000 ml (final volume)
pH after sterilization
6,9 ± 0,2
6.7 Physiological saline.
Sodium chloride (NaCl) 8,5 g
Water 1 000 ml (final volume)
6.8 SCDLP medium.
Peptone, digest of casein 17 g
Peptone, digest of soybean 3 g
Sodium chloride (NaCl) 5 g
Potassium dihydrogenphosphate 2,5 g
Glucose 2,5 g
Lecithin 1 g
Polysorbate 80 7 g
Water 1 000 ml (final volume)
pH after sterilization
7,2 ± 0,2
If the neutralizing power is insufficient, the content of polysorbate 80 or lecithin may be adjusted or another
neutralizing agent may be added. The use of any unspecified neutralizer shall be recorded along with the
name and concentration.
6.9 Dilution buffer for shake-out bacterial suspension.
This buffer solution consists of 0,005 mol/l sodium dihydrogenphosphate containing 0,037 % sucrose.
pH
7,2 ± 0,2
6.10 Neutralizing solution.
The composition of the standard neutralizing solution shall be as follows.
Polysorbate 80 30 g
Egg yolk lecithin 3 g
Histidine hydrochloride 1 g
Meat or casein peptone 1 g
Sodium chloride (NaCl) 4,3 g
Monopotassium phosphate 3,6 g
Disodium phosphate dihydrate 7,2 g
Water 1 000 ml (final volume)
When sufficient neutralizing power cannot be achieved, the content of polysorbate 80 or lecithin may be
adjusted or another neutralizing agent may be added. The use of any unspecified neutralizer shall be
recorded along with the name and concentration.
6.11 Enumeration agar (EA).
Dehydrated yeast extract 2,5 g
Casein tryptone 5,0 g
Glucose 1,0 g
Agar 12 g to 18 g (depending on the gel strength of the product)
Water 1 000 ml (final volume)
pH after sterilization
7,2 ± 0,2
6.12 Agar for printing.
Agar 20 g
Water 1 000 ml (final volume)
6.13 Cryoprotective solution for bacterial species.
For freezing, a cryoprotective solution containing 150 g/l of glycerol or 100 g/l of dimethylsulfoxide shall be
used.
For solutions containing glycerol, prepare the nutritive solution and add 150 g of glycerol per litre prior to
sterilizing.
For solutions containing dimethylsulfoxide, sterilize the dimethylsulfoxide by means of a filtering system
equipped with a 0,22 µm membrane filter. Prepare the nutritive solution and, after sterilization, add 100 g of
dimethylsulfoxide per litre.
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NOTE Any commercially available product may be used as long as it is a cryoprotective solution or preserving
system that contains glycerol or dimethylsulfoxide and allows preservation of the strains in the same manner as the
specified solutions.
Reagents used in tests shall be of analytical quality and/or suited for microbiological purposes.
6.14 Stock solution of ATP standard reagent.
Adenosine-disodium 5’triphosphate trihydrate 59,7 mg
Water 1 000 ml (final volume)
After preparation, the solution shall be placed in a tightly sealed container and cryopreserved at a temperature
of −20 °C or lower. The solution shall be used no later than 6 months from the date of preparation.
6.15 Buffer solution for ATP luminescence reagent.
Tris(hydroxymethyl)amino methane 760 mg
Ethylenediamine disodium tetraacetate dihydrate 370 mg
Magnesium acetate tetrahydrate 800 mg
DL-dithiothreitol 8 mg
Water 250 ml (final volume)
pH
7,5 ± 0,2
This solution shall be used no later than 8 h after preparation.
6.16 ATP luminescence reagent.
Luciferase (EC: 1.13.12.7) 10 mg
D-luciferin 15 mg
Bovine serum albumin 60 mg
Buffer solution of 6.15 30 ml (final volume)
After dissolving, the reagent shall be kept at room temperature for a minimum of 15 min before use and shall
be used within 3 h of preparation.
6.17 ATP extracting reagent.
10 % aq. Benzalkonium chloride 1 ml
Water 9 ml
Use of any unspecified extracting agent and the recipe shall be recorded.
6.18 ATP eliminating agent.
−13
An agent to reduce the ATP in nutrient broth to less than 10 mol/l within 15 min.
Apyrase (EC: 3.6.1.5) 5 international units
Adenosine deaminase (EC: 3.5.1.4) 5 international units
0,005 mol/l buffer solution of sodium dihydrogenphoshate 10 ml (final volume)
containing 0,037 % sucrose
pH
7,2 ± 0,2
Use of any unspecified eliminating agent and the recipe shall be recorded.
6.19 SCDLP or other medium for preparing ATP reference solution.
SCDLP of 6.8 or other medium 10 ml
ATP eliminating agent of 6.18 1 ml
After mixing, maintain at 30 °C to 37 °C for 1 h to prevent microbiological contamination.
Next, transfer to a hot water bath at 70 °C to 90 °C for 1 h and cool down to room temperature.
Preserve the solution under refrigeration and use within 24 h.
An ATP reference solution should be prepared if the addition of neutralizing agents causes the ATP content in
−11
the shake-out solution to exceed 10 mol/l.
7 Reference strains
7.1 Strains
The following strains shall be used in all antibacterial activity tests:
⎯ Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, DSM 799, NBRC 13276 or NCIMB 9518;
⎯ Klebsiella pneumoniae ATCC 4352, CIP 104216, DSM 789, NBRC 13277 or NCIMB 10341.
NOTE ATCC is the American Type Culture Collection (USA); CIP is the Pasteur Institute Collection (France); DSM is
the German Collection of Microorganism and Cell Cultures (Germany); NBRC is the NITE Biological Resource Center
(Japan); and NCIMB is the National Collection of Industrial Bacteria (UK).
In lieu of the specified strains, equivalent bacteria strains obtained from agencies of the World Federation of
Culture Collection (WFCC) may be used by agreement between the interested parties. The strains used in the
test shall be stated in the test report together with their supply sources.
7.2 Storage of strains
7.2.1 General
The strains shall be stored in accordance with the supplier’s recommendations or EN 12353.
The identification and origin (culture collection) of the strains as well as the laboratory storage method shall be
recorded.
8 © ISO 2007 – All rights reserved

7.2.2 Ceramic bead method
Obtain a sample of the freeze-dried bacterial strain following the recommendations supplied with the culture
and resuspend in 5 ml of TSB (6.2). Obtain a sample of the suspension and isolate it in a Petri dish (5.17)
containing TSA (6.3). Incubate the cultures for 18 h to 24 h at 37 °C ± 2 °C.
After incubation, use the culture isolated in the Petri dish to verify the purity of the strain.
After verification, prepare the stock cultures.
Sample 0,7 ml of the broth culture and spread it over the surface of the Petri dish containing the TSA.
Incubate the culture on plates for 18 h to 24 h under the conditions specified for the strain in the standard.
Add 10 ml of cryoprotective solution (6.13) to the surface of the TSA plate culture and resuspend the cells in
the solution using a sterile glass spreader. Sample the suspended cells from the surface of the agar, dilute
them in 100 ml of cryoprotective solution and incubate for 30 min at 20 °C.
Using a pipette (5.15), sample 1 ml of the suspension and transfer it to a cryogenic vial (5.16) containing the
beads (5.19). Shake the vial in order to spread the suspended cells around the beads.
⎯ Where a cryoprotective solution containing dimethylsulfoxide is used, do not let it stand longer than 1 min
at ambient temperature.
⎯ Where a cryoprotective solution containing glycerol is used, let it stand for 30 min at 20 °C.
⎯ Withdraw the excess cryoprotective solution with a sterile pipette. Place the cryogenic vials in a freezer
(5.12) set at −70 °C or lower.
−6 −7
Prepare 10 and 10 dilutions of the suspension using the serial dilution method. Take a 1,0 ml sample of
each dilution and transfer it to separate Petri dishes. Add 12 ml to 15 ml of nutritive solution, cooled down to
45 °C ± 1 °C. Incubate for 18 h to 24 h under the conditions specified for the strain. Enumerate the plate
cultures and confirm that the suspension contains less than 5 × 10 CFU/ml.
Store the cryogenic vials in a freezer at a temperature below −70 °C.
7.2.3 Glycerol suspension method
Inoculate a 15 ml culture tube containing 5 ml of appropriate medium with a freshly grown isolated colony.
Incubate at 37 °C until the culture is in the late log or stationary phase (usually 5 h to overnight).
For each strain to be stored below −70 °C, for the archives, prepare a sterile, labelled cryogenic vial. Place
225 µl of sterile 80 % glycerol in a cryogenic vial. Add 1,0 ml of the bacterial culture (frozen stock shall be
15 % glycerol). Mix well using the vortex mixer (5.4) and store in a tube at −70 °C or lower.
For each strain to be stored at −20 °C, as liquid glycerol working stock, pipette equal volumes of 80 % glycerol
and bacterial culture into a labelled polypropylene tube. Mix the contents well to avoid formation of ice crystals
that will decrease the viability of the cells. Place the tube in a freezer at −20 °C. Check the viability of the cells
after 1 week if possible.
To recover a strain from the below −70 °C glycerol stock, use a sterile toothpick to scrape pieces of the solid
substance, then streak the cells onto the appropriate medium. Do not thaw the frozen stock because each
freeze-thaw cycle will result in a 50 % loss in cell viability.
To use the −20 °C working stock, pipette 50 µl to 100 µl as inoculum for a 5 ml overnight culture.
7.2.4 Remarks
The identity of the strain shall be verified in accordance with commonly accepted identification methods.
For each microbial strain, the following information shall be recorded:
a) the name of the national culture collection from which the freeze-dried strain was obtained;
b) the taxonomic name and reference number of the freeze-dried strain;
c) the batch number of the freeze-dried sample obtained from the culture collection;
d) the date of the resuscitated freeze-dried sample;
e) the date of prepared stock culture;
f) the stock culture laboratory code.
Details of the methods used for verifying the purity and identity of the strain and dates on which the
verifications were conducted, and the results obtained, shall also be recorded.
8 Quantitative measurement
8.1 Plate count method
8.1.1 Take 1 ml of the inoculum using a pipette (5.15), add it to a test tube containing 9,0 ml ± 0,1 ml of the
nutrient broth (6.5) or the peptone-salt solution (6.6) and shake well.
8.1.2 Take 1 ml of this solution using a new pipette, add it to a separate test tube containing 9,0 ml ± 0,1 ml
of the medium and shake well. Repeat the procedure successively and prepare a dilution series so that the
dilutions are undertaken ten times in total. Ensure that 1 ml of each dilution is pipetted into two Petri dishes
each.
8.1.3 Warm approximately 15 ml of EA (6.11) to a temperature of 45 °C to 46 °C using a water bath (5.3),
add to the dishes and mix well. Maintain at room temperature and, when the medium solidifies, turn the dishes
upside down and incubate at 37 °C ± 2 °C for 24 h to 48 h.
8.1.4 After incubation, count the number of colonies on the Petri dishes of dilution series on which 30 CFU
to 300 CFU have appeared, and obtain the bacteria concentration in the solution according to the following
formula:
c = Z ⋅ R
B
where
c is the bacteria concentration, in Colony Forming Units per millilitre (CFU/ml);
B
Z is the average value, in Colony Forming Units (CFU), in the two Petri dishes;
R is the dilution rate.
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8.2 Luminescence method
8.2.1 Calibration curve formula
8.2.1.1 Take the standard ATP reagent (6.14), and the physiological saline (6.7), the SCDLP medium
–8
(6.8) or another suitable medium, and prepare three separate solutions diluted by 2 × 10 mol/l,
–9 –10
2 × 10 mol/l and 2 × 10 mol/l, respectively.
8.2.1.2 Pour 0,1 ml of each solution specified above into three separate test tubes. Add 0,9 ml of the
dilution buffer (6.9) to each tube and shake amply. Pour 0,1 ml of each into three separate test tubes and
designate them as samples for measuring the diluted standard reagent.
8.2.1.3 Pour 0,1 ml of physiological saline (6.7), SCDLP (6.8) or other suitable medium, 0,8 ml of the
dilution buffer (6.9), and 0,1 ml of ATP eliminating agent (6.18) into a plastic test tube. Shake amply and pour
0,1 ml portions into three separate test tubes. Let them stand for 5 min to 30 min and designate them as
samples for measuring the blank.
8.2.1.4 Add to a test tube containing the sample for measuring the blank, 0,1 ml of ATP extracting
reagent (6.17) and shake. Add 0,1 ml of ATP luminescence reagent (6.16), shake again and immediately
apply a luminescence photometer (5.9) to determine the quantities of luminescence.
8.2.1.5 Add to the samples for measuring the diluted standard reagent, 0,1 ml portions of ATP extracting
reagent (6.17) in order, starting from the lowest concentration, and shake. Then add 0,1 ml of ATP
luminescence reagent (6.16), shake again and immediately apply a luminescence photometer (5.9) to
determine the quantities of luminescence.
8.2.1.6 Divide the ATP concentration by the average of the quantity of luminescence obtained from the
–8 –9 –10
measurement of diluted standard reagent (2 × 10 mol/l, 2 × 10 mol/l and 2 × 10 mol/l), and record this
value as the average value coefficient A.
8.2.1.7 Obtain coefficient B by substituting coefficient A, and c = 0 into the following calibration curve
ATP
formula:
c = AX + B
ATP
where
c is the ATP concentration, in moles per litre (mol/l);
ATP
X  is the quantity of luminescence, in Relative Light Units (RLU).
NOTE The correlation coefficient between c and X is R W 0,9 and the confidence level is > 0,95.
ATP
8.2.2 ATP concentration of the bacterial suspension
8.2.2.1 Prepare one test tube for the ATP eliminating treatment and three test tubes for measuring.
8.2.2.2 Pour 0,1 ml of the shake-out bacterial suspension, 0,8 ml of the dilution buffer (6.9) and 0,1 ml of
the ATP eliminating agent (6.18) into the test tube designated for the ATP eliminating treatment and shake
amply. Pour 0,1 ml portions of the solution into the three test tubes designated for measuring and let them
stand for 5 min to 30 min.
8.2.2.3 Add 0,1 ml of the ATP extracting reagent (6.17) to each measuring test tube and shake amply.
Add 0,1 ml of the ATP luminescence reagent (6.16), shake again and immediately apply a luminescence
photometer (5.9) to determine the quantities of luminescence.
8.2.2.4 Obtain the ATP concentration, c , according to the formula specified in 8.2.1.7 and obtain the
ATP
concentration of ATP in the shake-out bacterial suspension according to the following formula:
c = c /1 000
ATP’ ATP
where c is the ATP concentration, in moles per millitre (mol/ml), in the shake-out bacterial suspension.
ATP’
9 Shaking method
9.1 Shaking by vortex mixer
Press the bottom portion of the test tubes or bottles on the plate or rubber holder of the vortex mixer (5.4) and
mix for 5 s × 5 cycles.
9.2 Shaking by hand
Take the test tube or bottle by hand and shake in an arc of approximately 30 cm for 30 s.
9.3 Shaking
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20743
Première édition
2007-06-01
Textiles — Détermination de l'activité
antibactérienne des produits finis
antibactériens
Textiles — Determination of antibacterial activity of antibacterial finished
products
Numéro de référence
©
ISO 2007
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Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 2
4 Mesures de sécurité . 3
5 Appareillage . 3
6 Réactifs et milieux de culture . 4
7 Souches de référence. 9
7.1 Souches . 9
7.2 Conservation des souches . 10
8 Mesurage quantitatif. 11
8.1 Méthode par dénombrement . 11
8.2 Méthode par luminescence. 12
9 Méthode d'agitation . 13
9.1 Agitation par agitateur de type vortex. 13
9.2 Agitation manuelle. 13
9.3 Agitation par machine Stomacher . 13
10 Modes opératoires d'essai. 13
10.1 Méthode d'absorption . 13
10.2 Méthode par transfert. 19
10.3 Méthode par impression . 23
Bibliographie . 30

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 20743 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 38, Textiles.
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Introduction
Ces méthodes d'essai ont été élaborées en vue de répondre au besoin important de disposer d'une Norme
internationale permettant de déterminer l'activité antibactérienne des produits textiles finis antibactériens.

NORME INTERNATIONALE ISO 20743:2007(F)

Textiles — Détermination de l'activité antibactérienne des
produits finis antibactériens
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie des méthodes d'essai quantitatives permettant de déterminer
l'activité antibactérienne des produits textiles finis antibactériens, y compris les non-tissés.
La présente Norme internationale s'applique à tous les produits textiles, y compris le tissu, le rembourrage, le
fil et les matériaux utilisés dans la confection de vêtements, de tissus d'ameublements et d'articles divers,
quel que soit le type d'agent antibactérien utilisé (organique, inorganique, naturel ou synthétique) ou quelle
que soit la méthode d'application (intégration, post-traitement ou greffage).
Tenant compte de l'application prévue et de l'environnement dans lequel le produit textile est destiné à être
utilisé, l'utilisateur peut choisir la plus adaptée des trois méthodes suivantes de détermination de l'activité
antibactérienne:
a) méthode par absorption (méthode d'évaluation dans laquelle la suspension bactérienne à l'essai est
ensemencée directement sur des échantillons);
b) méthode par transfert (méthode d'évaluation dans laquelle les bactéries soumises à l'essai sont placées
sur une boîte de milieu gélosé, puis transférées sur des échantillons);
c) méthode par impression (méthode d'évaluation dans laquelle les bactéries soumises à l'essai sont
placées sur un filtre, puis imprimées sur des échantillons).
La technique de dénombrement et la méthode de mesure de luminescence ATP (triphosphate d'adénosine)
sont également spécifiées pour le dénombrement des bactéries.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 6330, Textile — Méthodes de lavage et de séchage domestiques en vue des essais des textiles
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
textile
tissu
terme générique employé pour désigner les surfaces textiles, les tissus, les tricots, etc., formés par
l'entrecroisement de matériaux textiles ayant une certaine cohésion et qui sont généralement destinés à la
confection de vêtements et d'ameublement
NOTE Ce terme inclut souvent certains types de non-tissés.
3.2
tissu témoin
tissu utilisé pour valider les conditions de croissance des bactéries soumises à l'essai
NOTE Tissu identique à celui devant être soumis à l'essai mais n'ayant subi aucun traitement antibactérien. Si cela
n'est pas possible, tissu de coton 100 % sans azurage optique ni autre apprêt.
3.3
agent antibactérien
produit conçu pour empêcher ou atténuer la croissance des bactéries, pour réduire le nombre de bactéries ou
pour tuer les bactéries
3.4
apprêt antibactérien
traitement conçu pour empêcher ou atténuer la croissance des bactéries, pour réduire le nombre de bactéries
ou pour tuer les bactéries
3.5
activité antibactérienne
activité d'un apprêt antibactérien servant à empêcher ou à atténuer la croissance des bactéries, à réduire le
nombre de bactéries ou à tuer les bactéries
3.6
méthode par dénombrement
méthode dans laquelle le nombre de bactéries présent après incubation est calculé en dénombrant le nombre
de colonies selon une méthode de dilution au dixième
NOTE Les résultats sont exprimés en «UFC (unité formant colonie)».
3.7
méthode par luminescence
méthode dans laquelle la teneur en triphosphate d'adénosine (ATP) présente dans les cellules bactériennes
est mesurée
NOTE Les résultats sont exprimés en «mols d'ATP».
3.8
neutralisant
agents chimiques utilisés pour désactiver, neutraliser ou étouffer les propriétés antibactériennes des agents
antibactériens
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4 Mesures de sécurité
Les méthodes d'essai spécifiées dans le présent document nécessitent l'utilisation de bactéries.
Il convient que ces essais soient réalisés par des personnes formées et expérimentées dans la mise en
œuvre des techniques microbiologiques.
Il convient d'observer les mesures de sécurité appropriées en prenant en considération la réglementation
propre à chaque pays.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Spectrophotomètre, capable de mesurer à une longueur d'onde comprise entre 620 nm et 660 nm, ou
néphélomètre de McFarland.
5.2 Incubateur, capables de maintenir une température constante de (37 ± 2) °C.
5.3 Bains-marie, capables l'un de maintenir une température constante de (46 ± 2) °C, l'autre une
température entre 70 °C et 90 °C.
5.4 Agitateur, produisant une agitation de type vortex.
5.5 Machine Stomacher, capable de vitesses comprises entre 6 coups/s et 8 coups/s, munie des sacs
jetables correspondants.
5.6 Paillasse propre, pour l'essai microbien.
5.7 Machine à laver, conforme aux spécifications de l'ISO 6330.
5.8 Chambre d'humidité, chambre tropicale ou autre enceinte capable de maintenir des conditions
atmosphériques à humidité élevée.
5.9 Photomètre de luminescence, capable de mesurer l'ATP à une concentration comprise entre
–13 –7
10 mol/l et 10 mol/l à une longueur d'onde comprise entre 300 nm et 650 nm avec un réactif de
mesurage de la luminescence.
5.10 Appareil d'impression, capable d'appliquer une charge de 4 N sur une éprouvette et de faire tourner
l'éprouvette de 180° dans un sens pendant 3,0 s.
5.11 Réfrigérateur, capable de maintenir une température comprise entre 2 °C et 8 °C.
5.12 Congélateurs, pouvant être réglés l'un à une température inférieure à −70 °C et l'autre à une
température inférieure à −20 °C.
5.13 Balance, ayant une exactitude de mesurage de 0,01 g.
5.14 Appareil de filtration, constitué d'un récipient supérieur muni d'une membrane filtrante et d'un
récipient inférieur muni d'un orifice d'aspiration.
5.15 Pipette, possédant le volume le mieux adapté pour chaque utilisation, munie d'un embout en verre ou
en matière plastique et avec une tolérance inférieure ou égale à 0,5 %.
5.16 Ampoules, flacons en verre de capacité 30 ml, à ouverture vissée, munis d'un joint en PTFE ou en
silicone et d'un capuchon en polypropylène, en polycarbonate ou autre matériau approprié.
5.17 Boîtes de Petri, stérilisées et réalisées en verre ou en matière plastique, dont le diamètre est compris
entre 90 mm et 100 mm et entre 55 mm et 60 mm.
5.18 Tige en verre, de 18 mm de diamètre environ.
5.19 Régulateurs d'ébullition (billes en verre), dont le diamètre est compris entre 3 mm et 4 mm.
5.20 Fiole conique, d'une capacité de 100 ml.
5.21 Gabarit de découpage, réalisé en un matériau stérilisable (acier inoxydable ou verre) de (3,8 ± 0,1) cm
de diamètre.
5.22 Sachets plastiques jetables, appropriés pour contenir des aliments, à utiliser pour la conservation
d'échantillons.
5.23 Brucelles, réalisées en un matériau stérilisable.
5.24 Cylindre en acier inoxydable, d'une masse de (200 ± 10) g et d'un diamètre de (3,5 ± 0,1) cm.
5.25 Corbeille en fil métallique, pour l'autoclavage.
5.26 Feuille d'aluminium.
6 Réactifs et milieux de culture
Les réactifs utilisés lors des essais doivent être de qualité analytique et/ou adaptés à des fins
microbiologiques.
Les produits déshydratés disponibles dans le commerce sont préconisés pour la préparation des milieux de
culture. Il convient de suivre rigoureusement les instructions du fabricant relatives à la préparation de ces
produits.
6.1 Eau.
L'eau utilisée lors des essais doit être de qualité analytique destinée à la préparation des milieux
microbiologiques; cette eau est fraîchement distillée et/ou désionisée et/ou ultrafiltrée et/ou filtrée par osmose
inverse. Elle doit être exempte de toute substance toxique ou de substance inhibitrice de bactéries.
6.2 Bouillon de soja de tryptone (TSB).
Cette solution doit être utilisée pour la revivification des souches bactériennes lyophilisées.
Tryptone, digestat pancréatique de caséine 15 g
Peptone de soja, digestion papaïnique de soja 5 g
Chlorure de sodium (NaCl) 5 g
Eau 1 000 ml (volume final)
pH après stérilisation
7,2 ± 0,2
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6.3 Gélose au soja de tryptone (TSA).
Tryptone, digestat pancréatique de caséine 15 g
Peptone de soja, digestion papaïnique de soja 5 g
Chlorure de sodium (NaCl) 5 g
Gélose 15 g
Eau 1 000 ml (volume final)
pH après stérilisation
7,2 ± 0,2
6.4 Gélose pour transfert.
0,75 g
Tryptone, digestat pancréatique de caséine
Peptone de soja, digestion papaïnique de soja 0,25 g
Chlorure de sodium (NaCl) 5 g
Gélose 15 g
Eau 1 000 ml (volume final)
pH après stérilisation 7,2 ± 0,2
6.5 Bouillon nutritif.
Extrait de bœuf 3 g
Peptone 5 g
Eau 1 000 ml (volume final)
pH après stérilisation
6,9 ± 0,2
6.6 Eau saline peptonée.
Tryptone, digestat pancréatique de caséine 1 g
Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g
Eau 1 000 ml (volume final)
pH après stérilisation 6,9 ± 0,2
6.7 Solution physiologique salée.
Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g
Eau 1 000 ml (volume final)
6.8 Milieu de culture SCDLP.
Peptone, digestat de caséine 17 g
Peptone, digestat de soja 3 g
Chlorure de sodium (NaCl) 5 g
Dihydrogénophosphate de potassium 2,5 g
Glucose 2,5 g
Lécithine 1 g
Mono-oléate polyoxyéthylénique (20) de sorbitanne 7 g
Eau 1 000 ml (volume final)
pH après stérilisation
7,2 ± 0,2
Dans le cas où le pouvoir neutralisant est insuffisant, la teneur en mono-oléate polyoxyéthylénique (20) de
sorbitanne ou en lécithine peut être ajustée ou un autre neutralisant peut être ajouté. L'utilisation d'un
neutralisant non spécifié quelconque doit être consignée dans le rapport avec son nom et sa concentration.
6.9 Tampon de dilution pour la suspension bactérienne d'extraction.
Cette solution tampon est composée de 0,005 mol/l de dihydrogénophosphate de sodium renfermant 0,037 %
de saccharose.
pH
7,2 ± 0,2
6.10 Solution neutralisante.
La composition de la solution neutralisante standard doit être la suivante.
Mono-oléate polyoxyéthylénique (20) de sorbitanne 30 g
Lécithine de jaune d'œuf 3 g
Hydrochlorure de histidine 1 g
Peptone de viande ou de caséine 1 g
Chlorure de sodium (NaCl) 4,3 g
Phosphate monopotassique 3,6 g
Phosphate disodique dihydraté 7,2 g
Eau 1 000 ml (volume final)
Lorsque le pouvoir neutralisant est insuffisant, la teneur en mono-oléate polyoxyéthylénique (20) de
sorbitanne ou en lécithine peut être ajustée ou un autre neutralisant peut être ajouté. L'utilisation d'un
neutralisant non spécifié quelconque doit être consignée dans le rapport avec le nom et la concentration.
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6.11 Gélose de dénombrement.
Extrait de levure déshydraté 2,5 g
Peptone trypsique de caséine 5,0 g
Glucose 1,0 g
Gélose 12 g à 18 g (en fonction du pouvoir gélifiant du produit)
Eau 1 000 ml (volume final)
pH après stérilisation
7,2 ± 0,2
6.12 Gélose pour impression.
Gélose 20 g
Eau 1 000 ml (volume final)
6.13 Solution cryoprotectrice pour espèces bactériennes.
Pour la congélation, une solution cryoprotectrice contenant 150 g/l de glycérol ou 100 g/l de sulfoxyde
diméthylique doit être utilisée.
Pour les solutions contenant du glycérol, préparer la solution nutritive et ajouter 150 g de glycérol par litre
avant stérilisation.
Pour les solutions contenant du sulfoxyde diméthylique, stériliser le sulfoxyde diméthylique au moyen d'un
système de filtration muni d'une membrane filtrante de porosité 0,22 µm. Préparer la solution nutritive et,
après stérilisation, ajouter 100 g de sulfoxyde diméthylique par litre.
NOTE Tout produit disponible dans le commerce peut être utilisé à condition d'être une solution cryoprotectrice ou un
système de conservation qui contient du glycérol ou du sulfoxyde diméthylique et de permettre la conservation des
souches de la même manière que les solutions spécifiées.
Les réactifs utilisés lors des essais doivent être de qualité analytique et/ou adaptés à des fins
microbiologiques.
6.14 Solution mère du réactif standard d'ATP.
Adénosine 5'triphosphate disodique trihydraté 59,7 mg
Eau 1 000 ml (volume final)
Après préparation, la solution doit être placée dans un récipient fermé hermétiquement et cryoconservée à
une température égale ou inférieure à −20 °C. La solution doit être utilisée dans les 6 mois suivant la date de
préparation.
6.15 Solution tampon pour le réactif de luminescence ATP.
Méthane (hydroxyméthylique) de 760 mg
bis-(2-hydoxyethyl)-amino-tris
Éthylènediamine-N, N, N', acide N'-tétraacétique, 370 mg
sel disodique, dihydraté
Acétate de magnésium tétrahydraté 800 mg
DL-dithiothreitol 8 mg
Eau 250 ml (volume final)
pH
7,5 ± 0,2
Cette solution doit être utilisée dans les 8 h suivant la préparation.
6.16 Réactif de luminescence ATP.
Luciférase (EC: 1.13.12.7) 10 mg
D-luciferin 15 mg
Albumine de sérum de bœuf 60 mg
Solution tampon de 6.15 30 ml (volume final)
Après dissolution, le réactif doit être conservé à température ambiante pendant une durée minimale de 15 min
avant utilisation et doit être utilisé dans les 3 h suivant la préparation.
6.17 Réactif d'extraction d'ATP.
Solution aqueuse à 10 % de chlorure de 1 ml
benzalkonium
Eau 9 ml
L'utilisation d'un agent d'extraction non spécifié quelconque et sa formulation doivent être consignées.
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6.18 Agent d'élimination d'ATP.
–13
Agent permettant de réduire la teneur en ATP dans le bouillon nutritif à moins de 10 mol/l en 15 min.
Précurseur d'apyrase (EC: 3.6.1.5) 5 unités internationales
Déaminase d'adénosine (EC: 3.5.1.4) 5 unités internationales
Solution tampon à 0,005 mol/l de 10 ml (volume final)
dihydrogénophosphate de sodium renfermant
0,037 % de saccharose
pH 7,2 ± 0,2
L'utilisation d'un agent d'élimination non spécifié quelconque et sa formulation doivent être consignées.
6.19 Milieu SCDLP ou autre milieu pour la préparation de la solution de référence d'ATP.
Milieu SCDLP de 6.8 ou autre milieu 10 ml
Agent d'élimination d'ATP de 6.18 1 ml
Après mélange, maintenir à une température comprise entre 30 °C et 37 °C pendant 1 h afin d'empêcher la
contamination microbiologique.
Ensuite, transférer dans un bain-marie chauffé à une température comprise entre 70 °C et 90 °C pendant 1 h
et refroidir à la température ambiante.
Conserver la solution au réfrigérateur et l'utiliser dans les 24 h.
Il convient de préparer une solution de référence d'ATP si l'ajout d'agents neutralisants entraîne un
–11
dépassement au-delà de 10 mol/l de la teneur en ATP dans la solution d'extraction.
7 Souches de référence
7.1 Souches
Les souches suivantes doivent être utilisées dans tous les essais d'activité antibactérienne:
⎯ Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, DSM 799, NBRC 13276 ou NCIMB 9518;
⎯ Klebsiella pneumoniae ATCC 4352, CIP 104216, DSM 789, NBRC 13277 ou NCIMB 10341.
NOTE ATCC est le sigle de American Type Culture Collection (États-Unis), CIP est le sigle de la Collection de
l'Institut Pasteur (France), DSM est le sigle de la Collection de micro-organismes et de cultures cellulaires (Allemagne),
NBRC est le sigle du Centre biologique de Ressources du NITE (Japon), et NCIMB est le sigle de la National Collection of
Industrial Bacteria (Royaume-Uni).
Les souches opératrices spécifiées peuvent être remplacées par des souches de bactéries équivalentes
obtenues auprès d'agences de la Fédération mondiale pour les collections de cultures (WFCC), elles peuvent
être utilisées d'un commun accord entre les parties intéressées. Les souches utilisées lors de l'essai doivent
être indiquées dans le rapport d'essai avec leur source d'approvisionnement respective.
7.2 Conservation des souches
7.2.1 Généralités
Les souches doivent être conservées conformément aux recommandations du fournisseur ou selon
l'EN 12353.
L'identification et l'origine (collection de cultures) des souches, ainsi que la méthode de conservation de
laboratoire, doivent être consignées.
7.2.2 Méthode des billes en céramique
Obtenir un échantillon de la souche bactérienne lyophilisée conformément aux recommandations fournies
avec la culture et le remettre en suspension dans 5 ml du bouillon de soja de tryptone (TSB) (6.2). Obtenir un
échantillon de la suspension et l'isoler dans une boîte de Petri (5.17) contenant de la gélose au soja de
tryptone (TSA) (6.3). Incuber les cultures pendant 18 h à 24 h à (37 ± 2) °C.
Après incubation, utiliser la culture isolée dans la boîte de Petri pour vérifier la pureté de la souche.
Après vérification, préparer les cultures mères.
Prélever 0,7 ml de la culture en bouillon et l'étaler sur la surface de la boîte de Petri contenant la TSA. Incuber
la culture sur des plaques pendant une durée comprise entre 18 h et 24 h dans les conditions spécifiées dans
la norme concernant la souche.
Ajouter 10 ml de solution cryoprotectrice (6.13) sur la surface de la culture sur plaque TSA et remettre en
suspension les cellules en se servant d'un étaleur en verre stérilisé. Prélever les cellules en suspension de la
surface de la gélose, les diluer dans 100 ml de solution cryoprotectrice et les incuber pendant 30 min à 20 °C.
À l'aide d'une pipette (5.15), prélever 1 ml de la suspension et le transférer dans un flacon cryogénique (5.16)
contenant les billes (5.19). Agiter le flacon afin de répandre les cellules en suspension autour des billes.
⎯ Lors de l'utilisation d'une solution cryoprotectrice renfermant du diméthylsulfoxyde, ne pas laisser reposer
au-delà de 1 min à température ambiante.
⎯ Lors de l'utilisation d'une solution cryoprotectrice renfermant du glycérol, laisser reposer pendant 30 min
à 20 °C.
⎯ Retirer l'excès de solution cryoprotectrice avec une pipette stérile. Placer les flacons cryogéniques dans
un congélateur (5.12) réglé à une température égale ou inférieure à −70 °C.
–6 –7
Préparer des dilutions à 10 et 10 de la suspension en utilisant la méthode de dilution en série. Prélever un
échantillon de 1,0 ml de chaque dilution et le transférer dans des boîtes de Petri séparées. Ajouter 12 ml
à 15 ml de solution nutritive, refroidie à (45 ± 1) °C. Incuber pendant 18 h à 24 h dans les conditions
spécifiées pour la souche. Dénombrer les cultures sur plaque et confirmer que la suspension contient moins
de 5 × 10 UFC/ml.
Conserver les ampoules cryogéniques dans un congélateur à une température inférieure à −70 °C.
7.2.3 Méthode par suspension du glycérol
Ensemencer un tube à culture de 15 ml contenant 5 ml de milieu approprié avec une colonie isolée
fraîchement cultivée. Incuber à 37 °C jusqu'à ce que la culture se trouve dans la phase en retard de notation
ou la phase stationnaire (généralement entre 5 h et toute la nuit).
Pour chaque souche à conserver à une température inférieure à −70 °C, préparer pour les archives une
ampoule cryogénique stérile étiquetée. Introduire 225 µl de glycérol stérile à 80 % dans l'ampoule
cryogénique. Ajouter 1,0 ml de culture bactérienne (la solution mère congelée doit être du glycérol à 15 %).
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Bien mélanger à l'aide d'un agitateur de type vortex (5.4) et conserver dans un tube à une température égale
ou inférieure à −70 °C.
Pour chaque souche à conserver à −20 °C, en tant que solution mère de travail de glycérol liquide, pipetter
des volumes équivalents de glycérol à 80 % et de culture bactérienne dans un tube en polypropylène étiqueté.
Bien mélanger le contenu afin d'éviter la formation de cristaux de glace qui diminueraient la viabilité des
cellules. Placer le tube dans un congélateur à −20 °C. Si possible, vérifier la viabilité des cellules après une
semaine.
Pour récupérer une souche à partir de la solution mère de glycérol congelée à une température inférieure à
−70 °C, utiliser un cure-dent stérile pour gratter des morceaux de la substance solide, puis ensemencer en
stries les cellules sur le milieu approprié. Ne pas dégeler la solution mère congelée car chaque cycle de
gel/dégel entraînerait une perte de viabilité des cellules de 50 %.
Pour utiliser la solution mère de travail à −20 °C, pipeter entre 50 µl et 100 µl comme inoculum pour une
culture de 5 ml pendant une nuit.
7.2.4 Remarques
L'identité de la souche doit être vérifiée conformément aux méthodes d'identification communément admises.
Pour chaque souche microbienne, les informations suivantes doivent être consignées:
a) le nom de la collection nationale de cultures d'où la souche lyophilisée a été obtenue;
b) le nom taxinomique et le numéro de référence de la souche lyophilisée;
c) le numéro du lot de l'échantillon lyophilisé obtenu de la souchothèque (collection de cultures);
d) la date de revivification de l'échantillon lyophilisé;
e) la date de préparation de la culture mère;
f) le code laboratoire de la culture mère.
Les détails des méthodes utilisées pour vérifier la pureté et l'identité de la souche et les dates auxquelles les
vérifications ont été effectuées, ainsi que les résultats obtenus, doivent être consignés.
8 Mesurage quantitatif
8.1 Méthode par dénombrement
8.1.1 À l'aide d'une pipette (5.15), prélever 1 ml de l'inoculum, l'ajouter à un tube à essai contenant
(9,0 ± 0,1) ml du bouillon nutritif (6.5) ou de la solution d'eau saline peptonée (6.6) et bien agiter.
8.1.2 À l'aide d'une nouvelle pipette, prélever 1 ml de cette solution, l'introduire dans un tube à essai séparé
contenant (9,0 ± 0,1) ml du milieu et bien agiter. Répéter successivement les opérations et préparer des
séries de dilutions de sorte que les dilutions soient réalisées dix fois au total. S'assurer que 1 ml de chaque
dilution est pipeté dans deux boîtes de Petri.
8.1.3 Réchauffer dans un bain-marie (5.3) environ 15 ml de la gélose de dénombrement (6.11) à une
température comprise entre 45 °C et 46 °C, ajouter aux boîtes et bien mélanger. Maintenir à température
ambiante et, lorsque le milieu se solidifie, retourner les boîtes et incuber à (37 ± 2) °C pendant 24 h à 48 h.
8.1.4 Après incubation, compter le nombre de colonies présent sur les boîtes de Petri de dilutions en série
sur lesquelles est apparu un nombre d'unités formant colonie compris entre 30 UFC et 300 UFC et déterminer
la concentration en bactéries dans la solution à l'aide de la formule suivante:
c = Z · R
B
où
c est la concentration en bactéries, en unités formant colonie par millilitre (UFC/ml);
B
Z est la valeur moyenne dans les deux boîtes de Petri, en unités formant colonie (UFC);
R est le taux de dilution.
8.2 Méthode par luminescence
8.2.1 Formule de la courbe d'étalonnage
8.2.1.1 Prendre le réactif standard d'ATP (6.14) et la solution physiologique salée (6.7), le milieu de
culture SCDLP (6.8) ou un autre milieu approprié, puis préparer trois solutions séparées; diluées
–8 –9 –10
respectivement à 2 × 10 mol/l, 2 × 10 mol/l et 2 × 10 mol/l.
8.2.1.2 Verser 0,1 ml de chaque solution spécifiée ci-dessus dans trois tubes à essai distincts.
Ajouter 0,9 ml du tampon de dilution (6.9) dans chaque tube et bien agiter. Verser 0,1 ml de chaque solution
dans trois tubes à essai distincts et les désigner comme échantillons destinés au mesurage du réactif
standard dilué.
8.2.1.3 Verser 0,1 ml de la solution physiologique salée (6.7), du milieu de culture SCDLP (6.8) ou d'un
autre milieu approprié, 0,8 ml du tampon de dilution (6.9) et 0,1 ml d'agent d'élimination d'ATP (6.18) dans un
tube à essai en matière plastique. Bien agiter et verser des parties aliquotes de 0,1 ml dans trois tubes à
essai distincts. Laisser reposer pendant 5 min à 30 min et les désigner comme échantillons pour mesurage du
blanc.
8.2.1.4 Ajouter au tube d'essai contenant l'échantillon pour le mesurage du blanc 0,1 ml de réactif
d'extraction d'ATP (6.17) et agiter. Ajouter 0,1 ml de réactif de luminescence d'ATP (6.16), agiter de nouveau
et recourir immédiatement à un photomètre de luminescence (5.9) pour déterminer les quantités de
luminescence.
8.2.1.5 Ajouter aux échantillons de mesurage du réactif standard dilué des parties aliquotes de 0,1 ml du
réactif d'extraction d'ATP (6.17) en partant de la concentration la plus faible et agiter. Ajouter ensuite 0,1 ml
de réactif de luminescence d'ATP (6.16), agiter de nouveau et recourir immédiatement à un photomètre de
luminescence (5.9) pour déterminer les quantités de luminescence.
8.2.1.6 Diviser la concentration en ATP par la moyenne de la quantité de luminescence obtenue lors du
–8 –9 –10
mesurage du réactif standard dilué (2 × 10 mol/l, 2 × 10 mol/l et 2 × 10 mol/l) et enregistrer cette valeur
comme la valeur moyenne du coefficient A.
8.2.1.7 Déterminer le coefficient B à partir de la valeur de A, pour c = 0, dans la formule de courbe
ATP
d'étalonnage suivante:
c = AX + B
ATP
où
c est la concentration en ATP, en moles par litre (mol/l);
ATP
X est la quantité de luminescence, en unités de lumière relative (RLU).
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NOTE Le coefficient de corrélation entre c et X est R W 0,9, et le niveau de confiance est > 0,95.
ATP
8.2.2 Concentration en ATP de la suspension bactérienne
8.2.2.1 Préparer un tube à essai pour le traitement d'élimination d'ATP, et trois tubes à essai pour le
mesurage.
8.2.2.2 Verser 0,1 ml de la suspension bactérienne d'extraction, 0,8 ml du tampon de dilution (6.9) et
0,1 ml d'agent d'élimination d'ATP (6.18) dans le tube à essai désigné pour le traitement éliminatoire d'ATP et
bien agiter. Verser des parties aliquotes de 0,1 ml de la solution dans les trois tubes à essai désignés pour le
mesurage et laisser reposer pendant 5 min à 30 min.
8.2.2.3 Ajouter 0,1 ml de réactif d'extraction d'ATP (6.17) à chaque tube à essai de mesurage et bien
agiter. Ajouter 0,1 ml de réactif de luminescence d'ATP (6.16), agiter de nouveau et recourir immédiatement à
un photomètre de luminescence (5.9) pour déterminer les quantités de luminescence.
8.2.2.4 Déterminer la concentration en ATP, c , selon la formule spécifiée en 8.2.1.7 ainsi que la
ATP
concentration en ATP dans la suspension bactérienne d'extraction selon la formule suivante:
c = c /1 000
ATP' ATP
où c est la concentration en ATP dans la suspension bactérienne d'extraction, en moles par millilitre
ATP
(mol/ml).
9 Méthode d'agitation
9.1 Agitation par agitateur de type vortex
Insérer les tubes à essai ou les flacons au niveau de la plaque ou du support en caoutchouc de l'agitateur de
type vortex (5.4) en exerçant une pression sur la partie inférieure et mélanger pendant 5 s × 5 cycles.
9.2 Agitation manuelle
Prendre le tube à essai ou le flacon dans la main et agiter selon un mouvement de balancier en décrivant un
arc d'environ 30 cm pendant 30 s.
9.3 Agitation par machine Stomacher
Placer le sachet jetable désigné (5.22) dans la machine Stomacher (5.5), puis faire fonctionner celle-ci
pendant 1 min sur chaque face du sac.
10 Modes opératoires d'essai
10.1 Méthode d'absorption
10.1.1 Incubation et préparation de l'inoculum d'essai
10.1.1.1 Incubation A
Récupérer les bactéries mères conservées dans le récipient de stockage à l'aide d'un fil à ensemencer.
Ensemencer en stries sur la boîte de gélose de dénombrement (6.11) et incuber à (37 ± 2) °C pendant 24 h à
48 h.
NOTE La boîte est maintenue à une température comprise entre 5 °C et 10 °C et est utilisée dans un délai d'une
semaine après la date de préparation.
10.1.1.2 Incubation B
Introduire 20 ml du bouillon nutritif (6.5) ou du bouillon de soja de tryptone (TSB) (6.2) dans une fiole conique
de capacité 100 ml. À l'aide d'un fil à ensemencer, recueillir une colonie dans l'incubation A spécifiée en
10.1.1.1 et l'ensemencer dans le bouillon. Incuber dans les conditions suivantes:
Température: (37 ± 2) °C
–1
Vitesse d'agitation: 110 min et 3 cm de largeur
Durée d'incubation: 18 h à 24 h
10.1.1.3 Incubation C
Introduire 20 ml du bouillon nutritif (6.5) ou du bouillon de soja de tryptone (TSB) (6.2) dans une fiole conique
de capacité 100 ml. Ajouter à la fiole 0,4 ml de l'inoculum provenant de l'incubation B spécifiée en 10.1.1.2 qui
8 8
contient une concentration en bactéries entre 1 × 10 UFC/ml et 3 × 10 UFC/ml ou une concentration en ATP
–6 –6
comprise entre 1 × 10 mol/l et 3 × 10 mol/l et incuber dans les conditions suivantes:
Température: (37 ± 2) °C
–1
Vitesse d'agitation: 110 min et 3 cm de largeur
Durée d'incubation: (3 ± 1) h
7 –7
UFC cible ou concentration en ATP après incubation: 10 UFC/ml ou 10 mol/l.
NOTE L'inoculum préparé est conservé sur glace et est utilisé dans les 8 h.
10.1.1.4 Préparation de l'inoculum d'essai
5 5
Ajuster la concentration en bactéries à une valeur comprise entre 1 × 10 UFC/ml et 3 × 10 UFC/ml à l'aide
d'un spectrophotomètre ou d'une néphélomètre de McFarland (5.1) ou la concentration d'ATP à une valeur
–9 –9
comprise entre 1 × 10 mol/l et 3 × 10 mol/l par la méthode de luminescence en utilisant le bouillon nutritif
(6.5), après l'avoir dilué 20 fois avec de l'eau à température ambiante.
NOTE L'inoculum préparé est conservé sur glace et est utilisé dans les 4 h.
10.1.2 Préparation des échantillons pour essai
10.1.2.1 Masse et forme des échantillons pour essai
Préparer des éprouvettes ayant une masse de (0,40 ± 0,05) g et les découper à une taille adaptée aux
échantillons pour essai. Obtenir six échantillons pour essai de tissu témoin et six échantillons pour essai de
traitement antibactérien.
NOTE Trois des échantillons de tissu témoin et trois des échantillons traités avec agent antibactérien sont utilisés
pour un temps zéro immédiatement après ensemencement. Les échantillons restants sont utilisés pour le temps de
contact, après une période d'incubation comprise entre 18 h et 24 h.
10.1.2.2 Montage des échantillons pour essai
Placer chacun des échantillons pour essai dans des flacons individuels en choisissant la méthode suivante,
adaptée à la nature de l'échantillon pour essai.
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a) Si l'échantillon pour essai est un tissu qui a tendance à s'enrouler facilement ou s'il contient du
rembourrage ou du duvet, introduire une tige en verre (5.18) dans l'échantillon présent dans le flacon. En
variante, attacher les deux extrémités de l'échantillon pour essai avec du fil.
b) Si l'échantillon pour essai est du fil, disposer le fil en faisceau et introduire une tige en verre dans
l'échantillon présent dans le flacon.
c) Si l'échantillon pour essai est une moquette ou un produit de construction similaire, couper le velours et
introduire une tige en verre dans l'échantillon présent dans le flacon.
Lorsque cela est nécessaire, les échantillons pour essai peuvent être lavés conformément à l'ISO 6330 ou par
une autre méthode appropriée et, après le lavage final, les échantillons sont rincés avec de l'eau afin
d'éliminer le détergent de lavage. L'utilisation d'une méthode non spécifiée doit être consignée.
Lorsque cela est nécessaire, les échantillons pour essai sont stérilisés par autoclavage selon le mode
opératoire suivant:
1) Envelopper la partie supérieure des ampoules contenant les échantillons pour essai d'une feuille
d'aluminium (5.26).
2) Placer les ampoules recouvertes dans une corbeille en fils métalliques (5.25) pour autoclavage.
3) Envelopper le couvercle des ampoules d'une feuille d'aluminium et placer les ampoules dans la corbeille
en fils métalliques.
4) Stériliser les couvercles et les ampoules contenant les échantillons pour essai par autoclavage à 121 °C
et à 103 kPa pendant 15 min à 20 min.
5) Après stérilisation, retirer la feuille d'aluminium et laisser sécher les échantillons pour essai dans les
ampoules pendant une durée égale ou supérieure à 60 min, en les plaçant sur une paillasse propre (5.6)
ou en tout autre endroit où il n'existe aucun risque de contamination aérienne.
6) Fermer le couvercle des ampoules hermétiquement.
Lorsqu'il n'est pas possible de passer à l'autoclave, la stérilisation peut être réalisée par un traitement au gaz
d'oxyde d'éthylène, aux rayons gamma ou par une autre méthode appropriée. L'utilisation d'autres méthodes
doit être consignée.
10.1.3 Réalisation de l'essai
10.1.3.1 Ensemencement des échantillons pour essai
Prélever à la pipette avec précision 0,2 ml de l'inoculum préparé en 10.1.1.4 en plusieurs endroits sur chaque
échantillon pour essai préparé en 10.1.2.2, afin de s'assurer qu'aucun inoculum ne touche la surface de
l'ampoule et fermer le couvercle de celle-ci hermétiquement.
10.1.3.2 Extraction après ensemencement
Immédiatement après l'ensemencement décrit en 10.1.3.1, introduire 20 ml du milieu de culture SCDLP (6.8)
dans chacune des six ampoules dans lesquelles ont été placés un échantillon de tissu témoin et un
échantillon pour essai traité avec l'agent antibactériens, fermer le couvercle et procéder à l'extraction de la
manière spécifiée à l'Article 9.
10.1.3.3 Incubation
Incuber les ampoules (trois échantillons pour essai de tissu témoin, trois échantillons pour essai traités)
à (37 ± 2) °C pendant 18 h à 24 h.
10.1.3.4 Extraction après incubation
Après l'incubation décrite en 10.1.3.3, introduire 20 ml de milieu de culture SCDLP (6.8) dans chacune des
ampoules, resserrer fermement le couvercle et procéder à l'extraction de la manière spécifiée à l'Article 9.
10.1.3.5 Calcul du nombre de bactéries ou de la quantité d'ATP
10.1.3.5.1 Généralités
Calculer le nombre de bactéries ou la quantité d'ATP de la manière spécifiée en 10.1.3.2 et 10.1.3.4 à partir
de la concentration en bactéries ou en ATP obtenue à l'Article 8, selon la formule suivante:
10.1.3.5.2 Nombre de bactéries
M = c × 20
B
où
M est le nombre de bactéries par éprouvette;
c est la concentration en bactéries obtenue en 8.1;
B
20 est le volume de la solution d'extraction, en millilitres (ml).
10.1.3.5.3 Quantité d'ATP
M' = c × 20
ATP'
où
M' est la quantité d'ATP par éprouvette;
c est la concentration en ATP obtenue en 8.2;
ATP'
20 est le volume de la solution d'extraction, en millilitres (ml).
10.1.4 Résultats d'essai
10.1.4.1 Jugement de l'efficacité de l'essai
Lorsque a), b) et c) ou a), b) et d) sont satisfaits, l'essai est jugé efficace. Lorsque l'essai est jugé inefficace,
un contre-essai doit être réalisé.
a) L'inoculum d'essai préparé en 10.1.1.4 doit présenter une concentration en bactéries comprise
5 5 –9
entre 1 × 10 UFC/ml et 3 × 10 UFC/ml ou une concentration en ATP comprise entre 1 × 10 mol/l
–9
et 3 × 10 mol/l.
b) L'écart entre les valeurs extrêmes pour les trois tissus témoins immédiatement après l'ensemencement et
après l'incubation respectivement doit être lg u 1.
c) La valeur de croissance obtenue selon la formule suivante doit être W 1,0 dans la technique par
dénombrement.
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d) La valeur de croissance obtenue selon la formule suivante doit être W 0,5 dans la méthode de
luminescence.
F = lg C – lg C
t o
où
F est la valeur de croissance obtenue sur le tissu témoin;
lg C est le logarithme décimal moyen correspondant au nombre de bactéries ou à la quantité moyenne
t
d'ATP, obtenu à partir de trois échantillons pour essai de tissu témoin après une incubation d'une
durée comprise entre 18 h et 24 h;
lg C est le logarithme décimal moyen correspondant au nombre de bactéries ou à la quantité moyenne
o
d'ATP, obtenu à partir de trois échantillons pour essai de tissu témoin immédiatement après
ensemencement.
10.1.4.2 Calcul de la valeur de l'activité antibactérienne
Lorsque l'essai a été jugé efficace, déterminer la valeur d
...